CN101827606A - Rna疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含编码变应原或其衍生物的RNA分子的RNA疫苗及其用途。

Description

RNA疫苗
技术领域
本发明涉及RNA疫苗。
背景技术
在过去几十年中，I型过敏性疾病成为西方工业化国家的主要公共健康问题，至今已有约25％的人口受到影响。
除了家庭倾向之外，成长条件(包括早期儿童期的感染)和饮食习惯，还有环境因素例如被动吸烟或暴露于空气污染，均被证明与特异反应性(atopic)疾病发展的重大相关性。
特异性免疫治疗，即多年进行剂量渐增的变应原的注射，是现在唯一可获得的治疗性干预。但是，由于高剂量给药，所以存在明显的导致过敏的副作用，并且使用粗制的、几乎没有鉴定的变应原提取物存在病人针对以前未识别的成分而致敏的可能性。
此外，没有针对I型过敏症的预防性疫苗，虽然预防具有增加的遗传风险的年幼儿童发展过敏性疾病可能是最可行的方法。训练原态免疫系统比平衡已经出现的过敏性免疫表型较容易实现。
在Ying等人(Nature Med(1999)5：823-827)中公开了自我复制的RNA疫苗，其RNA编码β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶经常被用作研究免疫过程的模式分子。在Ying等人中，研究了抗肿瘤反应并且观察到了CD8阳性细胞的诱导。但是，在Ying等人中未研究的CD4阳性细胞，而不是CD8阳性细胞，调节针对过敏症的免疫保护并且防止B细胞中朝向IgE的种类转换。
最近，基于核酸的疫苗已经成为有前景的方法，以偏向过敏性疾病的免疫机理。已经在很多动物研究中表明，DNA疫苗可以防止I型过敏性反应的诱导，甚至可以逆转已经建立的过敏性TH2免疫状态(Weiss，R.等人(2006)Int Arch AllergyImmunol 139：332-345)。
但是，引起了基于DNA的疫苗的安全性的一般考虑：引入的DNA分子可以潜在地整合入宿主基因组，或者，由于其分布在各种组织，可以引起变应原的持续递送，因此在具有预先存在变应原特异性IgE分子的病人中诱导不可控制的过敏性反应。而且，对任何抗过敏症疫苗来说，健康儿童的疫苗接种需要最高的安全标准。
因此本发明的目标是提供克服DNA疫苗缺点的变应原疫苗，并且仍然允许过敏症的有效治疗或成功预防针对变应原的致敏。
发明内容
因此本发明涉及RNA疫苗，其包含至少一个编码至少一个变应原或其衍生物的RNA分子，其中所述的变应原是下列的变应原：赤杨(Alnus glutinosa)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、豚草(Ambrosia artemisiifolia)、芹菜(Apiumgraveolens)、花生(Arachis hypogaea)、疣枝桦(Betula verrucosa)、欧洲鹅耳枥(Carpinus betulus)、欧洲栗(Castanea sativa)、多主枝孢霉(Cladosporiumherbarum)、欧洲榛(Corylus avellana)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、胡萝卜(Daucus carota)、欧洲室尘蟎(Dermatophagoidespteronyssinus)、欧洲山毛榉(Fagus sylvatica)、家猫(Felis domesticus)、巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)、美国雪松(Juniperus ashei)、苹果(Malus domestica)、白栎(Quercus alba)和猫尾草(Phleum pratense)。
结果发现编码变应原或其衍生物的RNA分子还可以有效用作RNA疫苗。RNA疫苗表现出属于DNA疫苗的治疗过敏性疾病方面的性质：它们以最纯的形式提供变应原，即遗传信息，并且与DNA疫苗类似，它们诱导偏向TH1的免疫反应。而且，对于DNA疫苗开发的用于产生低变应原的基因产物的方法，也可应用于RNA疫苗。
此外，RNA疫苗具有相对于DNA疫苗的显著的优点：(i)疫苗含有变应原的纯的遗传信息但没有通常存在于用于DNA疫苗的质粒骨架中的附加的外源序列，例如病毒启动子、抗生素抗性基因或病毒/细菌调节序列。(ii)RNA不能整合入宿主基因组，因此去除了恶性风险。(iii)RNA在细胞的细胞质中被翻译，因此不需要细胞核的转录机制，这使得RNA疫苗不依赖于转运入细胞核和转运出细胞核，以及不依赖于核的阶段。(iv)由于RNA的迅速降解，外源转基因的表达寿命短，这避免了不可控制的长期抗原表达。
本发明的RNA疫苗可以包含一个以上的编码变应原的RNA分子，优选为两个、三个、五个、十个等。但是，一个RNA分子也可以编码至少一个变应原，意思是一个RNA分子包含编码至少一个、两个、三个、五个、十个等不同或相同的变应原的核苷酸序列。一个或多个RNA分子所编码的变应原可以选自下面所列的任意组合。
本文所用的术语“RNA疫苗”是指包含如本文所定义的RNA分子的疫苗。但是，所述疫苗当然可以包含其它的物质和分子，当给予个体所述疫苗时，所述物质和分子是必需的或有利的(例如药学赋形剂)。
术语“某某的变应原”和术语“源自某某的变应原”以及“从某某获得的变应原”可以相互替换地使用。其意思是该变应原天然表达于所述生物中，并且编码所述变应原的DNA/RNA被分离从而产生本发明的RNA分子。
结果发现，当给予哺乳动物或人类时，不是所有的编码变应原的RNA分子都能诱导变应原特异性抗体的形成。例如，编码艾蒿(Artemisia vulgaris)变应原Artv1和油橄揽(Olea europea)变应原Ole e 1的RNA分子不能诱导Th1记忆并抑制变应原特异性IgE反应。但是，编码上述来源的变应原的RNA分子能够做到。
根据本发明的优选具体实施方式，赤杨的变应原是Aln g 1，烟草赤星病菌的变应原选自Alt a 1、Alt a 3、Alt a 4、Alt a 5、Alt a 6、Alt a 7、Alt a 8、Alt a 10、Alt a 12或Alt a 13，豚草的变应原选自Amb a 1、Amb a 2、Amb a 3、Amb a 5、Amb a 6、Amb a 7、Amb a 8、Amb a 9或Amb a 10，芹菜的变应原选自Api g 1、Api g 4或Api g 5，花生的变应原选自Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 4、Ara h 5、Ara h 6、Ara h 7或Ara h 8，疣枝桦的变应原选自Bet v 1、Bet v 2、Bet v 3、Bet v4、Betv 6或Betv 7，欧洲鹅耳枥的变应原是Carb 1，欧洲栗的变应原选自Cas s 1、Cas s 5或Cas s 8，多主枝孢霉的变应原选自Cla h 2、Cla h 5、Cla h 6、Cla h 7、Cla h 8、Cla h 9、Cla h 10或Cla h 12，欧洲榛的变应原选自Cor a 1、Cor a 2、Cora 8、Cor a 9、Cor a 10或Cor a 11，日本柳杉的变应原选自Cryj 1或Cryj 2，鲤鱼的变应原是Cyp c 1，胡萝卜的变应原选自Dau c 1或Dau c 4，欧洲室尘蟎的变应原选自Derp 1、Derp 2、Derp 3、Derp 4、Derp 5、Derp 6、Derp 7、Derp 8、Derp 9、Derp 10、Derp 11、Derp 14、Derp 20、Derp 21或克隆30变应原，欧洲山毛榉的变应原是Fag s 1，家猫的变应原选自Fel d 1、Fel d 2、Fel d 3、Fel d 4、Fel d 5w、Fel d 6w或Fel d 7w，巴西橡胶树的变应原选自Hev b 1、Hev b 2、Hev b3、Hev b 4、Hev b 5、Hev b 6.01、Hev b 6.02、Hev b 6.03、Hev b 7.01、Hev b 7.02、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10、Hev b 11、Hev b 12或Hev b 13，美国雪松的变应原选自Jun a 1、Jun a 2或Jun a 3，苹果的变应原选自Mal d 1、Mal d 2、Mal d 3或Mal d 4，白栎的变应原是Que a 1，猫尾草的变应原选自Phl p 1、Phl p 2、Phl p 4、Phl p 5、Phl p 6、Phl p 7、Phl p 11、Phl p 12或Phl p 13。
根据本发明的优选具体实施方式，变应原选自：
草花粉：              Phl p 1，Phl p 2，Phl p 5，Phl p 6，Phl p 7，Phl p 12
房屋尘螨：            Der p 1，Der p 2，Der p 7，Der p 21，克隆30变应原(PCT-
                      申请AT2007/000201，奥地利专利申请AT 503530：
                      MKFNIIIVFI SLAILVHSSY AANDNDDDPT
                      TTVHPTTTEQ PDDKFECPSR FGYFADPKDP
                      HKFYICSNWE AVHKDCPGNT RWNEDEETCT，
                      SEQ ID No.1)
桦树花粉：            Bet v 1及其同源的树木(Aln g 1，Cor a 1，Fag s 1)或
                      食物变应原)Mal d 1，Api g 1，Pru p 1)
猫：                  Fel d 1，Fel d 2
野草(豚草属，艾属)：  Amb a 1
柏科/杜松属/雪松：    Cryj 1，Cryj 2，Jun a 1，Jun a 3，
                      Cha o 1，Cha o 2，Cup a 1，Cup a 3，Jun a 1，Jun a 3，Pla a
                      3
花生：     Ara h 1，Ara h 2，Ara h 4
榛实：     Cora 8，Cor a 9
