CN101835790A - 在双水相系统中分离重组蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及为了基于应用具有胆碱亲和力的多肽，在水溶液中分配、分离和纯化重组蛋白的方法。本发明基于一现象，通过该现象能够混合含有预定组分的两种水性溶液，最终分成不同密度的双相。融合的蛋白，结合至上述具有胆碱亲和力的多肽的蛋白质优先地定位于其中一相，而来自细胞提取物的大部分蛋白倾向于移动至另一相。经过一系列洗涤操作以去除余下的杂质后，通过添加对结合至目的蛋白质的多肽具有亲和力的可溶性分子，反转蛋白质的定位。本发明包括改变目的蛋白或多肽在一相或另一相中的存在，从而使得以高效和高纯度纯化所述蛋白或多肽。本发明是用于分离优选地用胆碱结合结构域标签的重组蛋白的一种有成本效益的办法。

Description

在双水相系统中分离重组蛋白的方法

发明领域

本发明涉及分离具有胆碱结合多肽序列的多肽或融合蛋白的方法，此胆碱结合多肽序列表现出的对水溶性聚合物的亲和性之外，还决定了多肽或融合蛋白在双水相系统中的不对称分布，其中一相富含所述聚合物。该方法可从细胞提取物的复杂蛋白质混合物中以简单方法快速分离融合蛋白，所述简单方法可以用来纯化目的多肽或蛋白。纯化方法包括一个或多个洗涤步骤，通过在系统中添加亲和多肽的天然配体，完成融合蛋白的分布反转。应用本发明的发明领域因此包括生物技术目的的，以及工业、农艺学、生物医学中治疗或诊断目的的，或生命科学领域中作为研究工具和分析目的的多肽和蛋白的生产、分离以及最终纯化。

现有技术

将酶固定化在固态支持物中是作为色谱技术纯化酶以及建造酶反应器用于进行所有类型的生物转化反应的常规方法(Mosbach，K.，ed.Immobilized Enzymes and Cells Part B.Methods in Enzymology.Vol.135.1987)。为此已经开发了种类繁多的共价或非共价的固定化系统。在特定情况下，使用具有能够与固态支持物强大而特异性相互作用的亲和多肽或“标签”的目的融合蛋白(Uhlen，M.，et al.，Fusionproteins in biotechnology.Curr Opin Biotechnol，1992.3(4)：p.363-9；Waugh，D.S.，Making the most of affinity tags.TrendsBiotechnol，2005.23(6)：p.316-20)。然而，用将酶固定化在固态基质中经常导致蛋白质性质，如结构和功能水平上的改变。因此，例如，支持物的理化特点能够影响底物扩散到酶相，或产物到流动相，造成酶的动力学常数的变化，在很多时候这意味着生产效率降低，而在任何情况下对设定需要做昂贵的研究。另一方面，工业应用级别的色谱方法涉及一系列技术难点，基本上由材料的可压缩性和需要在柱子中应用高压所造成的。因此，最近正在开发新的解决方法作为固态材料的替代品。于是，双水相系统通过两种结构上不同的聚合物的特定溶液混合或一种聚合物(通常为聚乙二醇或称PEG)和高浓度的盐混合而自发产生(Johansson，H.W.a.G.，ed.Aqueous Two-PhaseSystems.Methods in Enzymology.Vol.228.aquas，New approachesto aqueous polymer systems：Theory，thermodynamics andapplications to bimolecular separations.Pure and AppliedChemistry，1995.67(6)：p.955-962；Andrews，B.A.，A.S.Schmidt，and J.A.aqueos Biotechnol Bioeng，2005.90(3)：p.380-90)。双相出现后不久，即达到平衡。在两种聚合物的混合物中，每相富集两种聚合物中的一种，而在聚合物-盐系统中，一相富含聚合物，另一相富含盐。已经对这些混合物的理化特性进行了广泛研究(Cabezas，H.，Jr.，Theory of phase formation in Aqueous Two-Phase Systems.J Chromatogr B Biomed Appl，1996.680(1-2)：p.3-30)，并且已经建立用来显示引起相分离的每一种化合物的浓度范围的双结点图。名为“结线”的线指示每个聚合物在每个相中的最终浓度，一旦分离，也就是每个相的相对体积(Johansson，H.W.a.G.，ed.AqueousTwo-Phase Systems.Methods in Enzymology.Vol.228.1994)。双水相系统在生物材料分离上有着强大的应用性(Hustedt，H.，K.H.Kroner，and M.R.Kula，Applications of phase partitioning inbiotechnology.，in Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems：theory，methods uses and applications in biotechology，H.Walter，D.E.Brooks，and D.Fisher，Editors.1985，AcademicPress：Orlando，FL，.p.529-587；Persson，J.，et al.，Purification of recombinant and human apolipoprotein A-1 usingsurfactant micelles in Aqueous Two-Phase Systems：recycling ofthermoseparating polymer and surfactant withtemperature-induced phase separation.Biotechnol Bioeng，1999.65(4)：p.371-81)。它们具有例如高生物相容性，低表面张力(使生物分子降解最小化)，装料和产出的容量大，很容易扩大规模等几个优点(Albertsson，P.A.，Partition of cell particles andmacromolecules.1986，New York：Wiley；Walter，H.，G.Johansson，and D.E.Brooks，Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems：recent results.Anal Biochem，1991.197(1)：p.1-18)。在酶催化过程中，酶相和其他相的物质传输(底物和产物)远远超过当酶被吸收在固相表面。此外，这是一个经济的系统，因为可以控制很多因素来提高目标分子的分配。蛋白质在双相之间的分配取决于几个因素，例如电荷、目标蛋白质的大小以及疏水性，而疏水性通常很难预测。事实上，市场上这些系统的主要功能受限于对蛋白质分配的预测能力低下。然而，应用融合至目标蛋白质的亲和多肽或“标签”能够以更加可控的方式诱导蛋白进入一个或另一个相中，这命名为双水相系统中通过亲和力的分离。曾有报道形容应用已知的六聚组氨酸“标签”得到很有前景的结果(Chung，B.H.，D.Bailey，and F.H.Arnold，Metal affinity partitioning.，in Aqueous Two-Phase Systems，H.W.a.G.Johansson，Editor.1994.p.167-277；Birkenmeier，G.，et al.，Immobilized metal ion affinity partitioning，a methodcombining metal-protein interaction and partitioning ofproteins in Aqueous Two-Phase Systems.J Chromatogr，1991.539(2)：p.267-77)。在此系统中，能将大部分六聚组氨酸尾部的蛋白融合富集于含事先用金属离子以共价方式衍生的PEG相中。同样，在通过亲和力的这种分配方法中也研究了酪氨酸序列(Fexby，S.，etal.，Partitioning and characterization of tyrosine-taggedgreen fluorescent proteins in aqueous two-phase systems.Biotechnol Prog，2004.20(3)：p.793-8)或者色氨酸(Collen，A.，et al.，Genetic engineering of the Trichoderma reeseiendoglucanase I(Cel7B)for enhanced partitioning in AqueousTwo-Phase Systems containing thermoseparating ethyleneoxide--propylene oxide copolymers.J Biotechnol，2001.87(2)：p.179-91)。

