本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2007年6月29日提交的美国临时申请60/947,284的优先权,将所述临时申请所公开的全部内容并入本申请作为参考。
发明内容
本发明提供纯化含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物的方法,其包括在醇和碱存在下使所述组合物反应以由甘油三酯制备多不饱和脂肪酸酯,并蒸馏所述组合物以回收含有多不饱和脂肪酸酯的馏分。
在一些实施方案中,在醇和碱存在下使组合物反应的步骤在约60℃至约120℃的温度进行。
在一些实施方案中,在醇和碱存在下使组合物反应的步骤进行约2小时至约12小时的时间。
在一些实施方案中,含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物没有经历选自如下的一种或多种处理:精制(refining)、脱溶剂(desolventization)、除臭(deodorization)、冬化(winterization)、冷过滤(chillfiltration)和漂白(bleaching)。
在一些实施方案中,含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物没有经历精制、脱溶剂、除臭、冬化、冷过滤和漂白。
在一些实施方案中,含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物来自选自如下的来源:植物、微生物、动物和它们的混合物。
在一些实施方案中,所述来源为选自如下的微生物:藻类、细菌、真菌和原生生物。
在一些实施方案中,所述来源选自植物,所述植物选自大豆(soybean)、玉米(corn)、稻米(rice)、红花(safflower)、向日葵(sunflower)、芸苔(canola)、亚麻(flax)、花生(peanut)、芥菜(mustard)、油菜籽(rapeseed)、鹰嘴豆(chickpea)、棉花(cotton)、扁豆(lentil)、白三叶草(white clover)、橄榄(olive)、棕榈(palm)、琉璃苣(borage)、月见草(evening primrose)、亚麻籽(linseed)和烟草(tobacco)及它们的混合物。
在一些实施方案中,所述来源选自经遗传修饰的植物和经遗传修饰的微生物,其中所述遗传修饰包括引入聚酮合成酶(polyketide synthase)基因。
在一些实施方案中,所述来源为选自如下的微生物:破囊壶菌目(Thraustochytriales)、甲藻(dinoflagellate)和被孢霉属(Mortierella)。
在一些实施方案中,所述微生物为破囊壶菌目、裂殖壶菌属(Schizochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)。
在一些实施方案中,所述微生物为隐甲藻属(Crypthecodinium)的甲藻。
在一些实施方案中,所述来源为选自水生动物的动物。
在一些实施方案中,所述多不饱和脂肪酸为具有至少18个碳的链长度的多不饱和脂肪酸。
在一些实施方案中,所述多不饱和脂肪酸为选自如下的多不饱和脂肪酸:二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid)、二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid)、花生四烯酸(arachidonic acid)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid)、十八碳四烯酸(stearidonic acid)、亚麻酸(linolenicacid)、α亚麻酸(alpha linolenic acid)、γ亚麻酸(gamma linolenic acid)、共轭亚麻酸(conjugated linolenic acid)和它们的混合物。
在一些实施方案中,所述多不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸。
在一些实施方案中,所述多不饱和脂肪酸为花生四烯酸。
在一些实施方案中,所述碱为具有式RO-M的碱,其中M为单价阳离子,以及RO为C1-6烷基醇的醇化物根(alkoxide)。
在一些实施方案中,所述碱为乙醇钠。
在一些实施方案中,所述醇为C1-6烷基醇。
在一些实施方案中,所述醇为乙醇,以及所述多不饱和脂肪酸酯为多不饱和脂肪酸乙酯。
在一些实施方案中,蒸馏组合物以回收含有多不饱和脂肪酸酯的馏分的步骤在真空下进行。
在一些实施方案中,蒸馏组合物以回收含有多不饱和脂肪酸酯的馏分的步骤在低于约170℃的温度进行。
在一些实施方案中,所回收的馏分含有至少约50wt.%、75wt.%、90wt.%或95wt.%的多不饱和脂肪酸酯。
在一些实施方案中,在醇和碱存在下使组合物反应的步骤通过直接酯交换(transesterification)由甘油三酯制备多不饱和脂肪酸酯。
在一些实施方案中,所述方法还包括a)将含有多不饱和脂肪酸酯的馏分与尿素在介质中混合(combine);b)冷却或浓缩所述介质以形成含有尿素的沉淀物和液体馏分;以及c)将所述沉淀物与所述液体馏分分离。
在一些实施方案中,所述介质还含有可溶解多不饱和脂肪酸酯的有机溶剂。
在一些实施方案中,所述有机溶剂包括具有1至4个碳原子的烷基醇。
在一些实施方案中,所述有机溶剂包括乙醇。
在一些实施方案中,将所述介质冷却至约0℃至约25℃的温度以形成含有尿素的沉淀物。
在一些实施方案中,所述含有尿素的沉淀物中的至少一部分在非氧化气氛下形成。
本发明还提供由含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物制备多不饱和脂肪酸酯的方法,其包括在醇和碱存在下对所述组合物进行酯交换以由甘油三酯制备多不饱和脂肪酸酯,并蒸馏所述组合物以回收含有多不饱和脂肪酸酯的馏分。
本发明还提供纯化含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物的方法,其包括在醇和碱存在下使所述组合物反应以由甘油三酯制备多不饱和脂肪酸酯,并分离出含有至少约75%多不饱和脂肪酸酯的馏分。
在一些实施方案中,所述分离步骤包括蒸馏。
本发明还提供制备含有多不饱和脂肪酸酯的组合物的方法,其包括在醇和碱存在下使含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物反应以由甘油三酯制备多不饱和脂肪酸酯,其中含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物没有经历选自如下的一种或多种处理:精制、脱溶剂、除臭、冬化、冷过滤和漂白。
在一些实施方案中,在醇和碱存在下使组合物反应的步骤在约60℃至约120℃的温度进行。
在一些实施方案中,在醇和碱存在下使组合物反应的步骤进行约2小时至约12小时的时间。
在一些实施方案中,所述方法还包括蒸馏所述组合物以回收含有多不饱和脂肪酸酯的馏分的步骤。
在一些实施方案中,含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物来自选自如下的来源:植物、微生物、动物和它们的混合物。
在一些实施方案中,所述来源为选自如下的微生物:藻类、细菌、真菌和原生生物。
在一些实施方案中,所述来源选自植物,所述植物选自大豆、玉米、稻米、红花、向日葵、芸苔、亚麻、花生、芥菜、油菜籽、鹰嘴豆、棉花、扁豆、白三叶草、橄榄、棕榈、琉璃苣、月见草、亚麻籽和烟草及它们的混合物。
在一些实施方案中,所述来源选自经遗传修饰的植物和经遗传修饰的微生物,其中所述遗传修饰包括引入聚酮合成酶基因。
在一些实施方案中,所述来源为选自如下的微生物:破囊壶菌目、甲藻和被孢霉属。
在一些实施方案中,所述来源为选自如下的微生物:破囊壶菌目、甲藻和被孢霉属。
在一些实施方案中,所述微生物为隐甲藻属的甲藻。
在一些实施方案中,所述来源为选自水生动物的动物。
在一些实施方案中,所述多不饱和脂肪酸为具有至少18个碳的链长度的多不饱和脂肪酸。
在一些实施方案中,所述多不饱和脂肪酸为选自如下的多不饱和脂肪酸:二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、十八碳四烯酸、亚麻酸、α亚麻酸、γ亚麻酸、共轭亚麻酸和它们的混合物。
在一些实施方案中,所述多不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸。
在一些实施方案中,所述多不饱和脂肪酸为花生四烯酸。
在一些实施方案中,所述碱为具有式RO-M的碱,其中M为单价阳离子,以及RO为C1-6烷基醇的醇化物根。
在一些实施方案中,所述碱为乙醇钠。
在一些实施方案中,所述醇为C1-6烷基醇。
在一些实施方案中,所述醇为乙醇,以及所述多不饱和脂肪酸酯为多不饱和脂肪酸乙酯。
在一些实施方案中,蒸馏组合物以回收含有多不饱和脂肪酸酯的馏分的步骤在真空下进行。
在一些实施方案中,蒸馏组合物以回收含有多不饱和脂肪酸酯的馏分的步骤在低于约170℃的温度进行。
在一些实施方案中,所回收的馏分含有至少约50wt.%、75wt.%、90wt.%或95wt.%的多不饱和脂肪酸酯。
在一些实施方案中,在醇和碱存在下使组合物反应的步骤通过直接酯交换由甘油三酯制备多不饱和脂肪酸酯。
本发明还提供一种组合物,其包含至少约90wt.%的二十二碳六烯酸乙酯,其中所述组合物还含有至少约0.1wt.%的4,7,10,13,16,19,22,25-二十八碳八烯酸(C28:8)或其酯。
在一些实施方案中,所述组合物含有至少约0.5wt.%、1.0wt.%或1.2wt.%的4,7,10,13,16,19,22,25-二十八碳八烯酸(C28:8)或其酯。
在一些实施方案中,所述组合物还含有至少约0.1wt.%、0.3wt.%、0.4wt.%或0.5wt.%的二十二碳五烯酸(n-3)或其酯。
在一些实施方案中,所述组合物含有至少约92wt.%或95wt.%的二十二碳六烯酸乙酯。
在一些实施方案中,所述组合物还含有小于约1wt.%、0.5wt.%或0.25wt.%的二十碳五烯酸或其酯。
