CN101790320B - 用于活性成分的保护性水胶体 - Google Patents

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Abstract

部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白，或部分与单糖、二糖、寡糖或多糖缀合的水稻胚乳蛋白被用作新颖的用于脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂的保护性水胶体。本发明还涉及包含水稻胚乳蛋白和至少一种脂溶性活性成分/着色剂的组合物及其制造方法，水稻胚乳蛋白自身及其制造方法。这些组合物被用于对食物、饮料、动物饲料、个人护理或药物组合物进行富集、强化和/或着色。本发明涉及这些用途，并涉及分别含有这类水稻胚乳蛋白和这类组合物的食物、饮料、动物饲料、个人护理和药物组合物。

Description

用于活性成分的保护性水胶体
本发明涉及水稻胚乳蛋白(rice endosperm protein)作为新颖的保护性水胶体用于脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂的用途，其中所述水稻胚乳蛋白部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合(conjugate)或部分脱酰胺化(deamidate)。另外，本发明涉及下述组合物及其制造，所述组合物包含部分缀合或部分脱酰胺的水稻胚乳蛋白和至少一种脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂，本发明还涉及部分缀合或部分脱酰胺的水稻胚乳蛋白自身及其制造。本发明还涉及这类组合物用于对食物、饮料、动物饲料、个人护理或药物组合物进行富集、强化和/或着色的用途，还分别涉及含有这类部分缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白的食物、饮料、动物饲料、个人护理和药物组合物和这样的组合物。
通常，活性成分，特别是脂溶性活性成分或脂溶性着色剂，在向食物、饮料、动物饲料、个人护理和药物组合物中添加时不是原样添加，而是使用活性成分在保护性水胶体中的配制物的形式添加，这是为了增强例如化学稳定性、(水)溶解度、自由-流动和受控释放等原因。已知的保护性水胶体为例如不同来源(家禽、牛、猪、鱼)的明胶和淀粉。因为动物来源的保护性水胶体通常由于宗教或变应原的原因而不是所期望的，并且对无谷蛋白和无玉米制品感兴趣的消费者对基于淀粉的保护性水胶体可能具有低的偏好，所以对替代性的保护性水胶体存在持续的需要。
水稻胚乳蛋白被认为是有营养和低变应原的，因此可以是用于配制活性成分的保护性水胶体的一种合适的替代性来源。然而，水稻胚乳蛋白在中性pH下的高不溶解性和弱功能性限制其在食物和药物制品中作为功能性成分的工业应用。本发明克服了这些限制，并结合了作为保护性水胶体用于配制脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂的水稻胚乳蛋白，所述水稻胚乳蛋白部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化。
与其他谷物包括玉米和小麦相比，水稻蛋白质在营养品质上级别较高，并因此被认为具有作为食物成分的广泛的潜在用途。谷粒蛋白质富含必需氨基酸半胱氨酸和甲硫氨酸。赖氨酸是谷物蛋白质中主要的限制性氨基酸，但是水稻含有比其他谷物蛋白质(小麦2.3，玉米2.5g/16g N)更多的赖氨酸(3.8g/16g N)(见下文所列参考文献4)。尽管水稻通常被认为在常见谷粒(小麦10.6％，玉米9.8％，大麦11.0％，黍11.5％)中具有最低的蛋白质含量(7.3％)，但是水稻蛋白质的净蛋白质利用(73.8％)在谷物谷粒中(小麦53.0％，玉米58.0％，大麦62.0％，黍56.0％)是最高的。
与其他谷物蛋白质相比，水稻蛋白的分离是困难因而昂贵的。主要的水稻蛋白质谷蛋白是疏水的，并且通过二硫键交联。提取的蛋白质天然是高度不溶的，并且蛋白质分离中使用的条件进一步降低其溶解度，因此作为功能性成分具有有限的应用。可通过碱提取随后在蛋白质的等电点pH下沉淀，从米粉中获得高蛋白质水稻产物。通常使用淀粉水解酶例如α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和支链淀粉酶，通过溶解和去除淀粉来分离水稻中的蛋白质。除了淀粉水解酶以外，纤维素酶和半纤维素酶也被用于进一步提高水稻蛋白质浓缩物中的蛋白质含量。然而，关于合适提取方法和这类分离物的功能性的信息是有限的。使用经批准的食品级酶和化学品的有效提取方法对于水稻蛋白质的商业生产和应用是关键性的。
本发明的组合物满足了该需求，所述组合物包含部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白，和脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂。
背景技术信息
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发明详述
本发明的组合物
本发明的组合物可以是固体组合物，即稳定的、可溶于水或可分散于水的粉末，或它们可以是液体组合物，即上述粉末的水性胶体溶液或水包油分散液。可通过下文所述方法或类似的方式，制备稳定的水包油分散液，其可以是水包油乳液，或可表征为悬浮的(即固体、颗粒)和乳化的(即液体、微滴)的混合物。
更明确地，本发明涉及粉末形式的稳定组合物，所述组合物在水稻胚乳蛋白的基质中包含一种或多种脂溶性活性成分和/或一种或多种脂溶性着色剂，所述水稻胚乳蛋白部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化。
优选地，以组合物的总量为基础，部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白的含量为从1到70wt％，更优选地从5到50wt％，进一步更优选地从10到40wt％，最优选地从10到20wt％(20wt％是最优选的含量)，和/或脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂的含量为从0.1到90wt％，优选地从1到80wt％，更优选地从1到20wt％。如果存在另外的佐剂和/或赋形剂例如生育酚和/或抗坏血酸棕榈酸盐，则它们以组合物的总量为基础以从0.01到50wt％的含量，优选地以从0.1到30wt％的含量，更优选地以从0.5到10wt％的含量存在。
部分与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分 脱酰胺化的水稻胚乳蛋白
在本发明的优选的实施方案中，水稻胚乳蛋白是一种改性的水稻胚乳蛋白，其制造描述于下文中。
一种特别优选的水稻蛋白质是通过以下步骤获得的水稻蛋白质：碱提取，(酶修饰，特别是用Alkalase修饰)，与至少一种选自单糖、二糖、寡糖和多糖(特别是选自单糖和多糖)的化合物部分交联，离心和超滤。有一种特别优选的水稻蛋白质是通过以下步骤获得的水稻蛋白质：碱提取，(酶修饰，特别是用Alkalase修饰)，部分脱酰胺化，离心和超滤。
如果进一步使用需要，也可干燥由此获得的经修饰的水稻胚乳蛋白。
在本发明的优选的实施方案中，所使用的水稻胚乳蛋白的乳化活性≥0.2，优选地≥0.45，更优选地≥0.5，进一步更优选地从0.5到1.0，所述水稻胚乳蛋白部分与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化。乳化活性的测定描述于实施例1中。本发明还涉及部分与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合的这些水稻胚乳蛋白，或部分脱酰胺化的这些水稻胚乳蛋白。
如下文所公开的，以组合物的总重为基础，部分与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合的或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白的含量可以在从1到70wt％的范围内，优选地在从5到50wt％的范围内，更优选地在从10到40wt％的范围内，最优选地在从10到20wt％的范围内。
脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂
脂溶性活性成分优选地是具有药理学作用的成分，或通常对人或动物体提供健康益处的成分。“脂溶性”(脂溶性活性成分/脂溶性着色剂)在本发明的上下文中表示化合物在室温和大气压下几乎不溶于水。
脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂优选地选自胡萝卜素和结构相关的多烯化合物，脂溶性维生素，辅酶Q10，多不饱和脂肪酸例如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)及其酯(例如乙酯或甘油三酯(含有相同或不同的脂肪酸))，富含多不饱合脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯，脂溶性UV-A遮蔽剂，UV-B遮蔽剂，及它们的生理学可接受的衍生物例如其酯，特别是与C1-20碳酸的酯，及它们的任何混合物。
最优选的脂溶性维生素是维生素A或E。
胡萝卜素和结构相关的多烯化合物的优选例子是类胡萝卜素例如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、8′-阿朴-β-胡萝卜醛、8′-阿朴-β-胡萝卜酸酯例如乙酯、角黄素、虾青素、番茄红素、叶黄素、玉米黄素、藏红花酸、α-玉米胡萝卜素(α-zeacarotene)、β-玉米胡萝卜素及它们的生理学可接受的衍生物例如其酯，特别是与C1-20碳酸的酯，及它们的任何混合物。
最优选的类胡萝卜素是β-胡萝卜素。
术语“β-胡萝卜素”包括全顺式以及全反式异构体，和所有可能的混合的顺式-反式-异构体。这同样适用于其他类胡萝卜素。
术语“玉米黄素”包括天然的R，R-玉米黄素，以及S，S-玉米黄素、内消旋-玉米黄素(meso-zeaxanthin)及其任何混合物。这同样适用于叶黄素。
脂溶性活性成分可以是天然来源的，即从植物分离/提取的，纯化和/或浓缩的，以及通过化学和/或微生物(发酵)途径合成的那些。
如下文所公开的，以组合物的总重为基础，脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂的含量可以在从0.1到90wt％的范围内，优选地在从1到80wt％的范围内，更优选地在从1到20wt％的范围内。
其他组分
除了活性成分和部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白外，本发明的组合物可优选地额外含有至少一种水溶性抗氧化剂和/或脂溶性抗氧化剂。水溶性抗氧化剂和/或脂溶性抗氧化剂的含量以组合物的总重为基础可以在从0.1到10.0wt％的范围内，优选地在从0.5到5.0wt％的范围内，更优选地在从0.5到3.0wt％的范围内。
