CN101838641A - 一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，步骤为：一、以苯胺单体自身作为“模板”，或使用具有表面活性剂的酸性掺杂剂作为“软模板”，或使用聚苯乙烯(PS)为“硬模板”，将其加入到分散有苯胺单体的去离子水中，室温下磁力搅拌至均匀乳状液，在静电力的作用下，然后，一次性加入氧化剂的水溶液，可得到具有纳米结构的导电聚苯胺，二、将制得的导电聚苯胺分散于磷酸缓冲溶液中搅拌至均匀，然后，将游离酶溶解于同样的缓冲溶液中，于60-120rpm的摇床中共价耦合，洗涤，去除上清液，得到纳米结构导电聚苯胺为载体的固定化酶。该方法制得的固定化酶可用于染料的脱色反应中，具有反应条件温和，降解效率高，可重复使用的优点。

Description

一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法。

背景技术

酶作为一种特殊的生物催化剂，具有催化效率高，反应条件温和，特异性强等优点。然而，游离状态的酶稳定性差，对温度、离子浓度、pH值及重金属离子等外界因素敏感，容易失活，且反应后分离困难，不能重复利用，使用成本高，这些不足大大限制了游离酶的应用。酶固定化技术，即通过物理或化学的方法将游离酶束缚于一定区域内，保持了催化活性的同时可以重复，连续地使用。固定化酶克服了游离酶的不足，提高了酶的稳定性，方便回收和重复使用，降低了成本，更适应工业化生产的需要。生物酶的固定化技术主要有包埋法，吸附法，交联法和化学共价法。吸附法是最早出现的酶固定化方法，包括物理吸附和离子交换吸附，该法条件温和，操作简便，但酶和载体之间结合力弱，酶易受反应介质影响而从载体上脱落，导致固定化酶的稳定性差。交联法是先将酶吸附于载体上，利用双功能或多功能交联试剂，使酶分子之间进行分子间交联，形成交联网状结构而使酶固定化，交联法一般作为其它固定化方法的辅助手段。包埋法的基本原理是载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网络中，从而实现酶固定化的方法。该法分为网格型和微囊型两类，由于不涉及酶的构象及酶分子的化学变化，反应条件温和，因而酶活力回收率较高，但高分子网络不利于底物与产物的扩散，会导致固定化酶的活力降低。化学共价法则是酶分子与载体表面的活性功能基团之间产生共价结合而实现酶的固定化。共价结合的固定化酶与载体之间连接牢固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但通常固定化反应比较剧烈，固定化过程对酶的活力损失严重。固定化酶的性能除了取决于固定化方法外，主要依赖于所使用的载体材料。载体材料的结构和性质显著地影响了固定化酶的各种性能。因此，设计，开发和研制功能更加优异的载体材料已成为固定化酶研究的重点之一。

目前，随着纳米技术的发展，纳米材料成为当今新材料研究领域中最富有活力、最具有应用前景的新型材料。当材料在纳米尺度(1～100nm)范围内，表面效应、尺寸效应、量子效应等使纳米材料不同于其体材料，呈现出新颖独特的物理化学性能，以纳米材料为载体，有可能克服体材料酶负载量低、酶易流失、失活等不足，提高固定化酶的性能。磁性纳米颗粒，纳米孔材料，碳纳米管等已经开始应用于酶的固定化研究中，显示出优于体材料的催化效果。将纳米技术和纳米材料应用于酶固定化研究中，实现纳米技术、生物技术和环境技术的融合和发展，有望成为解决日益严重的环境污染的有效手段，具有重要的科学意义和技术应用前景。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，以具有纳米结构的导电聚苯胺为载体，合成固定化酶，发挥共轭分子有利于载体与酶之间的电子传输和纳米材料表面效应与小尺寸效应可极大提高材料比表面积的优势，具有制备简单、高效的特点。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，包括以下步骤：

一、首先采用“无模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将苯胺单体超声分散于水溶液中，苯胺单体与水溶液的比例按2-5mmol∶10-20mL，然后，一次性加入浓度为0.1-2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为(NH₂)₂S₂O₈、Fe(NO₃)₃、FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃或H₂O₂，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为10∶1-1∶1，静置反应12-24小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在10-60℃下真空干燥18-24小时，得到墨绿色的导电聚苯胺纳米纤维；

