CN101796194A - 2-吡喃酮-4,6-二羧酸的大量纯化方法 - Google Patents

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下俊久
大原尚己
片山义博
重原淳孝
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    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Abstract

本发明提供由发酵生产得到的PDC的工业化纯化方法。2-吡喃酮-4，6-二羧酸的纯化方法，其特征为：使一价～四价的阳离子的盐存在于由微生物生产的含有2-吡喃酮-4，6-二羧酸的发酵液中；以及2-吡喃酮-4，6-二羧酸的纯化方法，其特征为：无需从由微生物生产的含有2-吡喃酮-4，6-二羧酸的发酵液中形成2-吡喃酮-4，6-二羧酸盐，而是萃取2-吡喃酮-4，6-二羧酸。

Description

2-吡喃酮-4，6-二羧酸的大量纯化方法
技术领域
本发明涉及由发酵生产获得的2-吡喃酮-4，6-二羧酸的工业化纯化方法。
背景技术
植物的主要成分木质素作为芳族高分子化合物，是普遍含在植物细胞壁中的生物质资源。但是，以木质素为主成分的来自植物的芳族成分由化学结构多样的成分构成，或具有复杂的高分子结构，因此尚未开发出有效的利用技术。目前已知的利用技术是从对该芳族成分进行碱分解等化学分解生成的低分子芳族分解产物中分离制备作为香料原料的香草醛。但是，目前尚未得知化学分解生成的香草醛以外的、大量低分子芳族物质的有效利用方法。因此，在造纸步骤中大量生成的木质素未经有效利用，只是作为重油的替代品燃烧。
另一方面，本发明人发现：通过水解或氧化分解、溶剂分解等化学分解法，用超临界水或超临界有机溶剂进行的物理化学分解法等，木质素等的植物芳族成分被变换为含有香草醛、丁香醛、香草酸、丁香酸、原儿茶酸等的低分子混合物，这5种化合物进一步被变换为可成为功能性塑料原料或化学制品原料的单一的中间物质2-吡喃酮-4，6-二羧酸。
本发明人报道了使用转化细胞，由这5种化合物制备2-吡喃酮-4，6-二羧酸的方法(例如参照日本特开2005-278549号公报)，其中，所述转化细胞保有编码构成用于发酵生产2-吡喃酮-4，6-二羧酸的多步反应工艺的4种酶(苯甲醛脱氢酶、脱甲基酶、原儿茶酸4，5-二加氧酶、4-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱氢酶)的基因。
但是，专利文献1中，作为2-吡喃酮-4，6-二羧酸的纯化方法，只记载了活性碳处理，详细情况不明确。另外，日本特开2000-32988号公报中公开了在α-羟基-γ-羧基粘康酸-ε半醛的存在下制备2-吡喃酮-4，6-二羧酸的方法，但完全未言及纯化方法。
发明内容
本发明要解决的课题在于：提供可用作功能性塑料原料或化学制品的原料的、由发酵生产得到的2-吡喃酮-4，6-二羧酸的工业化纯化方法。
本发明人针对现状进行了深入的研究，结果发现：通过使特定的盐存在于含有2-吡喃酮-4，6-二羧酸的微生物发酵液中，则可以以高纯度、高收率分离对应的2-吡喃酮-4，6-二羧酸盐，从而完成了本发明。本发明人还发现：无需形成2-吡喃酮-4，6-二羧酸盐，通过用特定的有机溶剂萃取该微生物发酵液，则可以以高纯度、高收率分离2-吡喃酮-4，6-二羧酸，从而完成了本发明。
即，
(1)本发明提供2-吡喃酮-4，6-二羧酸的纯化方法，其特征在于：使选自一价、二价、三价和四价的阳离子的盐存在于由微生物生产的含有2-吡喃酮-4，6-二羧酸的发酵液中。
(2)本发明提供(1)所述的纯化方法，其中，上述一价、二价、三价或四价的阳离子是金属离子、或铵离子或烷基铵离子。
(3)本发明提供(1)或(2)所述的纯化方法，其中，上述一价的阳离子选自钠、钾、铷、银、锂和铯。
(4)本发明提供(1)或(2)所述的纯化方法，其中，上述二价的阳离子选自镁、钙、铁(II)、铜(II)、锌、钡、钴、镍(II)、锰和铬(II)。