水溶性抗氧化剂可以例如是抗坏血酸或其盐，优选地为抗坏血酸钠，水溶性多酚例如羟基酪醇和橄榄苦苷苷元；表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或迷迭香或橄榄的提取物。
脂溶性抗氧化剂可例如是生育酚，例如dl-α-生育酚(即合成的生育酚)、d-α-生育酚(即天然的生育酚)、β-或γ-生育酚，或其中两种或更多的混合物；丁基化的羟基甲苯(BHT)；丁基化的羟基茴香醚(BHA)；乙氧喹，没食子酸丙酯；叔丁基羟基喹啉；或6-乙氧基-1，2-二-羟基-2，2，4-三甲基喹啉(EMQ)，或脂肪酸的抗坏血酸酯，优选地为棕榈酸抗坏血酸酯和/或硬脂酸抗坏血酸酯。
本发明的组合物可还含有选自以下的共乳化剂(co-emulgator)：脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯，脂肪酸的甘油多酯，卵磷脂；N-酰化的氨基酸及其衍生物，带有烷基或链烯基的N-酰化的肽，及其盐；烷基或链烯基醚或酯硫酸酯，及其衍生物和盐；聚氧乙烯化的烷基或链烯基脂肪醚或酯；聚氧乙烯化的烷基或链烯基羧酸及其盐；N-烷基或N-链烯基甜菜碱；烷基三甲铵或链烯基三甲铵及其盐；多元醇烷基或链烯基醚或酯；及其混合物。
多元醇烷基或链烯基醚或酯的优选的例子是用至少20个环氧乙烷单位聚氧乙烯化的脱水山梨糖醇烷基或链烯基酯，例如脱水山梨糖醇棕榈酸酯20 EO或Seppic公司在商品名Montanox 40 DF下出售的Polysorbate40，脱水山梨糖醇月桂酸酯20 EO或ICI公司在商品名Tween 20下出售的Polysorbate 20，以及脱水山梨糖醇单硬脂酸酯。
以组合物的总重为基础，共乳化剂的含量可以在从0到90wt％的范围内，优选地在从0到50wt％的范围内，更优选地在从0到20wt％的范围内。
根据本发明的配制物可进一步被压制成片剂，其中可添加选自单糖、二糖、寡糖和多糖、甘油和甘油三酯的一种或多种赋形剂和/或佐剂。
可存在于本发明组合物中的单糖和二糖的优选的例子是蔗糖、转化糖、木糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗二糖和糖醇。
寡糖和多糖的优选的例子是淀粉、改性淀粉和淀粉水解产物。淀粉水解产物的优选的例子是糊精和麦芽糖糊精，特别是具有5到65个葡糖当量的那些，和葡萄糖浆，特别是具有20到95范围内DE的那些。术语“葡糖当量”(DE)表示水解程度，是以干重为基础以D-葡萄糖计算的还原糖的量；该标度以DE接近0的天然淀粉和 DE为100的葡萄糖为基础。
甘油三酯适当地为植物油或脂肪，优选地为玉米油、葵花子油、大豆油、红花油、菜籽油、花生油、棕榈油、棕榈仁油、棉籽油、橄榄油或椰子油。
以组合物的总重为基础，赋形剂和/或佐剂的含量可以在从0.1到50wt％的范围内，优选地在从0.1到30wt％的范围内，更优选地在从0.5到10wt％的范围内。
固体组合物可额外含有抗结块剂，例如硅酸或磷酸三钙等等，和至多为10wt％，通常为2到5wt％的水。
以组合物的总重为基础，抗结块剂的含量可以在从0到5wt％的范围内，优选地在从0到3wt％的范围内，更优选地在从0.2到3.0wt％的范围内。
组合物的制造
本发明的另一个目的是制造本发明的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
I)制备部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白的水溶液或胶体溶液(这类水稻胚乳蛋白的制造在下文中描述和)，
II)可选地向步骤I)中制备的溶液中添加至少一种水溶性赋形剂和/或佐剂，
III)制备至少一种脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂和可选地至少一种脂溶性佐剂和/或赋形剂的溶液或分散液，
IV)将步骤I)到III)中制备的溶液彼此混合，
V)匀化由此得到的混合物，
VI)可选地添加交联剂，用于部分地交联所述部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖和多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白，
VIa)可选地对进行步骤VI)后得到的混合物进行酶处理或热处理，从而部分地交联所述部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白，
VII)可选地将步骤V)和/或VI)中获得的分散液转化为粉末，
VIII)可选地干燥步骤VII)中获得的粉末，
IX)可选地对(干)粉进行热处理或酶处理，从而交联(经修饰的)水稻胚乳蛋白，
前题是进行步骤VI)时，仅进行步骤VIa)或步骤IX)之一，而不会二者都进行。
步骤I
如下简单地进行该步骤：向部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白(制造见下文)中添加水或反之亦然，可选地在搅拌下进行。或者可能通过超声处理进行匀化。
优选地，使用部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白，其具有上文和下文所述的优选级。
步骤II
可添加的水溶性赋形剂和/或佐剂是例如单糖、二糖、寡糖和多糖，甘油和水溶性抗氧化剂。其例子在上文中给出。
步骤III
脂溶性活性成分和脂溶性着色剂是上文所述的那些。
(脂溶性)活性成分和/或脂溶性着色剂和可选的脂溶性赋形剂和佐剂被原样使用，或溶于或分散于甘油三酯和/或(有机)溶剂中。
合适的有机溶剂是卤代的脂肪族烃，脂肪族醚，脂肪族和环状碳酸酯，脂肪族酯和环状酯(内酯)，脂肪族和环状酮，脂肪族醇及其混合物。
卤代脂肪族烃的例子是单卤代或多卤代的，线性、分支或环状的C1-到C15-烃类。特别优选的例子是单氯代或多氯代或溴代的，线性、分支或环状的C1-到C15-烃类。更优选的是单氯代或多氯代的线性、分支或环状的C1-到C15-烃类。最优选的是二氯甲烷和氯仿。
脂肪族酯和环状酯(内酯)的例子是乙酸乙酯，乙酸异丙酯和乙酸正丁基酯；和γ-丁内酯。
脂肪族和环状酮的例子是丙酮、二乙基酮和异丁基甲基酮；和环戊酮和异佛尔酮。
环状碳酸酯的例子特别地是碳酸亚乙酯和碳酸亚丙酯及其混合物。
脂肪醚的例子是二烷基醚，其中烷基部分具有1到4个碳原子。一种优选的例子是二甲基醚。
脂肪醇的例子是乙醇、异丙醇、丙醇和丁醇。
另外，可使用任何油(甘油三酯)、橙油、柠檬油(limonen)或类似物和水作为溶剂。
可添加的脂溶性赋形剂和/或佐剂是例如玉米油、脂肪酸的甘油单酯或甘油二酯，聚甘油脂肪酸，和中链甘油三酯(“MCT”)。
步骤IV
在本发明的一个替代性方法中，不进行步骤III)，而是将脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂和可选的脂溶性赋形剂和/或佐剂直接添加至步骤I)或II)的溶液中。
步骤V
为了进行匀化，可使用常规技术例如高压匀化，高剪切力乳化(转子-定子系统)，微粉化，湿磨法，微通道乳化，膜乳化或超声处理。用于制备含有脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂的下述组合物的其他技术公开于EP-A 0 937 412(特别是第[0008]、[0014]、[0015]、[0022]到[0028]段)，EP-A 1 008 380(特别是第[0005]、[0007]、[0008]、[0012]、[0022]、[0023]到[0039]段)和US 6,093,348(特别是第2栏，第24行到第3栏，第32行；第3栏，第48到65行；第4栏，第53行到第6栏，第60行)中，其内容通过引用并入本文，所述组合物用于对食物、饮料、动物饲料、化妆品或皮肤病学组合物进行富集、强化和/或着色。
步骤VI
交联剂优选地选自由还原糖、糖蛋白和糖肽组成的组。因此，(经修饰的)水稻胚乳蛋白和糖蛋白/糖肽的糖或糖部分之间形成分子间交联。交联剂的优选的例子是单糖(果糖、葡萄糖、半乳糖、木糖)、二糖(蔗二糖、乳糖)、寡糖(糊精)和多糖(黄原胶、果胶)，最优选的是果糖、葡萄糖和黄原胶。
糖蛋白是一种化合物，其含有与蛋白质共价交联的碳水化合物(或聚糖)。碳水化合物可以是单糖、二糖、寡糖、多糖或其衍生物(例如磺基取代或磷酸基取代)的形式。
糖蛋白的优选的例子是卵白蛋白、乳酪蛋白。
糖肽是由碳水化合物组成的化合物，所述碳水化合物与L-氨基酸和/或D-氨基酸组成的寡肽连接。糖-氨基酸是通过任何种类的共价键与单个氨基酸结合的糖。
糖肽的一个优选的例子是一种与铁结合的糖肽——乳乳铁蛋白。
因此，与共同待审的PCT/EP2006/011873相反，本文中部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白可进一步部分地与至少一种选自还原糖、糖蛋白或糖肽的化合物交联。
步骤VIa
可如下实现交联：对上述额外含有交联剂的混合物进行热处理，从而在麦拉德型反应中引起糖与蛋白质的交联，即通过热处理实现交联，优选地在从约30℃到约160℃的温度下，更优选地在从约70℃到约100℃的温度下，最优选地在从约80℃到约90℃的温度下进行。
交联是由蛋白质的可用氨基与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是单糖或多糖)的羰基之间初始缩合导致的酶或非酶反应。交联是被用于改变蛋白质物理化学和功能性能(例如改进乳化、包封)的一类特异的修饰。
也可通过用交联酶(酰基转移酶，EC 2.3，例如转谷氨酰胺酶，EC2.3.2.13，蛋白质-谷氨酰胺：γ-谷氨酰基转移酶)处理来实现部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白的部分交联，即通过酶处理来实现，所述酶处理便利地在从约0℃到约70℃的温度下，优选地在从约20℃到约40℃的温度下进行。优选地，根据步骤VIa)的酶处理是用交联酶，尤其是用转谷氨酰胺酶处理。
酶交联导致稳定的含蛋白质的多糖网络，在转谷氨酰胺酶的情况下通过ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸异肽键的形成实现。对酶交联而言，糖蛋白或糖肽的使用是优选的。
在麦拉德型反应中引起糖与蛋白质交联的热处理和酶交联两种技术均可被用于整合亲脂部分，并可在组合物的干燥形式(步骤IX)下进行，或者在水溶液或悬浮液(步骤VIa)中进行。酶交联优选地在水溶液或悬浮液中进行。
步骤VII
可使用任何常规技术例如喷雾干燥、喷雾干燥与流化床颗粒化组合(后一技术通常被称作流化喷雾干燥或FSD)，或通过粉末捕获技术(其中经雾化的乳液微滴被捕获在吸附剂例如淀粉、硅酸钙和二氧化硅的床体上并随后干燥)，在去除有机溶剂(如果存在的话)后将藉此获得的分散液转化为固体组合物，例如干粉，所述分散液为水包油分散液。