二、将制得的导电聚苯胺纳米纤维分散于pH范围为6-8的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1-2g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将游离酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与游离酶的质量比为1∶0.0025-1∶1，4-10℃下在1-5体积份的缓冲溶液中于60-120rpm的摇床中共价偶联4-72小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗3-5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

以上制备方法中，步骤1中制备导电聚苯胺采用“无模板”法制备。此外，导电聚苯胺的制备还可采用“软模板”或“硬模板”方法制得。

一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，包括以下步骤：

一、首先采用“软模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，选用具有表面活性剂性质的酸性掺杂剂，将苯胺单体与酸性掺杂剂按摩尔比为1∶0.1-1∶1.2混合分散于水溶液中，酸性掺杂剂为水杨酸、十二烷基苯磺酸、对甲苯磺酸或全氟磺酸，苯胺单体与水溶液的比例2-5mmol∶10-20mL。然后，一次性加入浓度为0.1-2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为(NH₂)₂S₂O₈、Fe(NO₃)₃、FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃或H₂O₂，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为：10∶1-1∶1，静置反应12-24小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在10-60℃下真空干燥18-24小时，得到墨绿色的导电聚苯胺微球；

二、将制得的导电聚苯胺微球分散于pH范围为6-8的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1-2g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将游离酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与游离酶的质量比为1∶0.0025-1∶1，4-10℃下在1-5体积份的缓冲溶液中于60-120rpm的摇床中共价偶联4-72小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗3-5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，包括以下步骤：

一、首先采用“硬模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将市售中空聚苯乙烯PS微球或无皂乳液聚合制备的PS微球，溶解于去离子水中，磁力搅拌，配成溶液浓度为10-30g/L的均匀乳状液；用注射器精确量取苯胺单体加入到上述乳状液中，苯胺单体与乳状液体积比为2-5mmol∶10-20mL，然后，一次性加入浓度为0.1-2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为(NH₂)₂S₂O₈、Fe(NO₃)₃、FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃或H₂O₂，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为10∶1-1∶1，静置反应12-24小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在10-60℃下真空干燥18-24小时，得到墨绿色聚苯乙烯/聚苯胺粉末，用HF酸溶解掉聚苯乙烯模板后，即可得到导电空心聚苯胺微球；

二、将制得的导电空心聚苯胺微球分散于pH范围为6-8的磷酸缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1-2g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将游离酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与游离酶的质量比为1∶0.0025-1∶1，4-10℃下在1-5体积份的缓冲溶液中于60-120rpm的摇床中共价偶联4-72小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗3-5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

检验本发明制得的纳米结构导电聚苯胺固定化酶性能及其重复利用性，步骤如下：将1体积份的导电聚苯胺固定化酶，加入10-40体积份的缓冲溶液的反应溶剂中，和1-10摩尔份的染料底物进行混合，染料底物可以为：甲基橙，活性艳红，灿烂绿，结晶紫或偶氮苯，并加入0.1-1摩尔份的过氧化氢作为引发剂，在20-25℃下，引发酶促降解反应，发现能够有效降解染料；将酶促降解反应后的产物进行离心过滤，沉淀用缓冲溶液冲洗，回收固定化酶，将回收的固定化酶再用于酶促降解反应，发现固定化酶可重复使用。

本发明中以苯胺单体自身作为“模板”，或使用具有表面活性剂的酸性掺杂剂作为“软模板”，或使用具有特定形貌(如球形)的聚苯乙烯(PS)为“硬模板”，将其加入到分散有苯胺单体的去离子水中，由于苯胺具有双亲的分子结构(亲水的氨基和疏水的苯环)，此类似于表面活性剂的结构使其在水溶液中自发形成胶束，室温下磁力搅拌至均匀乳状液，在静电力的作用下，苯胺单体胶束可以均匀地吸附于上述“软模板”的外表面，然后，一次性加入氧化剂的水溶液，由于氧化剂是水溶性的，故可在胶束与水的界面处围绕着模板发生氧化聚合反应，可得到各种具有纳米结构的导电聚苯胺，包括纳米纤维，微米管，微米球等。用最适pH缓冲溶液配制一定体积的酶溶液，将上述合成的导电聚苯胺分散于同一缓冲溶液中，然后将两种液体以一定的比例在适宜的温度下，共价耦合，洗涤，去除上清液，得到纳米结构导电聚苯胺为载体的固定化酶。该固定化酶可用于染料的脱色等反应中，具有反应条件温和，降解效率高，固定化酶可重复使用等优点。