(5)本发明提供(1)或(2)所述的纯化方法，其中，上述三价的阳离子选自铁(III)、铝和镓。
(6)本发明提供(1)或(2)所述的纯化方法，其中，上述四价的阳离子选自锡(IV)、铅(IV)、钛(IV)和锗(IV)。
(7)本发明提供(1)-(6)中任一项所述的纯化方法，其中，上述一价、二价、三价或四价的阳离子的盐是选自氯化物、溴化物、硫酸盐、磷酸盐和碳酸盐的单盐；氰基配合物；或复盐。
(8)本发明提供(7)所述的纯化方法，其中，上述复盐是含有2种阳离子的复盐。
(9)本发明提供(7)所述的纯化方法，其中，上述一价的阳离子的盐是氯化钠、氯化钾、氯化铷、氯化银、溴化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
(10)本发明提供(7)所述的纯化方法，其中，上述二价的阳离子的盐是氯化镁或硫酸铜、或六氰基铁(II)酸钾。
(11)本发明提供(7)所述的纯化方法，其中，上述三价的阳离子的盐是氯化铁(III)或六氰基铁(III)酸钾。
(12)本发明提供(7)或(8)所述的纯化方法，其中，上述四价的阳离子的盐是锡(IV)酸钾。
(13)本发明提供(1)-(12)中任一项所述的纯化方法，该方法包括回收由于上述阳离子的盐的存在而析出的2-吡喃酮-4，6-二羧酸盐、溶解于水、接着在酸性条件下用乙酸乙酯、环戊酮或环己酮萃取的步骤。
(14)本发明提供(13)所述的纯化方法，其中，在上述萃取步骤时添加过量的强酸。
(15)本发明提供(1)-(14)中任一项所述的纯化方法，该方法包括回收由于上述阳离子的盐的存在而析出的2-吡喃酮-4，6-二羧酸盐、溶解于水、接着将该溶液用阳离子交换树脂处理的步骤。
(16)本发明提供(1)-(15)中任一项所述的纯化方法，其中，相对于上述发酵液中的2-吡喃酮-4，6-二羧酸，使用至少2倍摩尔的上述阳离子的盐。
(17)本发明提供2-吡喃酮-4，6-二羧酸的纯化方法，其特征在于：不从由微生物生产的含有2-吡喃酮-4，6-二羧酸的发酵液中形成2-吡喃酮-4，6-二羧酸盐，而是萃取2-吡喃酮-4，6-二羧酸。
(18)本发明提供(17)所述的纯化方法，其中，用乙酸乙酯、环戊酮或环己酮萃取。
(19)本发明提供(17)或(18)所述的纯化方法，其中，用乙酸乙酯萃取。
(20)本发明提供(17)-(19)中任一项所述的纯化方法，其中，在上述萃取步骤时添加过量的强酸。
(21)本发明提供(20)所述的纯化方法，其中，相对于上述发酵液，至少使用3重量％上述强酸。
附图简述
图1表示PDC-Na+复盐的结构。
图2表示各种PDC复盐的水溶解度。
根据本发明，可以以高纯度、高收率、且廉价地从含有2-吡喃酮-4，6-二羧酸的微生物发酵液中大量纯化2-吡喃酮-4，6-二羧酸。
实施发明的最佳方式
本发明的PDC的纯化法的特征在于：使一价、二价、三价或四价的阳离子的盐存在于由微生物生产的含有2-吡喃酮-4，6-二羧酸(以下称为“PDC”)的发酵液中，以盐的形式获得PDC；或在该发酵液中阻碍PDC盐的形成，以游离体的形式获得PDC。
对于由微生物生产的含有PDC的发酵液，为了以单一化合物的形式获得PDC，只要是在香草醛、丁香醛、香草酸、丁香酸、原儿茶酸等来自植物的低分子化合物或它们的混合物的存在下培养转化细胞获得的发酵液即可，没有特别限定。其中，所述转化细胞含有编码适合多步或一步发酵生产PDC的酶的基因。该发酵液例如有按照日本特开2005-278549号公报所述的方法获得的发酵液。在该公报记载的方法中，通常在1L该发酵液中产生10-20g PDC。下述的PDC纯化之前，优选通过离心分离、活性碳吸附等从该发酵液中除去菌体。活性碳吸附优选如下进行：向该发酵液中添加活性碳、混合搅拌，然后通过过滤等除去活性碳；或者使该发酵液从活性碳填充层中通过。
<形成PDC盐的方法>
使一价、二价、三价或四价的阳离子的盐存在于含有PDC的微生物发酵液中，析出PDC所对应的盐。