本发明还提供一种组合物,其包含至少约90wt.%的二十二碳六烯酸乙酯,其中所述组合物还含有至少约0.1wt.%的二十二碳五烯酸(n-3)或其酯。
在一些实施方案中,所述组合物含有至少约0.3wt.%、0.4wt.%或0.5wt.%的二十二碳五烯酸(n-3)或其酯。
在一些实施方案中,所述组合物还含有至少约0.5wt.%、0.75wt.%、1.0wt.%或1.2wt.%的4,7,10,13,16,19,22,25-二十八碳八烯酸(C28:8)或其酯。
在一些实施方案中,所述组合物含有至少约92wt.%或95wt.%的二十二碳六烯酸乙酯。
在一些实施方案中,所述组合物还含有小于约1wt.%、0.5wt.%或0.25wt.%的二十碳五烯酸或其酯。
本发明还提供一种组合物,其包含至少约90wt.%的二十二碳六烯酸乙酯,其中所述组合物还含有至少一种额外脂肪酸或其酯,所述额外脂肪酸或其酯在压力为0.8mmHg时具有约150-170℃的沸点。
本发明还提供一种组合物,其包含至少约70wt.%的二十二碳六烯酸乙酯和至少约25wt.%的二十二碳五烯酸(n-6)乙酯。
在一些实施方案中,所述组合物还含有小于约4%的饱和脂肪酸或其酯。
在一些实施方案中,所述饱和脂肪酸或其酯具有少于20个碳。
在一些实施方案中,所述饱和脂肪酸或其酯具有14或16个碳。
本发明还提供一种组合物,其包含至少约90wt.%的二十二碳六烯酸乙酯和二十二碳五烯酸(n-6)乙酯的组合。
在一些实施方案中,所述组合物含有至少约10wt.%的二十二碳六烯酸乙酯和至少约10wt.%的二十二碳五烯酸(n-6)乙酯。
在一些实施方案中,所述组合物还含有小于约4%的饱和脂肪酸或其酯。
在一些实施方案中,所述饱和脂肪酸或其酯具有少于20个碳。
在一些实施方案中,所述饱和脂肪酸或其酯具有14或16个碳。
本发明还提供一种组合物,所述组合物含有至少约90wt.%的二十二碳六烯酸乙酯和二十二碳五烯酸(n-6)乙酯的组合,其中所述组合物还含有至少一种额外脂肪酸或其酯,所述额外脂肪酸或其酯在压力为0.5mmHg时具有约150-175℃的沸点。
本发明还提供制备含有多不饱和脂肪酸酯的组合物的方法,其包括在醇和碱存在下使含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物反应以由甘油三酯制备多不饱和脂肪酸酯,其中含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物具有选自如下的至少一个特征:至少约300ppm的磷(phosphorus)、至少约0.4%的游离脂肪酸和至少约0.2meq/kg的过氧化值(peroxide value)。
本发明还提供纯化含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物的方法,其中所述组合物具有选自如下的至少一个特征:至少约300ppm的磷、至少约0.4%的游离脂肪酸和至少约0.2meq/kg的过氧化值,所述方法包括a)在醇和碱存在下使所述组合物反应以由甘油三酯制备多不饱和脂肪酸酯;以及b)蒸馏所述组合物以回收含有多不饱和脂肪酸酯的馏分。
本发明还提供一种组合物,其包含至少约60wt.%的花生四烯酸酯。
在一些实施方案中,所述组合物还含有小于约10wt.%的二十碳五烯酸。
在一些实施方案中,花生四烯酸酯为花生四烯酸乙酯。
本发明还提供治疗具有高水平甘油三酯的受试者的方法,其包括向所述受试者给药权利要求68、81、94、95、99或104的组合物。
本发明还提供治疗患有神经障碍、痴呆或痴呆前相关病症(pre-dementiarelated condition)的受试者的方法,其包括向所述受试者给药权利要求68、81、94、95、99或104的组合物。
具体实施方式
本发明提供纯化含有具有PUFA残基的甘油三酯的组合物的新颖方法。在各个方面,本发明包括在醇和碱存在下使所述组合物反应以由甘油三酯制备多不饱和脂肪酸酯。在一个实施方案中,将本发明有利且有效地实施于没有经历常规加工方法的相对粗制油(relative crude oil),所述常规加工方法可包括精制、漂白、脱臭和冬化。在另一个方面,本发明包括由甘油三酯制备酯,然后蒸馏所得组合物以回收含有多不饱和脂肪酸酯的馏分。在另一个实施方案中,通过尿素结晶(urea crystallization)对含有多不饱和脂肪酸酯的馏分进行进一步纯化。本发明可有效且划算地直接由粗制油或经加工的油(processed oil)制备PUFA酯。
用于本发明方法的起始物质为含有具有PUFA残基的甘油三酯的组合物。术语″油″和″含有具有PUFA残基的甘油三酯的组合物″在本申请全文中可互换使用。本申请使用的″甘油三酯″是甘油和三个脂肪酸残基的酯,其具有化学通式CH2(OOCR1)CH(OOCR2)CH2(OOCR3),其中OOCR1、OOCR2和OOCR3各自代表脂肪酸残基。合适的甘油三酯含有至少一个PUFA。在一些实施方案中,所述PUFA具有至少18个碳的链长度。所述PUFA在本申请中称为长链PUFA或LC PUFA。在一些实施方案中,所述PUFA可以是二十二碳六烯酸C22:6n-3(DHA)、ω-3二十二碳五烯酸C22:5n-3(DPA)、ω-6二十二碳五烯酸C22:5n-6(DPA)、花生四烯酸C20:4n-6(ARA)、二十碳五烯酸C20:5n-3(EPA)、十八碳四烯酸(SDA)、亚麻酸(LLA)、α亚麻酸(ALA)、γ亚麻酸(GLA)、共轭亚麻酸(CLA)或它们的混合物。所述PUFA也可按在天然脂质中发现的任意常见形式存在,所述形式包括但不限于甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、磷脂、游离脂肪酸或这些脂肪酸的天然或合成衍生物形式(例如脂肪酸的钙盐等)。当提到本发明使用的油或其它含有具有PUFA残基的甘油三酯的组合物时,其可指含有仅具有单一类型的LC PUFA残基(例如DHA)的甘油三酯的组合物或含有具有多于一种类型的LC PUFA残基(例如DHA、EPA和ARA中的两种以上)的混合物的甘油三酯的组合物。
含有具有PUFA残基的甘油三酯的组合物可由任意合适的来源得到或源自任意合适的来源,所述来源为例如植物(包括含油种子)、微生物、动物或它们的混合物。所述微生物可以是藻类、细菌、真菌或原生生物。用于使含有营养物和/或PUFA的微生物生长的微生物来源和方法是本领域已知的(Industrial Microbiology and Biotechnology,2nd edition,1999,AmericanSociety for Microbiology)。例如,在发酵罐中所述微生物可在发酵培养基中培养。由微生物产生的油可用在本发明方法和组合物中。在一些实施方案中,生物体(organism)包括选自如下的那些生物体:金藻(例如管毛生物界(Stramenopile)的微生物)、绿藻、硅藻(diatom)、甲藻(例如甲藻目(Dinophyceae)的微生物,其包括隐甲藻属的成员,例如寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii))、酵母和毛霉属(Mucor)和被孢霉属的真菌(包括但不限于Mortierellaalpina和Mortierella sect.schmuckeri)。管毛生物界微生物组群的成员包括微藻(microalgae)和藻样微生物(algae-like microorganism),其包括如下的微生物组群:Hamatores、Proteromonads、Opalines、Develpayella、Diplophrys、Labrinthulids(网粘菌)、Thraustochytrids(破囊壶菌)、Biosecids、Oomycetes、Hypochytridiomycetes、Commation、Reticulosphaera、Pelagomonas、Pelagococcus、Ollicola、Aureococcus、Parmales、Diatoms、Xanthophytes、Phaeophytes(褐藻)、Eustigmatophytes、Raphidophytes、Synurids、Axodines(包括Rhizochromulinaales、Pedinellales、Dictyochales)、Chrysomeridales、Sarcinochrysidales、Hydrurales、Hibberdiales和Chromulinales。所述破囊壶菌(Thraustochytrid)包括裂殖壶菌属(种包括aggregatum、limnaceum、mangrovei、minutum、octosporum)、破囊壶菌属(种包括arudimentale、aureum、benthicola、globosum、kinnei、motivum、multirudimentale、pachydermum、proliferum、roseum、striatum)、Ulkenia属(种包括amoeboidea、kerguelensis、minuta、profunda、radiate、sailens、sarkariana、schizochytrops、visurgensis、yorkensis)、Aplanochytrium属(种包括haliotidis、kerguelensis、profunda、stocchinoi)、Japonochytrium属(种包括marinum)、Althornia属(种包括crouchii)和Elina属(种包括marisalba、sinorifica)。所述网粘菌(Labrinthulid)包括Labyrinthula属(种包括algeriensis、coenocystis、chattonii、macrocystis、macrocystis atlantica、macrocystis macrocystis、marina、minuta、roscoffensis、valkanovii、vitellina、vitellina pactfica、vitellina vitellina、zopfi)、Labyrinthomyxa属(种包括marina)、Labyrinthuloides属(种包括haliotidis、yorkensis)、Diplophrys属(种包括archeri)、Pyrrhosorus*属(种包括marinus)、Sorodiplophrys*属(种包括stercorea)、Chlamydomyxa*属(种包括labyrinthuloides、montana)。(*=目前对这些属的确切分类学归属没有达成共识)。