胆碱结合模块(CBM，“choline-binding modules”)构成的多肽家族是名为胆碱结合蛋白(CBP，“choline-binding proteins)的成员之一，它在各种微生物中广泛存在(Swiatlo，E.and e.al.，Choline-binding proteins.，in The Pneumococcus，E.I.Tuomanen，T.J.Mitchell，and D.A.Morrison，Editors.2004，AmericanSociety for Microbiology：Washington，DC.p.49-60)。CBM由非常保守的大约20个氨基酸的重复序列组成(CBR或称胆碱结合重复；code Pfam PF01473：http://www.sanger.ac.uk//cgi-bin/Pfam/getacc？PF01473)，并形成环-折叠-β类型的结构(Fernandez-Tornero，C.，et al.，A novelsolenoid fold in the cell wall anchoring domain of thepneumococcal virulence factor Lyt A.Nat Struct Biol，2001.8(12)：p.1020-4；Hermoso，J.A.，et al.，Insights intopneumococcal pathogenesis from the crystal structure of themodular teichoic acid phosphorylcholine esterase Pce.NatStruct Mol Biol，2005.12(6)：p.533-8；Hermoso，J.A.，et al.，Structural basis for selective recognition of pneumococcal cellwall by modular endolysin from phage Cp-1.Structure，2003.11(10)：p.1239-49)。两个连续的CBR构成胆碱的结合位点。CBM对胆碱和胆碱结构类似物的亲和力(Sanz，J.M.，R.Lopez，and J.L.Garcia，Structural requirements of choline derivatives for′conversion′of pneumococcal amidase.A new single-stepprocedure for purification of this autolysin.FEBS Lett，1988.232(2)：p.308-12)使得能够建立具有这些CBM中的一些的融合蛋白纯化的有效系统(Sanchez-Puelles，J.M.，et al.，Immobilizationand single-step purification of fusion proteins usingDEAE-cellulose.Eur J Biochem，1992.203(1-2)：p.153-9)。基本上，所述方法包括将含有融合蛋白的细胞提取物应用于叔胺或季胺如二乙基氨基乙醇(DEAE)的衍生支持物上。通过添加竞争性配体，如胆碱，将固定化的保持其功能性的蛋白很容易地洗脱下来。此方法基于早先的两个专利(ES 2 032 717和ES200700281)，其中应用酰胺酶LytA的C末端，也称为LYTAG。此方法的优点中，值得注意的是这个系统是高度特异性的，并且其使用来源广泛的商业可得的各种支持物(树脂，纸，多孔板等等)，很少会不兼容，并且拥有所有必要的元素用于有效升级到工业水平的生物反应器，譬如使用经济的化合物(支持物，胆碱等等)，还有无毒以及无相关的环境危害。本发明的目的包括在双水相系统中分配具有LYTAG结构域的融合蛋白的实验方法，这种分配能够通过添加胆碱来调控。这将使纯化融合蛋白成为可能，并扩大其应用，在此情况下LYTAG模块在其当前配置作为亲和“标签”应用于固相亲和层析方法中。此外本方法能够扩展到任何类似LYTAG的结构家族的胆碱结合模块。