喷雾干燥可在从约100℃到约250℃，优选地从约150℃到约200℃，更优选地从约160℃到约190℃的输入温度，和/或从约45℃到约160℃，优选地从约55℃到约110℃，更优选地从约65℃到约95℃的输出温度(产物温度)下进行。
步骤VIII
在步骤VII中获得的粉末的干燥优选地在≤100℃的温度下，优选地在从20℃到100℃的温度下，更优选地在从60℃到70℃的温度下进行。如果干燥在真空中进行，则温度更低。
步骤IX
如上文针对步骤VIa所述，通过热处理进行交联。这同样适用于酶处理，然而所述酶处理优选地在溶液/悬浮液中进行。
部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部 分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白的制造
本发明还涉及从糙米(milled rice)开始制造部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白的方法，其中在研磨前去除米糠(rice bran)，所述方法包括步骤a)到e)：
a)制备糙米的水溶液或悬浮液，其中在研磨前去除米糠，其中所述溶液或悬浮液以水溶液或悬浮液的总量为基础，优选地具有从0.1wt％到30wt％，优选地从10到15wt％的干物质含量；
b)去除糙米的非蛋白质部分或蛋白质部分来获得水稻胚乳蛋白，其中在研磨前去除米糠；
c)通过将糙米的蛋白质部分在麦拉德型反应中部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)反应，或通过部分地对糙米的蛋白质部分进行脱酰胺化，来修饰糙米的蛋白质部分，获得部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合的或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白，其中在研磨前去除米糠；
d)可选地分离部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特备是与单糖或多糖)缀合的或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白；
e)可选地将部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合的或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白转化为固体形式。
步骤a)
其中在研磨前去除米糠的糙米也被称作“米粉”。
通过向米粉中添加水或反之，可选地通过剧烈搅拌(用机械搅拌子)直至米粉完全分散，或通过用匀化器匀化米粉悬浮液，例如在室温下匀化5分钟，来简单地进行该步骤。
步骤b)
步骤b)可如Paraman，I.，Hettiarachchy，N.S.，Schaefer，C.，and Beck.M.I.在Cereal Chem.2006，83(6)，663-667：“Physicochemical properties of riceendosperm proteins extracted by chemical and enzymatic methods”中所述进行。
去除非蛋白质部分
可优选地如下实现步骤b)：用非蛋白质降解酶例如用
Figure G200880010503XD00141
的0.5％水性悬浮液，在90℃的温度下将米粉处理2小时，然后用纤维素酶的0.1％水性悬浮液在50℃的温度下处理30分钟而不进行任何pH调节(pH 6-7)，使酶失活，从米粉的蛋白质部分中分离和去除非蛋白质部分。
非蛋白质降解酶的优选的例子是淀粉降解酶例如α-淀粉酶，和纤维素酶即降解纤维素的酶，及其混合物。α-淀粉酶的一个优选的例子是可从Novo Nordisk Biochem，North America，Inc.，美国商业获得的
Figure G200880010503XD00142
120，L型。其他优选的例子是可从Novo Nordisk Biochem，North America，Inc.，美国商业获得的
Figure G200880010503XD00143
Supra；可从Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，Nagoya，日本商业获得的Amylase S“Amano”35G；可从GenencorInternational，Inc.，美国商业获得的Multifect Cellulase；和可从AmanoPharmaceutical Co.Ltd.，Nagoya，日本商业获得的Cellulase T“Amano”4。
如果使用无机酸(例如盐酸)或有机酸(例如柠檬酸)或碱，则可通过中和溶液或悬浮液终止酶的反应，或通过加热使酶变性来终止酶的反应。
可通过将溶液加热至从80℃到95℃的温度下，优选地从80℃到85℃(特别是在从3.5到4.5的低pH下)的温度下保持10到15分钟，来实现变性。之后可将溶液冷却至50℃。
可通过离心(5000g 15分钟)(其中非蛋白质部分在水相中)然后用去离子水洗涤来实现非蛋白质部分的分离。水稻胚乳蛋白残留在沉淀物中。
去除蛋白质部分
或者可在离心或过滤前进所谓的“碱提取”或所谓的“盐提取”。
“碱提取”表示首先在40℃到60℃下耗时3小时用碱溶液(例如NaOH水溶液)将米粉溶液或悬浮液的pH调节至从7到12的数值，优选地调节至从8到10的数值，更优选地调节至约为9。
在蛋白质产率比蛋白质功能性更重要的情况下，可以有利地将pH优选地调节为从8到12，更优选地从9到12，进一步更优选地从10到12的数值。
优选地，这样的碱具有约0.1到5M，优选地约0.5到约2M的浓度。碱可以是无机碱。无机碱的例子是碱(土)氢氧化物例如氢氧化钠(优选的)、氢氧化钾和氢氧化钙。
“盐提取”与“碱提取”是类似的，但是除了碱以外还使用盐例如氯化钠。在本发明的一个优选的实施方案中，使用0.08M氯化钠的水溶液(用NaOH调节至pH 11)作为提取溶剂。
在两种情况(碱提取或盐提取)下蛋白质部分均被转移至水相。然后可通过离心或过滤，将蛋白质部分从非蛋白质部分中分离。
蛋白质部分的进一步修饰
可通过用(可商业获得的)食品级别碱、中性和/或酸性蛋白酶处理米粉(的蛋白质部分)，实现对它的进一步修饰。对一些蛋白酶而言，酶规格和最适条件在下表中给出。
表1a：酶规格I
  酶   蛋白酶类型   来源   优先的特异性
  Protex 6L   丝氨酸蛋白酶   Bacilluslicheniformis   以针对肽键的宽泛特异性水解蛋白质
  菠萝蛋白酶   半胱氨酸蛋白酶   菠萝茎   宽泛特异性，但是在肽中强烈偏好Arg-Arg
  Alkalase   丝氨酸蛋白酶   Bacilluslicheniformis   宽泛特异性，并偏好大的不带电残基的羧基位点
  Liquipanol   半胱氨酸蛋白酶   浓缩的木瓜蛋白酶   宽泛特异性
  碱性蛋白酶(Alkalineprotease)   丝氨酸蛋白酶   细菌蛋白酶   以针对肽键的宽泛特异性水解蛋白质
  胃蛋白酶   天冬氨酸蛋白酶   猪胃   酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的C-端侧
表1b：酶规格II
  酶  pH-范围   活性/g   公司
  Protex 6L  6-10   580000   Genencor International，Inc.，Rochester，NY 14618，美国
  菠萝蛋白酶  5-8   150000   Enzyme Development Corporation，New York，NY 10001，美国.
  Alkalase  6-9   2.4AU   Novo Nordisk Biochem，Franklinton，NC 27525，美国
  Liquipanol  5-8   125000   Enzyme Development Corporation，New York，NY 10001，美国.
  碱性蛋白酶(Alkalineprotease)  6-9   175000   Enzyme Development Corporation，New York，NY 10001，美国.
表2：蛋白质水解中使用的最适酶条件
  酶  酶含量[wt％，以蛋白质重量为基础]   pH   温度[℃]   时间[分钟]
  Liquipanol  1.0   8.0   50   60
  菠萝蛋白酶  1.0   7.0   50   60
  Alkalase  1.0   9.0   60   60
  Protex 6L  1.0   10.0   60   60
  胃蛋白酶  0.5   3.0   37   30
蛋白酶可来自细菌或真菌，以及来自水果或可具有动物来源。
碱性蛋白酶的例子是可商业获得的
Figure G200880010503XD00171
(Novo Nordisk Biochem，Franklinton，NC，美国)、Alkaline
Figure G200880010503XD00172
(Enzyme DevelopmentCorporation，New York，NY，美国)、Protex(
Figure G200880010503XD00174
BacterialAlkaline Protease，Genencor International，Inc.，Rochester，NY，美国)和
Figure G200880010503XD00175
Protease 899(Genencor International，Inc.，Rochester，NY，美国)。
中性蛋白酶的例子是可商业获得的
Figure G200880010503XD00176
(Enzyme DevelopmentCorporation，New York，NY，美国)、
Figure G200880010503XD00177
(Enzyme DevelopmentCorporation，New York，NY，美国)和细菌中性蛋白酶(GenencorInternational，Inc.，Rochester，NY，美国)。中性蛋白酶的又一个例子是由一种植物番木瓜生产的可商业获得的
Figure G200880010503XD00178
of DSM Food Beverages，Delft，荷兰，即一种水果来源的酶。
酸性蛋白酶的例子是胃蛋白酶(Sigma，美国)和Acid protease(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.，Nagoya，日本)。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，随后在从7到10的pH范围内在40℃到60℃下用两种不同的碱性蛋白酶将米粉的蛋白质部分处理10到80分钟。
优选地，这些蛋白酶之一是丝氨酸特异性的蛋白酶例如Protex
Figure G200880010503XD00181
或Alkaline
