CN101812439A

CN101812439A - 一种透皮结构域及其衍生的具有透皮作用的融合蛋白和其制备方法

Info

Publication number: CN101812439A
Application number: CN200910046601A
Authority: CN
Inventors: 张舒羽
Original assignee: Individual
Current assignee: Xu Qiusheng
Priority date: 2009-02-25
Filing date: 2009-02-25
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2029-02-25
Also published as: CN101812439B

Abstract

本发明公开了一种具有(K)_m(R)_nx结构的多肽，本发明还公开了该多肽与目的蛋白连接获得的融合蛋白。所述的多肽特别适用于将目的蛋白转导入细胞内，特别是可穿透皮肤角质层将目的蛋白转入细胞内。

Description

一种透皮结构域及其衍生的具有透皮作用的融合蛋白和其制备方法

技术领域

本发明属基因工程领域，具体涉及一种蛋白透皮结构域与两种抗氧化作用的蛋白分别形成的融合蛋白，以及该类融合蛋白在制备抗氧化药物中的应用。

技术背景：

长久以来，生物个体为了保护自己免受病微生物、病毒等的侵害，形成了多重防护体系，第一层防护就是皮肤。皮肤由表皮和真皮构成，在表皮外有角质层覆盖，能够阻挡细菌、病毒等绝大多数大分子物质的进入；另一层防护就是细胞本身。细胞膜对于绝大多数物质是不透的，使其免受有害物质的损伤，保持其功能的完整性。

在正常情况下，蛋白质由于分子量较大，是不能透过细胞膜阻挡，进入细胞质甚至细胞核中的。蛋白质转导是近年发展起来的一种将外源蛋白导入细胞的方法。将某些特殊的多肽与靶物质共价相连后，这些多肽会连同靶物质一起，进入临近细胞。这种由多肽携带靶物质跨过细胞膜的阻挡，进入细胞质的过程称为蛋白转导(protein transduction)。这些能携带外源物质进入细胞的多肽成称蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)。

蛋白转导结构域是一些富含赖氨酸、精氨酸的蛋白结构域多肽。他们与共价的所需要的目的基因产物相连后，这些目的基因产物就会被带到细胞中，发挥应有的生物学功能。目前利用该方法已经高效地将绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶、Caspase-3等等多种大分子多肽带到细胞中。目前最常用的蛋白转导结构域共价偶连方法是将目的基因与蛋白转导结构域基因相融合，最后产生赋予了新的转导能力的目的蛋白。

同样，表面疏水的角质层对于分子量大的蛋白质同样有阻隔作用。小分子化合物能够扩散进入皮肤，但是一方面由于分子量太大，另一方面由于含有亲水氨基酸，因而难以透过角质层的阻挡，进入皮肤中。目前能介导蛋白质透皮的物质是表面疏水脂质体等，但是包封率有限。蛋白转导结构域的机理是通过其表面正电荷与细胞后接触后被吞噬进入细胞。这样的机理对于皮肤细胞摄取蛋白质也许同样适用。

超氧化物歧化酶(SOD-1)和人血红素加氧酶(HO-1)等都是人体内重要的抗氧化酶，在清除自由基，保持细胞内环境稳定中发挥着重要作用。然而当人体皮肤受到氧化损伤或者紫外线照射时，不仅表皮层会受到损伤，真皮层也会受到损伤(紫外线中的UVA主要损伤真皮层)。外源补给的这些抗氧化酶并不能穿透角质层细胞膜进入到细胞中，清除自由基，保护细胞，这大大降低了这些酶的应用价值。