鱼/虾：    Gad c 1，Cyp c 1，Pen a 1
用于本发明的RNA疫苗中的特别优选的变应原选自Aln g 1、Alt a 1、Amb a 1、Api g 1、Ara h 2、Bet v 1、β-酪蛋白、Car b 1、Cas s 1、Cla h 8、Cor a 1、Cryj 1、Cyp c 1、Dau c 1、Der p 2、Fag s 1、Fel d 1、Hev b 6、Jun a 1、Mal d 1、卵清蛋白(OVA)、Phl p 1、Phl p 2、Phl p 5、Phl p 6或Phl p 7。
结果发现，上面列举的变应原特别适合用于RNA疫苗。但是当然也可能将本发明用于其它的变应原，例如Amb a 1、Amb a 2、Amb a 3、Amb a 5、Amb a 6、Amb a 7、Amb a 8、Amb a 9、Amb a 10、Amb t 5、Hel a 1、Hel a 2、Hel a 3、Mera 1、Che a 1、Che a 2、Che a 3、Sal k 1、Cat r 1、Pla l 1、Hum j 1、Parj 1、Parj 2、Parj 3、Par o 1、Cyn d 1、Cyn d 7、Cyn d 12、Cyn d 15、Cyn d 22w、Cyn d 23、Cyn d 24、Dac g 1、Dac g 2、Dac g 3、Dac g 5、Fes p 4w、Hol l 1、Lol p 1、Lol p2、Lol p 3、Lol p 5、Lol p 11、Pha a 1、Phl p 1、Phl p 2、Phl p 4、Phl p 5、Phl p 6、Phl p 11、Phl p 12、Phl p 13、Poa p 1、Poa p 5、Sor h 1、Pho d 2、Aln g 1、Bet v 1、Bet v 2、Bet v 3、Bet v 4、Bet v 6、Bet v 7、Car b 1、Cas s l、Cas s 5、Cas s 8、Cor a l、Cor a 2、Cor a 8、Cor a 9、Cor a 10、Cor a 11、Que a 1、Fra e 1、Lig v 1、Syr v 1、Cry j 1、Cryj 2、Cup a 1、Cup s 1、Cup s 3w、Jun a 1、Jun a 2、Jun a 3、Jun o 4、Jun s 1、Jun v 1、Pla a 1、Pla a 2、Pla a 3、Aca s 13、Blo t 1、Blo t 3、Blot 4、Blo t 5、Blo t 6、Blo t 10、Blo t 11、Blo t 12、Blo t 13、Blo t 19、Der f 1、Derf2、Der f3、Der f 7、Der f 10、Der f 11、Der f 14、Der f 15、Der f 16、Der f 17、Der f 18w、Der m 1、Der p 1、Der p 2、Der p 3、Der p 4、Der p 5、Der p 6、Der p7、Der p 8、Der p 9、Der p 10、Der p 11、Der p 14、Der p 20、Der p 21、Eur m 2、Eur m 14、Gly d 2，Lep d 1、Lep d 2、Lep d 5、Lep d 7、Lep d 10、Lep d 13、Tyr p 2、Tyr p 13、Bos d 2、Bos d 3、Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 7、Bos d 8、Can f 1、Can f2、Can f3、Can f4、Equ c 1、Equ c 2、Equ c 3、Equ c 4、Equ c 5、Fel d 1、Fel d 2、Fel d 3、Fel d 4、Fel d 5w、Fel d 6w、Fel d 7w、Cav p 1、Cav p 2、Mus m1、Rat n 1、Alt a 1、Alt a 3、Alt a 4、Alt a 5、Alt a 6、Alt a 7、Alt a 8、Alt a 10、Alt a 12、Alt a 13、Cla h 2、Cla h 5、Cla h 6、Cla h 7、Cla h 8、Cla h 9、Cla h 10、Cla h 12、Asp fl 13、Asp f 1、Asp f2、Asp f3、Asp f4、Asp f5、Asp f6、Asp f7、Asp f8、Asp f9、Asp f 10、Asp f 11、Asp f 12、Asp f 13、Asp f 15、Asp f 16、Aspf 17、Asp f 18、Asp f22w、Asp f23、Asp f27、Asp f28、Asp f29、Asp n 14、Aspn 18、Asp n 25、Asp o 13、Asp o 21、Pen b 13、Pen b 26、Pen ch 13、Pen ch 18、Pen ch 20、Pen c 3、Pen c 13、Pen c 19、Pen c 22w、Pen c 24、Pen o 18、Fus c 1、Fus c 2、Tri r 2、Tri r 4、Tri t 1、Tri t 4、Cand a 1、Cand a 3、Cand b 2、Psi c 1、Psi c 2、Cop c 1、Cop c 2、Cop c 3、Cop c 5、Cop c 7、Rho m 1、Rho m 2、Mala f2、Mala f 3、Mala f 4、Mala s 1、Mala s 5、Mala s 6、Mala s 7、Mala s 8、Mala s 9、Mala s 10、Mala s 11、Mala s 12、Mala s 13、Epi p 1、Aed a 1、Aed a 2、Api m 1、Api m 2、Api m 4、Api m 6、Api m 7、Bom p 1，Bom p 4、Bla g 1、Bla g 2、Bla g 4、Bla g 5、Bla g 6、Bla g 7、Bla g 8、Per a 1、Per a 3、Per a 6、Per a 7、Chi k 10、Chi t 1-9、Chi t 1.01、Chi t 1.02、Chi t 2.0101、Chi t 2.0102、Chi t 3、Chi t 4、Chi t5、Chit 6.01、Chi t 6.02、Chi t 7、Chi t 8、Chi t 9、Cte f 1、Cte f2、Cte f3、Tha p1、Lep s 1、Dol m 1、Dol m 2、Dol m 5、Dol a 5、Pol a 1、Pol a 2、Pol a 5、Pol d1、Pol d 4、Pol d 5、Pol e 1、Pol e 5、Pol f5、Pol g 5、Pol m 5、Vesp c 1、Vesp c 5、Vesp m 1、Vesp m 5、Ves f5、Ves g 5、Ves m 1、Ves m 2、Ves m 5、Ves p 5、Ves s5、Ves vi 5、Ves v 1、Ves v 2、Ves v 5、Myr p 1、Myr p 2、Sol g 2、Sol g 4、Soli2、Sol i 3、Sol i 4、Sol s 2、Tria p 1、Gad c 1、Sal s 1、Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 7、Bos d 8、Gal d 1、Gal d 2、Gal d 3、Gal d 4、Gal d 5、Met e 1、Pen a 1、Pen i 1、Pen m 1、Pen m 2、Tod p 1、Hel as 1、Hal m 1、Ran e 1、Ran e 2、Bra j 1、Bra n 1、Bra o 3、Bra r 1、Bra r 2、Hor v 15、Hor v 16、Hor v 17、Hor v 21、Sec c20、Tri a 18、Tri a 19、Tri a 25、Tri a 26、Zea m 14、Zea m 25、Ory s 1、Api g 1、Api g 4、Api g 5、Dau c 1、Dau c 4、Cor a 1.04、Cor a 2、Cor a 8、Fra a 3、Fra a 4、Mal d 1、Mal d 2、Mal d 3、Mal d 4、Pyr c 1、Pyr c 4、Pyr c 5、Pers a 1、Pru ar 1、Pru ar 3、Pru av 1、Pru av 2、Pru av 3、Pru av 4、Pru d 3、Pru du 4、Pru p 3、Pru p4、Aspa o 1、Cro s 1、Cro s 2、Lac s 1、Vit v 1、Mus xp 1、Ana c 1、Ana c 2、Citl 3、Cit s 1、Cit s 2、Cit s 3、Lit c 1、Sin a 1、Gly m 1、Gly m 2、Gly m 3、Gly m4、Vig r 1、Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 4、Ara h 5、Ara h 6、Ara h 7、Ara h8、Len c 1、Len c 2、Pis s 1、Pis s 2、Act c 1、Act c 2、Cap a 1w、Cap a 2、Lyc e1、Lyc e 2、Lyc e 3、Sola t 1、Sola t 2、Sola t 3、Sola t 4、Ber e 1、Ber e 2、Jug n1、Jug n 2、Jug r 1、Jug r 2、Jug r 3、Ana o 1、Ana o 2、Ana o 3、Ric c 1、Ses i 1、Ses i 2、Ses i 3、Ses i 4、Ses i 5、Ses i 6、Cuc m 1、Cuc m 2、Cuc m 3、Ziz m 1、Ani s 1、Ani s 2、Ani s 3、Ani s 4、Arg r、Asc s 1、Car p 1、Den n 1、Hev b 1、Hev b 2、Hev b 3、Hev b 4、Hev b 5、Hev b 6.01、Hev b 6.02、Hev b 6.03、Hev b 7.01、Hev b 7.02、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10、Hev b 11、Hev b 12、Hev b 13、Hom s 1、Hom s 2、Hom s 3、Hom s 4、Hom s 5或Trip s 1。
根据本发明的优选具体实施方式，变应原衍生物是低变应原的。