Figure G200880010503XD00182
另一种是半胱氨酸特异性的蛋白酶例如
Figure G200880010503XD00183
或
也可以通过不一次添加酶而是分部分添加它们(先后或同时)，来调整该修饰步骤。
步骤c)
将步骤b)中获得的蛋白质部分用作起始材料用于进行步骤c)，即与单糖(二糖或寡糖)或多糖部分反应或者部分脱酰胺化。
糙米的蛋白质部分与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多 糖)的部分反应
蛋白质部分与单糖、二糖、寡糖或多糖的反应在麦拉德型反应中进行。可独立地分别制备蛋白质部分的水性分散液和单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是单糖或多糖)的水溶液/分散液，然后在搅拌下添加在一起。
通常，在搅拌下向蛋白质部分的水溶液(其最优选地具有10wt％的浓度)中缓慢添加单糖或多糖(或二糖或寡糖)的水溶液(其最优选地具有10wt％的浓度)，获得两种溶液/分散液的混合物。混合优选地在下述温度下进行下述时间，所述温度在从20℃到60℃的范围内，优选地在从30℃到50℃的范围内，更优选地在从35℃到45℃的范围内，所述时间在从10分钟到20小时的范围内，优选地在从30分钟到90分钟的范围内，更优选地在从45分钟到60分钟的范围内。
然后通过添加碱，优选地以水溶液的形式添加碱，将混合物的pH值调节为从6.0到9.0范围内的数值，优选地从6.5到8.5范围内的数值，优选地从7.0到8.0范围内的数值。优选地，这样的碱的浓度约为0.1到3M，优选地为约0.5到约2M。碱可以是无机碱。无机碱的例子是碱(土)氢氧化物例如氢氧化钠(最优选的)、氢氧化钾(优选的)和氢氧化钙。
然后将藉此获得的碱性混合物干燥，优选地通过喷雾干燥实现。喷雾干燥优选地在从50℃到250℃范围内、更优选地在从60℃到约100℃范围内、最优选地在从60℃到90℃范围内的输入温度下进行。
然后可在潮湿的培养箱中，通过将干燥的蛋白质和单糖或多糖(或二糖或寡糖)混合物孵育至在30℃到70℃范围内，优选地在40℃到60℃范围内，更优选地从45℃到55℃范围内的温度，进行反应(交联)。根据反应温度，反应的持续时间在2小时到60小时，优选地4小时到40小时，更优选地6小时到30小时的时间范围内。相对湿度可在39％到85％的范围内，更优选地在44％到79％的范围内，最优选地在54％到69％的范围内变化，以获得0.5到0.8范围内的水分活度(water activity)。
也可如上文针对步骤VIa所述，通过酶处理进行交联。
单糖的优选的例子是戊糖和己糖(果糖、葡萄糖、半乳糖、木糖，特别是果糖和葡萄糖)。
多糖的优选的例子是黄原胶和果胶。
除了单糖或多糖以外，还可以使用二糖(蔗二糖、乳糖)和寡糖(糊精)。
蛋白质部分与单糖的重量比位于0.5％到12％(w/w)的范围内，优选地在0.1％到8％(w，w)的范围内，更优选地在0.5％到4％(w/w)的范围内。
蛋白质部分与多糖(或二糖或寡糖)的重量比位于0.1％到20％(w，w)的范围内，优选地在0.5％到20％(w/w)的范围内。
如果使用葡萄糖作为单糖，则葡萄糖与步骤b)中获得的蛋白质部分的重量比优选地在从0.1％到8％(w/w)的范围内，更优选地在0.5％到4％(w/w)的范围内。
如果使用黄原胶作为多糖，则黄原胶与步骤b)中获得的蛋白质部分的重量比优选地在从0.1％到20％(w/w)的范围内，更优选地在从0.5％到10％(w/w)的范围内。
糙米蛋白质部分的部分脱酰胺化
如下进行脱酰胺化：通过添加碱，优选地添加水溶液形式的碱，将步骤b)中获得的水稻胚乳蛋白蛋白质部分水胶体溶液的pH值调节至从9.0到13.0范围内的数值，优选地从9.5到12.5范围内的数值，优选地从10.5到12.5范围内的数值。优选地这样的碱浓度为约0.1到3M，优选地约0.5到约2M。碱可以是无机碱。无机碱的例子是碱(土)氢氧化物例如氢氧化钠(最优选的)、氢氧化钾(优选的)和氢氧化钙。
然后将藉此获得的碱性混合物加热至在25℃到90℃范围内，优选地在30℃到80℃范围内，更优选地在40℃到70℃范围内的温度。
根据脱酰胺化温度，脱酰胺化的持续时间在0.5小时到24小时，优选地0.5小时到12小时，更优选地0.5小时到6小时的时间范围内。
步骤d)
可通过本领域技术人员已知用于分离蛋白质的任何方法进行步骤d)。
例如可通过离心和/或过滤进行步骤d)。
通常不必须分离部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖缀合或部分脱酰胺化的蛋白质。
步骤e)
可通过本领域技术人员已知的任何干燥方法实现成为固体形式例如干粉的转化。优选的是喷雾干燥或冷冻干燥。喷雾干燥优选地在200℃到240℃的输入温度和80℃到100℃的输出温度下进行。冷冻干燥优选地在从约-20℃到约-50℃的温度下进行10到48个小时。
本发明的一个目的也是部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白自身，特别是了通过上述任何方法获得的水稻胚乳蛋白。进一步更优选的是通过上述任何方法获得的部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白。
工业应用性
本发明涉及如上所述的组合物用于对食物、饮料、动物饲料、个人护理或药物组合物进行富集、强化和/或着色的用途，以及含有如上所述的组合物的食物、饮料、动物饲料、个人护理和药物组合物自身。
本发明还涉及如上所述含有下述水稻胚乳蛋白的食物、饮料、动物饲料、个人护理和药物组合物，以及这类水稻胚乳蛋白(具有前文所述的偏好)作为保护性水胶体用于脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂的用途，所述水稻胚乳蛋白部分地与单糖、二糖、寡糖或多糖(特别是与单糖或多糖)缀合或部分脱酰胺化。
在本发明的上下文中，动物(包括人)除了人以外还包括特别是农业动物例如绵羊、奶牛、马、家禽(肉禽和蛋禽)、虾和鱼(特别是三文鱼和虹鳟鱼)以及宠物例如猫、狗、鸟(例如红鹤)和鱼。
其中可使用本发明的组合物(特别是作为着色剂或功能性成分)的饮料可以是碳酸饮料，例如调味的塞耳特斯水、软饮或矿物饮品，以及非碳酸饮料例如调味的水、果汁、水果宾治和这些饮料的浓缩形式。它们可以基于天然的水果或蔬菜汁或者基于人造香料。还包括在内的是酒精饮料和即食饮料粉。另外，含糖饮料、带有非卡路里和人造的甜味剂的减肥饮料也包括在内。
另外，得自天然或合成来源的乳制品也属于食物制品的范围，其中本发明的组合物可被用作着色剂或功能性成分。这类制品的典型例子是乳饮品、冰激凌、乳酪、酸乳等等。乳替代制品如豆浆饮品和豆腐制品也包括在该应用范围内。
还包括在内的是含有本发明的组合物作为着色剂或功能性成分的甜品(sweets)，如糖果制品(confectionery product)、糖果、口香糖、甜点，例如冰激凌、果冻(jellies)、布丁、即食布丁粉等等。
还包括在内的是谷物、点心、曲奇、意大利面(pasta)、汤和沙司(sauces)、蛋黄酱、沙拉酱等等，其含有本发明的组合物作为着色剂或功能性成分。另外，用于乳和谷物的水果制备物也包括在内。
借由本发明的组合物添加至食物制品中的脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂的终浓度以食物组合物的总重为基础可从0.1到500ppm，尤其是1到50ppm，并取决于有待着色或强化的具体食物制品和着色或强化的预期等级。
优选地通过以本发明组合物的形式向食物制品中添加脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂，来获得本发明的食物组合物。为了食物或药物制品的着色或强化，可根据本身已知的方法使用本发明的组合物来应用可分散于水中的固体制品形式。
通常，根据特定的应用，组合物可作为水性储存溶液添加，或者作为与其他合适的食物成分的干粉混合物或预混合物添加。根据最终应用的配制物，可例如使用干粉搅拌器、低剪力混合器、高压匀化器或高剪力混合器完成混合。显而易见的是，这类技术是本领域技术人员已知的。
其中使用本发明的组合物作为着色剂的药物组合物例如片剂或胶囊也在本发明的范围内。可如下完成片剂的着色：以液体或固体着色组合物的形式，向片剂涂覆混合物中分离地添加组合物，或向片剂涂覆混合物的一种组分中添加着色剂组合物。可通过在胶囊物质的水溶液中掺入着色剂组合物，制备有色的硬壳或软壳胶囊。
其中使用本发明的组合物作为活性成分的药物组合物例如片剂(例如咀嚼片、泡腾片或薄膜包衣片)或胶囊(例如硬壳胶囊)也在本发明的范围内。本发明的组合物典型地作为粉末被添加至制片混合物中，或以本身已知的用于生产胶囊的方式被填充进胶囊中。
其中使用该组合物作为色素沉着着色剂(例如用于卵黄、肉鸡(tablepoultry)、小鸡(broilers)或水生动物(特别是虾、三文鱼、虹鳟鱼))或作为活性成分的动物饲料制品也在本发明的范围内，所述动物饲料制品例如营养成分的预混物、复合饲料、乳替代物、液体膳食或饲料制剂。
个人护理组合物：其中使用所述组合物作为着色剂或作为活性成分的化妆品(cosmetics)、美容用品(toiletries)和皮肤用品(derma product)也在本发明的范围内，所述化妆品、美容用品和皮肤用品即皮肤和头发护理制品例如乳霜、洗剂、沐浴用品、唇膏、洗发水、护发素、喷雾或凝胶。
本发明通过以下的实施例进一步阐述。
实施例
使用以下的缩写：
DH＝水解程度
DI水＝去离子水
dw＝以干重为基础
RH＝相对湿度
rpm＝每分钟转数
SDS＝十二烷基硫酸钠
w/v＝重量/体积
用长粒大米(long grain rice)制成的米粉由Riceland Foods(Stuttgart，AR)提供。乳清蛋白分离物作为以干重为基础含88.6％蛋白质(N x 6.25)的基准标准蛋白质得自Davisco Foods International，INC.，Minnesota。来自Bacillus licheniformis的细菌丝氨酸蛋白酶Alcalase 2.4L由NovoNordisk Biochem.提供(Franklinton，NC，2.4AU units/g)。分析试剂购自Fisher Scientific(Pittsburgh，Pa.)和Sigma chemical Co.(St.Louis，Mo.)。
(A)分析方法：实施例1-5
实施例1
乳化活性和乳液稳定性的测定
通过Pearce and Kinsella，Journal of Agric Food Chem.1978，26，716-722的比浊法测定乳化活性和稳定性。用超声波仪(Virtishear Tempest，TheVirtis Co.，Gardiner，N.Y.，U.S.A.)在6档下将6mL水稻胚乳蛋白的0.1％溶液(10mM pH 7.0的磷酸缓冲液中)与2mL油的混合物匀化1分钟。在匀化后0和10分钟，将50微升混合物转移进5mL 0.1％的SDS(w/v)水溶液中。用分光光度计(Shimadzu Model UV-1601，Kyoto，日本)测定500nm处溶液的吸光度。匀化后0时间处的吸光度是水稻胚乳蛋白的乳化活性。使用时间间隔(10分钟)期间初始吸光度的浊度(吸光度)降低来计算乳液稳定性。如下计算(ES)：