合适的微生物包括能产生含有ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸的脂质的那些微生物,特别要描述的是能产生含有DHA、DPA、EPA或ARA的油的微生物。更具体地,优选的微生物为藻类,例如破囊壶菌目的破囊壶菌,其包括破囊壶菌属(包括Ulkenia属)和裂殖壶菌属,并包括在共同受让的美国专利5,340,594和5,340,742中披露的破囊壶菌目(这两项专利都授权给Barclay),将这两项专利都整体并入本申请作为参考。更优选地,所述微生物选自具有如下鉴别特征的微生物:ATCC编号:20888、ATCC编号:20889、ATCC编号:20890、ATCC编号:20891和ATCC编号:20892。因为Ulkenia属是否为不同于破囊壶菌属的属在专家中尚有争议,所以出于本申请的目的,破囊壶菌属包括Ulkenia属。还优选的是菌株Mortierella schmuckeri(例如包括ATCC 74371)和菌株Mortierella alpina。还优选的是菌株寇氏隐甲藻,其包括具有如下鉴别特征的微生物:ATCC编号:30021、30334-30348、30541-30543、30555-30557、30571、30572、30772-30775、30812、40750、50050-50060和50297-50300。含油微生物(oleaginous microorganism)也是优选的。将本申请使用的″含油微生物″定义为能以脂质形式积累大于20%其细胞干重的微生物。经遗传修饰的产生含有PUFA的油的微生物也适于本发明。这些微生物可包括天然产生PUFA的经遗传修饰的微生物和不天然产生PUFA但经遗传修饰以产生PUFA的微生物。
合适的生物体可得自多种可得到的来源(包括从天然环境收集)。例如,美国典型培养物保藏中心目前列举了多种公众可得到的如上鉴别的微生物菌株。本申请使用的任意生物体或任意具体类型的生物体包括野生株、突变体或重组类型。对这些生物体进行培养或使这些生物体生长的生长条件是本领域已知的,且就这些生物体中的至少一些而言合适的生长条件参见例如美国专利5,130,242、美国专利5,407,957、美国专利5,397,591、美国专利5,492,938、美国专利5,711,983和美国专利6,607,900,将这些专利都整体并入本申请作为参考。当使用微生物油时,将所述微生物在有效的培养基(在本申请中将其定义为能促进油产生的任意培养基)中培养。优选地,所述有效的培养基也促进微生物快速生长。所述微生物可按常规发酵模式培养,所述常规发酵模式包括但不限于分批培养、补料分批培养和连续培养。
适于本发明组合物和方法的油的另一种来源包括植物来源,例如含油种子植物。在可选择的实施方案中,产生PUFA的植物可包括经遗传工程化以表达产生PUFA的基因的那些植物和天然产生PUFA的那些植物。所述基因可包括对参与经典脂肪酸合成酶途径的蛋白质进行编码的基因或对参与PUFA聚酮合成酶(PKS)途径的蛋白质进行编码的基因。参与经典脂肪酸合成酶途径的基因和蛋白质及经遗传修饰(用所述基因转化)的生物体例如植物参见例如Napier and Sayanova,Proceedings of the Nutrition Society(2005),64:387-393、Robert et a1.,Functional Plant Biology(2005)32:473-479或美国专利申请公开号2004/0172682。PUFA PKS途径、参与该途径的基因和蛋白质及针对表达和产生PUFA而经遗传修饰(用所述基因转化)的微生物和植物详细描述在美国专利6,140,486、美国专利6,566,583、美国专利申请公开号20020194641、美国专利7,211,418、美国专利申请公开号20050100995A1、美国专利申请公开号20070089199、PCT公开号WO 05/097982和美国专利申请公开号20050014231中,将它们各自整体并入本申请作为参考。
适于用在本发明中的含油种子作物包括经遗传修饰以产生上述PUFA的大豆、玉米、稻米、红花、向日葵、芸苔、亚麻、花生、芥菜、油菜籽、鹰嘴豆、棉花、扁豆、白三叶草、橄榄、棕榈油、琉璃苣、月见草、亚麻籽和烟草。
用于微生物和植物的遗传转化技术是本领域公知的。用于微生物的转化技术是本领域公知的,并参见例如Sambrook et al.,1989,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press。用于对甲藻进行转化的通用技术(可对其进行调整以用于寇氏隐甲藻)详细描述在Lohuisand Miller,The Plant Journal(1998)13(3):427-435中。用于对破囊壶菌进行遗传转化的通用技术详细描述在美国专利申请公开号20030166207(2003年9月4日公开)中。用于对植物进行遗传工程化的方法也是本领域公知的。例如,已开发出多种用于对植物进行转化的方法,其包括生物转化方案和物理转化方案。参见例如Miki et al.,″Procedures for Introducing Foreign DNAinto Plants″in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.and Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)pp.67-88。此外,用于对植物细胞或组织进行转化和使植物再生的载体和体外培养方法是可得到的。参见例如Gruber et al.,″Vectors for Plant Transformation″inMethods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.andThompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)pp.89-119。还参见Horsch et al.,Science 227:1229(1985)、Kado,C.I.,Crit.Rev.Plant.Sci.10:1(1991)、Moloney et al.,Plant Cell Reports 8:238(1989)、美国专利4,940,838、美国专利5,464,763、Sanford et al.,Part.Sci.Technol.5:27(1987)、Sanford,J.C.,Trends Biotech.6:299(1988)、Sanford,J.C.,Physiol.Plant79:206(1990)、Klein et al.,Biotechnology 10:268(1992)、Zhang et al.,Bio/Technology9:996(1991)、Deshayes et al.,EMBO J.,4:2731(1985)、Christouet al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA 84:3962(1987)、Hain et al.,Mol.Gen.Genet.199:161(1985)、Draper et al.,Plant Cell Physiol.23:451(1982)、Donn et al.,InAbstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue CultureIAPTC,A2-38,p.53(1990)、D’Halluin et al.,Plant Cell 4:1495-1505(1992)和Spencer et al.,Plant Mol.Biol.24:51-61(1994)。
当含油种子植物为含有PUFA的油的来源时,可收获所述种子并进行加工以从所收获的种子中除去任意杂质、碎屑(debris)或不可消化的部分。加工步骤基于含油种子的类型而变化且是本领域已知的。加工步骤可包括脱粒(例如当将大豆种子与豆荚分离时)、剥壳(除去果实、种子或坚果的干燥外部包覆物或外壳)、干燥、净化、碾碎(griding)、磨粉(milling)和压片(flaking)。在所述种子已被加工从而除去任意杂质、碎屑或不可消化的物质后,可将它们加到水溶液中,然后混合以形成浆液。在一些实施方案中,在与水混合前进行磨粉、破碎或压片。以该方式产生的浆液可按与就微生物发酵液所述相同的方式进行处理和加工。
适于本发明组合物和方法的含有PUFA的油的另一种生物质来源包括动物来源。动物来源的实例包括水生动物(例如鱼、海洋哺乳动物和甲壳类动物例如磷虾(krill)和其它磷虾(euphausid))和动物组织(例如脑、肝、眼等)及动物产品例如蛋和奶。用于从所述来源中回收含有PUFA的油的技术是本领域已知的。