为了在哺乳动物特别是在人中诱导特异性免疫反应，而不激发变应原性反应或激发显著减少的变应原性反应，优选为变应原或其衍生物表现出低变应原性的性质，即低变应原性分子不表现IgE反应性或表现出显著减少的IgE反应性。
本文所用的术语“低变应原的”是指：当给予个体时，源自具有变应原性性质的变应原的肽、多肽或蛋白的诱导对所述变应原特异性的T细胞的诱导并且表现出减少的或不表现出过敏性反应的能力。变应原的“低变应原性”衍生物诱导个体中过敏性反应的降低的或缺失的能力是通过从所述变应原除去或破坏IgE结合抗原决定簇，但是，保存所述变应原上存在的T细胞抗原决定簇而获得的。这可以通过例如将变应原剪接成具有降低的IgE结合能力或无IgE结合能力的片段并且可选地将所述片段中的一些或全部所述片段以不同于野生型变应原中片段顺序的顺序进行融合而达到(参见例如EP 1 440 979)。从变应原产生“低变应原性”分子的另一个方法包括将野生型变应原的C和/或N末端删除(参见例如EP 1 224215)。当然，也可以通过引入影响野生型变应原中的一个或多个氨基酸残基的特异性突变而产生低变应原性分子，其中所述修饰产生三维结构的丧失。
通过将产生的蛋白靶向细胞的泛素化途径而赋予RNA疫苗低变应原性，其中各个蛋白被降解为低变应原性的肽。这通过将编码泛素的序列融合至编码变应原的RNA的5’末端而实现。可以通过将76位的氨基酸残基从甘氨酸突变为丙氨酸(G76-＞A76)而增强泛素化的效率。可以通过将变应原的第一个氨基酸(蛋氨酸)突变为不稳定氨基酸(精氨酸)(M77-＞R77)而进一步增强泛素化的效率。或者，可以通过加入羧基末端不稳定序列(称为PEST序列)而实现所得到的基因产物的泛素化。
根据本发明的优选具体实施方式，疫苗中RNA所编码的低变应原性变应原衍生物表现出比野生型变应原的IgE反应活性低至少10％，优选低至少20％，更优选低至少30％，特别是低至少50％的IgE反应活性。
RNA疫苗的低变应原性可通过在体外在兔网织红细胞裂解液系统中翻译RNA而常规地检测。将使用合适的病人的血清库(pool)通过IgE western印迹分析所得到的基因产物。与所述网织红细胞裂解液系统中翻译的野生型分子的IgE结合能力相比较，从而评价各个低变应原的IgE结合能力的降低。
根据本发明的特别优选的具体实施方式，本发明的RNA分子可以编码一个以上，优选两个以上，更优选三个以上，再更优选四个以上的变应原或其衍生物。特别地，RNA分子可以编码Phl p 1、Phl p 2、Phl p 5和Phl p6，或编码Aln g 1、Cor a 1、Que a 1、Car b 1和Bet v 1。
将编码变应原或其衍生物的RNA分子融合至至少进一个肽、多肽或蛋白。
编码变应原的RNA序列可以融合至编码肽、多肽或蛋白的RNA序列。这些肽可以是将变应原靶向内质网从而增强蛋白从细胞的分泌的信号肽，例如人类组织血浆酶原激活剂信号肽(hTPA)。所述肽或蛋白可以是与溶酶体结合的膜蛋白(LAMP)或溶酶体内在膜蛋白-II(LIMP-II)的20个氨基酸的C末端尾巴。LAMP/LIMP-II序列用于将抗原蛋白指引到转染的专职抗原呈递细胞(APC)的主要组织相容性II类(MHC II)的小泡室，从而增强T辅助细胞的激活，T辅助细胞增加疫苗功效。所述蛋白或多肽还可以是增强疫苗的TH1偏向的蛋白，例如热激蛋白70(HSP70)，或细菌毒素例如霍乱毒素(CT)或相关毒素例如大肠杆菌(Escherichia coli)的不耐热肠毒素。
根据本发明的优选具体实施方式，RNA分子包含至少进一个元件，选自复制酶、β-球蛋白引导序列、cap0、cap1或polyA尾。
RNA疫苗由编码各个变应原的RNA序列组成。该RNA序列可以是变应原的野生型序列或可以根据其密码子使用而改编。密码子使用的改编可以增加翻译效率和RNA的半衰期。由至少30个腺苷残基组成的poly A尾附加至RNA的3’末端以增加RNA的半衰期。给RNA的5’末端加上具有m7G(5’)ppp(5’)N结构(cap 0结构)的修饰的核糖核苷酸或其衍生物的帽子，这可以在RNA合成过程中引入或者可以在RNA转录之后通过使用牛痘病毒加帽酶(VCE，由mRNA三磷酸酶、鸟苷酰转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶组成)而以酶学方法进行工程化，所述加帽酶催化N7-单甲基化cap 0结构的构建。cap 0结构在保持RNA疫苗的稳定性和翻译效率中发挥重要作用。RNA疫苗的5’帽子可以进一步被2’-O-甲基转移酶修饰，这产生cap 1结构(m7Gppp[m2′-O]N)，其进一步增加翻译效率。
RNA疫苗可以通过将其转化成自我复制的疫苗而进一步优化。这样的载体包括源自甲病毒的复制元件并以目标基因取代病毒结构蛋白。已经证明：由于源自病毒的危险信号调控的免疫激活，基于复制酶的RNA疫苗在极低的剂量诱导抗体以及细胞毒反应(Ying，H.等人(1999)Nat Med 5：823-827)。
RNA疫苗也可以是自我复制的RNA疫苗。自我复制的RNA疫苗由复制酶RNA分子组成，所述RNA分子源自塞姆利基森林病毒(SFV)、辛德毕斯病毒(SIN)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、罗斯河病毒(RRV)或其它属于甲病毒家族的病毒。复制酶的下游具有控制变应原RNA复制的亚基因组启动子，接着是由至少30个腺苷残基组成的人工poly A尾。
根据本发明的另一个优选具体实施方式，疫苗还包含CpG-DNA和细胞因子，优选为白细胞介素(IL)-12和IL-15。
本发明的疫苗或疫苗制剂还可以包含佐剂。根据本发明，“佐剂”是指增强对抗原的免疫反应的化合物或混合物。佐剂还可能作为组织库来缓慢释放抗原。佐剂包括完全弗氏佐剂，不完全弗氏佐剂，皂角苷，矿物凝胶例如氢氧化铝，表面活性物质例如溶血卵磷脂，复合多元醇，聚阴离子，肽，左咪唑(Levamisol)，CpG-DNA，油或烃乳剂，和潜在有用的佐剂例如BCG(卡介苗)和短棒菌苗。
或者，或另外，还可以提供免疫刺激蛋白作为佐剂或增强对疫苗的免疫反应。可以通过与疫苗特别是载体疫苗共同给予免疫刺激分子例如免疫刺激、免疫增强或促炎性细胞因子，淋巴因子，或趋化因子而增强疫苗接种的有效性(Salgaller andLodge，J.Surg.Oncol.(1988)68：122)。例如，可以使用细胞因子或细胞因子基因例如IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、IL-10、TGF-β、粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF)和其它的集落刺激因子、巨噬细胞炎性因子、Flt3配体(Lyman，Curr.Opin.Hematol.，1998，5：192)、CD40配体以及一些主要的共刺激分子或其基因(例如B7.1、B7.2)。这些免疫刺激分子可以作为蛋白全身或局部递送，或可以由本发明的RNA疫苗中的RNA分子或另外的RNA分子编码。作为免疫刺激分子还可以应用聚阳离子肽例如聚精氨酸。
根据本发明的另一个优选的具体实施方式，疫苗适合于肌内、皮内、静脉内、经皮、局部或生物导弹(biolistic)给药。
本发明的RNA疫苗可以以各种途径给药。例如，一种途径是在体内直接将RNA疫苗转移至机体(例如，肌内、皮内、静脉内、鼻内等)。或者，还可以将RNA放置入机体外的细胞(例如表皮细胞)里，例如在体外以RNA疫苗转染表皮细胞，然后给药(移植)入机体。当RNA被引入细胞内时，可以通过外源或异源RNA转染细胞。可以通过脉冲将RNA引入细胞，即以本发明的RNA分子孵育细胞。或者，可以在体内通过脂质体转染作为裸露RNA或与其它转染促进试剂(肽、聚合物等)一起而将RNA引入。可以使用合成的阳离子脂类来制备用于体内转染的脂质体。有用的用于转移核酸的脂类化合物和组合物为，例如DODC、DOPE、CHOL、DMEDA、DDAB、DODAC、DOTAP和DOTMA。其它分子对于促进体内核酸转染也是有用的，例如阳离子寡肽(例如WO 95/21931)、源自DNA结合蛋白的肽(例如WO 96/25508)或阳离子聚合物(例如WO 95/21931)。还可以使用聚乙烯亚胺及其衍生物，聚交酯-聚乙醇酸交酯和壳聚糖。或者，可以通过本领域已知的方法将RNA分子引入所需要的宿主细胞内，例如电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀，或使用基因枪(生物导弹转染)，参见例如Tang等人，Nature(1992)356：152-154)。
本发明的另一个方面涉及本文所述的至少一个RNA分子在制备用于治疗或预防过敏症的疫苗中的用途。
本发明的另外一个方面涉及本文所述的至少一个RNA分子在制备用于使个体对变应原弱敏化的疫苗中的用途。
根据本发明的另一个优选的具体实施方式，疫苗适合于肌内、皮内、静脉内、经皮、局部或生物导弹给药。
本发明的另一个方面涉及分离的RNA分子，其包含编码至少一个变应原或其衍生物的至少一个核苷酸序列。所述RNA分子优选包含至少一个选自cap0、cap1、5’-β球蛋白引导序列、自我复制型RNA、重新编码变应原序列或人工poly-A尾的核苷酸序列，其中Cap0-变应原序列-poly A尾是特别优选的RNA分子。Cap0对于体内产生抗体和关于自我复制型RNA疫苗的诱导变应原特异性T细胞和IFN-γ分泌是有用的。
本发明由以下附图和实施例进一步说明，但不是限制于此。
附图说明
图1显示了以编码β-半乳糖苷酶的RNA(βGal-RNA)或自我复制型RNA(βGal-repRNA)转录本体外转染BHK-21细胞。测试了具有(帽子)或不具有(无帽子)添加m7G(5′)ppp(5′)G帽子结构的RNA转录本。未转染的细胞作为背景对照(未转染)。数据显示为平均数±三次独立转染实验的SEM。
图2显示了以核酸疫苗接种(A)然后以明矾中的重组变应原致敏后(B)的Ph1p 5特异性的IgG1和IgG2a水平。血清以1∶1000(A)和1∶100000(B)稀释。柱顶端的数字代表各个组的平均IgG1∶IgG2a比例。数据以平均数±SEM(n＝4)表示。
图3显示通过RBL释放检验测定的Ph1p 5特异性IgE。以各个核酸疫苗接种后(灰色条柱)和接下来以明矾中的重组变应原致敏后(黑色条柱)测定的IgE水平。数值以％特异性氨基己糖苷酶的释放的平均数±SEM(n＝4)表示。***：P＜0.001。