乳液稳定性＝To x Δt/ΔT-其中ΔT是时间间隔Δt(10分钟)期间初始吸光度(To)的浊度(吸光度)降低。
实施例2
水解程度的测定
通过Nielsen and others(Nielsen，P.M.，Petersen，D.&Dambmann，C.：Improved method for determining food protein degree of hydrolysis.Journal ofFood Science 2001，66(5)，642-646)的方法测定DH。如下制备邻苯二醛(OPA)试剂：将7.620g四硼酸二钠十水合物(Na2B4O7.10H2O)和200mg十二烷基硫酸钠(SDS)溶于150mL去离子水中，然后与160mg OPA(预先溶于4mL乙醇中的97％OPA)和176mg 99％二硫苏糖醇(DTT)混合。用去离子水将最终的溶液补足200mL。将0.1g冷冻干燥的蛋白质样品溶于10mL去离子水中。为了测量吸光度，向10mL管中添加3mL OPA试剂，然后向每种样品、标准和空白的四个管中分别添加400μL样品溶液、丝氨酸标准物(10mg/100mL)和去离子水。随后混合5秒并精确地静置2分钟。用分光光度计(Shimadzu Model UV-1601，Kyoto，日本)在340nm处读数。如下计算DH：
DH＝h/h总*100％；其中h是水解的键的数量，h总是每蛋白质当量的肽键总数；h＝(丝氨酸-NH2-β)/α当量/g蛋白质；其中h是水解的键的数量，h总是每蛋白质当量的肽键总数；对谷蛋白而言，α是1.00，β是0.40，且h总为8.0。
丝氨酸-NH2＝[(A340样品-A340空白)/(A340标准-A340空白)]*0.9516毫当量/L*0.01*100/(X*P)；其中丝氨酸-NH2＝毫当量丝氨酸NH2/g蛋白质；X＝g样品；P＝样品中的蛋白质％；0.01是以升(L)表示的样品体积。
实施例3
蛋白质溶解度和总溶解度的测定
通过进行了一些修正的Bera and Mukherjee(Bera，M.B.，Mukherjee，R.K.：Solubility，emulsifying，and foaming properties of rice bran proteinconcentrates.J Food Sci 1989，54(1)，142-145)的方法测定蛋白质溶解度(也称作N-溶解度)。将200mg蛋白质样品分散于10mL去离子水中，用1NHCl或1N NaOH将pH调节至7.0。将分散剂持续搅拌30分钟并在5000rpm下离心15分钟(model J2-21，Beckman，Fullerton，Calif.，美国)。回收上清液，并通过自动的Kjeldahl法(AACC 1990)测定上清液中的蛋白质含量。通过以下的等式计算蛋白质溶解度的百分比：
蛋白质溶解度被计算为上清液中蛋白质占初始样品中总蛋白质的百分比。
总溶解度通过烘干法测定，并被表述为上清液的总可溶部分与蛋白质分离物总重的百分比。
Figure G200880010503XD00252
实施例4
粘度测定
在室温(26℃)下，通过装有MVDIN测量锤(半径＝19.36mm，高度＝58.08mm)的旋转流变仪(Haake VT 550，德国)测定蛋白质分离物的粘度。将蛋白质分离物与去离子水混合，形成10％的浆体，并且在分析前将浆体静置60分钟用于平衡。将样品(30ml)上样进圆柱状杯(半径＝21.0mm)中，并使用计算机控制的程序施加在3分钟间从0变化到400l/s的剪切率。通过Rheowin Pro Data manager2.84版(Haake Mess Tech，德国)分析数据。
实施例5
蛋白质含量的测定
通过自动的Kjeldahl方法(AACC，1990)测定蛋白质含量。使用Kjeldahl 2006 Digester(Foss Tecator，Hoganas，瑞典)将样品在浓硫酸中于420℃下消化1小时，使用
Figure G200880010503XD00253
片剂作为催化剂，并使用
Figure G200880010503XD00254
2300 Analyzer Unit(Foss Tecator，Hoganas，瑞士)测定产物的氮含量。通过用氮含量乘以9.5的倍数自动计算蛋白质含量。
(B)水稻胚乳蛋白分离物(RP)的制造(起始材料和比较实施例)
实施例6
在匀化器(Virtishear Tempest，The Virtis Co.，Gardiner，N.Y.，美国)中用8L去离子水(1∶8，w/v)将1kg米粉匀化1分钟。用1M NaOH将浆体的pH调节至11.0，并将悬浮液在40℃下搅拌3小时。通过离心(5000rpm，15分钟)分离溶液中的可溶蛋白质。将该过程重复一次，从残余物中提取额外的蛋白质。在pH 4.5处将合并的第一次和第二次提取的上清液中的蛋白质等电位沉淀，并在4℃下静置1小时。通过在5000rpm离心20分钟回收沉淀物，用去离子水洗涤(1∶4，w/v，pH 4.5)，调节至pH 7.0。提取的蛋白质(RP)被用作制备以下的(C)和(D)的起始材料。
实施例(C)、(D)和(E)的实验设计
本发明包括两组实验：(1)优化水稻蛋白质糖基化，和(2)在水稻蛋白质物理化学特性方面对受控的糖基化、脱酰胺化和alcalase修饰方法(比较实施例)进行比较。糖基化实验的优化在2x7双因素析因设计(葡萄糖和黄原胶)中进行，一式三份重复测量(7个反应时间)。糖基化、脱酰胺化和alcalase修饰方法的比较可在单因素完全随机设计中进行，所述设计包括对照(未修饰的)水稻蛋白质和基准乳清蛋白，以评价和比较所选择的修饰方法的有效性。
因此，通过以下方法修饰水稻胚乳蛋白：(1)用D-葡萄糖将水稻胚乳蛋白糖基化(RPGlu)；(2)用黄原胶将水稻胚乳蛋白糖基化(RPXG)；(3)使用碱处理对水稻胚乳蛋白脱酰胺化(RPDA)；(4)用alcalase将水稻胚乳蛋白处理至1.8％DH(RPAlc)。评价蛋白质衍生物的生物化学特性和功能特性，与未修饰的水稻胚乳蛋白(RP)的特性比较，并作为基准与乳清蛋白分离物比较。
(C)制造部分经水解的水稻胚乳蛋白
实施例7(比较实施例)
用alcalase将水稻胚乳蛋白处理至1.8％DH(RP Alc )
以先前的研究(Paraman et al 2007)和我们的初步数据为基础选择alcalase处理的条件。用DI水(8％w/v)匀化水稻胚乳蛋白分离物(RP)并调节至pH 6.5。在40℃下用0.1％alcalase将蛋白质胶体溶液处理8.5分钟。将酶在85℃下失活7分钟。通过添加冰立刻冷却水解产物，并将pH再次调节至7.0。将蛋白质水解产物喷雾干燥，并在5℃下储存于气密容器中，直至使用(RPAlc)。
(D)制造部分地与单糖或多糖缀合的水稻胚乳蛋白
实施例8
评价用于部分糖基化水稻胚乳蛋白的最适反应条件
将提取的水稻蛋白质RP(以干重为基础20g)溶于去离子水中，得到10％(w/v)的蛋白质胶体溶液。向蛋白质溶液中添加溶于10mL DI水中的D-葡萄糖(0.465g)，同时在37℃下搅拌蛋白质溶液。将蛋白质-葡萄糖混合物调节至pH 8.0并在37℃下搅拌1小时。将混合物冷冻干燥，并将干燥的蛋白质-糖混合物置于铝板上，并在维持65％相对湿度的培养箱中于50℃下孵育。以4小时的间隔取出2.5g蛋白质-葡萄糖混合物作为样品，持续24小时。将糖基化的蛋白质于5℃下储存于气密容器中，直至使用。
基本与上述蛋白质-葡萄糖优化方法相似地进行水稻蛋白质-黄原胶优化，不同之处是以下的改变：蛋白质-黄原胶比例为100∶1，并将蛋白质-黄原胶溶液的pH调节至7.0的值。
实施例9
用D-葡萄糖糖基化水稻胚乳蛋白(RP Glu )
以上述优化和从文献(Kato at al 1990，Kato at al 1991，Achouri et al 2005，Oliver et al 2006)中选择的条件为基础进行糖基化，进行如下文所述的一些变更。将碱提取的水稻蛋白分离物RP(以干重为基础200g)溶于水中，得到10％(w/v)的蛋白质胶体溶液。向蛋白质溶液中添加溶于100mL DI水中的D-葡萄糖(4.65g)，同时在37℃下搅拌蛋白质溶液。将蛋白质-葡萄糖混合物调节至pH 8.0并在37℃下搅拌1小时。将混合物喷雾干燥，并于5℃下储存于气密容器中，直至使用。将喷雾干燥的蛋白质-糖混合物置于铝板上，并在50℃和65％RH下孵育8小时。将糖基化的蛋白质(RPGlu)储存于5℃下，直至使用。
实施例10
用黄原胶糖基化水稻胚乳蛋白(RP XG )
将以干重为基础200g水稻胚乳蛋白分离物(RP)溶于水中，得到10％(w/v)的蛋白质胶体溶液。将黄原胶(2g)独立地溶于水中，得到1％(w/v)的黄原胶溶液。将黄原胶溶液添加进蛋白质溶液中，同时在37℃下搅拌蛋白质溶液。将蛋白质-黄原胶混合物喷雾干燥，并于5℃下储存于气密容器中，直至使用。将喷雾干燥的蛋白质-黄原胶混合物置于铝板上，并在50℃和65％RH下孵育20小时。将糖基化的蛋白质(RPXG)储存于5℃下，直至分析使用。
实施例11
用马铃薯糊精糖基化水稻胚乳蛋白(RP PD )
将以干重为基础200g水稻胚乳蛋白分离物(RP)溶于水中，得到10％(w/v)的蛋白质胶体溶液。将马铃薯糊精(2g)独立地溶于水中，得到1％(w/v)的马铃薯糊精溶液。将马铃薯糊精溶液添加进蛋白质溶液中，同时在37℃下搅拌蛋白质溶液。将蛋白质-糊精混合物调节至pH 7.0，在37℃下搅拌1小时，喷雾干燥，并于5℃下储存于气密容器中，直至使用。将喷雾干燥的蛋白质-糊精混合物置于铝板上，并在50℃和65％RH下孵育20小时。将糖基化的蛋白质(RPPD)储存于5℃下，直至分析使用。
实施例12
用环糊精糖基化水稻胚乳蛋白(RP CD )
将以干重为基础200g水稻胚乳蛋白分离物(RP)溶于水中，得到10％(w/v)的蛋白质胶体溶液。将环糊精(2g)独立地溶于水中，得到1％(w/v)的环糊精溶液。将环糊精溶液添加进蛋白质溶液中，同时在37℃下搅拌蛋白质溶液。将蛋白质-环糊精混合物调节至pH 7.0，在37℃下搅拌1小时，喷雾干燥，并于5℃下储存于气密容器中，直至使用。将喷雾干燥的蛋白质-环糊精混合物置于铝板上，并在50℃和65％RH下孵育20小时。将糖基化的蛋白质(RPCD)储存于5℃下，直至分析使用。
实施例13
用果胶糖基化水稻胚乳蛋白(RP P )
将以干重为基础200g水稻胚乳蛋白分离物(RP)溶于水中，得到10％(w/v)的蛋白质胶体溶液。将果胶(2g)独立地溶于水中，得到1％(w/v)的果胶溶液。将果胶溶液添加进蛋白质溶液中，同时在37℃下搅拌蛋白质溶液。将蛋白质-果胶混合物调节至pH 7.0，在37℃下搅拌1小时，喷雾干燥，并于5℃下储存于气密容器中，直至使用。将喷雾干燥的蛋白质-果胶混合物置于铝板上，并在50℃和65％RH下孵育20小时。将糖基化的蛋白质(RPP)储存于5℃下，直至分析使用。
(E)制造部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白
实施例14
使用碱处理脱酰胺化水稻胚乳蛋白(RP DA )