发明内容：

本发明的目的正是从蛋白转导结构域中筛选到具有透皮能力的结构域，我们称之为透皮结构域，从而弥补了超氧化物歧化酶(SOD-1)、人血红素加氧酶(HO-1)不能透过角质层进入皮肤细胞发挥抗氧化作用的不足。将寡聚赖氨酸、精氨酸编码序列分别与人SOD-1、HO-1基因融合后表达，使得这些抗氧化酶具有了新的功能-能够进入皮肤中进行的抗氧化作用。研究表明，该类融合蛋白既能进入细胞中，也能透过大鼠角质层、表皮层和真皮层，并显示很好的抗氧化能力。

本发明的融合蛋白通过下述方式获得：

1、分别扩增超氧化物歧化酶(SOD-1)、人血红素加氧酶(HO-1)基因

根据已知的人的SOD-1、HO-1基因的mRNA序列，设计引物，用RT-PCR扩增出这三种基因的cDNA序列。扩增产物酶切后连接到表达载体中(比如Novagen公司的pET-28a，分别构建成为pET-SOD-1、pET-HO-1上述载体经酶切鉴定及测序检测，序列正确。

2、构建融合蛋白基因

透皮结构域的核苷酸序列采用寡核苷酸合成。分别合成两条链引物，5’-CGGGATCCAGGAGGAGGAGGAGGAGGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGCTTCCC-3’(核酸序列如SEQ ID NO：4所示)，以及5’-GGGAAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTGGATCCCG-3’(核酸序列如SEQ ID NO：5所示)，上述两条引物含有透皮结构域编码基因以及BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点和保护碱基。引物退火后分别连接BamHⅠ和HindⅢ双到酶切后的pET-SOD-1和pET-HO-1载体中，构建成为pPD-SOD-1和pPD-HO-1上述载体经测序检测，序列正确。

3、融合基因在大肠杆菌中的表达

用构建好的载体pPD-SOD-1HE和pPD-HO-1分别转化带有DE3的大肠杆菌。菌液生长至OD600＝0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，在30℃诱导2小时。SDS-PAGE电泳分析证实，上述融合基因在大肠杆菌(DE3)中获得高效表达。

4、融合蛋白纯化

收集上述诱导表达的菌液，经过溶菌酶处理和超声破碎后，4℃下12000rpm离心30分钟，表达产物存在于上清液中，经镍柱亲和层析纯化，获得纯化后的融合蛋白，其纯度大于90％。

本发明的另一个目的是提供以本发明的融合蛋白中一种或两种混合为活性成分的抗氧化药物。在需要的时候，在上述药物中还可以含有一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的透皮促渗剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸附载体、润滑剂等。本发明的融合蛋白可以制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液及注射液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明巧妙地利用低分子量的寡聚精氨酸、赖氨酸多肽与人源的超氧化物歧化酶、血红素加氧酶融合，赋予了这两种酶新的功能-进细胞膜与透皮，使得他们可以进入跨过皮肤角质层以及细胞膜的阻挡，到表皮、真皮组织中发挥抗氧化作用，提高了这些细胞的抗氧化能力。本发明的融合蛋白具有很高的应用价值，可以作为一种高效的通过透皮给药的抗氧化药物。