图4显示在体外以重组Ph1p 5重刺激后通过ELISPOT测定的分泌IFN-γ(A)、IL-4(B)和IL-5(C)的脾细胞的数目。数据以每106个脾细胞中分泌细胞因子的细胞数目的平均数±SEM(n＝4)表示。
图5显示i.n.给予变应原之后致敏小鼠的BALF中总的白细胞(A)和嗜酸性粒细胞(B)的总数目。数值以平均数±SEM(n＝4)表示。*：P＜0.05；**：P＜0.01。
图6显示i.n.给予变应原之后致敏小鼠的BALF中IL-5(A)和IFN-γ(B)的水平。数值以平均数±SEM(n＝4)表示。*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001。
图7显示由RNApTNT-Bet v 1产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图8显示由RNApTNT-Car b 1产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图9显示由RNApTNT-Cas s 1产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图10显示由RNA pTNT-Phl p 1产生的Th1记忆的诱导。
图11显示由RNApTNT-Phl p 6产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图12显示由RNApTNT-Cor a 1产生的Th1记忆的诱导。
图13显示由RNApTNT-Aln g 1产生的Th1记忆的诱导。
图14显示由RNApTNT-Fag s 1产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图15显示由RNApTNT-Phl p 2产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图16显示由RNApTNT-Phl p 7产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图17显示由RNApTNT-杂交体(Phl p 1-2-5-6)产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图18显示由RNApTNT-Cryj 1产生的Th1记忆的诱导。
图19显示由RNApTNT-Jun a 1产生的Th1记忆的诱导。
图20显示由RNApTNT-Amb a 1产生的Th1记忆的诱导。
图21显示由RNApTNT-Api g 1产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图22显示由RNApTNT-Dau c 1产生的Th1记忆的诱导。
图23显示由RNApTNT-Mal d 1产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图24显示由RNApTNT-Ova产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图25显示由RNApTNT-β-酪蛋白产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图26显示由RNApTNT-Cyp c 1产生的Th1记忆的诱导。
图27显示由RNApTNT-Fel d 1产生的Th1记忆的诱导。
图28显示由RNApTNT-Derp 2产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图29显示由RNApTNT-Alt a 1产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图30显示由RNApTNT-Cla h 8产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图31显示由RNApTNT-Hev b 6产生的Th1记忆的诱导。
图32显示由RNApTNT-杂交体(变应原)产生的Th1记忆的诱导。
图33显示由RNApTNT-Ara h 2产生的Th1记忆的诱导和IgE反应的抑制。
图34显示由RNApTNT-Que a 1产生的Th1记忆的诱导。
图35显示RNApTNT-Artv 1不产生Th1记忆的诱导。
图36显示RNApTNT-Ole e 1不产生Th1记忆的诱导或IgE反应的抑制。
具体实施方式
实施例
实施例1：
在本实施例中显示，编码临床上相关的梯牧草花粉变应原Ph1p 5的RNA以及基于复制酶的RNA疫苗可以有效地防止过敏性反应。
材料和方法
用于RNA转录的质粒
质粒pTNT购自Promega(Mannheim，Germany)并包括一些特殊的特征，提供了相对于其它载体的优点。存在两个启动子，一个是针对SP6，另一个是针对T7聚合酶，以允许基于SP6和T7的体外转录。它们一前一后地位于多克隆位点(MCS)附近。5’-β球蛋白引导序列帮助增加几个基因的翻译以更快地启动翻译。另一个增强基因表达的特征是其合成的poly(A)30尾。
质粒pSin-Rep5(Invitrogen，Austria)源自辛德毕斯甲病毒，该病毒是有被膜的，正链RNA病毒。基于甲病毒的复制子载体缺少病毒结构蛋白，但是保持了细胞质RNA自我扩增和通过甲病毒启动子表达插入基因所必需的复制元件(复制酶)。
Phl p 5基因通过NheI/XbaI从载体pCMV-Phlp5切割而来(Gabler等人(2006)，JAllergy Clin Immunol 118：734-741)并连接至pTNT和pSin-Rep5的XbaI限制性位点，分别产生pTNT-P5和pSin-Rep5-P5。
RNA转录
使用相应的限制性酶将质粒pTNT-P5和pSin-Rep5-P5线性化；通过苯酚-氯仿-异戊醇提取然后进行单次氯仿-异戊醇提取来纯化模板。加入1/10体积的pH 5.2的3M醋酸钠后，以2体积的100％乙醇沉淀质粒，并以70％的乙醇洗涤3次。
所有的转录反应以T7或SP6 RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems(Promega)根据生产商的规程进行。简单地说，对于100μl的反应，以不含核酸酶的水将20μl转录缓冲液、30μl rNTP、5-10μg模板和10μl酶混合物加满至100μl并在37℃孵育2-3小时。当使用SP6 RiboMax试剂盒时，使用20μl而不是30μl的rNTP。
为了模拟mRNA的加帽结构，在RNA合成过程中引入5’7-甲基鸟苷核苷酸(m7G(5′)ppp(5′)G)或帽子的类似物(EPICENTRE，USA)。以25∶25∶25∶22.5∶2.5mM混合rATP、rCTP、rUTP、rGTP和m7G(5′)ppp(5′)G来制备rNTP混合物。
在转录以后，通过向反应管中加入1体积的5M醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟来沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
结果
以RNA和自我复制型RNA进行的体外转染
在体外以编码β-半乳糖苷酶的两种不同的RNA转录本，或者作为从载体pTNT-βGal(βGal-RNA)转录的常规RNA疫苗，或者作为从载体pRep5-βGal(βGal-repRNA)转录的自我复制型RNA而转染BHK-21细胞。
以含有不含有添加的m7G(5′)ppp(5′)G帽子结构测试RNA转录本。图1显示，以等量的自我复制型RNA的转染诱导了比常规RNA高7.5倍的转基因的表达。另外，以帽子结构稳定RNA对于RNA的体外转染/翻译是至关重要的。
编码变应原Phl p 5的基于RNA的疫苗是免疫原性的并且防止IgE的诱导
为了研究基于RNA的疫苗防止诱导过敏症的潜力，以编码Phl p 5的常规RNA或者编码Phl p 5的自我复制型RNA免疫雌性BALB/c小鼠。为了评价RNA疫苗的效力也使用相同剂量的编码Phl p 5的常规DNA疫苗(pCMV-P5)和自我复制型DNA疫苗(pSin-P5)免疫对应的小组。免疫小鼠三次，间隔为一周；两周后通过两次注射重组Phl p 5与明矾的混合物将小鼠致敏(这是已知的诱导过敏表型的规程)，其特征为高水平的IgE以及T细胞的偏向TH2的细胞因子图谱。
图2A显示，与自我复制型DNA疫苗pSin-P5相比，两个RNA疫苗均诱导相似的体液免疫反应。相反，与其它疫苗相比，常规DNA疫苗pCMV-P5诱导的体液免疫反应高出将近一个数量级。所有类型的疫苗均显示出清晰的偏向TH1的血清型图谱，特征是IgG1/IgG2a比例低，没有诱导功能性IgE(如RBL释放检验所测定，图3，灰色条柱)。
致敏后，没有预先免疫的对照组显示出严格的偏向TH2的血清学，具有高IgG1水平和高IgG1/IgG2a比例，这表明过敏性致敏。相反，所有疫苗接种的小组保持了TH1平衡的免疫表型(图2B)。与其DNA对应物作为对照动物相比较，以两种类型的RNA疫苗预先疫苗接种均诱导了相似的或更好的IgE诱导的抑制(图3，黑色条柱)。总体来说，以两种类型的RNA疫苗预先疫苗接种产生了对过敏性致敏诱导的IgE的93％的抑制。
基于RNA的疫苗诱导偏向TH1的T细胞记忆
在最后一次致敏后两周，在体外以重组Phl p 5蛋白重新刺激脾细胞以检测其TH1/TH2图谱。因此，通过ELISPOT确定了分泌IFN-γ、IL-4和IL-5的细胞的数目。
与对照组相比，所有的以核酸疫苗预先疫苗接种的小组显示出显著的对分泌IFN-γ细胞的诱导(图4A)。同时，分泌TH2类细胞因子IL-4(图4B)和IL-5(图4C)的细胞数量被抑制，这表明与DNA疫苗类似，RNA疫苗能够建立偏向TH1的抗原特异性记忆，这可以在后续暴露于变应原之后被重新激活。
基于RNA的疫苗减少变应原诱导的肺炎
为了研究RNA疫苗接种对于诱导肺病的效应，在最后一次致敏后两周，以两次每日i.n.给予1μg重组Phl p 5诱导肺炎。这个规程诱导强烈的白细胞渗透入致敏小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中(图5A，对照)。约80％的渗透性白细胞是嗜酸性粒细胞(图5B)。相反，预先进行疫苗接种的小鼠显示出显著减少量的总白细胞渗透，嗜酸性粒细胞的减少甚至更多。
炎性渗透的减少还通过BALF中IL-5的强烈抑制反映出来(图6A)。IL-5的抑制与IFN-γ的诱导负相关(图6B)。