发明概述

本发明的目的是在溶液中分配和纯化含有胆碱结合多肽模块的融合蛋白的方法，基于应用双水相系统，其中主要化合物自动分配到双相中，其中一相富含对胆碱结合结构域(CBD)有亲和力的可溶性聚合物，另一相富含其他聚合物或其他的盐。本方法如下图1中显示，它基本上包括孵育的水性提取物，其得自过量表达具有至少融合一个胆碱结合结构域的目标融合蛋白的细胞培养物，以及适当浓度和比例的双相系统的组分，以利于在两个不同的相中分离混合物。由于CBD对其中一相中的溶解的聚合物具有亲和力，相分离后，融合蛋白优先地定位于富含此聚合物的相中，以这种方式有可能移除对立相(oppositephase)，在其中优先地分布着提取物的蛋白质和其他杂质。然后向富集具有CBD亲和聚合物的相添加与弃去相(rejected phase)组分一致的溶液体积，搅拌混和后重新分离成双相。这样的洗涤过程重复所需次数，直到移除的相中达到最低数量的污染性蛋白质。此时，最后一次替换弃去相的相应溶液，但这次含有的胆碱终浓度足以反转胆碱结合结构域与特定聚合物的结合，胆碱与聚合物竞争与蛋白质的结合并替换蛋白质，使蛋白质从聚合相转移到对立相，因此最后一次混合以及相分离后，含有盐或另一种聚合物的相含有高纯度的融合CBD的蛋白。

本发明方法的对象优选地包括使用PEG(3-15％)和磷酸钾(5-15％)，例如分别为15％和12.5％。另一优先的配置是用其他磷酸、硫酸或柠檬酸盐替代磷酸钾，它们也具有高水溶性并能够分离双相。已经证明有效的PEG的分子量范围包括PEG-6000到PEG-20000，而优先的配置为使用PEG-8000(后面将简写为PEG)。

另外优选的配置包括使用PEG(3-15％)和葡聚糖(5-10％，例如6％)形成双相，其能够在20mM Tris-HCl，pH8.0的缓冲液中进行相分离。另一优选的配置是用葡聚糖的衍生物或者结构类似淀粉的多糖及其衍生物替代葡聚糖。

根据所选系统，离心收集来自微生物培养物的细胞，如果用PEG/磷酸盐系统纯化，将其优选地重悬于20mM，pH8.0的磷酸钾缓冲液，如果用PEG/葡聚糖系统，优选地重悬于20mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液。用超声波裂解细胞后，离心所得粗提物以去除细胞残渣，向获得的上清液中添加所需量的PEG和磷酸氢二钾或者PEG和葡聚糖，直到浓度和比例达到系统要求。短时轻轻摇动溶液使其分离成双相，或者通过离心混合物来加速此过程。做下一步之前，可以通过聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析，或用识别胆碱结合结构域的抗体的免疫方法，验证上面的一相，也就是两种系统中富含PEG的相，是否存在含有CBD的融合蛋白。接下来，根据所使用的系统，使用吸管或顷析漏斗(decantation funnel)去除富含磷酸盐或葡聚糖的下相，然后向混合物添加与去除的相相同的体积，其浓度依赖于所使用系统的双相分离图谱(Johansson，H.W.a.G.，ed.Aqueous Two-PhaseSystems.Methods in Enzymology.Vol.228.1994)以及所使用试剂的最初浓度，以维持相分离和它们的相对体积。重复数次上述洗涤过程后，可以选择使用富含目标蛋白质的上相或者包括最后一步用相同组分但包含胆碱的溶液替换下相。一旦混合溶液并形成新的双相特色的系统，融合CBD的蛋白优先地以高纯度富集在下相。本文所述发明代表了使用色谱固相支持物纯化重组表达的蛋白的替代。

