CN101824086A - 一种普兰林肽的制备方法 - Google Patents

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马永
郭夏
张志强
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Abstract

本发明公开了一种普兰林肽(式I化合物)的制备方法，包括将式V、式VI、式VII、式VIII化合物的对接步骤，普兰林肽为一种极具药理和治疗特性的多肽类药物。

Description

一种普兰林肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种普兰林肽的制备方法，特别是一种采用收敛合成制备方法。
背景技术
普兰林肽(式I)是人工合成的胰淀素类似物，是稳定的水溶性物质，结构特征为胰淀素25位的丙氨酸、28位和29位的丝氨酸用脯氨酸代替，普兰林肽作用与胰淀素类似，通过减慢餐后胃排空速度而控制餐后血糖，作用维持约3h，但并不改变碳水化合物和其他营养物质吸收的总量。同时，其抑制餐后胰高血糖素的分泌和引起饱腹感也可起到控制血糖的作用。其可抑制食欲，可能有降低体重的作用，其用于1型和2型成人糖尿病患者控制血糖，也是目前除胰岛素外唯一可用于治疗1型糖尿病的药物。
Figure B2009100791346D0000011
WO-A-93/10146和US-A-5424394报道了一种采用固相合成法制备普兰林肽的方法，选择一个组成多肽羧基端的氨基酸固定在不溶性树脂上，在此树脂上将需要的单个的氨基酸依次通过共价键的方式偶联上去来延长肽链，合成多肽。首先选择将赖氨酸(Lys)固定在不溶性树脂上，然后把需要的氨基酸依次偶联上去，接着使肽链的2位和7位两个半胱氨酸发生分子内环合，得到二硫基桥键，最后脱除固定树脂，依次类推，逐个将单个的氨基酸连接上去，最终制备得到普兰林肽。很显然对于包含37个氨基酸的普兰林肽来说，该方法的合成路线很长，固相合成的纯化方法是每步反应后洗涤树脂，来达到纯化目的，而且普兰林肽中有很多重复的氨基酸片段，需要多次重复偶联，因此整个工艺操作繁琐，收率极低，成本很高，不适合工业化。
WO2006/045603报道了另外一种利用固相合成法制备普兰林肽的方法，首先选择设计组成普兰林肽的几个组成合理的氨基酸残基片段，然后通过收敛合成以共价键的形式将几个片段合理的偶联起来，制备得到普兰林肽。该路线采用的收敛合成法是制备多肽化合物的有效方法，但收敛合成法的关键是找到合适的氨基酸片段和偶联顺序以克服偶联困难，产物难以分离的问题以及偶联反应时末端手性碳原子的外消旋化。很显然，包含37个氨基酸的普兰林肽有很多可能的合成片段和偶联顺序，而目前的专利技术中没有做详细的研究报道，而且采用的片段，偶联顺序均较随意，整个设计不太合理，合成分离困难，操作复杂，收率较低，而且成本较高，不适合工业化。
WO2009/003666报道了一种另外一种普兰林肽的制备方法，
Figure B2009100791346D0000021
13                                      24
Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-OH         (III)
25                                              37
Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2(IV)
该方法同样是采用收敛合成法，共有6步反应，设计制备普兰林肽的三个合理的片段，即(I)、(III)和(IV)，同时采用如下偶联顺序：先(III)和(IV)偶联，再与(II)发生偶联制备得到普兰林肽，整个路线设计相对合理，操作简单，但每个片段包含12个氨基酸片段，比较长，合成路线较长，每次洗脱树脂损失严重，而且连接处氨基酸活性基团，位阻较大，反应效率较低，成本较高，不太适合工业化。