以文献信息(Schwenke 1997，Cabra et al 2007)为基础选择脱酰胺化的条件，如下文所述进行一些变更。将用碱提取的蛋白质分离物与DI水混合(8％w/v)。将蛋白质胶体溶液调节至pH11.0并在25℃下搅拌12小时。然后提高蛋白质溶液的温度在70℃下搅拌30分钟。通过添加冰立即冷却溶液，并将pH再调节至7.0。将脱酰胺化的蛋白质溶液喷雾干燥并储存于5℃下(RPDA)。
(F)结果
统计学分析
所有的实验一式两份进行。用JMP 6软件(SAS Inst 2002)分析数据的方差和多重均值比较(multiple mean comparison)。通过Tukey HSD步骤，在5％显著性水平(P＜0.05)上测定均值之间的差异显著性。
水稻胚乳蛋白糖基化的优化
如上文所述优化D-葡萄糖和黄原胶对水稻蛋白质的糖基化。被糖基化的蛋白质的溶解度和乳化特性列于表3中。
表3：经D-葡萄糖和黄原胶糖基化的水稻蛋白质的溶解度和乳化特性作为50℃和65％相对湿度下孵育时间的函数
Figure G200880010503XD00301
在50℃和65％相对湿度下用不同的孵育时间(0-24小时)制备水稻蛋白质D-葡萄糖(2.25％，w/w)和水稻蛋白质-黄原胶(1％，w/w)缀合物的糖基化。因为反应开始地非常迅速，所以即使在开始时也能识别与未处理的水稻胚乳蛋白分离物相比的差异。
经糖基化的蛋白质的功能特性作为麦拉德反应时间的函数显著差异，并取决于用于糖基化蛋白质的糖的类型。对D-葡萄糖而言，最适的麦拉德反应时间为50℃和65％RH下8小时。作为麦拉德反应的函数，经糖基化的蛋白质显示溶解度和乳化特性的逐步改进，一直到8小时为止。随着反应时间从0小时进行到8小时，溶解度从23％提高到34％，乳化活性从0.371提高到0.712，阐明了该趋势。这些特性在孵育8小时后降低。然而，作为0到24小时孵育时间的函数，经糖基化的蛋白质的乳液稳定性从15.4分钟逐步提高至28分钟。与晚期(12-24小时)相比，孵育早期阶段(0-12小时)时乳液稳定性的增量更高，这可能归因于氨基的可用性随着麦拉德反应的进行而降低。
在用黄原胶糖基化的蛋白质中，溶解度和乳化特性逐步提高，分别直至16和20小时为止。在16小时的孵育中，溶解度从26％提高至33％；在20小时的孵育中，乳化活性从0.479提高到0.629。与葡萄糖相比，黄原胶介导的糖基化以更低的速率改进功能特性，并且需要更多的时间用于麦拉德反应。对50℃、65％RH下的黄原胶和1∶100的黄原胶∶蛋白质比例而言，18-20个小时的孵育周期是最适的反应时间。最适反应时间会变化并取决于反应物和反应条件(Oliver 2006)。与多糖相比，简单的糖可更快地反应并且需要更短的持续时间。
在本研究中，最适的反应时间比先前公开的研究短得多。在7天的麦拉德反应后，用黄原胶糖基化的溶菌酶展示更好的乳化特性(Nakamura etal 2000)。类似地，用葡萄糖缀合的卵清蛋白在1天的反应时间中达到最大的乳化活性，并在14天的反应时间中达到最大乳液稳定性(Kato et al1995)。时间需求的差异可能归因于这些实验中使用的预孵育条件的差异。例如，在这两种先前的研究中，将蛋白质-糖混合物调节至pH 7.0并立即冷冻干燥。然而，在本研究中，在干燥前将蛋白质-糖混合物搅拌1小时。将糖-水稻蛋白质混合物的pH维持在pH 8.0。在液体阶段中，微碱性条件(pH 8.0)和更长的混合条件(1小时)可有助于麦拉德反应。
孵育0小时的天然蛋白质和糖基化蛋白质的溶解度和乳化数据支持了该推测(表3)。孵育0小时的糖基化蛋白质的溶解度和乳化特性显示比天然水稻蛋白质对照更高的溶解度和乳化特性。对葡萄糖-水稻蛋白质缀合物而言，不进行任何干燥-阶段反应，溶解度从18％提高至24％，乳化活性从0.266提高至0.371(表3)；对黄原胶-水稻蛋白质缀合物而言，溶解度从18％提高至26％，乳化活性和稳定性分别从0.266提高至0.479和从14.7分钟提高至18.1分钟。
在糖基化交联研究中，用D-葡萄糖、马铃薯-糊精、环糊精、果胶、 黄原胶进行预实验。
根据表4中所示的初步数据，与水稻胚乳蛋白和马铃薯-糊精、环糊精或果胶缀合的水稻蛋白质相比，D-葡萄糖和黄原胶缀合显著地提高溶解度和乳化特性。因此，选择D-葡萄糖和黄原胶用于糖基化的进一步工艺优化。
与对照水稻胚乳蛋白相比，马铃薯-糊精、环糊精和果胶缀合未提高胚乳蛋白的溶解度，但是轻微地提高其乳化特性。
表4：在50℃和65％相对湿度下用多种碳水化合物糖基化12和24小时的水稻胚乳蛋白的溶解度和乳化特性
  碳水化合物类型   孵育时间(h)   溶解度(％)   乳化活性(A500)   乳液稳定性(分钟)
  对照水稻蛋白质   17.4   0.259   15.8
  D-葡萄糖   12   31.4   0.596   23.1
  D-葡萄糖   24   26.7   0.417   26.2
  马铃薯-糊精   12   16.1   0.367   18.6
  马铃薯-糊精   24   17.9   0.339   20.4
  环糊精   12   14.8   0.317   24.3
  环糊精   24   11.8   0.294   22.5
  果胶   12   14.1   0.266   15.8
  果胶   24   13.7   0.386   17.9
  黄原胶   12   29.7   0.509   22.6
  黄原胶   24   35.7   0.577   28.3
该实验中使用的蛋白质∶碳水化合物比例对葡萄糖而言为100∶2.265，对马铃薯-糊精、环糊精、果胶和黄原胶而言为100∶1。
针对通过受控的酶水解和碱脱酰胺化修饰的蛋白质的物理化学特性和功能特性，对经优化的糖基化的水稻蛋白质进行进一步的比较和评价。处理和主要修饰方法概括于表5中。
表5：水稻蛋白质修饰方法概要。
Figure G200880010503XD00331
通过上述方法修饰水稻胚乳蛋白：(1)用D-葡萄糖糖基化水稻胚乳蛋白(RPGlu)；(2)用黄原胶糖基化水稻胚乳蛋白(RPXG)；(3)使用碱处理脱酰胺化水稻胚乳蛋白(RPDA)；(4)用alcalase将水稻胚乳蛋白处理至1.8％DH(RPAlc)，从而提高其溶解度和乳化特性。
受控制的糖基化、脱酰胺化和alcalase修饰对水稻蛋白质物理化学特性和功能特性的影响
物理化学特性
水稻蛋白质制品的蛋白质和水分含量展示于表6中。
表6：通过受控的酶水解、糖基化和脱酰胺化修饰的水稻蛋白质分离物的水分、蛋白质含量和粘度。
  水稻蛋白质分离物类型   pH(原样)   水分％  蛋白质(原样，％)   蛋白质(％)(以干重为基础)   粘度(mPas)*
  RP对照   7.1   2.7  84.6   86.7   8.7
  RPAlcalase   7.4   3.3  83.7   86.5   7.0
  RP葡萄糖   6.9   8.8  77.4   84.9   12.4
  RP黄原胶   6.8   9.0  75.9   83.4   31.6
  RP脱酰胺化   6.9   4.5  74.2   77.6   14.0
  乳清蛋白   8.4   3.9  85.2   88.6   5.6
数值是一式两份的均值，并以干重为基础表述。相同列中带有不同字母的均值是有显著差异的(P＜0.05)。
*粘度在26℃下400s-1的恒定剪切率下；1Pas(帕斯卡秒)＝1000cP(厘泊＝mPas)；粘度以“原样”为基础测量。
经糖基化的蛋白质RPGlu、RPXG含有比其他蛋白质更高的水分含量(8.8-9.0％)。这两种产物RPGlu、RPXG在65％RH下分别进行8和18小时的糖基化过程期间吸收水分。经糖基化的蛋白质(RPGlu，RPXG)的蛋白质含量与对照水稻蛋白质分离物(RP)并无差异，因为使用低百分比的葡萄糖(2.25％，w/w)和黄原胶(1％，w/w)糖基化蛋白质。
蛋白质的粘度展示于表6和图1中。
图1显示了对于10％w/v浓度下的水稻蛋白质分离物(-RP对照)、水解产物(◆RPAlc)、糖基化的水稻蛋白质(●RPGlu和■RPXG)和脱酰胺化的水稻蛋白质(▲RPDA)而言，剪切应力(y-轴；以Pa表示)和剪切速率(x-轴；以sec-1表示)的关系；1Pas(帕斯卡秒)＝1000cP(厘泊＝mPas)。粘度是剪切应力和剪切速率的线性图线的斜率。
经糖基化(RPGlu，RPXG)和脱酰胺化(RPDA)的蛋白质显示比经蛋白酶处理(RPAlc)和对照(RP)的水稻蛋白质高得多的粘度。提高的粘度是经糖基化的蛋白质亲水性提高的指征。具体地，用黄原胶糖基化将产物的粘度提高至31.6mPas，这比葡萄糖介导的糖基化(12.4mPas)和脱酰胺化(14.0mPas)方法显著更高。与黄原胶缀合的蛋白质的更高粘度可能归因于糖基残基的复杂尺寸。通常，糖基化的蛋白质粘度提高表明蛋白质结构的改变。糖基化的蛋白质具有更大的流体力学体积，并且由于蛋白质表面亲水性的提高和蛋白质四级结构的部分解折叠而提高水合特性(Baniel et al 1992)。
脱酰胺化还将粘度从8.7提高至14.0mPas。这表明脱酰胺化的蛋白质改进的水合特性。酰胺基成为羧基的脱酰胺化可能改变蛋白质的电荷含量，并改进蛋白质与水分子的相互作用。然而，考虑到用于进行脱酰胺化的条件，脱酰胺化的蛋白质的粘度显然是脱酰胺化、变性和肽键切割的净结果。
Alcalase处理在RPAlc中将粘度从8.7轻微地降低至7.0mPas。粘度的降低归因于蛋白质分子尺寸的降低。然而，粘度范围较小，因为蛋白质水解被控制为1.8％DH。
蛋白质溶解度
蛋白质的溶解度和乳化特性展示于表7中。
表7：水稻蛋白质分离物的氮溶解度和乳化特性
  水稻蛋白质分离物   水解程度(DH)*  N溶解度(％)   乳化活性(A500)   乳液稳定性(min)
  RP对照   -  18.0   0.266   14.7
  RPAlcalase   1.8  33.3   0.468   17.5
  RP葡萄糖   -  39.7   0.721   26.8
  RP黄原胶   -  38.6   0.661   26.1
  RP脱酰胺化   -  68.3   0.776   24.0
  乳清蛋白   -  97.2   0.952   18.8
数值是一式两份的均值，并以干重为基础表述。相同列中带有不同字母的均值是有显著差异的(P＜0.05)。
*DH值仅针对进行了蛋白酶处理的样品展示。
用葡萄糖和黄原胶糖基化将水稻蛋白质的溶解度提高约40％，然而，通过糖基化对溶解度的增量没有期望的水平显著。
Alcalase处理(1.8％，DH)将溶解度从18％提高至33％。提高的溶解度归因于降低的分子尺寸和提高的极性基团数(Nielsen 1997)。先前的研究报道甚至在用alcalase酶处理至13.5％DH之后仍然有高百分比的水稻蛋白质保持不溶(Paraman et al 2007)，这表明被蛋白酶切割的肽通过分子间疏水相互作用或巯基相互作用与未水解的蛋白质结合，或者只有蛋白质的无定形区能够进行水解。