尽管在本发明一个实施方案中,含有具有PUFA残基的甘油三酯的组合物可以是粗制油(以下更详细地讨论),但可用在本发明中的其它所述组合物可通过本领域技术人员已知的任意合适方法从它们的来源中回收。例如,油可通过用溶剂(例如氯仿、己烷、二氯甲烷、甲醇等)萃取来回收,或通过超临界流体萃取来回收。可选择地,所述油可使用萃取技术来萃取,所述萃取技术参见例如美国专利6,750,048和PCT专利申请US01/01806(这两项专利都是2001年1月19日提交的且题目为″Solventless Extraction Process”),将它们整体并入本申请作为参考。其它萃取和/或纯化技术参见PCT专利申请PCT/IB01/00841(题目为“Method for the Fractionation of Oil and PolarLipid-Containing Native Raw Materials”且在2001年4月12日提交)、PCT专利申请PCT/IB01/00963(题目为“Method for the Fractionation of Oil and PolarLipid-Containing Native Raw Materials Using Water-Soluble Organic Solventand Centrifugation”且在2001年4月12日提交)、美国临时专利申请60/291,484(题目为“Production and Use of a Polar Lipid-Rich FractionContaining Stearidonic acid and Gamma Linolenic from Plant Seeds andMicrobes”且在2001年5月14日提交)、美国临时专利申请60/290,899(题目为“Production and Use of a Polar-Lipid Fraction Containing ω-3and/or ω-6Highly Unsaturated Fatty Acids from Microbes,Genetically Modified PlantSeeds and Marine Organisms”且在2001年5月14日提交)、美国专利6,399,803(题目为“Process for Separating a Triglyceride Comprising aDocosahexaenoic Acid Residue from a Mixture of Triglycerides”、在2000年2月17日提交且在2002年6月4日授权)和PCT专利申请US01/01010(题目为“Process for Making an Enriched Mixture of Polyunsaturated Fatty AcidEsters”且在2001年1月11日提交),将这些文献都整体并入本申请作为参考。可对经萃取的油进行减压蒸发以得到浓缩的油物质的样品。用于对生物质进行酶处理以回收脂质的方法参见美国临时专利申请60/377,550(题目为″HIGH-QUALITY LIPIDS AND METHODS FOR PRODUCING BYENZYMATIC LIBERATION FROM BIOMASS”且在2002年5月3日提交)、PCT专利申请PCT/US03/14177(题目为″HIGH-QUALITY LIPIDS ANDMETHODS FOR PRODUCING BY ENZYMATIC LIBERATION FROMBIOMASS”且在2003年5月5日提交)、共同待审的美国专利申请10/971,723(题目为″HIGH-QUALITY LIPIDS AND METHODS FORPRODUCING BY LIBERATION FROM BIOMASS”且在2004年10月22日提交)、欧洲专利公开号0776356和美国专利5,928,696(这两项专利的题目都为“Process for extracting native products which are not water-soluble fromnative substance mixtures by centrifugal force”),将这些文献公开的内容整体并入本申请作为参考。
在一些实施方案中,得自上述来源的油可作为用于本发明方法的起始物质,甚至当所述油没有经历常规加工时也可如此。可不经历的所述常规加工的实例包括精制(例如物理精制、硅胶精制(silica refining)或苛性碱精制(caustic refining))、脱溶剂、除臭、冬化、冷过滤和/或漂白。因此,在一些实施方案中,含有具有PUFA残基的甘油三酯的组合物没有经历选自如下的一种或多种处理:精制、脱溶剂、除臭、冬化、冷过滤和漂白,以及在其它实施方案中,所述组合物没有经历精制、脱溶剂、除臭、冬化、冷过滤和漂白中的任一种。
在本发明另一个方面,含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物可以是这样的油,所述油具有没有经历常规加工(例如精制、脱溶剂、除臭、冬化、冷过滤和漂白)的油的特征。因此,合适的油可具有未经加工的油的化学特征或物理特征。例如,所述油可含有如下水平的不希望的组分(例如杂质),所述水平通常在经常规加工的油中是不存在的。例如,所述油可含有约300ppm的磷至约1000ppm的磷。在一些实施方案中,所述油含有至少约300ppm的磷、至少约400ppm的磷、至少约500ppm的磷、至少约600ppm的磷、至少约650ppm的磷、至少约700ppm的磷、至少约750ppm的磷、至少约800ppm的磷、至少约850ppm的磷、至少约900ppm的磷、至少约950ppm的磷或至少约1000ppm的磷。在另一个方面,所述油可含有范围为约0.4wt.%至约1.4wt.%的游离脂肪酸。在一些实施方案中,所述油含有至少约0.4wt.%的游离脂肪酸、至少约0.6wt.%的游离脂肪酸、至少约0.8wt.%的游离脂肪酸、至少约0.9wt.%的游离脂肪酸、至少约1.0wt.%的游离脂肪酸、至少约1.1wt.%的游离脂肪酸、至少约1.2wt.%的游离脂肪酸、至少约1.3wt.%的游离脂肪酸或至少约1.4wt.%的游离脂肪酸。在另一个方面,所述油可具有范围为约0.2meq/kg至约2.5meq/kg的过氧化值。在一些实施方案中,所述油具有至少约0.2meq/kg的过氧化值、至少约0.4meq/kg的过氧化值、至少约0.6meq/kg的过氧化值、至少约0.8meq/kg的过氧化值、至少约1.0meq/kg的过氧化值、至少约1.2meq/kg的过氧化值、至少约1.4meq/kg的过氧化值、至少约1.5meq/kg的过氧化值、至少约1.6meq/kg的过氧化值、至少约1.7meq/kg的过氧化值、至少约1.8meq/kg的过氧化值、至少约1.9meq/kg的过氧化值、至少约2.0meq/kg的过氧化值、至少约2.1meq/kg的过氧化值、至少约2.2meq/kg的过氧化值、至少约2.3meq/kg的过氧化值、至少约2.4meq/kg的过氧化值或至少约2.5meq/kg的过氧化值。
在一些实施方案中,粗制油可使用标准技术从微生物中分离出来而不经历进一步的精制或纯化。在所述实施方案中,所述油为仅经历溶剂萃取(例如己烷萃取、异丙醇萃取等)的微生物油(microbial oil)。
在其它实施方案中,含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物(例如以上描述的油)可经历进一步的加工步骤(例如精制、脱溶剂、除臭、冬化、冷过滤和/或漂白)。所述″经加工的″油包括经历溶剂萃取和一个或多个上述额外加工步骤的微生物油。在一些实施方案中,油经最低程度加工。″经最低程度加工的″油包括经历溶剂萃取和过滤的微生物油。在一些实施方案中,经最低程度加工的油还经历冬化。
本发明方法涉及在醇和碱存在下使含有具有PUFA残基的甘油三酯的组合物反应以由甘油三酯制备PUFA酯。
适于在本发明中使用的醇包括具有1至6个碳原子的任意低级烷基醇(即C1-6烷基醇)。抛开理论的束缚,认为在本发明方法中使用低级烷基醇可制备PUFA低级烷基酯。例如,使用乙醇可制备乙酯。在一些实施方案中,所述醇为甲醇或乙醇。在这些实施方案中,所制备的PUFA酯分别为PUFA甲酯或PUFA乙酯。在本发明方法中,所述醇通常占所述组合物、所述醇和所述碱的混合物的约25wt.%至约50wt.%、约30wt.%至约45wt.%或约35wt.%至约40wt.%。在一些实施方案中,所述醇占所述组合物、所述醇和所述碱的混合物的约38wt.%。在一些实施方案中,可将所述组合物和所述碱加到纯的乙醇或纯的甲醇中。通常,所使用的醇量可随含有具有PUFA残基的甘油三酯的油或组合物在醇中的溶解度而变化。
本领域已知的适于用作反应物的任意碱都可用在本发明中。具有式RO-M的碱(其中M为单价阳离子,以及RO为C1-6烷基醇的醇化物根)特别适于本发明。合适的碱的实例包括元素钠、甲醇钠、乙醇钠、甲醇钾和乙醇钾。在一些实施方案中,所述碱为乙醇钠。在本发明方法中,所述碱通常以如下量加到含有所述组合物和所述醇的反应步骤中:甘油三酯的约0.5至约1.5摩尔当量、甘油三酯的约0.7至约1.4摩尔当量、甘油三酯的约0.9至约1.3摩尔当量或甘油三酯的约1.0至约1.2摩尔当量。在一些实施方案中,所述碱通常以如下量加到含有所述组合物和所述醇的反应步骤中:甘油三酯的约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、1.0、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.10、1.15、1.2、1.3、1.4或1.5摩尔当量。在一些实施方案中,所述碱以甘油三酯的1.04摩尔当量加到含有所述组合物和所述醇的反应步骤中。
使含有具有多不饱和脂肪酸残基的甘油三酯的组合物、醇和碱在如下温度一起反应如下时间,所述温度和时间允许脂肪酸残基与醇形成酯。合适的反应时间和温度可由本领域技术人员确定以形成酯。抛开理论的束缚,认为在反应步骤中PUFA残基与甘油三酯的甘油骨架断裂,且就每个PUFA残基而言形成酯。在一些实施方案中,在醇和碱存在下使组合物反应的步骤在以下温度进行:约60℃至约120℃、约70℃至约110℃、约75℃至约100℃或约80℃至约90℃的温度。在另一个实施方案中,在醇和碱存在下使组合物反应的步骤在以下温度进行:约75℃、80℃、85℃、90℃或95℃。在一些实施方案中,在醇和碱存在下使组合物反应的步骤进行约2小时至约12小时、约3小时至约11小时、约4小时至约10小时、约5小时至约9小时或约6小时至约8小时。在一些实施方案中,在醇和碱存在下使组合物反应的步骤进行约5.5、6、6.5、7、7.5、8或8.5小时。
在一个实施方案中,使油组合物、醇和碱反应的步骤可通过使组分回流来进行以制备PUFA酯。在其它实施方案中,使油组合物反应的步骤可在不使反应组分回流的温度进行。例如,在大于大气压的压力下进行使油组合物反应的步骤,这可提高存在于反应混合物中的溶剂的沸点。在所述条件下,反应可在如下温度进行但不会导致反应组分回流,溶剂在所述温度和大气压下将沸腾。在一些实施方案中,反应在如下压力进行:约5至约20磅/平方英寸(psi)、约7至约15psi或约9至约12psi。在一些实施方案中,反应在如下压力进行:约7、8、9、10、11或12psi。在压力下进行的反应可在上述反应温度进行。在一些实施方案中,在压力下进行的反应可在约70℃、75℃、80℃、85℃或90℃进行。
