CN101817871A - 迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子及其构建和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子及其构建和应用。具体为所述阻断因子具有序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列，其表达方法：将质粒pCI-neo用EcoRI/SmaI酶切后与寡聚核苷酸P1连接得具有序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示的质粒pC5411。所述具有序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列的阻断因子具有提高动物体内机体抵抗细菌感染的作用。本发明所得迟缓爱德华氏菌LuxS/AI2密度感应系统阻断因子为小分子可分泌性肽，其在动物体内表达能够显著降低致病性迟缓爱德华氏菌在机体内的侵染能力。

Description

迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子及其构建和应用
技术领域
本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子及其构建和应用。
背景技术
密度感应(quorum sensing)是一种细菌用于调控群体行为的方式。已发现的密度感应系统有多种，其中一类为LuxS/AI2所介导。这一类系统利用二类自体诱导分子(autoinducer 2)AI2作为传导信号；AI2是一种小分子化合物，由LuxS等酶合成。AI2可以穿过细胞膜，扩散至细胞外；当细胞生长达到一定程度时，其所分泌的AI2分子在环境中达到一定的浓度，即可被其它周边细菌感应到，由此导致细菌中某些基因表达的变化，从而诱发该环境中细菌群体行为的改变。不同于一类自体诱导分子(autoinducer 1)AI1，AI2分子可以被不同种/属细菌识别，因而是一种种间信号传导因子。由于LuxS/AI2密度感应系统调控多种细菌生命过程，如生长代谢，致病能力，环境适应等，因而阻断该系统往往对细菌，尤其是病原菌，有诸多影响。基于此，密度感应系统前已成为控制细菌性疾病感染的药物研究靶点。
迟缓爱德华氏菌为一种重要的养殖水生生物病原菌，能够感染多种鱼类、动物以及人类。由迟缓爱德华氏菌引起的爱德华氏菌病每年给我国水产养殖业带来极大经济损失。
发明内容
本发明目的在于提供一种迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子及其构建和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子：序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。
迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子的构建：将质粒pCI-neo用EcoRI/Sma I酶切后与寡聚核苷酸P1(5’-AATTCACCACCATGCATACCCTTGAGCACCTATTCGCCGGCTTTATGTAACCC-3’)用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，得具有序列表SEQID No.1中的氨基酸序列所示的质粒。
迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子的应用：所述具有序列表SEQID No.1中的氨基酸序列的阻断因子具有提高动物体内机体抵抗细菌感染的作用。将具有序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列的阻断因子与PBS缓冲液混合后取100-150ul对动物体进行肌肉注射，其中每微升PBS中含0.1ug阻断因子。
本发明具有如下优点：
1.特异性阻断。本发明的阻断因子能够特异性地与LuxS作用，因而只干扰LuxS/AI2密度感应系统。
2.稳定表达。由于本发明的阻断因子是蛋白质性质，因而可以在真、原核系统高效表达，从而避免了昂贵的人工合成途径。
3.扩散性分泌。本发明的阻断因子为小分子肽，可以在多种细菌中合成并被分泌至胞外，又为其它细菌所截获，因而其影响广泛。
4.迟缓爱德华氏菌LuxS/AI2密度感应系统与该菌的致病力密切相关，LuxS和AI2的表达和活性改变引起细菌致病力的改变。基于此，本发明提供LuxS/AI2抑制因子，其在牙鲆中表达能够显著降低迟缓爱德华氏菌的感染能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrookand Russell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold SpringHarbor Laboratory Press 2001)；
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子具序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。
序列表SEQ ID No.1为：
HTLEHLFAGFM
(a)序列特征：
·长度：11
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人工设计
迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子的构建方法：
1)表达迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子的质粒pC5411构建：将质粒pCI-neo(购于美国Promega公司)用EcoRI/Sma I酶切后与寡聚核苷酸P1(5’-AATTCACCACCATGCATACCCTTGAGCACCTATTCGCCGGCTTTATGTAACCC-3’)用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有安卡青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取转化子，提取质粒，即为质粒pC5411，具有序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。
实施例2
迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子的应用
1)迟缓爱德华氏菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养迟缓爱德华氏菌TX1(保存于CGMCC，编号为CGMCC No.2330)至OD600为0.5，然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x106cfu/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；所述PBS百分比组成成分为：0.8g NaCl，0.02g KCl，0.358g Na2HPO4.12H2O，0.024g NaH2PO4。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.358％Na2HPO4.12H2O，0.024％NaH2PO4。
2)将10条牙鲆(每条重约10g)随机分为2组，每组5条。将这2组分别命名为A和B组。将A组的每条鱼肌肉注射100-150ul含有10-15ug混有实施例1质粒pC5411的PBS。将B组的每条鱼肌肉注射100ul含有10ug质粒pCI-neo的PBS。10天后将两组鱼每条腹腔注射100ul上述步骤1)的迟缓爱德华氏菌悬液，48小时后取50ul鱼血涂布于含有四环素(15ug/ml)的LB固体培养基上培养32-48小时，菌落计数。结果为B组菌落数是A组的19倍。故迟缓爱德华氏菌在表达LuxS/AI2密度感应系统阻断因子的鱼体中的感染能力明显下降。
序列表txt
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
<120>迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子及其构建和应用
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>人工设计
<220>
<221>PRT
<222>(1)..(11)
<223>
<400>1
His Thr Leu Glu His Leu Phe Ala Gly Phe Met
1               5                   10

Claims (4)

1.一种迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子，其特征在于：序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。
2.一种按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子的构建，其特征在于：将质粒pCI-neo用EcoRI/SmaI酶切后与寡聚核苷酸P1(5’-AATTCACCACCATGCATACCCTTGAGCACCTATTCGCCGGCTTTATGTAACCC-3’)用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，得具有序列表SEQID No.1中的氨基酸序列所示的质粒。
3.一种按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子的应用，其特征在于：所述具有序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列的阻断因子具有提高动物体内机体抵抗细菌感染的作用。
4.按权利要求3所述的迟缓爱德华氏菌密度感应系统阻断因子的应用，其特征在于：将具有序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列的阻断因子与PBS缓冲液混合后取100-150ul对动物体进行肌肉注射，其中每微升PBS中含0.1ug阻断因子。
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