脱酰胺化的蛋白质显示比任何其他处理(28-39％)更高的溶解度(68％)。脱酰胺化的蛋白质显示68.3％的溶解度。碱性条件下的脱酰胺化可能脱去天冬氨酸和谷氨酸氨基酸的侧链酰胺基，并可能改变蛋白质的极性。脱酰胺化增加负电荷，并且能够破坏疏水键和氢键(Schwenke 1997)。这些结构改变可有助于溶解度的提高。具体地，水稻谷蛋白中最丰富的氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Wen and Luthe 1985)。这些氨基酸残基的脱酰胺化能够促进蛋白质溶解度，并有助于改进乳化特性。另外，在脱酰胺化过程中可能进行肽键的部分切割。水解与脱酰胺化的组合作用可有助于溶解度的重大提高。
乳化特性
经糖基化和脱酰胺化的蛋白质的乳化活性和稳定性比经蛋白酶处理的水稻蛋白质分离物显著更高。用葡萄糖糖基化的蛋白质显示0.721的乳化活性和26.8分钟的乳液稳定性。脱酰胺化的蛋白质显示0.776的乳化活性和24.0分钟的乳液稳定性。这两种蛋白质分离物的乳化特性比未经修饰和用蛋白酶修饰的水稻蛋白质分离物更高。糖基化使得蛋白质更加亲水(Katoet al 1991)。因此，受控和有限的糖化改进乳化特性。提高的亲水性质改进水合和溶解度，因此可能打开蛋白质的球状结构。部分解折叠可能改进了糖基化的蛋白质在油-水界面上形成稳定界面膜的能力。
在脱酰胺化的蛋白质的情况下，乳液特性的改进可能是提高蛋白质溶解度和极性所导致(Schwenke 1997)。除了如之前所述的脱酰胺化外，肽键的部分切割也可能有助于改进溶解度和乳化特性。脱酰胺化的蛋白质的提高的溶解度可能帮助在油-水界面上产生稳定的相互作用，并进而改进乳化特性。脱酰胺化和肽键切割的适当平衡可能是通过脱酰胺化改进水稻蛋白质乳液特性的关键。
与未经修饰的水稻蛋白质(RP)相比，alcalase处理至1.8％DH(RPAlc)将乳化活性从0.266提高至0.468，将乳液稳定性从17.7提高至17.5分钟。通常，推荐低水解程度改进食物蛋白质的功能性，特别是乳液稳定性。有限的蛋白质水解可能促进蛋白质的分子柔性和疏水-亲水平衡，这导致更好的乳化(Nielsen 1997；Schwenke 1997)。然而，溶解度和乳化特性的有限改进可能归因于(1)高疏水和巯基相互作用，和伴随高温酶失活的蛋白质隐藏的疏水区的暴露，可能促进了经部分水解的蛋白质的聚集和交联(Paramanet al 2007)。另外，归因于蛋白质的致密性质，酶alcalase可能能够有限接近内部肽键，这可能导致不均一的肽尺寸的形成，并降低得到的水解产物的乳化特性。
结论
为了改进水稻胚乳蛋白的溶解度和乳化特性，糖基化和脱酰胺化类的修饰比通过alcalase蛋白质水解至1.8％DH的修饰更有效。在水稻胚乳蛋白糖基化中，在50℃和65％RH下对D-葡萄糖和黄原胶而言，最优的麦拉德反应时间分别为8小时和20小时。在该研究中评价的蛋白质中，脱酰胺化的蛋白质显示最高的溶解度(68％)和乳化特性(0.776-乳化活性，24分钟乳液稳定性)。与未经修饰的水稻蛋白质(RP)相比，通过alcalase的1.8％DH的受控酶水解仅将乳化活性从0.266提高至0.468，并将乳液稳定性从14.7提高至17.5分钟。脱酰胺化的蛋白质的最高溶解度和乳化特性是脱酰胺化过程中发生的脱酰胺化、肽键切割和蛋白质变性的净结果。
(G)制造根据本发明的脂溶性活性成分或脂溶性着色剂的组合物
实施例15
制造维生素E(乙酸酯)的配制物
可如下制备包含水稻胚乳蛋白和维生素E的配制物：
a)乳液的制备：
将20g根据实施例9的RPGlu(用D-葡萄糖糖基化的水稻胚乳蛋白)与60g蔗糖混合，并通过在75℃下搅拌15分钟重溶于140ml水中，将88.3g dl-α乙酸生育酚加热至70℃，并在剧烈的搅拌下添加至该水溶液中。在轻柔的搅拌下，再添加225mL水，并分析获得的乳液的内相的粒径。通过激光衍射(Malvern Masersizer)测量，乳液内相的平均粒径(Sauter直径，D[3，2])为1.86μm。储存12小时后，再次分析乳液的内相的粒径。通过激光衍射(Malvern Masersizer)测量，储存后乳液的平均粒径(Sauter直径，D[3，2])为1.81μm。
b)从乳液制备固体配制物：
可将乳液喷雾进预冷的玉米淀粉流化床中。可通过过筛去除过量的玉米淀粉，并可在室温下气流中干燥获得的粉末。可通过过筛收集0.16到0.63mm范围内的粉末颗粒级分。或者可通过使用其他公知的干燥技术例如喷雾干燥将乳液转化为固体形式。
实施例16
制造维生素E(乙酸酯)的配制物
可如下制备包含水稻胚乳蛋白和维生素E的配制物：
a)乳液的制备：
将20g根据实施例10的RPXG(用黄原胶糖基化水稻胚乳蛋白)与60g蔗糖混合，并通过在75℃下搅拌15分钟重溶于140ml水中。将83.2gdl-α乙酸生育酚加热至70℃，并在剧烈的搅拌下添加至该水溶液中。将分散液再剧烈地搅拌15分钟。在轻柔的搅拌下，再添加225mL水，并分析获得的乳液的内相的粒径。通过激光衍射(Malvern Masersizer)测量，乳液内相的平均粒径(Sauter直径，D[3，2])为1.65μm。储存12小时后，再次分析乳液的内相的粒径。通过激光衍射(Malvern Masersizer)测量，储存后乳液的平均粒径(Sauter直径，D[3，2])为1.64μm。
b)从乳液制备固体配制物：
可将乳液喷雾进预冷的玉米淀粉流化床中。可通过过筛去除过量的玉米淀粉，并可在室温下气流中干燥获得的粉末。可通过过筛收集0.16到0.63mm范围内的粉末颗粒级分；或者可通过使用其他公知的干燥技术例如喷雾干燥将乳液转化为固体形式。
实施例17
制造维生素E(乙酸酯)的配制物
可如下制备包含水稻胚乳蛋白和维生素E的配制物：
a)乳液的制备：
将20g根据实施例14的RPDA(使用碱处理脱酰胺化水稻胚乳蛋白)与60g蔗糖混合，并通过在75℃下搅拌15分钟重溶于140ml水中。将81.9g dl-α乙酸生育酚加热至70℃，并在剧烈的搅拌下添加至水溶液中。将分散液再剧烈地搅拌15分钟。在轻柔的搅拌下，再添加225mL水，并分析获得的乳液的内相的粒径。通过激光衍射(Malvern Masersizer)测量，乳液内相的平均粒径(Sauter直径，D[3，2])为1.77μm。储存12小时后，再次分析乳液的内相的粒径。通过激光衍射(Malvern Masersizer)测量，储存后乳液的平均粒径(Sauter直径，D[3，2])为1.68μm。
b)从乳液制备固体配制物：
可将乳液喷雾进预冷的玉米淀粉流化床中。可通过过筛去除过量的玉米淀粉，并可在室温下气流中干燥获得的粉末。可通过过筛收集0.16到0.63mm范围内的粉末颗粒级分。或者可通过使用其他公知的干燥技术例如喷雾干燥将乳液转化为固体形式。
实施例18
制造β-胡萝卜素的配制物
可如下制备包含水稻胚乳蛋白和β-胡萝卜素的配制物：
a)制备(基于油的)溶液1：
混合6.6g玉米油和1.2g dl-α-生育酚。将13.8g晶体β-胡萝卜素分散于180ml氯仿(三氯甲烷)中，并将得到的分散液添加至玉米油和生育酚的混合物中。通过轻柔的搅拌并同时将混合物加热至约60℃，得到溶液。
b)制备(水)溶液2：
通过在60℃下搅拌，将30g根据实施例9的RPGlu(用D-葡萄糖糖基化的水稻胚乳蛋白)重溶于120ml水中。
c)从溶液1和2制备乳液：
在53℃下剧烈的搅拌下，将溶液1添加至溶液2中，并将分散液再剧烈地搅拌30分钟。将搅拌后的分散液在50℃到55℃下保持30分钟。在50℃到55℃下去除残余的三氯甲烷。通过离心去除残余的气泡后，将乳液在50℃到55℃下柔和地搅拌数分钟，然后分析乳液的内相的粒径。通过激光衍射(Malvern Masersizer)测量，乳液内相的平均粒径(Sauter直径，D[3，2])为440nm。
d)从乳液制备固体配制物：
可将乳液喷雾进预冷的玉米淀粉流化床中。可通过过筛去除过量的玉米淀粉，并可在室温下气流中干燥获得的粉末。可通过过筛收集0.16到0.63mm范围内的粉末颗粒级分，并就水性分散液的类胡萝卜素含量、颜色强度和色调、玉米淀粉的含量和残余湿度等方面进行分析表征。
表8：计算的干燥配制物的组成
  化合物   含量[wt％，以总干重为基础]
  RPGlu：根据实施例9的水稻胚乳蛋白   25.0
  蔗糖   30.5
  抗坏血酸棕榈酸盐   1.5
  β-胡萝卜素   11.5
  玉米油   5.5
  dl-α-生育酚   1.0
  玉米淀粉流体   25.0
实施例19
制造β-胡萝卜素的配制物
可如下制备包含水稻胚乳蛋白和β-胡萝卜素的配制物：
a)制备(基于油的)溶液1：
混合6.6g玉米油和1.2g dl-α-生育酚。将13.8g晶体β-胡萝卜素分散于180ml氯仿(三氯甲烷)中，并将得到的分散液添加至玉米油和生育酚的混合物中。通过轻柔的搅拌并同时将混合物加热至约60℃，得到溶液。
b)制备(水)溶液2：
通过在60℃下搅拌，将30g根据实施例10的RPXG(用黄原胶糖基化水稻胚乳蛋白)重溶于120ml水中。另外添加1.8g抗坏血酸棕榈酸盐和36.6g蔗糖。使用0.5ml水性1N NaOH将pH调节至7.3的数值。
c)从溶液1和2制备乳液：
在53℃下剧烈的搅拌下，将溶液1添加至溶液2中，并将分散液再剧烈地搅拌30分钟。将搅拌后的分散液在50℃到55℃下保持30分钟。在50℃到55℃下去除残余的三氯甲烷。通过离心去除残余的气泡后，将乳液在50℃到55℃下柔和地搅拌数分钟，然后分析乳液的内相的粒径。通过激光衍射(Malvern Masersizer)测量，乳液内相的平均粒径(Sauter直径，D[3，2])为380nm。
d)从乳液制备固体配制物：
可将乳液喷雾进预冷的玉米淀粉流化床中。可通过过筛去除过量的玉米淀粉，并可在室温下气流中干燥获得的粉末。可通过过筛收集0.16到0.63mm范围内的粉末颗粒级分，并就水性分散液的类胡萝卜素含量、颜色强度和色调、玉米淀粉的含量和残余湿度等方面进行分析表征。
表9：计算的干燥配制物的组成
  化合物   含量[wt％，以总干重为基础]
  RPXG：根据实施例10的水稻胚乳蛋白   25.0
  蔗糖   30.5
  抗坏血酸棕榈酸盐   1.5
  β-胡萝卜素   11.5
  玉米油   5.5
  dl-α-生育酚   1.0
  玉米淀粉流体   25.0
实施例20
制造β-胡萝卜素的配制物
可如下制备包含水稻胚乳蛋白和β-胡萝卜素的配制物：
a)制备(基于油的)溶液1：
混合6.6g玉米油和1.2g dl-α-生育酚。将13.8g晶体β-胡萝卜素分散于180ml氯仿(三氯甲烷)中，并将得到的分散液添加至玉米油和生育酚的混合物中。通过轻柔的搅拌并同时将混合物加热至约60℃，得到溶液。
b)制备(水)溶液2：
通过在60℃下搅拌，将30g根据实施例16的RPDA(使用碱处理对水稻胚乳蛋白脱酰胺化)重溶于120ml水中。另外添加1.8g抗坏血酸棕榈酸盐和36.6g蔗糖。使用0.4ml水性1N NaOH将pH调节至7.0的数值。
c)从溶液1和2制备乳液：
在53℃下剧烈的搅拌下，将溶液1添加至溶液2中，并将分散液再剧烈地搅拌30分钟。将搅拌后的分散液在50℃到55℃下保持30分钟。在50℃到55℃下去除残余的三氯甲烷。通过离心去除残余的气泡后，将乳液在50℃到55℃下柔和地搅拌数分钟，然后分析乳液的内相的粒径。通过激光衍射(Malvern Masersizer)测量，乳液内相的平均粒径(Sauter直径，D[3，2])为500nm。