结论
DNA疫苗具有预防和治疗过敏性疾病的巨大前景。但是，与DNA疫苗相关的假定的风险提出了在健康成人甚至儿童中临床使用这类新型疫苗的问题。
在这个实施例中，第一次证明了具有临床相关变应原的裸露的RNA疫苗接种可以在所使用的相同剂量上与可比较的DNA疫苗在相同的程度上防止过敏症的诱导。
为了解决生产大量RNA的问题，将常规RNA与源自辛德毕斯病毒复制子的自我复制型RNA进行了比较。以两种类型的RNA进行的体外转染均证明抗原表达除其它因素外依赖于m7G(5′)ppp(5′)G帽子类似物的添加。已知大部分真核mRNA在5’末端具有这样的m7G(5′)ppp(5′)G帽子结构，这对于结合翻译起始因子是重要的，并且对mRNA稳定性起作用。另外，还显示出相似数量的自我复制型RNA翻译出高7倍水平的蛋白(图1)，这可容易地归结于编码各个抗原的亚基因组RNA的自我复制。这与自我复制型DNA疫苗相反，自我复制型DNA疫苗的蛋白表达比常规DNA疫苗要低，这个效果归结于转染细胞中细胞凋亡的诱导。但是，RNA疫苗的表达只是瞬时的，因此与那些经过自我复制疫苗转染后不久进行细胞凋亡的细胞是相当的。的确自我复制型RNA疫苗诱导与自我复制型DNA疫苗相似的体液免疫反应(图2A)，而常规DNA疫苗(以其连续的抗原表达)显示出最高的体液免疫反应。
虽然在这个实施例中自我复制型核酸疫苗以比常规RNA/DNA疫苗低5倍的剂量给予，但是观察到相似的TH1记忆的诱导(显示为在后续的以明矾中的重组变应原致敏后的IgG2a的增多(图2B)和重新刺激的脾细胞的TH1细胞因子图谱)和高保护能力(图3)。在这里，两种RNA疫苗和自我复制型DNA疫苗显示出比常规DNA疫苗更高的保护能力，虽然后者诱导更高水平的完整抗原和更高的体液免疫反应。这表明以RNA和自我复制型疫苗看来，与短期疫苗表达相比，疫苗诱导的长期持续的变应原分泌可能是其反作用的。
在以变应原i.n.刺激后，RNA疫苗接种还产生与DNA疫苗类似的对肺渗透的减少(图5A)，这主要归结于BALF中嗜酸性粒细胞数量的强烈减少(图5B)。这与肺中IL-5的减少(图6A)和IFN-γ的中度水平的诱导(图2B)相关，表明疫苗诱导的TH1细胞的产生也影响肺中TH1/TH2细胞因子的平衡。虽然在病毒模型中肺中的IFN-γ可以对哮喘和肺病具有有害的效应，但这似乎是间接效应，因为IFN-γ可以激活肺上皮细胞以募集更多的TH2细胞到组织中。确实，在过敏症模型中，可以显示将TH2免疫重新指向更平衡的TH1环境对肺炎和气道高反应性具有有益的效应，主要是通过反调节IL-5和IL-13(Ford，J.G.等人(2001)J Immunol167：1769-1777)。
综上，可以证明，基于RNA的疫苗可以诱导显著的对于过敏性致敏的保护，并且通过使用自我复制型RNA疫苗，可以在低剂量实现这个效应。鉴于RNA疫苗的完美的安全性能，这为临床上应用RNA疫苗打开了一扇门，不光是用于治疗性安排，还用于具有发展过敏性病症的高风险的健康个体。
实施例2：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Bet v 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的规程加帽子。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Bet v 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Bet v 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Bet v 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Betv 1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图7A)和IFN-γ的分泌(图7B)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图7C)。
实施例3：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Car b 1的cDNA克隆入载体pTNT。按上述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Car b 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Car b 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Car b 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Car b1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图8A)和IFN-γ的分泌(图8B)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图8C)。
实施例4：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Cas s 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Cas s 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Cas s 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Cas s 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Cas s1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图9A)和IFN-γ的分泌(图9B)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图9C)。
实施例5：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Phl p 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Phl p 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Phl p 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA测定变应原特异性血清IgG2a，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Phl p 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Phl p1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图10A)和IFN-γ的分泌(图10B)所指征。
实施例6：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Phl p 6的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Phl p 6免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Phl p 6与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Phl p 6重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Phl p6预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图11A)和IFN-γ的分泌(图11B)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图11C)。
实施例7：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Cor a 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Cor a 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Cor a 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA测定变应原特异性血清IgG2a。
结果
与致敏对照(黑色条柱)相反，以RNApTNT-Cor a 1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图12)所指征。
实施例8：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Aln g 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Aln g 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Aln g 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏10天后，在体外以重组Aln g 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Aln g1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IFN-γ的分泌(图13)所指征。
实施例9：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Fag s 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Fag s 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Fag s 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Fag s 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Fag s1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图14A)和IFN-γ的分泌(图14B)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图14C)。