导电聚苯胺是一类最具应用前景的导电高聚物材料，具有高度共轭结构的分子结构，通过“掺杂”后可以使其电导率由绝缘体变为导体，优异的物理、化学电活性能引起了科学家们的极大兴趣，成为材料领域中的研究热点。聚苯胺分子骨架中带有氨基，而酶的主要成分是氨基酸，聚苯胺不需要任何表面修饰即可通过氨基与酶分子中的羧基等基团直接键合，实现酶的固定化。除此之外，聚苯胺还具有以下特点：(1)单体价格便宜，易于合成；(2)分子骨架具有多样化的结构，易于实现载体的多样化；(3)独特的质子酸“掺杂”机制，通过使用不同的掺杂剂，实现载体性质可控可调，(4)高度共轭的分子结构，有利于载体与酶分子之间的电子传输，增强酶活性中心与底物间长距离的电子传输效率。结合高分子材料本身良好的机械性能、可加工性及环境稳定性高、可重复使用等优点，聚苯胺可以作为一种理想的新型载体，实现生物酶的高效固定化。

以纳米结构的聚苯胺为载体，一方面可发挥共轭分子有利于载体与酶分子之间的电子传输的优势，另一方面发挥纳米结构的优势，提高载体的比表面积，增加酶的负载量，同时，通过纳米结构载体与酶分子之间的相互作用，改善酶促反应的微环境，提高酶活性中心与载体和反应物之间的传输效率和传质扩散速度，有望提高固定化酶的催化活性，实现高效降解难降解污染物的目的。人们对于该方面的研究才刚刚开始，具有广阔的发展空间和开发前景。

综上所述，本发明的优点总结为：利用具有纳米结构的高度共轭的导电聚苯胺为载体，发挥纳米材料表面效应与小尺寸效应的优势，提高载体的比表面积，增加酶的负载量，同时，通过纳米结构载体与酶分子之间的相互作用，改善酶促反应的微环境，提高酶活性中心与载体和反应物之间的传输效率和传质扩散速度，提高固定化酶的催化活性，实现高效降解难降解污染物的目的。该方法非常简单，载体材料无需活化，即可与生物酶分子共价耦合，实现酶固定化。同时该固定化酶还具有与产物易分离、可重复使用等优点。

具体实施方式

实施例一

本实施例包括以下步骤：

一、首先采用“无模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将苯胺单体超声分散于水溶液中，苯胺单体与水溶液的比例按5mmol∶20mL，然后，一次性加入0.25M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为(NH₂)₂S₂O₈，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为1∶1，静置反应12小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在60℃下真空干燥18小时，得到墨绿色的导电聚苯胺纳米纤维；

二、将制得的导电聚苯胺纳米纤维分散于pH范围为7的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将辣根过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与辣根过氧化物酶的质量比为1∶0.01，4℃下在2体积份的缓冲溶液中于120rpm的摇床中共价偶联24小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗3次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

将本实施例得到的1体积份的导电聚苯胺固定化酶，加入10体积份的缓冲溶液的反应溶剂中，和1摩尔份的甲基橙染料底物进行混合，并加入1摩尔份的过氧化氢作为引发剂，在25℃下，引发酶促降解反应，发现能够有效降解染料，10分钟甲基橙降解效率达到85％；将酶促降解反应后的产物进行离心过滤，沉淀用缓冲溶液冲洗3次，回收固定化酶，将回收的固定化酶再用于酶促降解反应，发现固定化酶可重复使用5次，降解效率保持在70％以上。

实施例二

本实施例包括以下步骤：

一、首先采用“无模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将苯胺单体超声分散于水溶液中，苯胺单体与水溶液的比例按2mmol∶10mL，然后，一次性加入2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为Fe₂(SO₄)₃，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为10∶1，静置反应20小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在50℃下真空干燥24小时，得到墨绿色的导电聚苯胺纳米纤维；