一价、二价、三价或四价的阳离子有：一价、二价、三价或四价的金属离子；铵离子；六亚甲基二胺、乙二胺、二乙醇胺、三乙醇胺等烷基铵离子等。
一价的阳离子例如有：钠、钾、铷、银、锂、铯等金属离子，其中优选钠离子、钾离子、铷离子或银离子。
二价的阳离子例如有：镁、钙、铁(II)、铜(II)、锌、钡、钴、镍(II)、锰、铬(II)等金属离子。
三价的阳离子例如有：铁(III)、铝、镓等离子。
四价的阳离子有：锡(IV)、铅(IV)、钛(IV)、锗(IV)等离子。
一价、二价、三价或四价的阳离子的盐有：氯化物、溴化物、氢氧化物、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、氰酸盐、硫氰酸盐等单盐；氨配合物(例如四氨合铜配合物)、氰基配合物(例如六氰基合铁配合物)、卤素配合物(例如四氯合铁配合物)、羟基配合物(例如氧化铝配合物)等配合物；复盐(优选含有2种阳离子的复盐)等。一价阳离子的盐具体有：氯化钾、氯化铷、氯化银、溴化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、或磷酸氢二钾，优选氯化钠、氯化钾、氯化铷、氯化银或溴化钠。二价阳离子的盐具体有：氯化镁或硫酸铜、或六氰基铁(II)酸钾。三价阳离子的盐具体有：氯化铁(III)、六氰基铁(III)酸钾、或明矾(例如钾明矾、铁明矾、铵铁矾等。四价阳离子的盐具体有：锡(IV)酸钾。
这些一价、二价、三价或四价的阳离子的盐也可以两种以上混合使用。
除上述一价、二价、三价或四价的阳离子之外，也可以使用氧钒离子(VO2+)、钛酸(TiO2)离子、氰离子、硫氰离子、含有硫羰基的离子性化合物等。
PDC在其2和4位具有羧酸基，这些羧酸基通过与上述的阳离子的盐接触，不是形成单一的PDC的羧酸盐，而是如图1所示，在PDC两个分子之间形成氢键，形成两个羰基在金属离子(图1中为钠离子)的周围配位的具有八面体六配位结构的复盐。以下，为了与在阳离子的盐项下记载的复盐区分，有时将PDC的以羰基为中心形成的复盐称为“PDC的复盐”。PDC的复盐结构已在各种文献(例如Acta.Cryst.(1992)C48，460-465)中有报道。图2表示PDC和一价阳离子形成的PDC的复盐的水溶解度。由图2可知，在由PDC和一价阳离子形成的复盐中，特别是PDC的钠盐、钾盐、铷盐或银盐，与游离的PDC、微生物培养基成分、由各种植物萃取的水溶性成分相比，水溶解度非常低(游离的PDC的水溶解度：182mM)。由此表明，特别是PDC的钠盐、钾盐、铷盐或银盐，可以使PDC容易地与大部分培养基成分或植物萃取水溶性成分分离、盐析，适合PDC的分离。
相对于微生物发酵液中存在的PDC，优选将上述的阳离子的盐大量地过量使用，例如优选至少使用2倍摩尔、特别优选使用2倍摩尔-10倍摩尔。为了提高盐析效果，也可以使存在有该阳离子的盐的发酵液冷却或浓缩。冷却时，将该发酵液在0-4℃左右静置12-24小时。盐析的PDC的复盐可通过过滤回收。
上述PDC的复盐可通过进一步实施以下两种不同的纯化步骤，以纯度更高的游离的PDC的形式获得。
(I)将上述PDC的复盐溶解于水、例如纯水中，在酸性条件下(pH1-2左右)用有机溶剂萃取，可以以游离的PDC的形式萃取PDC的复盐。萃取溶剂例如有：乙酸乙酯、环己酮、环戊酮、己烷、庚烷、甲苯、苯、二乙醚、四氢呋喃、氯仿和二氯甲烷，优选乙酸乙酯、环己酮或环戊酮，从沸点低的角度考虑，特别优选乙酸乙酯。在形成酸性条件时，可使用过量、优选水层的3％以上、更优选水层的3％-7％的强酸水溶液。强酸有：盐酸、硫酸、磷酸、硝酸等，特别优选盐酸。也可以根据需要，将所得的有机层用强酸水溶液处理多次。所得PDC可根据需要反复重结晶，由此可进一步提高纯度。
(II)将上述PDC的复盐溶解于水、例如纯水中，将该溶液用H型阳离子交换树脂进行处理，由此也可得到游离的PDC。H型阳离子交换树脂例如可使用凝胶型聚苯乙烯·磺酸型离子交换树脂——离子交换容量为2.0meq/ml左右的Amberlite(注册商标)IR120B、DIAION(注册商标)SK1B等。