实施例10：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Phl p 2的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Phl p 2免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Phl p 2与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过RBL测定变应原特异性血清IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Phl p 2重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Phl p2预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IFN-γ的诱导(图15A)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图15B)。
实施例11：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Phl p 7的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNA pTNT-Phl p 7免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Phl p 7与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过RBL测定变应原特异性血清IgE，如实验1所述。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Phl p7预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IFN-γ的诱导(图16A)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图16B)。
实施例12：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Phl p 1、Phl p 2、Phl p 5和Phl p 6的杂交体cDNA(Linhart B.和Valenta R.，Int Arch Allergy Immunol(2004)134：324-331)克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNA pTNT-杂交体(Phl p 1-2-5-6)免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Phl p 1、Phl p 2、Phl p 5和Phl p 6与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组变应原重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNA pTNT-杂交体(Phl p 1-2-5-6)预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图17A)和IFN-γ的分泌(图17B)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图17C)。
实施例13：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Cryj 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Cryj 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Cry j 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA测定变应原特异性血清IgG2a，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Cry j 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Cry j1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图18A)和IFN-γ的分泌(图18B)所指征。
实施例14：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Jun a 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Juna 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Jun a 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏10天后，在体外以重组Jun a 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Jun a1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IFN-γ的诱导(图19)所指征。
实施例15：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Amb a 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Amb a 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg纯化的Amb a 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏10天后，在体外以纯化的Amb a 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Amba 1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IFN-γ的分泌(图20)所指征。
实施例16：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Api g 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Api g 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Api g 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Api g 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Api g1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图21A)和IFN-γ的分泌(图21B)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图21C)。
实施例17：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Dau c 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Dau c 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Dau c 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA测定变应原特异性血清IgG2a，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Dau c 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Dau c1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图22A)和IFN-γ的分泌(图22B)所指征。
实施例18：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Mal d 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Mal d 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Mal d 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Mal d 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Mal d1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图23A)和IFN-γ的分泌(图23B)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图23C)。
实施例19：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Ova的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Ova免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Ova与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Ova重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNA pTNT-Ova预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图24A)和IFN-γ的分泌(图24B)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图24C)。