二、将制得的导电聚苯胺纳米纤维分散于pH范围为8的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与磷酸缓冲溶液分散时的比值按2g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将木质素过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与木质素过氧化物酶酶的质量比为1∶0.001，6℃下在5体积份的缓冲溶液中于80rpm的摇床中共价偶联72小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗4次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

实施例三

本实施例包括以下步骤：

一、首先采用“软模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，选用具有表面活性剂性质的水杨酸为掺杂剂，将苯胺单体与酸性掺杂剂按摩尔比为1∶1混合分散于水溶液中，苯胺单体与水溶液的比例按2mmol∶20mL，然后，一次性加入浓度0.2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为Fe(NO₃)₃，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为2∶1，静置反应16小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在30℃下真空干燥20小时，得到墨绿色的导电聚苯胺微球；

二、将制得的导电聚苯胺微球分散于pH范围为6.6的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1.5g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将锰过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与锰过氧化物酶的质量比为1∶0.025，8℃下在4体积份的缓冲溶液中于100rpm的摇床中共价偶联38小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

将本实施例得到的1体积份的导电聚苯胺固定化酶，加入20体积份的缓冲溶液的反应溶剂中，和2摩尔份的活性艳红染料底物进行混合，并加入0.5摩尔份的过氧化氢作为引发剂，在20℃下，引发酶促降解反应，发现能够有效降解染料，10分钟活性艳红降解效率达到80％；将酶促降解反应后的产物进行离心过滤，沉淀用缓冲溶液冲洗3次，回收固定化酶，将回收的固定化酶再用于酶促降解反应，发现固定化酶可重复使用5次，降解效率保持在70％以上。

实施例四

本实施例包括以下步骤：

一、首先采用“软模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，选用具有表面活性剂性质的对甲苯磺酸为掺杂剂，将苯胺单体与酸性掺杂剂按摩尔比为1∶0.1混合分散于水溶液中，苯胺单体与水溶液的比例按5mmol∶10mL，然后，一次性加入浓度为2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为H₂O₂，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为4∶1，静置反应22小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在60℃下真空干燥19小时，得到墨绿色的导电聚苯胺微球；

二、将制得的导电聚苯胺微球分散于pH范围为7.5的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1.8g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将氢过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与氢过氧化物酶的质量比为1∶0.05，9℃下在5体积份的缓冲溶液中于105rpm的摇床中共价偶联65小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

实施例五

本实施例包括以下步骤：

一、首先采用“硬模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将市售中空聚苯乙烯PS微球溶解于去离子水中，磁力搅拌，配成溶液浓度为10g/L的均匀乳状液；用注射器精确量取苯胺单体加入到上述乳状液中，苯胺单体与乳状液体积比为4mmol∶10mL，然后，一次性加入浓度为0.8M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为FeCl₃，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为2∶1，静置反应18小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在30℃下真空干燥18小时，得到墨绿色聚苯乙烯/聚苯胺粉末，用HF酸溶解掉聚苯乙烯模板后，即可得到导电空心聚苯胺微球；

二、将制得的导电空心聚苯胺微球分散于pH范围为6的磷酸缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1.2g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将辣根过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与辣根过氧化物酶的质量比为1∶1，4℃下在2体积份的缓冲溶液中于60rpm的摇床中共价偶联70小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

将本实施例得到的1体积份的导电聚苯胺固定化酶，加入40体积份的缓冲溶液的反应溶剂中，和5摩尔份的结晶紫染料底物进行混合，并加入1摩尔份的过氧化氢作为引发剂，在20℃下，引发酶促降解反应，发现能够有效降解染料，10分钟结晶紫降解效率达到85％；将酶促降解反应后的产物进行离心过滤，沉淀用缓冲溶液冲洗3次，回收固定化酶，将回收的固定化酶再用于酶促降解反应，发现固定化酶可重复使用5次，降解效率保持在75％以上。

实施例六

本实施例包括以下步骤：

一、首先采用“硬模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将无皂乳液聚合制备的PS微球溶解于去离子水中，磁力搅拌，配成溶液浓度为20g/L的均匀乳状液；用注射器精确量取苯胺单体加入到上述乳状液中，苯胺单体与乳状液体积比为3mmol∶20mL，然后，一次性加入浓度为1.4M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为(NH₂)₂S₂O₈，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为2∶1，静置反应20小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在50℃下真空干燥20小时，得到墨绿色聚苯乙烯/聚苯胺粉末，用HF酸溶解掉聚苯乙烯模板后，即可得到导电空心聚苯胺微球；