发明详述

本发明的目标方法的开发起始于下述事件的认知：聚合物聚乙二醇(PEG)，常规应用于双水相系统，它与胆碱结合蛋白如乙酰胆碱酯酶相互作用，并以特定方式插入胆碱的识别位点，从而在高浓度下成为此酶的抑制剂(Koellner，G.，et al.，A neutral molecule in acation-binding site：specific binding of a PEG-SH toacetylcholinesterase from Torpedo californica.J Mol Biol，2002.320(4)：p.721-5)。胆碱结合结构域作为来自肺炎链球菌(S.pneumoniae)蛋白LytA的羧基端(C-LytA)，噬菌体Cp-1的溶菌酶CPL1，或者通常来源各种微生物的CBM家族的任何胆碱结合结构域(专利ES2032717；Swiatlo，E.and e.al.，Choline-bindingproteins.，in The Pneumococcus，E.I.Tuomanen，T.J.Mitchell，and D.A.Morrison，Editors.2004，American Society forMicrobiology：Washington，DC.p.49-60)，含有与胆碱有天然亲和力的并在结构和功能上有重复性的序列。本发明根据PEG和胆碱之间的相似性而具有和胆碱的结合结构域相互作用的能力。这可以通过对此聚合物中存在的LYTAG结构域(源自C-LytA)的圆二色性分析验证PEG和胆碱的等效性。在不含胆碱以及pH7的水性介质中，蛋白LYTAG是部分变性的(Maestro，B.and J.M.Sanz，Accumulation ofpartly folded states in the equilibrium unfolding of thepneumococcal choline-binding module C-LytA.Biochem J，2005.387(Pt 2)：p.479-88)。结果是它的圆二色光谱重复性差，并且依赖于样品的保存时间和对样品的冻融循环次数。然而，添加胆碱稳定了蛋白，还增加了它的椭圆性(图2A)。根据与胆碱结合的LYTAG结构(Fernandez-Tornero，C.，et al.，A novel solenoid fold in thecell wall anchoring domain of the pneumococcal virulence factorLytA.Nat Struct Biol，2001.8(12)：p.1020-4)，此氨基醇似乎对保护胆碱结合位点的疏水区域是重要的，并且通过最后的叉状结构诱导二聚化，事实上很大程度的稳定了该蛋白质(Fernandez-Tornero，C.，et al.，A novel solenoid fold in the cell wall anchoringdomain of the pneumococcal virulence factor LytA.Nat StructBiol，2001.8(12)：p.1020-4；Usobiaga，P.，et al.，Structuralorganization of the major autolysin from Streptococcuspneumoniae.J Biol Chem，1996.271(12)：p.6832-8)。添加10％的PEG能够产生类似高浓度胆碱的稳定化效果的圆二色光谱(图2A)，表明此配体对结合位点有类似的相互作用。通常，蛋白质的溶解度在对应于其等电点的pH值附近时为最低，这是由于缺乏净电荷有助于疏水相互作用介导的分子间凝聚。从这个意义上讲，配体结合到蛋白质能够遮挡蛋白质表面上存在地的疏水区域，从而增加蛋白质在接近其等电点的pH值的溶解度。正如图2B所示，在pH值为6.5到8.0之间的范围内，制备的LYTAG蛋白中在223纳米处的圆二色信号没有变化，而当pH值低于6.0时信号下降，在pH4.5和5.5之间达到最低。在pH5.0的光谱显示在所有波长(wave longitude)的信号普遍下降(图2A)，与此同时样品光吸收也下降(数据未显示)。这表明在这个pH范围LYTAG的溶解度最低，产生了蛋白的凝聚，减少了可溶性分子群体，容易产生圆二色信号。这些结果同蛋白质的理论等电点相符合，所述理论等电点根据信息学应用程序(http://www.embl-Heidelberg.de/cgi/pi-wrapper.pl)计算大约5.3。添加饱和浓度的胆碱(140mM)诱导LYTAG蛋白在包括2.4到8.0之间的pH值范围内键椭圆(elepticity)和稳定性普遍增加(图2A和2B)，支持了假说，即配体的结合遮挡了疏水位点，使其不能暴露出来，从而避免了凝聚。另外支持这一假说是，添加低极性添加物如2％的CHAPS或140mM2，2-二甲基丙醇(DMP)同样能够在pH5.0恢复圆二色光谱(数据未显示)。在存在10％的PEG时完成这些相同的试验，所得的结果和使用胆碱的情况类似(图2A和2B)，进一步证实这个假说，即该多聚物与LYTAG蛋白相互作用，另外行使与它天然配体同等的效力，表明两种分子可能结合在相同的蛋白质区域。这也通过如下事实所证明：当存有PEG时，LYTAG蛋白丧失保留在DEAE-纤维素柱子中的能力(数据未显示)，说明由于PEG插入胆碱结合位点，阻止它或类似物例如DEAE的结合。最后，还检查了PEG能否仿效胆碱影响LYTAG结构，分析蛋白质的热稳定性，通过跟踪223纳米处的圆二色信号与温度函数关系(图3)。缺少配体时，LYTAG源于中间状态的累积而显示/展开双相的转变(Maestro，B.and J.M.Sanz，Accumulation of partlyfolded states in the equilibrium unfolding of the pneumococcalcholine-binding module C-LytA.Biochem J，2005.387(Pt 2)：p.479-88)。而存在150mM胆碱情况下，避免了中间状态的积累，从而产生了独特的S型曲线以及热稳定状态，这和之前的描述一致(Maestro，B.and J.M.Sanz，Accumulation of partly folded statesin the equilibrium unfolding of the pneumococcalcholine-binding module C-LytA.Biochem J，2005.387(Pt 2)：p.479-88)。存在PEG的情况下进行类似的试验，检查添加此化合物导致了中间效应，即中间状态消失了但是在变性温度下却没有变化(图3)。因此，PEG模拟了胆碱的作用。尽管研究表明，PEG不能像胆碱那样诱导相同的构象改变，但是它们建立了CBD对PEG的亲和力是本发明的基础之一。