实施例20：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码β-酪蛋白的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-β-酪蛋白免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组β-酪蛋白与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过RBL测定变应原特异性血清IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组β-酪蛋白重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-β-酪蛋白预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IFN-γ的分泌(图25A)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图25B)。
实施例21：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Cyp c 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Cyp c 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Cyp c 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA测定变应原特异性血清IgG2a，如实验1所述。
结果
以RNApTNT-Cyp c 1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图26)所指征。
实施例22：
材料和方法
质料和RNA转录
如实施例1所述，将编码Fel d 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Fel d 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Fel d 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA测定变应原特异性血清IgG2a，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Fel d 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Fel d1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图27A)和IFN-γ的分泌(图27B)所指征。
实施例23：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Der p 2的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Der p 2免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Der p 2与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。
结果
以RNApTNT-Der p 2预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图28A)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图28B)。
实施例24：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Alt a 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Alt a 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Alt a 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Alt a 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Alt a 1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图29A)和IFN-γ的分泌(图29B)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图29C)。
实施例25：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Cla h 8的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Cla h 8免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Cla h 8与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过RBL测定变应原特异性血清IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Cla h 8重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Clah8预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如IFN-γ的分泌(图30A)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图30B)。
实施例26：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Hev b 6的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Hev b 6免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Hev b 6与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA测定变应原特异性血清IgG2a，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Hev b 6重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Hevb6预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图31A)和IFN-γ的分泌(图31B)所指征。
实施例27：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码5个不同变应原的部分的杂交体的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNA pTNT-杂交体(Aln-Cor-Que-Car-Bet)免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组全部变应原与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA测定变应原特异性血清IgG2a，如实验1所述。
结果
以RNApTNT-杂交体(变应原)预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图32)所指征。
实施例28：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Ara h 2的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Arah2免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Ara h 2与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgE，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Arah 2重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
以RNApTNT-Ara h 2预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如IFN-γ的分泌(图33A)所指征。这个Th 1的引发能够抑制变应原特异性IgE反应的诱导(图33B)。
实施例29：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Que a 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Que a 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Que a 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA测定变应原特异性血清IgG2a，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Que a 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