附图说明：

图1为透皮结构域与SOD-1的融合蛋白表达载体pPD-SOD-1结构示意图。

图2为纯化前后的PD-SOD-1融合蛋白SDS-PAGE电泳结果。

图3为透皮结构域与SOD-1的融合蛋白PD-SOD-1进细胞免疫荧光照片。

图4融合蛋白PD-SOD-1对HEK-293细胞抗氧化作用图。

图5融合蛋白PD-SOD-1对角朊细胞抗氧化作用曲线。

图6融合蛋白PD-HO-1对HEK-293细胞抗氧化作用图。

图7融合蛋白PD-SOD-1与PD-HO-1联合抗氧化作用曲线。

图8融合蛋白PD-SOD-1的透皮作用免疫荧光照片。

图9融合蛋白Mut-PD-SOD-1的透皮作用免疫荧光照片。

具体实施方式

实施例1透皮结构域(Penetrating domain，PD)与SOD-1融合蛋白在大肠杆菌中表达

1、构建重组透皮结构域与SOD-1融合蛋白基因

1)用RT-PCR扩增SOD-1基因

采用TRIzoll抽提肝脏的总RNA，用引物P1和P2进行PCR扩增，P1：5’-CCCAAGCTTGC_GACGAAGGCCGTGTGC-3’，以及P2：5’-CCGCTCGAGTT_ATTTGGGCGATCCCAATTACACC-3’，下划线部分分别是HindⅢ与XhoⅠ的酶切位点。PCR扩增反应在50微升体系中采用高保真Pfu聚合酶进行扩增，扩增条件为94℃变性5min，94℃30s，51℃1min，72℃Imim，30个循环，72℃5mim。反应完成后，全部PCR反应液用1％琼脂糖中电泳，割胶回收约450bp条带(回收反应采用博大泰克公司回收试剂盒)。回收产物连接到T_A克隆载体中，用HindⅢ与XhoⅠ酶切后，连入pET-28a载体中，构建成为pET-28a-SOD-1，插入序列经测序鉴定，序列正确(测序采取双脱氧法，ABI 3730DNA测序仪，测序引物：T7 promoter primer，上海英骏公司完成)。穿透结构域的核苷酸序列和酶切位点序列采用寡核苷酸合成。分别合成两条链引物，5’-CGGGATCCAGG_AGGAGGAGGAGGAGGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGCTTCCC-3’，以及5’-GGGAAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTGGATCCCG-3’(上海生工)。引物分别溶于100μl纯水，各取20μl，加入40μl 1mol/L NaCl和20μl石蜡油，置于沸水中煮5min后让其缓慢冷却，自动退火。将退火产物连接到用HindⅢ与BamHⅠ消化的pET-281-SOD-1中，构建成为pPD-SOD-1，该载体经酶切及测序检测，序列正确(图1所示)。

2、融合基因在大肠杆菌中的表达

用构建的载体pPD-SOD-1与pET-28a-SOD-1(前者作为试验蛋白，后者作为对照)分别转化E.coli BL21(DE3)。菌液生长至OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)30℃诱导10小时。

3、融合蛋白纯化

上述诱导表达的菌液中加入溶菌酶处理一小时，经过超声破碎后，4℃12000rpm离心30分钟，表达产物溶于上清液中。取离心后上清至10ml Eppendorf管中，加入Ni-NTA(Novagen公司)，4℃，50rpm震荡2h。将上述混合物转移至层析柱中，待液体快流尽时加入4ml Wash Buffer(含有PBS及0.1M的咪唑)，洗涤层析柱。待液体快流尽时加入300μL洗脱液，(含有PBS及0.4M的咪唑)，在核酸蛋白质检测仪作用下收集流出的蛋白峰。纯化后液体经SDS-PAGE检验，分子量大小约为25KD，与计算值相符，获得融合蛋白纯度大于90％。(图2所示)。

实施例2免疫荧光检测融合蛋白进胞作用

体外培养的HEK-293细胞，生长到密度为用30％-40％时，在培养基中加入0.5-2μl纯化的PD-SOD-1融合蛋白，对照组加入纯化的SOD-1蛋白，4小时后弃掉培养液，用PBS漂洗三次；-20℃甲醇固定20分钟后，自然干燥10分钟。用PBS洗净10分钟后，用1％Triton-X100作用25min-30min，PBS漂洗10分钟。加入5％的小牛血清37℃封闭20分钟。加入200μL稀释1000倍的SOD-1一抗(上海康成生物有限公司)，4℃孵育过夜。次日用PBS漂洗10分钟后，加入罗丹明标记的二抗(稀释100倍)，37度孵育一小时；PBS漂洗15分钟后置于荧光显微镜下拍照。结果显示加入PD-SOD-1细胞内能观察到红色亮点，而在用SOD-1处理过的细胞中没有红色亮点，这表明透皮结构域能介导SOD-1融合蛋白进入细胞(图3所示)。