双水相系统中亲和纯化LYTAG融合蛋白的通用实验方法

本发明根据表明LYTAG和PEG有相互作用的以前的结果，并提供实现的实例，其中通过双水相在蛋白分离系统中应用此聚合物，由此开发了分离含胆碱结合结构域的多肽的实验方法。

优选的实验方法基于选择PEG/磷酸盐和PEG/葡聚糖的组合用于开发分离方法。PEG/磷酸盐系统能够在pH 8.0，使不同浓度范围的PEG(3-15％)和磷酸钾(5-15％)自动分离成双相。其中一相富集了PEG(上相)而另一相富集磷酸盐(下相)。含15％PEG和12.5％磷酸盐(pH8.0)的系统(也称ExtP缓冲液)表现最好，因为其中双相体积差别最小。就PEG/葡聚糖系统而言，此方法包括使用浓度范围为3-10％的PEG和5-10％的葡聚糖。和之前的系统一样，这些浓度范围使得双相可以分离，上相富集PEG，下相富集葡聚糖。优选地浓度为在pH 8.0，20mM Tris-HCl缓冲液中，PEG 6％，葡聚糖6％(也称为ExtD缓冲液)，同样也是因为其中双相之间体积差别最小。通用的实验方法总结于图1，开始于获得过量表达含有至少一个胆碱结合结构域，优选的是LYTAG的融合蛋白的细胞提取物。存在所需化合物的情况下获得提取物用于通过离心或重力产生双相，并能够在最后用顷析漏斗取代离心。前述LYTAG对PEG的亲和力决定了LYTAG融合物的定量定位于含有这种聚合物的上相(详细例子见下)。一旦进行极端的检查，经过一系列洗涤，其中包括去除下相并且添加相同体积新鲜溶液，始终保持弃去相的组分一致，因此仍然存在相之间分离。以发表在文献(Johansson，H.W.a.G.，ed.Aqueous Two-Phase Systems.Methods in Enzymology.Vol.228.1994)中的双节点线图的数据为基础，对于前述优选的配置，新鲜相的组分包括1％PEG，16％磷酸钾，pH8.0(或称WashP缓冲液)，或者pH8.0，20mM Tris-HCl中的0.5％PEG，16％葡聚糖(也称WashD缓冲液)。经过重新混合和相分离后，用WashP或WashD缓冲液取代下相，重复此过程直到最后的洗涤(通常2-3轮)。此时，PEG相的蛋白质纯度已经能够达到相当高。但是向WashP或WashD缓冲液中添加150mM胆碱能有效在配体结合位点取代PEG，特异性驱动融合蛋白到下相，这可以用于将其纯化至电泳纯。

同已有的其他蛋白纯化系统相比，本发明具有几个优点，其中之一是简单、快速并且经济的方法，能够在软环境下进行纯化。首先，该系统通用性灵活，可应用于广泛的反应物和浓度，允许根据每个特殊情况的特定需要作调整。此外，最小化了柱层析中的典型问题，譬如需要装载，由过载引起的压力问题......，并且此方法在任何情况下比使用固相支持物的方法快速的多而且简单(图4)。另一方面，因为没有有毒组分(如在六聚组氨酸“标签”的特定情况下的重金属)，使得双相系统对环境友好。从更加技术性的角度看，更有效地产生蛋白质对亲和化合物的吸附性，本系统是溶液中的聚合物而不像基于树脂表面的亲和支持物。此外PEG与CBD LYTAG的相互作用在宽的pH范围内诱导蛋白质的普遍稳定化，这使在pH值远离中性时应用这些纯化系统成为可能，避免在酸性pH值下蛋白质和色谱支持物之间的静电排斥的发生。因此借助于CBD具有的对PEG和胆碱的双亲和力，这种亲和力似乎是融合蛋白生物物理特性的主要标准，它可以阐明在系统是否存在胆碱情况下目的融合物的定位。尽管通常来说，PEG/磷酸盐和PEG/葡聚糖系统似乎优选地适用于通过CBD对LYTAG的亲和力分配融合物，至于究竟选择哪种方案还是要视每个例子的具体特性(总电荷性、分子大小和疏水性)。这个意义上讲，本发明非常灵活，因为可以调整不同的参数来使系统适应于每一个具体融合蛋白和提高产率，如离子力，温度，pH，使用洗涤剂......(Johansson，H.W.a.G.，ed.Aqueous Two-Phase Systems.Methods in Enzymology.Vol.228.1994)。此外，本发明设想还可以用有潜力的替代双相系统，如上所述例如PEG/柠檬酸盐，PEG/硫酸盐，PEG/淀粉，......。对低溶解度蛋白质，可以以体积高进行提取，从而稀释样品并最小化蛋白质凝聚和沉淀。最后，本方法能够整合到生物转化的酶促过程中，其中将酶定位于其中一相(用是否添加胆碱来调控)，而产物在相对相中积累，促进纯化并最小化产物对酶抑制的风险。