可对含有PUFA酯的反应混合物进行进一步加工以由所述混合物得到PUFA酯。例如,所述混合物可被冷却、用水稀释和用溶剂(例如己烷)萃取水溶液以制备含有PUFA酯的组合物。用于洗涤和/或萃取粗反应混合物的技术是本领域已知的。
在本发明一个实施方案中,PUFA酯如下从反应混合物中分离:对组合物进行蒸馏以回收含有多不饱和脂肪酸酯的馏分。以该方式可将反应混合物中包含重要PUFA酯的靶标馏分从反应混合物中分离并回收。
在一些实施方案中,所述蒸馏在真空下进行。抛开理论的束缚,与非真空的情况相比,真空蒸馏使蒸馏在较低温度完成,因此可防止酯降解。蒸馏温度通常为120℃至约170℃。在一些实施方案中,蒸馏步骤在以下温度进行:低于约180℃、低于约175℃、低于约170℃、低于约165℃、低于约160℃、低于约155℃、低于约150℃、低于约145℃、低于约140℃、低于约135℃或低于约130℃。用于真空蒸馏的压力通常为约0.1mmHg至约10mmHg。在一些实施方案中,用于真空蒸馏的压力为约0.1、0.5、1、1.5、2、2,5、3、3.5或4mmHg。
本发明方法可用于制备含有高百分比PUFA酯的组合物。例如,所述组合物可含有约50wt.%至约100wt.%的PUFA酯,且在其它实施方案中,所述组合物可含有至少约50wt.%、至少约55wt.%、至少约60wt.%、至少约65wt.%、至少约70wt.%、至少约75wt.%、至少约80wt.%、至少约85wt.%、至少约90wt.%、至少约95wt.%或至少约99wt.%的PUFA酯。
在一些实施方案中,所述PUFA酯经历尿素结晶步骤。当尿素在含有PUFA酯(例如DHA酯)和使用上述技术通过对甘油酯来源进行酯交换而形成的饱和脂肪酸酯的溶液中结晶时,形成含有尿素和至少一部分所述饱和脂肪酸酯的沉淀物。然而,该沉淀物与初始反应混合物相比含有相当较小分数的PUFA酯。相反地,大部分PUFA酯留在溶液中,因此可容易地与所沉淀的饱和脂肪酸酯分离。
尿素结晶分离方法包括首先形成含有脂肪酸酯和尿素的溶液。尿素的量优选与待从溶液中分离的饱和脂肪酸的总量成比例。当从上述酯交换反应混合物中分离脂肪酸酯时,脂肪酸酯的混合物与尿素的质量比(mass ratio)通常为约1∶2。所述溶液也优选含有可溶解尿素和所需PUFA酯的有机溶剂,并更优选含有可溶解尿素和混合物中所有脂肪酸酯的有机溶剂。合适的溶剂的实例包括具有1至4个碳的烷基醇,其中甲醇和乙醇是较优选的,且乙醇是最优选的。脂肪酸酯的混合物与溶剂的体积比(volumetric ratio)优选为约1∶10。
优选地,将基本所有尿素都溶解在溶液中。这可通常经由加热溶液来实现。然而,优选不将所述溶液加热至高于有机溶剂沸点的温度。通常,将所述溶液加热至约60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。
一旦将尿素溶解,就将PUFA酯加到溶液中。加入后如果留有固体,则可将混合物加热直到固体溶解。可将溶液冷却以形成含有脂肪酸酯的尿素加合物(urea adduct)的沉淀物。在一些实施方案中,将溶液冷却至约0℃至约25℃(例如约15℃至约25℃)。在其它实施方案中,将溶液冷却至约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃或约20℃至约25℃。一旦将溶液冷却,就可将其在冷却温度静置一段时间(通常不长于约20小时),其间偶尔搅拌。
在本发明另一个实施方案中,在形成溶液(含有脂肪酸酯和所溶解的尿素)后,含有尿素的沉淀物通过对溶液进行浓缩来形成。例如,可通过蒸发溶液中的一部分溶剂而将溶液浓缩。所除去的溶剂量优选足以使溶液中的尿素浓度超过饱和浓度。
在尿素结晶分离方法中,可将溶液保持在非氧化气氛中,所述非氧化气氛为例如基本由惰性气体、氮气或它们的组合组成的气氛,其中基本由氮气组成的气氛是最优选的。使用所述气氛可有助于使对PUFA酯中的碳-碳双键的氧化最小化。
在已形成含有尿素的沉淀物后,可将所述沉淀物与富含PUFA酯的液体馏分分离。这可例如通过过滤或离心来实现。在一个实施方案中,所述沉淀物可随后用少量有机溶剂(优选用尿素饱和)洗涤以回收与沉淀物留在一起的任意残留的未沉淀的所需PUFA酯。接下来,可将该溶剂与所述液体馏分混合。
可将所述液体馏分浓缩,与水混合,然后其中的酯可用非极性溶剂从所得混合物中萃取。例如,可通过从所述液体馏分中蒸发一部分溶剂而将所述液体馏分浓缩(然而所蒸发的溶剂量优选不大到进一步使尿素沉淀的程度)。随后与所得经浓缩的液体馏分混合的水量可在宽范围内变化。优选地,水与经浓缩的液体馏分的体积比为约2∶1(在特别优选的实施方案中还引入足够的酸(优选为H2SO4)以中和尿素)。可用于从所得经浓缩的母液/水混合物中萃取所述脂肪酸酯的非极性溶剂可以是例如石油醚、戊烷、己烷、环己烷、乙酸乙酯或庚烷,其中己烷是最优选的。非极性溶剂与经浓缩的母液/水混合物的体积比优选为约2∶3。
在其它实施方案中,所述液体馏分也可用略微极性的有机溶剂萃取以使脂肪酸酯(其是略微极性的)的回收最大化。合适的略微极性的溶剂的实例包括乙醚和乙酸乙酯,其中乙醚是最优选的。优选地,略微极性的溶剂与所述母液/水混合物的体积比为约2∶3。在用该略微极性的溶剂萃取后,可优选将所述溶剂与在最初萃取中使用的非极性溶剂混合。
萃取结束后,任意残留的水可如下从萃取溶剂中除去:例如所述溶剂用盐水洗涤和/或使所述溶剂通过无水盐(例如硫酸钠)。然后溶液优选通过例如蒸发一部分溶剂来浓缩。
例如,本发明方法可用于由粗制Mortierella alpina油纯化花生四烯酸乙酯。通过己烷萃取由Mortierella alpina得到的粗制油(通常其中ARA含量为约0.5g/g油)可直接使用而不经任意进一步加工(例如冬化和/或RBD加工)。可在室温和氮气下将150mL无水乙醇(absolute ethanol)加到在一升烧瓶中的175g(约0.2摩尔)粗制油中。可将混合物搅拌15分钟以得到均匀溶液。然后可向所述溶液中加入67g浓度为21%的NaOEt(乙醇钠)/EtOH(乙醇)溶液(约1.04摩尔当量),并可将混合物在氮气下回流约10小时。反应过程可通过气相色谱法(GC)和/或薄层色谱法(TLC)来监测。
当反应结束时,可蒸馏除去约75mL乙醇,并可将混合物在氮气下冷却至室温。可向冷却的混合物中加入300mL己烷,并可将混合物在室温搅拌15分钟。然后可向混合物中加入300mL去离子水,并可将混合物再搅拌15分钟。在取出并保存有机层后,水层可用300mL己烷洗涤两次。合并的有机层可用200mL饱和NaCl溶液洗涤。对有机层进行的GC分析可用于确定ARA乙酯在粗产物中的量。在一些实施方案中,粗产物中的约50%为ARA乙酯,其中其余物质主要为低分子量乙酯。粗产物然后可经历真空分馏或其它纯化方法。在一些实施方案中,在对粗产物进行分馏后可得到纯度大于约60%的ARA乙酯。
抛开理论的束缚,认为本发明方法使具有PUFA残基的甘油三酯发生直接的酯交换以产生PUFA酯。先前方法使用长反应时间和大量试剂且使油经历苛刻条件(例如高温和高酸性条件)。因此,本申请披露的方法提供较有效和较经济的纯化方法,所述纯化方法得到纯的产物。而且,本申请披露的方法可用于粗制油和经纯化的油,这使效率和成本节约得以额外增加。
本发明其它实施方案包括由本申请所述方法制备的组合物。如上所述,所述组合物可含有大于约50wt.%,大于约55wt.%等的PUFA酯。在所述实施方案中,所述组合物可含有至少约89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99wt.%的PUFA酯。在其它实施方案中,所述组合物还可含有低于约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25或0.1wt.%的二十碳五烯酸。本发明组合物可包括如上所述的任意PUFA酯,所述PUFA即DHA、ω-3DPA、ω-6DPA、ARA、SDA、LLA、ALA、GLA或CLA或它们的组合。在一些实施方案中,所述组合物可包含乙酯。在一些实施方案中,所述组合物含有至少约89wt.%的DHA酯。在其它实施方案中,所述组合物含有至少约89wt.%的DHA酯和DPA酯的组合。
本发明组合物也包括含有至少约60、65、70、75、80、85、90或95wt.%ARA酯的组合物。在一些实施方案中,所述ARA酯可以是ARA乙酯。在其它实施方案中,所述组合物还可含有低于约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25或0.1wt.%的二十碳五烯酸。
本发明还提供如下组合物,其包含至少约90wt.%的二十二碳六烯酸(DHA)乙酯和至少约0.1wt.%的4,7,10,13,16,19,22,25-二十八碳八烯酸(C28:8)。这些组合物可通过本申请披露的方法来制备。在一些实施方案中,所述组合物中DHA乙酯的量可以是至少约91、92、93、94、95、96、97、98或99wt.%。在一些实施方案中,所述组合物中C28:8的量可以是至少约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5wt.%。所述C28:8可呈甘油三酯形式或酯形式。例如,所述C28:8可呈乙酯形式。
本发明还提供如下组合物,其包含至少约90wt.%的二十二碳六烯酸(DHA)乙酯和至少约0.1wt.%的DPA(n-3)。这些组合物可通过本申请披露的方法来制备。在一些实施方案中,所述组合物中DHA乙酯的量可以是至少约91、92、93、94、95、96、97、98或99wt.%。在一些实施方案中,所述组合物中DPA(n-3)的量可以是至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0wt.%的DPA(n-3)。所述DPA(n-3)可呈甘油三酯形式或酯形式。例如,所述DPA(n-3)可呈乙酯形式。
在一些实施方案中,所述组合物含有DHA乙酯、C28:8和DPA(n-3)中的全部三种,其中DHA乙酯、C28:8和DPA(n-3)的浓度范围如上所述。