实施例3PD-SOD-1融合蛋白在HEK-293细胞中抗氧化作用检测

在体外培养的HEK-293细胞培养基中，试验组加入终浓度为5μM纯化后的PD-SOD-1蛋白，对照组加入同样剂量纯化后的SOD-1蛋白，两小时后更换培养基。一组加入终浓度为5mM甲基紫精(Paraquat)以产生超氧化物阴离子，另外一组加入PBS。12小时后用比色法测量细胞存活率。比色法采用MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-dip-henyltetrazolium bromide，Sigma)进行测定.结果表明加入在正常情况下，PD-SOD-1蛋白不影响细胞生长，但是自由基存在条件下PD-SOD-1蛋白的试验组细胞存活率能明显增高，证实PD-SOD-1融合蛋白进入细胞并具有明显抗氧化能力(图4所示)。

实施例4PD-SOD-1融合蛋白在角朊细胞中抗氧化作用检测

在原代培养的小鼠皮肤角朊细胞培养基中，试验组加入终浓度为0.1-10μM纯化后的PD-SOD-1蛋白，对照组加入终浓度为0.1-10μM纯化后的SOD-1蛋白，两小时后用胰酶和EDTA混合液消化细胞，离心去上清液，加入磷酸缓冲液动融，置于漩涡混匀器上剧烈混匀，再次离心，上清为SOD-1提取液。在二甲亚砜中加入NaOH，在有氧条件下可产生氧自由基，此时加入化学发光剂鲁米诺，会发出冷化学光。再取0.1mlSOD-1提取液加入发光溶液中，计算发光抑制率。抑制率越高，说明SOD-1浓度越高。结果显示试验组的SOD-1浓度显著高于对照组，说明含有转导结构域的SOD-1融合蛋白进入了角朊细胞中(图5所示)。

实施例5PD-HO-1融合蛋白在HEK-293细胞中抗氧化作用检测

采用实施例1的构建载体表达融合蛋白的方法，分别表达、纯化PD-HO-1与HO-1蛋白。在体外培养的HEK-293细胞培养基中，试验组加入终浓度为5μM纯化后的PD-HO-1蛋白，对照组加入同样剂量纯化后的HO-1蛋白，比较在有无自由基作用下细胞的存活率。蛋白加入4小时后，加入0.2mM的H₂O₂加入以产生氧自由基。12小时后，用前述的MTT比色法测量细胞存活率。结果表明加入PD-HO-1蛋白的试验组细胞存活率较加入HO-1的对照组增高30％，证实PD-HO-1融合蛋白进入细胞并能明显增高细胞的抗氧化能力(图6所示)。

实施例6PD-HO-1与PD-SOD-1联合抗氧化作用检测

在体外培养的HEK-293细胞培养基中，试验组加入终浓度为0.1-10μM纯化后的PD-HO-1与PD-SOD-1融合蛋白混合物(摩尔比1∶1)，对照组加入0.1-10μM纯化后的HO-1与SOD-1蛋白混合物(摩尔比1∶1)蛋白。2小时后加入0.2mM的H₂O₂，或5mM甲基紫精(Paraquat)以产生氧自由基。12小时后，用前述的MTT比色法测量细胞存活率。结果表明加入PD-HO-1与PD-SOD-1融合蛋白混合物的试验组细胞存活率明显高于对照组增高，，且呈现出剂量依赖性(图7所示)。