附图说明

图1.通过亲和分配纯化LYTAG的融合蛋白。

图2：在20℃以远紫外光CD分析pH对LYTAG结构的影响。(A)在pH7.0(实心符号)和pH 5(空心符号)无添加物(圆形)，存在10％PEG(三角形)或存在胆碱140mM记录波长光谱。(B)在无添加物(实心圆)，存在胆碱140mM(方形)和存在10％PEG(空心圆)情况下，pH滴度以及在223纳米处的CD信号。

图3.在无添加物(o)，存在10％PEG(●)以及存在胆碱150mM(x)情况下，LYTAG的热稳定性以及圆二色图谱。

图4.双水相和亲和层析的纯化系统比较图。

图5.在双相系统PEG/葡聚糖(左管)和PEG/磷酸盐(右管)中分配GFP-LYTAG蛋白，分别用WashD+胆碱和WashP+胆碱缓冲液洗脱，(A)为洗脱前(B)为洗脱后。C)对来自PEG/磷酸盐纯化的级分进行SDS-PAGE分析。道1，REG-1的粗提物[pALEX2-Ca-GFP]；道2，分子量标签；道3，纯蛋白对照，来自亲和层析；道4，洗脱前的上相，富含PEG；道5，洗脱前的下相，富含磷酸盐；道6，洗脱后的上相，道7，洗脱后的下相。

图6.对来自PEG/葡聚糖纯化的LYTAG蛋白A的级分进行SDS-PAGE分析。(A)道1，分子量标签；道2，REG-1粗提物[pX]；道3，洗涤前上相，富含PEG；道4，洗涤前下相，富含葡聚糖；道5，第一次洗涤后的上相；道6，第一次洗涤后的下相；道7，第二次洗涤后的上相；道8，第二次洗涤后的下相。(B)，道1，分子量标签，道2，第一次洗脱后的上相；道3，第一次洗脱后的下相；道4，第二次洗脱后的上相；道5，第二次洗脱后的下相。(C)，对来自PEG/磷酸盐纯化的级分进行SDS-PAGE分析。道1，分子量标签；道2，REG-1的粗提物[pX]；道3，洗脱前的上相，富含PEG；道4，洗脱前的下相，富含磷酸盐；道5，洗脱后的上相；道6洗脱后的下相。

图7.对来自PEG/葡聚糖纯化的LYTAG-Lip36的级分进行SDS-PAGE分析。(A)道1，分子量标签；道2，REG-1的粗提物[pALEXb-Lip36]；道3，洗涤前的上相，富含PEG；道4，洗涤前的下相，富含葡聚糖；道5，第一次洗涤后的上相；道6，第一次洗涤后的下相；道7，第二次洗涤后的上相，道8，第二次洗涤后的下相。(B)，道1，分子量标签；道2，第一次洗脱后的上相；道3，第一次洗脱后的下相；道4，第二次洗脱后的上相；道5，第二次洗脱后的下相。

图8.对来自PEG/葡聚糖纯化的LYTAG-β-半乳糖苷酶的级分进行SDS-PAGE分析。道1，分子量标签；道2，REG-1的粗提物[pALEX2c-LacZ]；道3，洗涤前的上相，富含PEG；道4，洗涤前的下相，富含葡聚糖；道5，第一次洗脱后的上相；道6，第一次洗脱后的下相。

本发明实施例

实施例1：纯化LYTAG-GFP融合物

本实施例显示如何纯化荧光蛋白与CBD结构域，即LYTAG的融合物。对于本发明的实现例子，表达该绿色荧光GFP-LYTAG蛋白的融合物是如下进行的：通过培养用从pALEX2-Ca载体(Biomedal)获得的pALEX2-Ca-GFP表达质粒转化的400毫升大肠杆菌(E.coli)REG-1株培养物(Biomedal，

www.biomedal.com)，于37℃孵育所述培养物直到根据Biomedal的LYTAG“试剂盒”的建议，添加水杨酸至培养基来诱导GFP-LYTAG蛋白的表达。离心收集细胞并重悬于20毫升pH 8.0，20mM磷酸钾缓冲液中，在此情况下用PEG/磷酸盐系统进行纯化；或重悬于pH 8.0，20mM Tris-HCl中，在此情况下用PEG/葡聚糖进行纯化。超声波裂解细胞并离心以去除细胞残余物，向每个等份试样添加以重量记所需量的PEG、磷酸钾或葡聚糖用来重建上面提到的ExtP和ExtD缓冲液。在烧杯里温和搅拌溶液(以减少DNA片段以免污染最后的蛋白制备物)，直到两种化合物完全重悬，然后室温12000rpm离心5分钟(对更敏感的蛋白可在4℃离心)。已证实的LYTAG“标签”对PEG的特异性亲和力决定了两测试案例中所产生的融合蛋白聚集在富含PEG的相中(上相)(图5A)。绿色的上相含有GFP-LYTAG蛋白证实是正确折叠并有功能的。富含磷酸盐和葡聚糖的下相保留了大部分细胞蛋白，表明上相中GFP-LYTAG蛋白的纯度已经非常高了(图5C)。在任何情况下，添加胆碱至洗涤缓冲液都会使GFP-LYTAG蛋白洗脱到下相(图5B和5C)。值得注意的是，首先，这些图展示的电泳胶上蛋白移动的不一致是由于高盐浓度和所使用的聚合物引起的。尽管洗脱的蛋白质不是第一次提取的全部蛋白质(图5C，道6)，用过添加含有胆碱的新鲜下相来进行随后的提取，使得回收了系统中存在的大部分GFP-LYTAG融合蛋白(数据未显示)。具体对本蛋白，能够验证PEG/磷酸盐系统的产率(大约5毫克/升培养物)和纯度略微高于PEG/葡聚糖系统。