在其它实施方案中,所述组合物除DHA乙酯和C28:8外还可含有低于约1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1wt.%的EPA。在一个实施方案中,所述组合物可含有低于约0.25wt.%的EPA。所述EPA可呈甘油三酯形式或酯形式。例如,所述EPA可呈乙酯形式。在一些实施方案中,所述组合物可含有0wt.%的EPA。
本发明还提供如下组合物,其包含至少约90wt.%的二十二碳六烯酸乙酯和至少一种额外脂肪酸或其酯。在一些实施方案中,所述组合物中DHA乙酯的量可以是至少约91、92、93、94、95、96、97、98或99wt.%。在一些实施方案中,所述额外脂肪酸在压力为0.8mmHg时可具有约150-170℃的沸点。
本发明还包括如下组合物,其包含至少约70wt.%的二十二碳六烯酸(DHA)乙酯和至少约25wt.%的二十二碳五烯酸(n-6)乙酯。
本发明组合物还包括如下组合物,其包含至少约90wt.%的二十二碳六烯酸乙酯和二十二碳五烯酸(n-6)乙酯的组合。在一些实施方案中,所述组合物可含有至少约91、92、93、94、95、96、97、98或99wt.%的二十二碳六烯酸乙酯和二十二碳五烯酸(n-6)乙酯的组合。在一些实施方案中,所述组合物可包含至少约10wt.%的二十二碳六烯酸乙酯和至少约10wt.%的二十二碳五烯酸(n-6)乙酯。在其它实施方案中,所述组合物可包含至少约15或20wt.%的二十二碳六烯酸乙酯和至少约15或20wt.%的二十二碳五烯酸(n-6)乙酯。
本发明还提供如下组合物,其包含至少约90wt.%的二十二碳六烯酸乙酯和二十二碳五烯酸(n-6)乙酯的组合及至少一种额外脂肪酸或其酯。在一些实施方案中,所述组合物可包含至少约91、92、93、94、95、96、97、98或99wt.%的二十二碳六烯酸乙酯和二十二碳五烯酸(n-6)乙酯的组合。在一些实施方案中,所述额外脂肪酸在压力为0.8mmHg时可具有约150-170℃的沸点。
如上所述的DHA/DPA(n-6)组合物还可包含低于约4%的饱和脂肪酸或其酯。在一些实施方案中,所述组合物可包含低于约3.5%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%或0.5%的饱和脂肪酸或其酯。
在一些实施方案中,所述饱和脂肪酸或其酯可含有少于20个的碳,且为例如含有19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9或8个碳的饱和脂肪酸或其酯。在一些实施方案中,所述饱和脂肪酸或其酯可具有14或16个碳。
本发明PUFA酯和组合物(有时统称为“PUFA酯”)可用在药品中。在一些实施方案中,所述药品可含有PUFA酯而不具有额外药物活性剂。在其它实施方案中,所述药品可含有药物活性剂。药物活性剂的实例包括他汀类药物(statin)、抗高血压药物、抗糖尿病药物、抗痴呆药物、抗抑郁药物、抗肥胖药物、食欲抑制剂及提高记忆和/或认知功能的药物。所述药品还可含有任意药用赋型剂、载体、粘合剂或本领域已知的其它制剂组分。
通过本发明方法制备的PUFA酯和本发明组合物适于用作治疗剂和实验剂。本发明一个实施方案包括制备用于治疗缺乏PUFA的婴儿的PUFA酯。所述PUFA酯可包括在如下肠胃外制剂中,所述肠胃外制剂可通过肠胃外途径而给药至婴儿以强化对婴儿的PUFA供给。优选的肠胃外途径包括但不限于皮下途径、皮内途径、静脉内途径、肌内途径和腹膜内途径。肠胃外制剂可包含本发明PUFA酯和适于肠胃外递送的载体。本申请使用的″载体″是指适于作为媒介物用于将分子或组合物递送至合适的体内作用部位的任意物质。所述载体的实例包括但不限于水、磷酸盐缓冲盐水、林格(Ringer’s)溶液、葡萄糖溶液、含有血清的溶液、汉克(Hank’s)溶液和其它生理平衡水溶液。合适的载体还包括基于油的载体、非水性溶液、混悬液和乳液。实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射的有机酯(例如油酸乙酯、聚氧化乙烯蓖麻油(polyethoxylated castor oil)(Cremaphor))和本领域已知的其它物质。可接受的以有效的方式给药PUFA酯的方案包括各个剂量大小、剂量数目、剂量给药频率和给药模式。所述方案可由本领域技术人员基于各种变量来确定,所述变量包括婴儿体重和PUFA缺乏程度。本发明另一个实施方案包括制备用于治疗成人特别是孕妇的PUFA酯。所述产物可用于增加温血动物的乳中长链PUFA的水平。可接受的用于将PUFA酯给药至成人的方案包括肠胃外供给技术(parenteral feeding technique)或将本发明PUFA酯封装在胶囊[例如明胶(即可消化的)胶囊]中用于口服给药和/或置于液体饮食制剂(liquid diet formulation)中。液体饮食制剂可包含如下液体组合物,所述液体组合物含有适于补充饮食的营养物或足以作为全部饮食(complete diet)的营养物。
通过本发明方法制备的PUFA酯和本发明组合物也可用于治疗如下受试者(例如人类或动物),所述受试者具有高水平甘油三酯,其包括患有甘油三酯血症(triglyceridemia)的受试者。例如,空腹甘油三酯为150mg/dL或更高的受试者可受益于用本发明PUFA酯进行的治疗,另外餐后甘油三酯的升高可通过用本发明PUFA酯进行治疗来降低。在一些实施方案中,可将单独的PUFA酯给药至受试者以治疗高水平甘油三酯。在一些实施方案中,所述PUFA酯可以是DHA或ARA。在其它实施方案中,可将PUFA酯的组合给药至受试者以治疗高水平甘油三酯。在一些实施方案中,所述PUFA酯的组合可包含ω-3PUFA和ω-6PUFA(例如DHA和DPA n-6)。在一些实施方案中,所述PUFA酯可占给药至受试者的组合物的约90%。所述PUFA酯可与其它组分和赋型剂(例如上述载体)一起给药。所述PUFA酯也可用于治疗患有与高水平甘油三酯有关的疾病(例如心血管疾病或高血压)的受试者。
本发明PUFA酯和组合物可用于治疗患有神经障碍、痴呆和痴呆前相关病症的受试者。这些病症包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease)、血管性痴呆(Vascular Dementia)、混合型痴呆(Mixed Dementia)、卢伊体痴呆(Dementiawith Lewy Bodies)和由药物、谵妄或抑郁造成的继发性痴呆。
适于与本发明PUFA酯和组合物一起使用的治疗性化合物包括如下任意治疗性化合物,所述治疗性化合物可用于保护个体而使其不患有本申请所述任意病症或疾病,并可包括蛋白质、氨基酸、药物、其它天然产物和碳水化合物。所述治疗性化合物就所治疗的具体疾病或病症而言是本领域技术人员公知的。与本发明组合物或制剂联用的一些优选的治疗性化合物包括但不限于:他克林(Tacrine)(COGNEX);多萘哌齐(Donepezil)(ARICEPT);利伐斯的明(Rivastigmine)(EXELON);加兰他敏(Galantamine)(REMINYL);美金刚(Memantine)(AKATINOL);噻嗯环戊酯(Neotropin);益智药(Nootropic);α-生育酚(维生素E);司来吉兰(Selegeline)(ELDEPRYL);非甾类抗炎药(NSAIDS);银杏内酯(Gingko biloba);雌激素(estrogen);β-分泌酶抑制剂;疫苗,其包括基于液体或脂质体的疫苗,所述疫苗溶解脑中的斑块;B族维生素(B complex vitamin);钙通道阻断剂;HMG CoA还原酶抑制剂;他汀类和其它抗胆固醇药物(例如Zocor(辛伐他汀(simvastatin))、Lipitor(阿托伐他汀钙(atorvastatin calcium))、Lescol(氟伐他汀(fluvastatin))、Lopid(吉非贝齐(gemfibrozil))或Pravachol(普伐他汀钠(pravastatin sodium));甘蔗脂肪醇类(policosanol);贝特类(fibrate);氯碘羟喹(Clioquinol);和其它天然产物(例如姜黄素(curcumin)、木脂素(lignan)、植物雌激素(phytoestrogen)、植物甾醇(phytosterol)、烟酸(niacin)和维生素补充剂(vitaminsupplement))。
剂量和给药途径是本领域已知的并可由本领域技术人员确定。
尽管本发明PUFA酯和组合物可局部给药或注射给药,但最优选的给药途径是口服给药。可将所述PUFA以如下形式给药至个体:营养补充剂和/或食品和/或药物制剂和/或饮料。优选的食品类型为医药食品(medicalfood)(例如在如下制剂中的食品,所述制剂在医师的监督下服用或外部给药,所述食品旨在对疾病或病症进行具体的饮食管理,其中明确的营养需要基于已知的科学原则通过医药评价来确定)。对于婴儿,所述脂肪酸以婴儿配方(infant formula)、断奶食品(weaning food)、罐装幼儿食品(jarred babyfood)、母乳强化剂和/或婴儿谷物(infant cereal)的形式给予婴儿。