鉴于普兰林肽及其盐、特别是其醋酸盐的药学价值，有必要通过更有效的合成方法得到普兰林肽，我们本着反应步骤较少，原料易得，操作简单，收率较高，处理“三废”成本较低，适合工业化生产的原则，发明了一种普兰林肽合成的新路线。
发明内容
本发明提供一种普兰林肽的制备方法，包含采用1-8，9-19，20-28，29-37的四个氨基酸残基片段，通过收敛包含1-8，9-19，20-28，29-37的四个氨基酸残基片段通过收敛合成，制备包含37个氨基酸序列的普兰林肽。本制备方法采用的氨基酸片段长度合适，不仅降低了损失，减少了末端手性碳的异构化，而且片段之间的连接氨基酸，结构简单，活性基团单一，位阻较小，偶联收率较高，易于纯化。
更具体的讲，本发明提供的普兰林肽制备方法，首先通过固相合成法制备得到氨基酸残基片段式(V)，(VI)，(VII)，(VIII)化合物：
Figure B2009100791346D0000041
其中Boc，Fmoc，Trt，tBu，Pbf分别代表保护基。
首先将(VI)与(VII)偶联得到(IX)：
Figure B2009100791346D0000042
然后(IX)与(VIII)偶联得到(X)：
Figure B2009100791346D0000043
接着(X)与(V)偶联得到(XI)：
Figure B2009100791346D0000051
最后脱保护，纯化得到药用的一种多肽普兰林肽。
按照本发明专利，四个氨基酸残基片段(V)，(VI)，(VII)，(VIII)的合成以及偶联顺序构成了其核心，使用该方法制备普兰林肽的工艺起始原料易于获得，步骤相对较短，反应操作简单，产品易于分离纯化，易于实现工业化，经过三批放大实验，整合成本，环保以及操作等方面考虑，确定为目前合成普兰林肽的较佳合成方法，推进了普兰林肽的工业化生产。
实例说明
下面的实施例阐述了本发明。
实施例1：式(V)化合物制备
Fmoc(Ala)-OH按照0.64mmol/g的量固定到80g的CTC不溶性树脂上，以TCTU/6-Cl-HOBt/DIEA为反应偶联试剂，将待偶联的氨基酸以2.5当量的投料，先在0-5℃去活化，然后再转入多肽合成仪，在20℃下偶联反应。每次偶联完成以KSEISER TEST和HPLC检测，偶联完成后，在30℃下，用20％(wt)的piperidine的N-甲基吡咯烷酮中去除Fmoc保护基，然后在0℃下，在DMF溶剂中，用3当量的碘合成2，7两个半胱氨酸的二硫桥键，接着用1％的TFA的二氯甲烷溶液把合成的多肽从树脂上洗脱下来，浓缩溶剂得到淡黄色油状物，用水沉淀，抽滤，干燥得到162.3g白色粉末。
实施例2：式(VI)化合物制备
Fmoc(Ser)-OH按照0.66mmol/g的量固定到80g的CTC不溶性树脂上，以DIC/6-Cl-HOBt/DIEA为反应偶联试剂，将待偶联的氨基酸以2.2-2.5当量的投料，先在0-5℃去活化，然后再转入多肽合成仪，在20℃下偶联反应。每次偶联完成以KSEISER TEST和HPLC检测，偶联完成后，在30℃下，用20％(wt)的piperidine的N-甲基吡咯烷酮中去除Fmoc保护基，接接着用2％的TFA的二氯甲烷溶液把合成的多肽从树脂上洗脱下来，浓缩溶剂得到淡黄色油状物，用水沉淀，抽滤，干燥得到113.6g多肽粗品。
实施例3：式(VII)化合物制备
Fmoc(Pro)-OH按照0.55mmol/g的量固定到150g的CTC不溶性树脂上，以TCTU/6-Cl-HOBt/DIEA为反应偶联试剂，将待偶联的氨基酸以2.5当量的投料，先在0-5℃去活化，然后再转入多肽合成仪，在20℃下偶联反应。每次偶联完成以KSEISER TEST和HPLC检测，偶联完成后，在30℃下，用20％(wt)的piperidine的N-甲基吡咯烷酮中去除Fmoc保护基，接接着用3％的TFA的二氯甲烷溶液把合成的多肽从树脂上洗脱下来，浓缩溶剂得到淡黄色油状物，用水沉淀，抽滤，干燥得到119.26g白色粉末。
实施例4：式(VIII)化合物制备