实施例2：纯化LYTAG-蛋白A融合物

本实施例显示如何通过本发明纯化C-LytA胆碱结合结构域与蛋白A的片段的融合物，蛋白A来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)并能结合免疫球蛋白。为实现这个实施例，遵循与前面实施例对LYTAG-GFP融合物的相同的方法，但是用来自于pALEXb载体(Biomedal)的pALEXb-ProtA质粒转化的REG-1株培养物，应用PEG/葡聚糖(图6A和6B)，PEG/磷酸盐(6C)2个系统中的任意获得良好的纯化结果。同前述例子相同，应用葡聚糖而不是磷酸盐需要增加洗涤步骤的次数(本例为2次)。同样，洗涤后，蛋白LYTAG-蛋白A以相当的纯度保留在PEG相中。类似的，添加含有胆碱的新鲜下相使融合多肽定位于葡聚糖相中，经过数次洗脱步骤后基本上回收了所有的蛋白质。

实施例3：纯化LYTAG-Lip36融合物

和上述几实施例一致，除了使用来自pALEXb载体(Biomedal)的pALEXb-Lip36质粒转化的REG-1株培养物。本实施例只在PEG/葡聚糖系统中有效纯化。图7显示，同样，当使用该聚合物时，就需要洗涤几次。产率波动范围为5-10毫克/升培养物。

实施例4：纯化LYTAG-β-半乳糖苷酶融合物

本实施例采用类似的方法，除了使用来自pALEX2c载体(Biomedal)的pALEX2c-LacZ质粒转化的REG-1株培养物表达的LYTAG-β-半乳糖苷酶融合物，它证实了此双相分配系统能用于纯化类似β-半乳糖苷酶的高分子量蛋白质和寡聚物。在此情况下，有可能，即融合的另一部分的生物物理性质对LYTAG而言强过胆碱结合模块，因而蛋白倾向于位于其中一相。在这个意义上，可以检查可能由于融合蛋白分子量较大遗留在相间隙。尽管如此，正如图8所示，PEG/葡聚糖系统能够纯化杂合蛋白质到可接受的纯度。这样纯化的蛋白质保留了对合成底物o-123456邻硝基苯基半乳糖苷(ONPG)的活性(数据未显示)，表明其如实施例1描述的GFP-LYTAG融合物一样，结构稳定折叠充分。

实施例5：纯化分泌到培养基中的LYTAG融合蛋白

本实施例中，本发明用于纯化无论在细菌，酵母菌和其他微生物分泌到培养基中的重组蛋白。毕赤酵母(Pichia pastoris)具有有效的分泌机制，利用此优势通过例如使用pPIC9载体(Pichia ExpressionKit，Invitrogen)生产融合至引导肽的目标蛋白，而此引导肽能够指导蛋白转运到细胞外培养基。如果此蛋白再和胆碱结合结构域LYTAG融合，如用pPIC9-CLYT载体(Caubin，J.，et al.，Choline-bindingdomain as a novel affinity tag for purification of fusionproteins produced in Pichia pastoris.Biotechnol Bioeng，2001.74(2)：p.164-71)，就能够用所述的双水相系统之一从细胞外培养基进行纯化。为此，用来自pPIC9-CLYT质粒的构建体转化毕赤酵母GS115株，并表达LYTAG和目的蛋白的可分泌融合物，酵母株在30℃，BMGY缓冲培养液中进行培养，直到其DO₆₀₀达到2-6，此时通过改变碳源将1％甘油(BMGY培养基)换成0.5％甲醇(BMMY培养基)诱导LYTAG的融合物的表达。诱导15-24小时后，离心培养物病收获上清液。其中含有分泌的LYTAG融合蛋白可直接用到前面实施例中提到的纯化系统之一，进行目的蛋白的纯化。

同样，纯化培养基中的融合胆碱结合结构域的蛋白也可以来自于大肠杆菌的细菌培养物，所述大肠杆菌表达与先导肽融合的融合物LYTAG-蛋白或蛋白-LYTAG的融合物，所述先导肽转运融合物至周质空间或细胞外培养基。

