CN101784294A - 用于恢复血液状况的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于体外除去血液或血液成分中的有害物质的装置，其包含通过共价端点连接(covalent end point attachment)而固定在固体基质上的全长肝素。本发明还涉及用于体外除去哺乳动物血液或血液成分中的有害物质的方法。本发明进一步涉及用于将全长肝素共价端点连接到固体基质上的方法。

Description

用于恢复血液状况的装置和方法
发明领域
本发明涉及用于体外除去血液或血液成分中的有害物质的装置，该装置包括通过共价端点连接而固定在固体基质上的全长肝素。本发明还涉及用于体外除去哺乳动物血液或血液成分中的有害物质的方法。本发明进一步涉及用于将全长肝素共价端点连接于固体基质上的方法。
发明背景
脓毒症(sepsis)最常见的诱因是由革兰氏阴性菌的全身性感染，目前，由抗生素耐受性菌株导致的感染是相当严重的问题，需要提供可选择的预防和治疗方法。早先的体外和体内研究显示，含有固定化肝素的组合物对微生物感染具有预防性质。另外，由体外循环(circuit)的生物不相容性导致的炎症应答在临床上造成了严重的问题，而且可能最终导致脓毒症。
硫酸乙酰肝素(Heparan sulfates)是一类蛋白多糖，存在于几乎所有哺乳动物细胞的表面。许多微生物利用哺乳动物细胞表面上的硫酸乙酰肝素作为受体。而且，炎性细胞和细胞因子利用细胞表面上的硫酸乙酰肝素进行结合和激活。肝素是另一种蛋白多糖，分子量为15-25kDa，它是从哺乳动物组织肥大细胞嗜碱性颗粒中的蛋白多糖中分离出来的。由于肝素与硫酸乙酰肝素之间的结构相似性，固定在固体表面上的肝素可以结合细菌、病毒和寄生物，以及炎性细胞和细胞因子。
促炎症状态的发展与许多哺乳动物疾病急剧增加的发病率和致死率有关，包括败血症(septicemia)、病毒血症(viraemia)、急性或慢性肾病、心血管病、低血容量性休克(hypovolemic shock)、过敏性反应(anaphylactic reaction)和自身免疫性疾病。组织损伤和器官功能障碍不仅可以由外来微生物导致，还可以由应答于这类感染而被释放的促炎症媒介所造成，或者是由于常规体外循环导致的表面激活(补体激活等)。细胞因子(例如肿瘤坏死因子、白细胞介素-1、白细胞介素-6)和非细胞因子(例如一氧化氮、血小板活化因子、补体和类花生酸类物质(eicosonoid))可能造成附带组织损伤(collateral tissueinjury)，并促成多器官系统障碍以及机体细胞死亡。来自细菌、寄生物、真菌或病毒的成分可以通过多种细胞类型引起促炎症细胞因子的激活。炎性细胞(包括巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞)被激活。内源抗炎媒介应答感染而被释放，并控制压倒性的全身炎症应答。首先，致病微生物的清除是减少炎症应答的关键。其次，作用于炎性媒介的正反馈与负反馈之间的脆弱平衡是调节细胞损伤和影响临床结果的关键因素，使得降低循环中的促炎症刺激和/或促炎症细胞因子成为控制脓毒并发症(septic complication)的关键事件。
US 6,197,568公开了根据所述微生物与固定在琼脂糖上的肝素之间的相互作用来分离、诊断和处理微生物，例如黄病毒(flaviviruses)和其它出血性病毒(hemorrhagic virus)的方法。US 6,197,568中所用的肝素-琼脂糖包括固定在琼脂糖上的裂解肝素(cleaved heparin)。
在Artificial Organs，26(12)：1020-1025(2002)中，用包被有肝素的体外回路吸附炎性细胞因子。体外回路具有一个静电结合多点连接肝素的BaxterDuraflo II肝素表面。
存在对于体外处理血液的改进方法和装置的需求。
发明内容
本发明的一个目的是提供改进装置和方法，用于体外除去哺乳动物血液或血液成分中的有害物质。
本发明的另一个目的是提供用于除去哺乳动物血液或血液成分中的有害物质的装置，用于在例如血液透析或氧合的常规体外循环系统中使用。
本发明的一个进一步的目的是提供一种方法，用于将全长肝素固定到装置上面，而不改变肝素分子的期望生物活性。而且，该表面在所用的反应条件下将是稳定的，特别就肝素的浸出(leaching)而言。