二、将制得的导电空心聚苯胺微球分散于pH范围为7的磷酸缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1.4g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将木质素过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与木质素过氧化物酶的质量比为1∶0.5，4℃下在5体积份的缓冲溶液中于110rpm的摇床中共价偶联56小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

Claims (9)

1.一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，包括以下步骤：

一、首先采用“无模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将苯胺单体超声分散于水溶液中，苯胺单体与水溶液的比例按2-5mmol∶10-20mL，然后，一次性加入浓度为0.1-2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为(NH₂)₂S₂O₈、Fe(NO₃)₃、FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃或H₂O₂，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为10∶1-1∶1，静置反应12-24小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在10-60℃下真空干燥18-24小时，得到墨绿色的导电聚苯胺纳米纤维；

二、将制得的导电聚苯胺纳米纤维分散于pH范围为6-8的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1-2g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将游离酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与游离酶的质量比为1∶0.0025-1∶1，4-10℃下在1-5体积份的缓冲溶液中于60-120rpm的摇床中共价偶联4-72小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗3-5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

2.根据权利要求1所述的一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、首先采用“无模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将苯胺单体超声分散于水溶液中，苯胺单体与水溶液的比例按5mmol∶20mL，然后，一次性加入0.25M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为(NH₂)₂S₂O₈，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为1∶1，静置反应12小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在60℃下真空干燥18小时，得到墨绿色的导电聚苯胺纳米纤维；

二、将制得的导电聚苯胺纳米纤维分散于pH范围为7的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将辣根过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与辣根过氧化物酶的质量比为1∶0.01，4℃下在2体积份的缓冲溶液中于120rpm的摇床中共价偶联24小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗3次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

3.根据权利要求1所述的一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、首先采用“无模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将苯胺单体超声分散于水溶液中，苯胺单体与水溶液的比例按2mmol∶10mL，然后，一次性加入2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为Fe₂(SO₄)₃，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为10∶1，静置反应20小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在50℃下真空干燥24小时，得到墨绿色的导电聚苯胺纳米纤维；

二、将制得的导电聚苯胺纳米纤维分散于pH范围为8的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与磷酸缓冲溶液分散时的比值按2g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将木质素过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺纳米纤维与木质素过氧化物酶酶的质量比为1∶0.001，6℃下在5体积份的缓冲溶液中于80rpm的摇床中共价偶联72小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗4次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

4.一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、首先采用“软模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，选用具有表面活性剂性质的酸性掺杂剂，将苯胺单体与酸性掺杂剂按摩尔比为1∶0.1-1∶1.2混合分散于水溶液中，酸性掺杂剂为水杨酸、十二烷基苯磺酸、对甲苯磺酸或全氟磺酸，苯胺单体与水溶液的比例2-5mmol∶10-20mL。然后，一次性加入浓度为0.1-2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为(NH₂)₂S₂O₈、Fe(NO₃)₃、FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃或H₂O₂，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为：10∶1-1∶1，静置反应12-24小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在10-60℃下真空干燥18-24小时，得到墨绿色的导电聚苯胺微球；

二、将制得的导电聚苯胺微球分散于pH范围为6-8的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1-2g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将游离酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与游离酶的质量比为1∶0.0025-1∶1，4-10℃下在1-5体积份的缓冲溶液中于60-120rpm的摇床中共价偶联4-72小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗3-5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

5.根据权利要求4所述的一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、首先采用“软模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，选用具有表面活性剂性质的水杨酸为掺杂剂，将苯胺单体与酸性掺杂剂按摩尔比为1∶1混合分散于水溶液中，苯胺单体与水溶液的比例按2mmol∶20mL，然后，一次性加入浓度0.2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为Fe(NO₃)₃，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为2∶1，静置反应16小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在30℃下真空干燥20小时，得到墨绿色的导电聚苯胺微球；

二、将制得的导电聚苯胺微球分散于pH范围为6.6的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1.5g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将锰过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与锰过氧化物酶的质量比为1∶0.025，8℃下在4体积份的缓冲溶液中于100rpm的摇床中共价偶联38小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