实施例6：通过应用LYTAG-蛋白A在双相中纯化抗体

蛋白A对免疫球蛋白有亲和力，此特性可用于通过实施例2所述的双相系统来纯化抗体。本实施例中，将双相组分溶解于1毫升含有经纯化并在pH 8.0的20mM磷酸盐缓冲液(在此情况下应用PEG/葡聚糖系统)中透析的LYTAG-蛋白A(5-10毫克/毫升)的混合物，以及19毫升表达目的抗体的杂交瘤培养物的上清液。上清液必须在pH8.0的20mM磷酸盐缓冲液(在此情况下应用PEG/磷酸盐系统)或pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液(在此情况下应用PEG/葡聚糖系统)中透析。一旦两种组分溶解，就按前面的实施例所述条件进行分离，洗涤和洗脱，最后在下相得到高度纯化的蛋白A-抗体复合物。另外，也可以通过最后一步调整有利于融合物LYTAG-蛋白A分离的pH条件和离子浓度回收纯化的抗体，融合物LYTAG-蛋白A留在富含PEG的相中，并且能够重复使用。

Claims (21)

1.用于分配或分离含有对胆碱具有亲和力的多肽序列的融合蛋白的方法，其特征在于：

a)细胞培养物或细胞提取物，其表达含有对胆碱具有亲和力的序列的融合多肽，该序列包含至少一个胆碱结合结构基序(CBR或“胆碱结合重复”；代码Pfam PF01473)，并且其优选地来自一个肺炎链球菌的酰胺酶LytA的C末端结构域；

b)含有水中的超过5％的聚乙二醇(PEG)以及盐或可溶性聚合物的提取物或培养物的混合物，导致该混合物自发分离成双水相；

c)含有对胆碱具有亲和力的序列的融合多肽优先地富集于具有较高聚乙二醇浓度的相。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于通过添加胆碱使融合蛋白富集到与高PEG浓度相不同的相中。

3.根据权利要求1和2的方法，其特征在于二元系统中总PEG浓度为3-15％。

4.根据权利要求1-3的方法，其特征在于二元系统的第二组分包含磷酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐或这三种盐的混合物。

5.根据权利要求1-3的方法，其特征在于二元系统的第二组分含有磷酸钾，其浓度为5-15％，并且混合物的pH值为6.0-9.0。

6.根据权利要求1-3的方法，其特征在于二元系统的第二组分含有葡聚糖或衍生物，其浓度为5-10％，并且混合物的pH值为6.0-9.0。

7.根据权利要求1-3的方法，其特征在于二元系统的第二组分含有淀粉或衍生物，其浓度为5-10％，并且混合物的pH值为6.0-9.0。

8.根据权利要求1-7的方法，其特征在于二元系统从下列开始形成：表达根据权利要求1的含有对胆碱具有亲和力的多肽序列的融合蛋白的细胞提取物或培养基，向其中添加以上权利要求所述组分。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于细胞提取物或培养基来自杂交瘤、霉菌、酵母和细菌的培养物。

10.根据权利要求9的方法，其特征在于含有对胆碱具有亲和力的肽的融合蛋白优先地聚集于所得双相系统的富含PEG的相中。

11.根据权利要求10的方法，其特征在于来自细胞提取物或培养基的、未聚集于富含PEG的相中的蛋白质能够通过弃去富含PEG的相的对立相而被去除。

12.根据权利要求11的方法，其特征在于随后添加在组成和体积方面与弃去物等价的溶液，随后混合并分离成双相，以及根据前一项权利要求重新去除污染性蛋白质，可以重复此过程直到足量消除。

13.根据权利要求10、11和12的方法，其特征在将含有目的蛋白质的富含PEG的相直接用于获得纯化形式的、含有胆碱结合结构域的目的多肽或蛋白质。

14.根据权利要求10、11和12的方法，其特征在于将含有目的蛋白的富含PEG的相用于任何类型的酶反应器，所述酶反应器具有在水相中催化目的反应的功能，从而能够在不同于具有较高PEG浓度的相的相中回收产物。

15.根据权利要求12的方法，其特征在于洗涤后，添加浓度高于50mM的胆碱的新鲜溶液，从而导致将显著部分的含有对胆碱具有亲和力的肽的融合蛋白置换至不富含PEG的相。

16.根据权利要求15的方法，其特征在于将含有目的蛋白的富含PEG的相用于任何类型的酶反应器，所述酶反应器具有在水相中催化目的反应的功能，从而能够通过添加高于50mM的胆碱来回收存留在不富含PEG的相中的生物催化剂。

17.根据权利要求15的方法，其特征在于将含有目的蛋白的不富含PEG的相直接用于获得纯化形式的该蛋白质。

18.根据权利要求15的方法，其特征在于将含有目的蛋白的不富含PEG的相取出以为了其使用，并在系统中替换成一定量的优选地在组成和体积方面与取出物类似的溶液，其后混合并分离成双相，可以重复该过程直到从富含PEG的相中足量洗脱出目的蛋白。

19.用于进行根据权利要求1-18中一些的蛋白质纯化方法的产品，其包括以下组分中的至少一些：

a.-盐浓度高于5％的溶液

b.-PEG浓度高于5％的溶液

c.-浓度高于50mM的胆碱浓缩溶液。

20.根据权利要求1-18的方法的用途，其用于分离和纯化蛋白质、多肽或任何蛋白质性质的衍生物。

21.权利要求1-16的方法以及权利要求的产品的用途，其用于分离由与任何胆碱结合结构域相融合的酶介导的生化反应的产物。

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