与致敏对照(黑色条柱)或原态小鼠(白色条柱)相反，以RNApTNT-Que a1预先接种(阴影条柱)产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如增加的IgG2a的诱导(图34A)和IFN-γ的分泌(图34B)所指征。
实施例30：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Art v 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Art v 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Art v 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a，如实验1所述。最后一次致敏后10天，在体外以重组Art v 1重新刺激脾细胞72小时，分析细胞培养物上清液中的IFN-γ作为变应原特异性Th 1细胞激活的指征。
结果
以RNApTNT-Art v 1预先接种(阴影条柱)不产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如没有增加的IgG2a的诱导(图35A)或IFN-γ的分泌(图35B)所指征。
实施例31：
材料和方法
质粒和RNA转录
如实施例1所述，将编码Ole e 1的cDNA克隆入载体pTNT。按所述制备RNA转录本并使用ScriptCap试剂盒(Ambion)根据生产商的说明书加帽。
在37℃以不含RNAse的DNAse(Promega)孵育加帽的转录本15分钟以除去模板DNA。然后，通过向反应管中加入1体积的5M的醋酸铵并在冰上孵育混合物10-15分钟而沉淀RNA。在4℃或室温离心15分钟(13000rpm)的时间后，以70％的乙醇洗涤沉淀并重悬于不含核酸酶的水。
免疫和致敏
以RNApTNT-Ole e 1免疫小鼠三次，间隔为一周；一周后通过两次注射(每周一次)1μg重组Ole e 1与明矾的混合物将小鼠致敏以诱导过敏性表型。对照动物只致敏，不接受RNA疫苗预先接种。
Th 1记忆的诱导和保护的测定
最后一次致敏一周后，通过ELISA和RBL测定变应原特异性血清IgG2a和IgE，如实验1所述。
结果
以RNA pTNT-Ole e 1预先接种(阴影条柱)不产生变应原特异性Th 1细胞的募集，如没有增加的IgG2a的诱导(图36A)所指征。此外，没有检测到变应原特异性IgE反应的诱导的抑制(图36B)。
序列表
<110>碧欧美公司
 
<120>RNA疫苗
 
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<211>90
<212>PRT
<213>欧洲室尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
 
<400>1
 
Met Lys Phe Asn Ile Iie Ile Val Phe Ile Ser Leu Ala Ile Leu Val
1               5                   10                  15
His Ser Ser Tyr Ala Ala Asn Asp Asn Asp Asp Asp Pro Thr Thr Thr
            20                  25                  30
Val His Pro Thr Thr Thr Glu Gln Pro Asp Asp Lys Phe Glu Cys Pro
        35                  40                  45
Ser Arg Phe Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr
    50                  55                  60
Ile Cys Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr
65                  70                  75                  80
Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr
                85                  90

Claims (15)

1.RNA疫苗，其包含至少一个编码至少一个变应原或其衍生物的RNA分子，其中所述的变应原是赤杨、烟草赤星病菌、豚草、芹菜、花生、疣枝桦、欧洲鹅耳枥、欧洲栗、多主枝孢霉、欧洲榛、日本柳杉、鲤鱼、胡萝卜、欧洲室尘蟎、欧洲山毛榉、家猫、巴西橡胶树、美国雪松、苹果、白栎和猫尾草的变应原。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于赤杨的变应原是Aln g 1，烟草赤星病菌的变应原选自Alt a 1、Alt a 3、Alt a 4、Alt a 5、Alt a 6、Alt a 7、Alt a 8、Alt a 10、Alt a 12或Alt a 13，豚草的变应原选自Amb a 1、Amb a 2、Amb a 3、Amb a 5、Amb a 6、Amb a 7、Amb a 8、Amb a 9或Amb a 10，芹菜的变应原选自Api g 1、Api g 4或Api g 5，花生的变应原选自Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 4、Ara h 5、Ara h 6、Ara h 7或Ara h 8，疣枝桦的变应原选自Bet v 1、Bet v 2、Bet v3、Betv4、Betv 6或Betv 7，欧洲鹅耳枥的变应原是Carb 1，欧洲栗的变应原选自Cas s 1、Cas s 5或Cas s 8，多主枝孢霉的变应原选自Cla h 2、Cla h 5、Cla h 6、Cla h 7、Cla h 8、Cla h 9、Cla h 10或Cla h 12，欧洲榛的变应原选自Cor a 1、Cora 2、Cor a 8、Cor a 9、Cor a 10或Cor a 11，日本柳杉的变应原选自Cryj 1或Cryj 2，鲤鱼的变应原是Cyp c 1，胡萝卜的变应原选自Dau c 1或Dau c 4，欧洲室尘蟎的变应原选自Der p 1、Der p 2、Der p 3、Der p 4、Der p 5、Der p 6、Der p 7、Der p 8、Der p 9、Der p 10、Der p 11、Der p 14、Der p 20、Der p 21或克隆30变应原，欧洲山毛榉的变应原是Fag s 1，家猫的变应原选自Fel d 1、Fel d 2、Fel d 3、Fel d 4、Fel d 5w、Fel d 6w或Fel d 7w，巴西橡胶树的变应原选自Hev b 1、Hev b2、Hev b 3、Hev b 4、Hev b 5、Hev b 6.01、Hev b 6.02、Hev b 6.03、Hev b 7.01、Hev b 7.02、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10、Hev b 11、Hev b 12或Hev b 13，美国雪松的变应原选自Jun a 1、Jun a 2或Jun a 3，苹果的变应原选自Mal d 1、Mal d 2、Mal d 3或Mal d 4，白栎的变应原是Que a 1，猫尾草的变应原选自Phl p 1、Phl p 2、Phl p 4、Phl p 5、Phl p 6、Phl p 7、Phl p 11、Phl p 12或Phl p 13。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于变应原选自Aln g 1、Alt a 1、Amb a 1、Api g 1、Ara h 2、Bet v 1、β-酪蛋白、Car b 1、Cas s 1、Cla h 8、Cor a 1、Cry j 1、Cyp c 1、Dau c 1、Der p 2、Fag s 1、Fel d 1、Hev b 6、Jun a 1、Mal d 1、卵清蛋白(OVA)、Phl p 1、Phl p 2、Phl p 5、Phl p 6或Phl p 7。
4.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于RNA分子编码Phl p 1、Phlp 2、Phl p 5和Phl p6或编码Aln g 1、Cor a 1、Que a 1、Car b 1和Bet v 1。
5.根据权利要求1至4任一项所述的疫苗，其特征在于变应原衍生物是低变应原性的。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于低变应原性变应原衍生物表现出比野生型变应原的IgE反应活性低至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，特别是至少50％的IgE反应活性。
7.根据权利要求1至6任一项所述的疫苗，其特征在于编码变应原或其衍生物的RNA分子与至少进一个编码肽、多肽或蛋白的分子融合。
8.根据权利要求1至7任一项所述的疫苗，其特征在于RNA分子包含至少进一个选自复制酶、β-球蛋白引导序列、cap0、cap1或polyA尾的元件。
9.根据权利要求1至8任一项所述的疫苗，其特征在于疫苗还包含佐剂，优选选自CpG-DNA或细胞因子，细胞因子优选为IL-12和IL-15。
10.根据权利要求1至9任一项所述的疫苗，其特征在于疫苗适合于肌内、皮内、静脉内、经皮、局部或生物导弹给药。
11.如权利要求1至8任一项所述的至少一个RNA分子在制备用于治疗或预防过敏症的疫苗中的用途。
12.如权利要求1至8任一项所述的至少一个RNA分子在制备用于使个体对变应原弱敏化的预防性和治疗性疫苗中的用途。
13.根据权利要求11或12所述的用途，其特征在于疫苗还包含佐剂，优选选自CpG-DNA或细胞因子，细胞因子优选为IL-12和IL-15。
14.根据权利要求11至13任一项所述的用途，其特征在于疫苗适合于肌内、皮内、静脉内、经皮、局部或生物导弹给药。
15.分离的RNA分子，其包含编码如权利要求1至8任一项所述的至少一个变应原或其衍生物的至少一个核苷酸序列。
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