6.根据权利要求4所述的一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、首先采用“软模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，选用具有表面活性剂性质的对甲苯磺酸为掺杂剂，将苯胺单体与酸性掺杂剂按摩尔比为1∶0.1混合分散于水溶液中，苯胺单体与水溶液的比例按5mmol∶10mL，然后，一次性加入浓度为2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为H₂O₂，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为4∶1，静置反应22小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在60℃下真空干燥19小时，得到墨绿色的导电聚苯胺微球；

二、将制得的导电聚苯胺微球分散于pH范围为7.5的磷酸缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1.8g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将氢过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电聚苯胺微球与氢过氧化物酶的质量比为1∶0.05，9℃下在5体积份的缓冲溶液中于105rpm的摇床中共价偶联65小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

7.一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、首先采用“硬模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将市售中空聚苯乙烯PS微球或无皂乳液聚合制备的PS微球，溶解于去离子水中，磁力搅拌，配成溶液浓度为10-30g/L的均匀乳状液；用注射器精确量取苯胺单体加入到上述乳状液中，苯胺单体与乳状液体积比为2-5mmol∶10-20mL，然后，一次性加入浓度为0.1-2M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为(NH₂)₂S₂O₈、Fe(NO₃)₃、FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃或H₂O₂，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为10∶1-1∶1，静置反应12-24小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在10-60℃下真空干燥18-24小时，得到墨绿色聚苯乙烯/聚苯胺粉末，用HF酸溶解掉聚苯乙烯模板后，即可得到导电空心聚苯胺微球；

二、将制得的导电空心聚苯胺微球分散于pH范围为6-8的磷酸缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1-2g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将游离酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与游离酶的质量比为1∶0.0025-1∶1，4-10℃下在1-5体积份的缓冲溶液中于60-120rpm的摇床中共价偶联4-72小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗3-5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

8.根据权利要求7所述的一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、首先采用“硬模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将市售中空聚苯乙烯PS微球溶解于去离子水中，磁力搅拌，配成溶液浓度为10g/L的均匀乳状液；用注射器精确量取苯胺单体加入到上述乳状液中，苯胺单体与乳状液体积比为4mmol∶10mL，然后，一次性加入浓度为0.8M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为FeCl₃，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为2∶1，静置反应18小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在30℃下真空干燥18小时，得到墨绿色聚苯乙烯/聚苯胺粉末，用HF酸溶解掉聚苯乙烯模板后，即可得到导电空心聚苯胺微球；

二、将制得的导电空心聚苯胺微球分散于pH范围为6的磷酸缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1.2g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将辣根过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与辣根过氧化物酶的质量比为1∶1，4℃下在2体积份的缓冲溶液中于60rpm的摇床中共价偶联70小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。

9.根据权利要求7所述的一种纳米结构的导电聚苯胺固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、首先采用“硬模板”法制备纳米结构的导电聚苯胺，将无皂乳液聚合制备的PS微球溶解于去离子水中，磁力搅拌，配成溶液浓度为20g/L的均匀乳状液；用注射器精确量取苯胺单体加入到上述乳状液中，苯胺单体与乳状液体积比为3mmol∶20mL，然后，一次性加入浓度为1.4M(mol/L)的氧化剂水溶液中，氧化剂为(NH₂)₂S₂O₈，氧化剂水溶液中氧化剂与苯胺单体的摩尔比为2∶1，静置反应20小时，将混合溶液离心，离心后的固体依次用蒸馏水、无水乙醇和乙醚洗涤，最后在50℃下真空干燥20小时，得到墨绿色聚苯乙烯/聚苯胺粉末，用HF酸溶解掉聚苯乙烯模板后，即可得到导电空心聚苯胺微球；

二、将制得的导电空心聚苯胺微球分散于pH范围为7的磷酸缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与磷酸缓冲溶液分散时的比值按1.4g∶1L，室温下磁力搅拌至均匀，然后，将木质素过氧化物酶溶解于同样的缓冲溶液中，导电空心聚苯胺微球与木质素过氧化物酶的质量比为1∶0.5，4℃下在5体积份的缓冲溶液中于110rpm的摇床中共价偶联56小时，离心过滤，去除上清液，固定化酶用同样pH的缓冲溶液清洗5次，自然干燥，得到墨绿色的纳米结构导电聚苯胺固定化酶，4℃冰箱中保存。