可通过重结晶从所得的PDC的溶剂浓缩物或离子交换树脂的流出物的浓缩物中以晶体的形式获得PDC。根据需要反复重结晶，可进一步提高晶体的纯度。形成PDC的复盐的本纯化方法无需大容量的微生物发酵液的萃取操作，通过盐析即可简便地以盐的形式纯化PDC，同时可以容易地除去比PDC的复盐的水溶解度高的有机分子等。
<不形成PDC的复盐的方法>
在酸性条件下，通过用有机溶剂萃取含有PDC的微生物发酵液，可以以游离的PDC的形式分离PDC。本发明中使用的有机溶剂例如有乙酸乙酯、环己酮、环戊酮、己烷、庚烷、甲苯、苯、二乙醚、四氢呋喃、氯仿和二氯甲烷，优选乙酸乙酯、环戊酮或环己酮，从沸点低的角度考虑，特别优选乙酸乙酯。在用上述有机溶剂萃取之前，为了防止PDC的复盐的萃取，优选使该发酵液为强酸性，且将萃取后的有机溶剂用强酸水溶液清洗。强酸可使用盐酸、硫酸、磷酸、硝酸等，特别优选盐酸。优选在用有机溶剂萃取前后使用的强酸相对于微生物发酵液共计3-7％，特别优选3-5％。
为了除去上述发酵液中的蛋白质，在上述萃取步骤之前，可以使该发酵液中进一步存在丙酮；甲醇、乙醇等醇类等沸点较低的极性溶剂。存在醇类时，酸的添加优选在除去醇之后进行。
按照常规方法减压浓缩上述有机层，在纯水中使浓缩干燥固化物重结晶，由此可以以晶体的形式获得PDC。该PDC晶体通过反复重结晶，可以进一步提高纯度。
根据不包括PDC的复盐的形成的本纯化方法，通过一次萃取操作，可以以高的PDC纯度(99.5％-99.9％)、以完全的游离体形式获得PDC。根据本纯化方法获得的PDC不含有其盐，因此容易溶解于各种溶剂中，有望作为聚合物或化学制品的合成材料等，获得广泛的应用。
实施例
下面给出实施例来详细说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
(材料)
含有PDC的微生物发酵液按照日本特开2005-278549号公报所述的方法获得。
实施例1形成PDC钠盐的纯化方法
将1.5L含有PDC的微生物培养液进行离心分离(4000rpm，1小时，4℃)，除去菌体。向所得上清液中添加15g氯化钠，在4℃下放置12小时，使PDC钠盐析出，过滤回收，得到粗制PDC钠盐(22g)。
接着，将10g该粗制PDC钠盐溶解于600ml纯水中，用3N HCl调节至pH 1.5，用乙酸乙酯(100ml×3次)萃取。将乙酸乙酯层用100mlpH 1.0的盐酸水洗涤，减压浓缩，在4℃下进行结晶。过滤收集晶体，溶解于纯水中进行重结晶，在60℃下减压干燥，得到5.7g PDC(回收率70％)。纯度通过HPLC确定，为98.5％。
HPLC分析条件：装置：Waters；流量：0.2ml/分钟；注射量：50μl；柱：(センシユウ科学制造：ODS-1251-SS)；流动相：水∶乙腈∶乙酸＝74∶25∶1；检测波长：294nm。
实施例2-11
在25ml纯水中加入0.25g(1.4mmol)PDC(游离体)，得到PDC水溶液(0.054mol/L)。接着，按照表1所述的量向该PDC水溶液中添加下述表1列举的金属盐。根据金属盐的种类不同，添加后有立即析出的，也有加热后冷却而析出的，还有将水浓缩后析出的。过滤析出物(或沉淀物)，然后在60℃下干燥过夜，以报道的氯化钠的析出物的组成(Na2PDC2H2O)为基准，由析出物的重量计算PDC析出率(回收率)。结果如表1所示。
Figure GPA00001018125100101
实施例12形成PDC钠盐的纯化方法
将10g与实施例1同样操作得到的粗制PDC钠盐溶解于600mL纯水中，使其通过由100g离子交换容量2.2meq/ml的H型阳离子交换树脂(アンバ一ライト)制作的柱
Figure GPA00001018125100111
用纯水洗涤，用pH1的盐酸展开，收集流出组分，减压浓缩，在4℃下进行结晶。过滤收集晶体，溶解于纯水中进行重结晶，在60℃下减压干燥，得到7.2g PDC(回收率88％，纯度98.5％)。
实施例13不形成PDC钠盐的方法