本发明主题涵盖生物学可接受的任意剂型及其组合。所述剂型的实例包括但不限于咀嚼片剂、快速溶解片剂、泡腾片剂、可复原粉末剂(reconstitutable powder)、酏剂、液体制剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、多层片剂、双层片剂、胶囊剂、软明胶胶囊剂、硬明胶胶囊剂、小胶囊剂(caplet)、锭剂(lozenge)、咀嚼锭剂、珠剂(bead)、粉末剂(powder)、颗粒剂(granule)、粒子剂(particle)、微粒剂(microparticle)、可分散颗粒剂(dispersiblegranule)、扁囊剂(cachet)、灌洗剂(douche)、栓剂(suppository)、乳膏剂、局部用制剂(topical)、吸入剂(inhalant)、气雾吸入剂(aerosol inhalant)、贴剂(patch)、颗粒吸入剂(particle inhalant)、植入剂(implant)、储库植入剂(depotimplant)、可消化剂(ingestible)、注射剂(injectable)、输注剂(infusion)、健康棒(health bar)、糖果(confection)、谷物(cereal)、谷物涂层(cereal coating)、食品(food)、营养食品(nutritive food)、功能食品(functional food)和它们的组合。上述剂型的制备是本领域技术人员公知的。优选地,富含所需PUFA的食品选自以下组群,所述组群包括但不限于:烘焙货品(baked goods)和混合料;口香糖(chewing gum);早餐谷物(breakfast cereal);奶酪制品(cheese product);坚果和基于坚果的制品(nut-based product);明胶(gelatin)、布丁(pudding)和馅料(filling);冷冻乳制品(frozen dairy product);奶制品(milk product);乳制品类似物;软糖(soft candy);汤和汤混合料(soup mix);快餐(snack food);经加工的果汁(processed fruit juice);经加工的蔬菜汁(processed vegetablejuice);脂肪(fat)和油(oil);鱼制品(fish product);植物蛋白制品(plant proteinproduct);禽制品(poultry product);和肉制品(meat product)。
本发明还包括制备本发明上述任意组合物的方法,例如使用本领域已知的任意合适方法将所述组合物的组分混合成任意合适的递送形式。
根据本发明,本发明方法适于用在以下个体中,所述个体为脊椎动物纲的成员即哺乳动物,其包括但不限于灵长类动物、家畜和宠物(例如伴侣动物(companion animal))。最典型地,个体可以是人类个体。术语″个体″可与术语″受试者″或″患者″互换使用,并且是指本发明方案或方法的受试者。因此,个体可包括健康的正常的(没有患病的)个体及患有本申请所述痴呆前(pre-dementia)或痴呆或其症状或指征或处于发展出这些疾病风险中的个体。
通过本发明方法制备的PUFA酯可用于制备PUFA盐。在一些实施方案中,PUFA盐可如下制备:在碱金属碱例如碱金属氢氧化物(例如氢氧化钾)存在下使本发明PUFA酯反应。由本发明PUFA酯制备的PUFA盐可用在各种应用中,例如用在食品、饮料和药物中。在一些实施方案中,使用本发明PUFA酯制备的PUFA盐是水溶性的,并可直接用在食品、饮料和药物中。
通过本发明方法制备的PUFA酯可用在任意动物食品原料(food material)中,特别是用在人类食品原料中,从而得到PUFA浓度提高的食品。脂肪酸在食品中的天然量在食品之间是不同的。本发明食品可具有正常量的PUFA或改变量的PUFA。在前一种情况下,一部分天然存在的脂质可被本发明PUFA酯所代替。在后一种情况下,天然存在的脂质可被本发明PUFA酯所补充。
可将PUFA酯加到婴儿食品中,例如加到婴儿配方和幼儿食品(babyfood)中。根据本发明,婴儿是指婴儿和小于约两岁的儿童,特别是指早产儿。一些PUFA是婴儿配方和幼儿食品中特别重要的组分,这是因为婴儿的快速生长(即体重在生命的第一年翻两番或翻三番)。PUFA酯对婴儿配方进行补充的有效量为这样的量,所述量接近PUFA在人类母乳中的浓度。加到婴儿配方或幼儿食品中的PUFA酯的优选量为总脂肪酸的约0.1至约1.0%,更优选为总脂肪酸的约0.1至约0.6%,且甚至更优选为总脂肪酸的约0.4%。
本发明另一个方面包括含有食品材料(food material)及本发明PUFA酯的食品。可将PUFA酯加到食品材料中以制备PUFA浓度提高的食品。本申请使用的术语″食品材料″是指供人类或非人类动物食用的任意食品类型。本发明还包括制备食品的方法,其包括将通过本发明方法制备的PUFA酯加到食品材料中。
适于制备本发明食品的食品材料包括动物食品。术语″动物″是指属于动物界的任意生物体,并包括但不限于灵长类动物(例如人类和猴子)、家畜和宠物。术语″食品″包括供所述动物食用的任意产品。供人类消费的优选食品材料包括婴儿配方和幼儿食品。供宠物消费的优选食品材料包括狗粮。
可在生产的各个阶段将通过本发明方法制备的PUFA酯加到范围广泛的产品中,所述产品为例如烘焙货品、维生素补充剂、饮食补充剂(dietsupplement)、粉状饮料(powdered drink)等。使用本发明组合物可制备多种成品或半成品粉状食品(powdered food product)。
含有本发明产物的部分食品包括面团(dough)、面糊(batter)、烘焙食品(baked food item),其包括例如蛋糕(cake)、奶酪蛋糕(cheesecake)、派(pie)、纸托蛋糕(cupcake)、曲奇饼(cookie)、饼干棒(bar)、面包(bread)、面包卷(roll)、饼干(biscuit)、松饼(muffin)、酥皮点心(pastry)、烤饼(scone)和面包丁(crouton);液体食品,例如饮料、能量饮料(energy drink)、婴儿配方(infant formula)、液体膳食(liquid meal)、果汁(fruit juice)、多维生素糖浆(multivitamin syrup)、膳食替代品(meal replacer)、医药食品(medicinal food)和糖浆;半固体食品,例如幼儿食品(baby food)、酸奶(yogurt)、奶酪(cheese)、谷物(cereal)、薄烤饼混合料(pancake mix);食品棒(food bar),其包括能量棒(energy bar);加工肉类(processed meat);冰淇淋;冷冻甜点(frozen dessert);冷冻酸奶(frozenyogurt);华夫混合料(waffle mix);沙拉调味料(salad dressing);和蛋替代品混合料(replacement egg mix)。还包括烘焙货品,例如曲奇饼、薄脆饼(cracker)、甜食(sweet good)、零食蛋糕(snack cake)、派、燕麦花卷(granola)/零食棒(snack bar)和烤制酥皮点心(toaster pastry);盐制零食(salted snack),例如土豆片、玉米片、玉米饼(tortilla chip)、挤出零食(extruded snack)、爆米花(popcorn)、椒盐卷饼(pretzel)、炸薯条(potato crisp)和坚果;特色零食(specialty snack),例如蘸料(dip)、水果干零食(dried fruit snack)、肉类零食(meat snacks)、猪肉皮(pork rind)、保健食品棒(health food bar)和稻米/玉米蛋糕;和糖果零食(confectionary snack),例如糖果(candy)。
尽管通过具体的方法、产物和生物体披露了本发明,但本发明意在包括根据本申请披露的教导而可得到且可使用的所有方法、产物和生物体,其包括本领域技术人员可得到的所有替代形式、改变形式和优化形式。出于说明目的提供以下实施例和试验结果而不是意在限制本发明范围。
实施例1
该实施例说明了本发明由含有二十二碳六烯酸的单细胞油(single celloil)纯化二十二碳六烯酸乙酯(DHA乙酯)的方法。
在室温和氮气下将150mL无水乙醇(EtOH)加到在一升烧瓶中的175g(约0.2摩尔甘油三酯)
-T油(Martek Biosciences Corporation,Columbia,MD,其DHA含量为0.4g/g油)中。
-T油由微藻寇氏隐甲藻制备。将混合物搅拌15分钟,从而得到均匀溶液。然后向溶液中加入67g浓度为21%的乙醇钠/乙醇溶液(NaOEt/EtOH)(其为甘油三酯的约1.04摩尔当量),并使混合物在氮气下回流约9小时。反应过程通过气相色谱法(GC)和薄层色谱法(TLC)来监测。当反应结束时,蒸馏除去约75mL EtOH。然后将反应混合物在氮气下冷却至室温。向冷却的反应混合物中加入300mL己烷,并将混合物在室温搅拌15分钟。然后向混合物中加入300mL去离子水,并将混合物再搅拌15分钟。在取出并保存有机层后,水层用300mL己烷洗涤两次。弃去深褐色水层。然后合并的有机层用200mL饱和NaCl溶液洗涤。对有机层进行的GC分析表明存在约44.7%的DHA乙酯;其余物质主要为低分子量乙酯(参见表1)。
将合并的有机层减压浓缩。然后使粗浓缩物经历真空分馏(vacuumfractional distillation)。在温度为100-150℃且压力为0.8mmHg的情况下收集低分子量乙酯。该馏分的主要组分为油酸酯、饱和C-14酯和饱和C-12酯(oleic,saturated C-14and C-12ester)。在温度为155-165℃且压力为0.8mmHg的情况下收集DHA乙酯。对DHA乙酯馏分进行的GC分析显示DHA纯度为约91.3%(参见表1)。由所述分馏得到68g(86%收率)DHA乙酯,其为浅黄色油状物。
样品 |
酯交换后的有机层 |
真空分馏后含有DHA乙酯的馏分 |
%22:6(n-3)DHA |
44.72 |
91.29 |
%20:5(n-3)EPA |
0.00 |
0.00 |
%额外组分 |
55.28 |
8.81 |
实施例2
该实施例说明了本发明由粗制寇氏隐甲藻油纯化二十二碳六烯酸乙酯(DHA乙酯)的方法。
通过己烷萃取由寇氏隐甲藻得到的粗制油(DHA含量为0.5g/g油)无需任何进一步加工(例如冬化和/或RBD加工)即直接使用。在室温和氮气下将150mL无水乙醇加到在一升烧瓶中的175g(约0.2摩尔甘油三酯)粗制油中。将混合物搅拌15分钟,从而得到均匀溶液。然后向溶液中加入67g浓度为21%的NaOEt/EtOH溶液(其为甘油三酯的约1.04摩尔当量),并使混合物在氮气下回流约10小时。反应过程通过GC和TLC来监测。当反应结束时,蒸馏除去约75mL乙醇,并在氮气下将混合物冷却至室温。向冷却的混合物中加入300mL己烷,并将混合物在室温搅拌15分钟。然后向混合物中加入300mL去离子水,并将混合物再搅拌15分钟。在取出并保存有机层后,水层用300mL己烷洗涤两次。合并的有机层然后用200mL饱和NaCl溶液洗涤。对有机层进行的GC分析表明存在约51%的DHA乙酯;其余物质主要为低分子量乙酯(参见表2)。