实施例7PD-SOD-1透皮作用检测

取成年Wistar大鼠两只(200g)，剃掉背部皮肤，试验组在裸露处涂抹10μl纯化后的PD-SOD-1蛋白，对照组加入10μl纯化后的SOD-1蛋白，2小时后再涂抹一次。第二次涂抹2小时后，处死大鼠，取下背部涂抹过蛋白的皮肤，进行冰冻切片。切片按照前述的方法进行免疫荧光试验。试验结果表明在涂抹了PD-SOD-1的大鼠皮肤切片中，表皮、真皮区域均能明显观察到SOD-1蛋白，表明透皮结构域能介导SOD-1蛋白进入皮肤，透过基底膜进入真皮层；而在涂抹SOD-1处理过的细胞中几乎观察不到SOD-1蛋白的存在，仅有的红色区域可能是内源性SOD-1蛋白(图8所示)。

实施例8透皮结构域突变的Mut-PD-SOD-1透皮作用检测

对编码SEQ.ID.NO：1氨基酸序列的核苷酸进行末位点突变，氨基酸序列如SEQ.ID.NO：6所示。按照前述方法表达、纯化蛋白Mut-PD-SOD-1。取成年Wistar大鼠两只(200g)，剃掉背部皮肤，试验组在裸露处涂抹10μl纯化后的Mut-PD-SOD-1蛋白，对照组加入10μl纯化后的SOD-1蛋白，2小时后再涂抹一次。第二次涂抹2小时后，处死大鼠，取下背部涂抹过蛋白的皮肤，进行冰冻切片。切片按照前述的方法进行免疫荧光试验。试验结果表明在涂抹了Mut-PD-SOD-1的大鼠皮肤切片中，真皮区域均同样能明显观察到SOD-1蛋白，表明透皮结构域基本碱性氨基酸骨架不改变，仅有点突变情况下仍能介导SOD-1蛋白进入皮肤，透过基底膜进入真皮层；而在涂抹SOD-1处理过的细胞中几乎观察不到SOD-1蛋白的存在，仅有的红色区域可能是内源性SOD-1蛋白(图9所示)。

序列表

<110>张舒羽

<120>一种透皮结构域及其衍生的具有透皮作用的的融合蛋白和其制备方法

<130>

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>1

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210>2

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>2

aggaggagga ggaggaggaa gaagaagaag aagaag 36

<210>3

<211>153

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>3

Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly

1 5 10 15

Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp

20 25 30

Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His

35 40 45

Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe

50 55 60

Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His

65 70 75 80

Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp

85 90 95

Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile

100 105 110

Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys

115 120 125

Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu

130 135 140

Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln

145 150

<210>4

<211>288

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>4

Met Glu Arg Pro Gln Pro Asp Ser Met Pro Gln Asp Leu Ser Glu Ala

1 5 10 15

Leu Lys Glu Ala Thr Lys Glu Val His Thr Gln Ala Glu Asn Ala Glu

20 25 30

Phe Met Arg Asn Phe Gln Lys Gly Gln Val Thr Arg Asp Gly Phe Lys

35 40 45

Leu Val Met Ala Ser Leu Tyr His Ile Tyr Val Ala Leu Glu Glu Glu

50 55 60

Ile Glu Arg Asn Lys Glu Ser Pro Val Phe Ala Pro Val Tyr Phe Pro

65 70 75 80

Glu Glu Leu His Arg Lys Ala Ala Leu Glu Gln Asp Leu Ala Phe Trp

85 90 95

Tyr Gly Pro Arg Trp Gln Glu Val Ile Pro Tyr Thr Pro Ala Met Gln

100 105 110

His Tyr Val Lys Arg Leu His Glu Val Gly Arg Thr Glu Pro Glu Leu

115 120 125

Leu Val Ala His Ala Tyr Thr Arg Tyr Leu Gly Asp Leu Ser Gly Gly

130 135 140

Gln Val Leu Lys Lys Ile Ala Gln Lys Ala Leu Asp Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Gly Glu Gly Leu Ala Phe Phe Thr Phe Pro Asn Ile Ala Ser Ala Thr