Fmoc(Gly)-OH按照0.56mmol/g的量固定到150g的CTC不溶性树脂上，以TCTU/DIEA为反应偶联试剂，将待偶联的氨基酸以2.5当量的投料，先在0-5℃去活化，然后再转入多肽合成仪，在20℃下偶联反应。每次偶联完成以KSEISER TEST和HPLC检测，偶联完成后，在30℃下，用20％(wt)的piperidine的N-甲基吡咯烷酮中去除Fmoc保护基，接接着用5％的TFA的二氯甲烷溶液把合成的多肽从树脂上洗脱下来，浓缩溶剂得到淡黄色油状物，用水沉淀，抽滤，干燥得到121.4g白色粉末。
实施例5：式(IX)化合物制备
将自制的(VI)化合物3.6g，先在0.31g 6-Cl-HOBt，0.63g TCTU和0.60g DIEA的52g DMF溶液中预活化10min，然后将3.2g自制的(VII)化合物的0.70g DIEA加入反应体系，进行偶联反应，30min后，补加0.1g 6-Cl-HOBt和0.2g TCTU，维持20℃下反应3h，反应完毕后，将反应混合物倒入0-5℃冷水中，有沉淀出现，抽滤，洗涤干燥，得到多肽5.63g。
实施例6：式(X)化合物制备
将自制的(IX)化合物4.2g，先在0.42g 6-Cl-HOBt，0.72g TCTU和0.76g DIEA的70g DMF溶液中预活化10min，然后将3.3g自制的(VIII)化合物的0.5g DIEA加入反应体系，进行偶联反应，30min后，补加0.10g 6-Cl-HOBt和0.18g TCTU，维持40℃下反应2h，反应完毕后，将反应混合物倒入0-5℃冷水中，有沉淀出现，抽滤，洗涤干燥，得到多肽7.34g。
实施例7：式(XI)的制备
将自制的(X)化合物6.94g，先在0.53g 6-Cl-HOBt，0.84g TCTU和0.91g DIEA的80g DMF溶液中预活化10min，然后将3.61g自制的(V)化合物的0.60g DIEA加入反应体系，进行偶联反应，30min后，补加0.10g 6-Cl-HOBt和0.18g TCTU，维持30℃下反应3h，反应完毕后，将反应混合物倒入0-5℃冷水中，有沉淀出现，抽滤，洗涤干燥，得到多肽10.24g。
实施例8：普兰林肽的制备
将实施例6制备的保护的普兰林肽(XI)10.0g，溶解在100mlTFA，3ml三异丙基硅烷和3.0g苯酚中，维持20℃下反应4h，加入600ml异丙醚，有大量沉淀出现，抽滤，干燥得到7.9g普兰林肽粗品。将普兰林肽粗品用HPLC纯化：柱子20*2.5cm，流速30ml/min；流动相乙腈/1％乙酸；多肽流速8mg/ml.纯化后得到普兰林肽5.9g，纯度97.3％。

Claims (5)

1.一种普兰林肽(式I化合物)的制备方法，包括将式V、式VI、式VII、式VIII化合物的对接步骤，
Figure F2009100791346C0000011
2.根据权利要求1的方法，其特征在于式VI化合物与式VII化合物固相生成式IX化合物，
3.根据权利要求2的方法，其特征在于式IX化合物与式VIII化合物固相生成式X化合物
Figure F2009100791346C0000021
4.根据权利要求3的方法，其特征在于式X化合物与式V化合物固相生成式XI化合物
Figure F2009100791346C0000022
5.根据权利要求4的方法，其特征在于式XI化合物在三异丙基硅烷和苯酚中使用1％-5％TFA脱除保护基。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102180943A (zh) * 2010-12-16 2011-09-14 深圳市健元医药科技有限公司 一种辅助降血糖多肽药物的生产工艺
CN102816213A (zh) * 2012-05-29 2012-12-12 南京工业大学 使用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法
CN105777892A (zh) * 2014-12-17 2016-07-20 深圳翰宇药业股份有限公司 普兰林肽聚乙二醇衍生物、其制备方法及其应用

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