将合并的有机层减压浓缩。然后使粗浓缩物经历真空分馏。在温度为100-150℃且压力为0.8mmHg的情况下收集低分子量乙酯。该馏分的主要组分为油酸酯、饱和C-14酯和饱和C-12酯。在温度为155-165℃且压力为0.8mmHg的情况下收集DHA乙酯。对DHA乙酯馏分进行的GC分析显示DHA纯度为约92%(参见表2)。由所述分馏得到69g(66%收率)DHA乙酯,其为浅黄色油状物。
表2.对粗制寇氏隐甲藻油酯交换和蒸馏产物进行的GC分析
样品 |
酯交换后的有机层 |
真空分馏后含有DHA乙酯的馏分 |
%22:6(n-3)DHA |
51.25 |
91.80 |
%20:5(n-3)EPA |
0.00 |
0.00 |
%额外组分 |
48.75 |
8.20 |
实施例3
该实施例说明了本发明由粗制裂殖壶菌属种(Schizochytrium sp.)油纯化二十二碳六烯酸乙酯(其形式为DHA乙酯/DPA乙酯混合物)的方法。
通过己烷萃取由裂殖壶菌属种得到的粗制油无需任何进一步加工(例如冬化和/或RBD加工)即直接使用。
在室温和氮气下将150mL无水乙醇加到在一升烧瓶中的175g(约0.2摩尔甘油三酯)粗制油(DHA含量为40%且DPA含量为15%)中。将混合物搅拌15分钟,从而得到均匀溶液。然后向溶液中加入67g浓度为21%的NaOEt/EtOH溶液(其为甘油三酯的约1.04摩尔当量),并使混合物在氮气下回流约10小时。反应过程通过GC和TLC来监测。当反应结束时,蒸馏除去约65mL乙醇,并在氮气下将混合物冷却至室温。向冷却的混合物中加入300mL己烷,并将混合物在室温搅拌15分钟。然后向混合物中加入300mL去离子水,并将混合物再搅拌15分钟。在取出并保存有机层后,水层用300mL己烷洗涤两次。合并的有机层用200mL饱和NaCl溶液洗涤。对有机层进行的GC分析表明存在约40%的DHA乙酯和15%的DPA乙酯;其余物质主要为低分子量乙酯(参见表3)。
将合并的有机层减压浓缩。然后使粗浓缩物经历真空分馏。在温度为100-150℃且压力为0.8mmHg的情况下收集低分子量乙酯。该馏分的主要组分为饱和C-14乙酯和饱和C-16乙酯。在温度为155-170℃且压力为约0.5mmHg的情况下收集DHA乙酯/DPA乙酯混合物。对DHA/DPA乙酯馏分进行的GC分析显示组合纯度(combined purity)为约93%(参见表3)。由所述分馏得到85g(85%收率)DHA/DPA乙酯,其为极浅黄色油状物。
表3.对粗制裂殖壶菌属种油酯交换和蒸馏产物进行的GC分析。
样品 |
酯交换后的有机层 |
真空分馏后含有DHA/DPA乙酯的馏分 |
%22:6(n-3)DHA |
40.07 |
67.31 |
%22:5(n-6)DPA |
15.09 |
25.86 |
%20:5(n-3)EPA |
1.21 |
0.32 |
%额外组分 |
43.63 |
6.5 |
实施例4
该实施例说明了对来自寇氏隐甲藻油和裂殖壶菌属种油的粗制和经纯化的PUFA乙酯进行的GC分析。
通过己烷萃取由裂殖壶菌属种或寇氏隐甲藻得到的粗制油无需任何进一步加工(例如冬化和/或RBD加工)即直接使用。然后使粗制油经历如以上实施例2和3中所述的酯交换反应。然后使粗乙酯经历如上所述的尿素加合(urea adduction),或经历如实施例2和3中所述的蒸馏。然后对每种样品及DPA乙酯产物或DHA乙酯产物进行GC分析(Nu-Chek Prep,Inc.,Elysian,MN)。结果示于下表4(裂殖壶菌属种)或下表5(寇氏隐甲藻)中。对来自寇氏隐甲藻油的粗制和经蒸馏的乙酯进行两种分析。
表4.对裂殖壶菌属种乙酯产物进行的GC分析。
脂肪酸 |
粗乙酯 |
对粗制油进行尿素加合后的乙酯 |
对粗制油进行蒸馏后的乙酯 |
Nu-ChekDPAEE |
%C12:0 |
0.26 |
0.20 |
0.00 |
0.67 |
%C14:0 |
8.63 |
1.68 |
0.00 |
0.00 |
%C14:1 |
0.00 |
0.13 |
0.00 |
0.36 |
%C16:0 |
24.65 |
0.53 |
0.00 |
0.10 |
%C16:1 |
0.40 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
%C18:0 |
0.57 |
0.00 |
0.00 |
0.10 |
%C18:1(n-9) |
0.36 |
0.00 |
0.00 |
1.77 |
%C18:1(n-7) |
0.35 |
0.00 |
0.00 |
0.72 |
%C18:2 |
0.41 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
%C18:2(n-6) |
0.24 |
0.58 |
0.00 |
0.00 |
%C20:3(n-6) |
0.42 |
2.75 |
0.00 |
0.00 |
%C20:3(n-3) |
0.00 |
0.27 |
0.00 |
0.00 |
%C20:3(n-6) |
0.00 |
0.59 |
0.00 |
0.00 |
%C20:4ARA |
1.50 |
2.29 |
0.00 |
0.16 |
%C20:5(n-3)EPA |
0.00 |
2.01 |
0.00 |
0.00 |
%C22:4(n-6) |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
3.83 |
%C22:5(n-6)DPA |
15.89 |
22.78 |
26.46 |
87.15 |
%C22:5(n-3)DPA |
|
|
|
5.21 |
脂肪酸 |
粗乙酯 |
对粗制油进行尿素加合后的乙酯 |
对粗制油进行蒸馏后的乙酯 |
Nu-ChekDPAEE |
%C22:6(n-3)DHA |
40.65 |
57.67 |
71.83 |
0.00 |
%额外组分 |
4.95 |
7.19 |
0.94 |
0.80 |
实施例5
该实施例说明了本发明通过尿素结晶(urea crystallization)由含有二十二碳六烯酸的单细胞油(docosahexaneoic acid-containing single cell oil)的脂肪酸乙酯混合物纯化二十二碳六烯酸乙酯(DHA乙酯)的方法。
在70℃和氮气下将脂肪酸乙酯的150g粗混合物(其如下得到:对含有二十二碳六烯酸的单细胞-T油(由微藻寇氏隐甲藻制备)进行酯交换)加到262.5g尿素(其为酯的1.75重量当量)于1050mL甲醇(其为酯的7体积当量)中的溶液中。将所得尿素和酯的混合物继续在70℃和氮气下加热1小时。首先将混合物冷却至20℃,然后冷却至0-4℃,从而完成尿素加合物结晶。将混合物再在0-4℃放置2小时。然后在0-4℃过滤所结晶的尿素加合物。
滤液用300mL水稀释,且混合物用稀硫酸酸化至pH为1-2。经酸化的溶液用己烷(300mL×3)萃取。合并的己烷萃取物用饱和NaCl溶液洗涤。经洗涤的己烷溶液用无水硫酸钠干燥,并真空浓缩,从而得到70-75%的理论收率。通常,GC分析显示以上所得DHA乙酯的纯度为约90-96%(800-860mg/g)。
表5.对寇氏隐甲藻乙酯产物进行的GC分析
脂肪酸 |
粗乙酯 |
对粗制油进行尿素加合后的乙酯 |
对粗制油进行蒸馏后的乙酯 |
粗乙酯#2 |
对粗制油进行蒸馏后的乙酯#2 |
Nu-ChekDHAEE |
%C8:0 |
0.19 |
0.00 |
0.00 |
0.36 |
0.00 |
0.00 |
%C10:0 |
0.95 |
0.00 |
0.00 |
1.86 |
0.00 |
0.00 |
%C12:0 |
4.04 |
0.00 |
0.00 |
7.18 |
0.00 |
0.00 |
%C13:0 |
0.00 |
0.09 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
%C14:0 |
13.77 |
0.00 |
0.00 |
19.99 |
0.00 |
0.00 |
%C14:1 |
0.17 |
0.00 |
0.00 |
0.19 |
0.00 |
0.00 |
%C16:0 |
11.08 |
0.00 |
0.10 |
16.15 |
0.00 |
0.10 |
%C16:1 |
2.83 |
0.00 |
0.00 |
2.24 |
0.00 |
0.00 |
脂肪酸 |
粗乙酯 |
对粗制油进行尿素加合后的乙酯 |
对粗制油进行蒸馏后的乙酯 |
粗乙酯#2 |
对粗制油进行蒸馏后的乙酯#2 |
Nu-ChekDHAEE |
%C18:0 |
0.21 |
0.00 |
0.00 |
0.48 |
0.00 |
0.00 |
%C18:1(n-9) |
9.77 |
0.00 |
0.00 |
10.27 |
0.00 |
0.00 |
%C18:1(n-7) |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
0.18 |
0.00 |
%C22:5(n-3)DPA |
0.65 |
0.00 |
1.16 |
0.20 |
0.59 |
0.00 |
%C22:6(n-3)DHA |
55.64 |
93.00 |
89.67 |
41.26 |
96.73 |
99.95 |
%C24:0 |
0.00 |
0.00 |
0.69 |
0.00 |
0.00 |
0.00 |
%C28:8 |
0.60 |
** |
1.40 |
0.25 |
1.20 |
0.00 |
%额外组分 |
0.70 |
2.52 |
8.38 |
0.50 |
1.11 |
0.05 |
**未确定
以上说明书描述了本发明原理、优选实施方案和操作模式。然而,本申请意在保护的发明不应该被解释为限于所披露的具体形式,这是因为所述具体形式是说明性而非限制性的。本领域技术人员可在不背离本发明主旨的情况下进行更改和变化。因此,应该认为实施本发明的上述最佳模式本质上是示例性的,而不应该认为其限制了所附权利要求书中所述的本发明范围和主旨。