165 170 175

Lys Phe Lys Gln Leu Tyr Arg Ser Arg Met Asn Ser Leu Glu Met Thr

180 185 190

Pro Ala Val Arg Gln Arg Val Ile Glu Glu Ala Lys Thr Ala Phe Leu

195 200 205

Leu Asn Ile Gln Leu Phe Glu Glu Leu Gln Glu Leu Leu Thr His Asp

210 215 220

Thr Lys Asp Gln Ser Pro Ser Arg Ala Pro Gly Leu Arg Gln Arg Ala

22 5230 235 240

Ser Asn Lys Val Gln Asp Ser Ala Pro Val Glu Thr Pro Arg Gly Lys

245 250 255

Pro Pro Leu Asn Thr Arg Ser Gln Ala Pro Leu Leu Arg Trp Val Leu

260 265 270

Thr Leu Ser Phe Leu Val Ala Thr Val Ala Val Gly Leu Tyr Ala Met

275 280 285

<210>5

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

cgggatccag gaggaggagg aggaggaaga agaagaagaa gaagaagctt ccc 53

<210>6

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

gggaagcttc ttcttcttct tcttcttcct cctcctcctc ctcctggatc ccg 53

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>7

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Arg His

1 5 10

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

cccaagcttg cgacgaaggc cgtgtgc 27

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

ccgctcgagt tattgggcga tcccaattac acc 33

<210>10

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>10

Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Leu Met Lys Arg

1 5 10

<210>11

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>11

Pro Ile Arg Arg Arg Lys Lys Leu Arg Arg Leu Lys

1 5 10

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于含有透皮结构域，其含有选自以下序列：

a.其氨基酸序列如SEQ.ID.NO：1所示；

b.(a)序列的变体序列，含有一个或多个插入、缺失、替换但基本保持(a)序列的活性；

c.与(a)序列同源性至少有75％的序列。

2.根据权利要求书1所述的融合蛋白，其中透皮结构域与Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD-1)或人血红素加氧酶(HO-1)中的一种共价相连，连接发生在蛋白质的氨基端或羧基端，或沿着上述蛋白质任何不明显影响活性的位置。其中Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD-1)氨基酸序列如SEQ.ID.NO：2所示，人血红素加氧酶(HO-1)氨基酸序列如SEQ.ID.NO：3所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其制备方法包括以下步骤：

a.分别扩增超氧化物歧化酶(SOD-1)、人血红素加氧酶(HO-1)基因：根据已知的人的SOD-1、HO-1基因的mRNA序列，设计引物，用RT-PCR扩增出这三种基因的cDNA序列；扩增产物酶切后连接到表达载体中(比如Novagen公司的pET-28a，分别构建成为pET-SOD-1、pET-HO-1上述载体经酶切鉴定及测序检测；

b.构建融合蛋白基因：透皮结构域的核苷酸序列采用寡核苷酸合成。分别合成两条链引物，5’-CGGGATCCAGGAGGAGGAGGAGGAGGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGCTTCCC-3’(核酸序列如SEQID NO：4所示)，以及5’-GGGAAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTGGATCCCG-3’(核酸序列如SEQ ID NO：5所示)，上述两条引物含有透皮结构域编码基因以及BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点和保护碱基。引物退火后分别连接BamHⅠ和HindⅢ双到酶切后的pET-SOD-1和pET-HO-1载体中，构建成为pPD-SOD-1和pPD-HO-1上述载体经测序检测；

c.融合基因在大肠杆菌中的表达：用构建好的载体pPD-SOD-1HE和pPD-HO-1分别转化带有DE3的大肠杆菌。菌液生长至OD₆₀₀＝0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，在30℃诱导2小时；

d.融合蛋白纯化：收集上述诱导表达的菌液，经过溶菌酶处理和超声破碎后，4℃下12000rpm离心30分钟，表达产物存在于上清液中，经镍柱亲和层析纯化，获得纯化后的融合蛋白。

4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：可以和药学意义上可接受的辅料制成各种可供临床使用的剂型。