在1.5L PDC原液(微生物培养后的滤液)中加入1.5L丙酮和45ml浓盐酸，搅拌混合。向其中加入20g活性碳(037-02115，和光纯药工业株式会社)，搅拌15分钟，然后在#131滤纸上铺满Celite(08003-02，Celite503，关东化学株式会社)，进行吸滤，除去活性碳。从该滤液中减压馏去丙酮，将溶液量浓缩至1.5L。在浓缩液中加入18ml浓盐酸，进行乙酸乙酯230ml×3次+150ml×2次的萃取。在乙酸乙酯萃取液中加入36g无水硫酸镁，干燥，吸滤，减压干燥固化。将所得固体减压干燥大约3小时(55℃)后，在60℃下溶解于15ml的蒸馏水中，加入2ml浓盐酸，在冰箱中放置，重结晶。过滤收集固体，减压干燥(55℃)，得到约13.2g PDC(收率68％，纯度98.5％)。
即使将PDC原液的量按比例增加(PDC原液50L)，也可得到同样的回收率。
产业实用性
本发明的方法可用作从含有2-吡喃酮-4，6-二羧酸的微生物发酵液中工业化纯化2-吡喃酮-4，6-二羧酸的方法。

Claims (21)

1.2-吡喃酮-4，6-二羧酸的纯化方法，其特征在于：使选自一价、二价、三价和四价的阳离子的盐存在于由微生物生产的含有2-吡喃酮-4，6-二羧酸的发酵液中。
2.权利要求1所述的纯化方法，其中，上述一价、二价、三价或四价的阳离子是金属离子、或铵离子或烷基铵离子。
3.权利要求1或2所述的纯化方法，其中，上述一价的阳离子选自钠、钾、铷、银、锂和铯。
4.权利要求1或2所述的纯化方法，其中，上述二价的阳离子选自镁、钙、铁(II)、铜(II)、锌、钡、钴、镍(II)、锰和铬(II)。
5.权利要求1或2所述的纯化方法，其中，上述三价的阳离子选自铁(III)、铝和镓。
6.权利要求1或2所述的纯化方法，其中，上述四价的阳离子选自锡(IV)、铅(IV)、钛(IV)和锗(IV)。
7.权利要求1-6中任一项所述的纯化方法，其中，上述一价、二价、三价或四价的阳离子的盐是选自氯化物、溴化物、硫酸盐、磷酸盐和碳酸盐的单盐；氰基配合物；或复盐。
8.权利要求7所述的纯化方法，其中，上述复盐是含有2种阳离子的复盐。
9.权利要求7所述的纯化方法，其中，上述一价的阳离子的盐是氯化钠、氯化钾、氯化铷、氯化银、溴化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾。
10.权利要求7所述的纯化方法，其中，上述二价的阳离子的盐是氯化镁或硫酸铜、或六氰基铁(II)酸钾。
11.权利要求7所述的纯化方法，其中，上述三价的阳离子的盐是氯化铁(III)或六氰基铁(III)酸钾。
12.权利要求7或8所述的纯化方法，其中，上述四价的阳离子的盐是锡(IV)酸钾。
13.权利要求1-12中任一项所述的纯化方法，该方法包括回收由于上述阳离子的盐的存在而析出的2-吡喃酮-4，6-二羧酸盐、溶解于水、接着在酸性条件下用乙酸乙酯、环戊酮或环己酮萃取的步骤。
14.权利要求13所述的纯化方法，其中，在上述萃取步骤时添加过量的强酸。
15.权利要求1-14中任一项所述的纯化方法，该方法包括回收由于上述阳离子的盐的存在而析出的2-吡喃酮-4，6-二羧酸盐、溶解于水、接着将该溶液用阳离子交换树脂处理的步骤。
16.权利要求1-15中任一项所述的纯化方法，其中，相对于上述发酵液中的2-吡喃酮-4，6-二羧酸，使用至少2倍摩尔的上述阳离子的盐。
17.2-吡喃酮-4，6-二羧酸的纯化方法，其特征在于：不从由微生物生产的含有2-吡喃酮-4，6-二羧酸的发酵液中形成2-吡喃酮-4，6-二羧酸盐，而是萃取2-吡喃酮-4，6-二羧酸。
18.权利要求17所述的纯化方法，其中，用乙酸乙酯、环戊酮或环己酮萃取。
19.权利要求17或18所述的纯化方法，其中，用乙酸乙酯萃取。
20.权利要求17-19中任一项所述的纯化方法，其中，在上述萃取步骤时添加过量的强酸。
21.权利要求20所述的纯化方法，其中，相对于上述发酵液，至少使用3重量％上述强酸。
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