d)从乳液制备固体配制物：
可将乳液喷雾进预冷的玉米淀粉流化床中。可通过过筛去除过量的玉米淀粉，并可在室温下气流中干燥获得的粉末。可通过过筛收集0.16到0.63mm范围内的粉末颗粒级分，并就水性分散液的类胡萝卜素含量、颜色强度和色调、玉米淀粉的含量和残余湿度等方面进行分析表征。
表10：计算的干燥配制物的组成
  化合物   含量[wt％，以总干重为基础]
  RPDA：根据实施例14的水稻胚乳蛋白   25.0
  蔗糖   30.5
  抗坏血酸棕榈酸盐   1.5
  β-胡萝卜素   11.5
  玉米油   5.5
  dl-α-生育酚   1.0
  玉米淀粉流体   25.0

Claims (37)

1.从糙米开始制造下述水稻胚乳蛋白的方法，所述水稻胚乳蛋白部分地与D-葡萄糖或黄原胶缀合或被部分脱酰胺化，其中在研磨前去除米糠，所述方法包括以下的步骤a)到e)：
a)制备糙米的水溶液或悬浮液，其中在研磨前去除米糠；
b)可选地去除糙米的非蛋白质部分或蛋白质部分来获得水稻胚乳蛋白，其中在研磨前去除米糠；
c)通过将步骤b)中获得的蛋白质部分在麦拉德型反应中部分地与D-葡萄糖或黄原胶反应，或通过部分地对糙米的蛋白质部分脱酰胺化，来修饰糙米的蛋白质部分，获得部分地与D-葡萄糖或黄原胶缀合的或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白，其中在研磨前去除米糠；
d)可选地分离部分地与D-葡萄糖或黄原胶缀合的或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白；
e)可选地将部分地与D-葡萄糖或黄原胶缀合的或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白转化为固体形式。
2.根据权利要求1的方法，其中如下实现步骤b)中的非蛋白质部分的去除：用非蛋白质降解酶处理糙米，使所述酶失活，以及从糙米的蛋白质部分中分离和去除非蛋白质的部分。
3.根据权利要求2的方法，其中所述非蛋白质降解酶是淀粉降解酶、纤维素降解酶或其混合物。
4.根据权利要求2的方法，其中通过离心及随后的洗刷实现非蛋白质部分的分离。
5.根据权利要求1到4中任一项的方法，其中通过用碱性、中性和/或酸性蛋白酶处理糙米的蛋白质部分来实现步骤c)。
6.根据权利要求5的方法，其中用两种不同的碱性蛋白酶先后处理所述糙米的蛋白质部分。
7.根据权利要求6的方法，其中这些蛋白酶之一是丝氨酸特异性的蛋白酶，另一种是半胱氨酸特异性的蛋白酶。
8.根据权利要求1到4中任一项的方法，其中通过将糙米溶液或悬浮液的pH调节至从7到12的值，实现步骤b中的蛋白质部分的去除。
9.根据权利要求1到4中任一项的方法，其中通过干燥实现步骤e)。
10.根据权利要求1到4中任一项的方法，其中步骤a)中所述溶液或悬浮液以水溶液或悬浮液的总量为基础，具有从0.1重量％到30重量％的干物质含量。
11.根据权利要求1到4中任一项的方法，其中如下实现所述脱酰胺化：在25℃到90。℃范围内的温度下将步骤b)中获得的水稻胚乳蛋白的蛋白质部分的水性胶体溶液的pH值调节至9.0到13.0范围内的值。
12.能够通过根据权利要求1到10或11中任一项的方法获得的部分地与D-葡萄糖或黄原胶缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白。
13.能够通过根据权利要求1到10或11中任一项的方法获得的乳化活性≥0.6的水稻胚乳蛋白，其中所述乳化活性根据下述方法测定，所述方法包括步骤：
(1)用超声波仪在6档下将6mL在10mM pH7.0的磷酸缓冲液中的水稻胚乳蛋白的0.1％溶液与2mL油的混合物匀化1分钟；
(2)在匀化后0和10分钟，将50微升混合物转移进5mL 0.1％w/v的SDS水溶液中；
(3)用分光光度计测定500nm处溶液的吸光度，匀化后0时间处的吸光度是水稻胚乳蛋白的乳化活性。
14.能够通过根据权利要求1到10或11中任一项的方法获得的乳液稳定性≥20分钟的水稻胚乳蛋白，其中所述乳液稳定性根据下述方法测定，所述方法包括步骤：
(1)用超声波仪在6档下将6mL在10mM pH7.0的磷酸缓冲液中的水稻胚乳蛋白的0.1％溶液与2mL油的混合物匀化1分钟；
(2)在匀化后0和10分钟，将50微升混合物转移进5mL 0.1％w/v的SDS水溶液中；
(3)用分光光度计测定500nm处溶液的吸光度，匀化后0时间处的吸光度是水稻胚乳蛋白的乳化活性；
(4)使用时间间隔10分钟期间初始吸光度的浊度降低来计算乳液稳定性，如下计算：
乳液稳定性＝To×Δt/ΔT-其中ΔT是时间间隔Δt期间初始吸光度To的浊度降低。
15.包含下述水稻胚乳蛋白和脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂的组合物，所述水稻胚乳蛋白部分地与D-葡萄糖或黄原胶缀合或部分脱酰胺化。
16.根据权利要求15的组合物，其中所述脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂是胡萝卜素或结构相关的多烯化合物，脂溶性维生素，富含多不饱和脂肪酸的甘油三酯，油溶性UV-A遮蔽剂，UV-B遮蔽剂或其混合物。
17.根据权利要求16的组合物，其中所述胡萝卜素或结构相关的多烯化合物是选自α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、8′-阿朴-β-胡萝卜醛、8′-阿朴-β-胡萝卜酸酯、角黄素、虾青素、番茄红素、叶黄素、玉米黄素、藏红花酸、α-玉米胡萝卜素、β-玉米胡萝卜素或其混合物。
18.根据权利要求16的组合物，其中所述脂溶性维生素是维生素A或E。
19.权利要求15到18中任一项的组合物，其中还包含选自以下的至少一种化合物：单糖、寡糖、多糖、甘油、甘油三酯、水溶性抗氧化剂和脂溶性抗氧化剂。
20.根据权利要求19的组合物，其中所述单糖或寡糖是蔗糖、木糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖。
21.根据权利要求19的组合物，其中所述寡糖或多糖是淀粉、淀粉水解产物或改性淀粉。
22.根据权利要求21的组合物，其中所述淀粉水解产物是糊精、麦芽糖糊精或葡萄糖浆。
23.根据权利要求16的组合物，其中所述甘油三酯是植物油或脂肪。
24.根据权利要求19的组合物，其中所述甘油三酯是植物油或脂肪。
25.根据权利要求15到18中任一项的组合物，其中还包含选自以下的共乳化剂：脂肪酸甘油单酯和甘油二酯，脂肪酸的甘油多酯，卵磷脂和脱水山梨醇单硬脂酸酯。
26.根据权利要求15到18中任一项的组合物，其中所述水稻胚乳蛋白的乳化活性≥0.6，其中所述乳化活性根据下述方法测定，所述方法包括步骤：
(1)用超声波仪在6档下将6mL在10mM pH7.0的磷酸缓冲液中的水稻胚乳蛋白的0.1％溶液与2mL油的混合物匀化1分钟；
(2)在匀化后0和10分钟，将50微升混合物转移进5mL 0.1％w/v的SDS水溶液中；
(3)用分光光度计测定500nm处溶液的吸光度，匀化后0时间处的吸光度是水稻胚乳蛋白的乳化活性。
27.根据权利要求15到18中任一项的组合物，其中所述水稻胚乳蛋白的乳液稳定性≥20分钟，其中所述乳液稳定性根据下述方法测定，所述方法包括步骤：
(1)用超声波仪在6档下将6mL在10mM pH7.0的磷酸缓冲液中的水稻胚乳蛋白的0.1％溶液与2mL油的混合物匀化1分钟；
(2)在匀化后0和10分钟，将50微升混合物转移进5mL 0.1％w/v的SDS水溶液中；
(3)用分光光度计测定500nm处溶液的吸光度，匀化后0时间处的吸光度是水稻胚乳蛋白的乳化活性；
(4)使用时间间隔10分钟期间初始吸光度的浊度降低来计算乳液稳定性，如下计算：
乳液稳定性＝To×Δt/ΔT-其中ΔT是时间间隔Δt期间初始吸光度To的浊度降低。
28.根据权利要求15到18中任一项的组合物，其中以所述组合物的总量为基础，部分地与D-葡萄糖或黄原胶缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白的含量为从1到70重量％，和/或脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂的含量为从0.1到90重量％。
29.根据权利要求15到18中任一项的组合物，其为粉末形式。
30.用于制造权利要求15到29中任一项所述组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
I)制备部分地与D-葡萄糖或黄原胶缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白的水溶液或胶体溶液，
II)可选地向步骤I)中制备的溶液中添加至少一种水溶性佐剂，
III)制备至少一种脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂和可选地至少一种脂溶性佐剂的溶液或分散液，
IV)将步骤I)到III)中制备的溶液彼此混合，
V)匀化由此得到的混合物，
VI)可选地添加交联剂，用于交联部分地与D-葡萄糖或黄原胶缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白，
VIa)可选地对进行步骤VI)后得到的混合物进行酶处理或热处理，从而交联水稻胚乳蛋白或经修饰的水稻胚乳蛋白，
VII)可选地将步骤V)和/或VI)中获得的分散液转化为粉末，
VIII)可选地干燥步骤VII)中获得的粉末，
IX)可选地对步骤VII)中获得的粉末或步骤VIII)中获得的干燥的粉末进行热处理或酶处理，从而交联部分地与D-葡萄糖或黄原胶缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白，
前提是进行步骤VI)时，仅进行步骤VIa)或步骤IX)之一，而不会二者都进行。
31.根据权利要求30的方法，其中根据步骤VIa)或步骤IX)的酶处理是使用交联酶的处理。
32.根据权利要求30的方法，其中根据步骤VIa)或步骤IX)的酶处理是使用转谷氨酰胺酶的处理。
33.根据权利要求30的方法，其中部分地与D-葡萄糖或黄原胶缀合或部分脱酰胺化的水稻胚乳蛋白是在权利要求13和/或14中定义的水稻胚乳蛋白。
34.权利要求15到29中任一项所述组合物用于对食物、饮料、动物饲料、个人护理或药物组合物进行富集、强化和/或着色的用途。
35.含有权利要求15到29中任一项所述的组合物的食物、饮料、动物饲料、个人护理和药物组合物。
36.含有权利要求12到14中任一项所述的水稻胚乳蛋白的食物、饮料、动物饲料、个人护理和药物组合物。
37.权利要求12到14中任一项所述的水稻胚乳蛋白作为用于脂溶性活性成分和/或脂溶性着色剂的保护性水胶体的用途。
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