在第一个方面中，本发明提供了一种用于体外除去血液或血液成分中的有害物质的装置，该装置包括通过共价端点连接固定在固体基质上的全长肝素。
目前使用的最成功的表面肝素化技术是Carmeda Bioactive Surface(Carmeda Bioactive Surface)
Figure G200880025586XD00021
在
Figure G200880025586XD00022
表面的制备中，肝素分子被切裂，以提供反应基团，用来将肝素片段端点连接(end point attachment)到表面上。为了使肝素结合性模块有可能接触并结合于肝素分子，多糖的端点连接是必须的。依照
Figure G200880025586XD00031
程序连接的肝素分子的平均分子量为6-9kDa。
在根据本发明的装置中，使用这样一种肝素固定化技术，其中平均分子量超过21KDa的全长肝素分子被端点连接于表面。使用本发明的方法，连接在表面上的肝素量可以达到现今技术水平的
Figure G200880025586XD00032
技术的近2倍。依照本发明的方法连接的更长的链还提供了间隔物(spacer)功能，由此可提供更多可供肝素结合性模块结合的可及性(accessible)肝素寡聚体。
本发明人发现，根据本发明的全长肝素包被表面结合TNF-α的效率比现有技术中一般采用的用肝素片段包被的常规表面高得多。在现有技术中，大多数肝素包被表面的制备方法涉及断裂肝素分子以便获得可用于将肝素片段偶联于固体基质的活性基团。前人尝试了将全长肝素与固体表面偶联，结果得到的肝素表面偶联肝素的表面浓度低，不能用于实际应用。其它人尝试了将全长肝素偶联于固体表面，结果肝素分子与固体基质形成多点连接(multi-point attachment)，这大大降低了肝素的结合能力。
因此，在本发明的一个实施方案中，固定的肝素分子的平均分子量超过10kDa。在本发明的另一个实施方案中，固定的肝素分子的平均分子量超过15kDa。在本发明另外一个实施方案中，固定的肝素分子的平均分子量超过21kDa。在本发明另外一个实施方案中，固定的肝素分子的平均分子量超过30kDa。优选地，固定的肝素分子的平均分子量范围在15-25kDa。平均分子量还可以更高，例如25-35kDa的范围。
因此，在根据本方面的装置中的固定化肝素分子的平均分子量显著高于当前技术中使用的肝素分子的平均分子量。根据本发明使用的全长肝素分子就下述两个方面而言都提供了更高的对肝素结合分子的结合能力：固体基质每单位表面积上可以结合的肝素结合分子的量，以及表面可以结合的分子的范围(这是由固定全长肝素分子所呈现的结合基团的选择增加所致的)。
本发明涉及一种用于制备携带有端点连接的全长肝素的表面的方法，该方法产生具有高全长肝素表面浓度的全长肝素包被表面。与现有技术的肝素表面相比，在本发明各个方面中使用的全长肝素分子可以显著增加每单位表面积上结合肝素结合实体(heparin binding entities)的能力。肝素优选地与所述固体基质共价连接。肝素分子的共价偶联防止肝素被浸出到与肝素包被表面接触的血液中。肝素的浸出是利用例如静电将肝素结合于表面的现有技术的一个问题。
在一个更具体的实施方案中，所述肝素通过共价端点连接与所述固体基质连接。肝素与固体基质的共价连接与非共价连接相比可以对表面密度及固定化分子的取向等参数进行更好的控制。本发明人发现，这些参数对于肝素结合性有害物质与固定化肝素分子的最佳结合是重要的。在一个实施方案中，固体基质上的肝素的表面浓度范围是1-20μg/cm2。在另一个实施方案中，固体基质上的肝素的表面浓度范围是5-15μg/cm2。共价端点连接的意思是指肝素通过肝素分子的末端残基共价连接于固体基质。
在本发明的一个实施方案中，全长肝素分子与表面的共价连接是通过肝素分子的醛基与表面上存在的一级氨基的反应实现的。所有碳水化合物的一个固有性质是它们在其还原性末端具有一个半缩醛基(hemiacetal)。这个缩醛(acetal)与醛形式形成平衡，并能够与一级胺形成席夫碱(Schiff’sbase)。这些席夫碱可以继续被还原成稳定的二级胺。在本发明装置的一个实施方案中，所述肝素通过稳定的二级氨基共价连接于所述固体基质。
在一个实施方案中，该装置是一种包括容纳有肝素化固体基质的外壳(casing)的柱子，所述柱子具有可供血液通过而进入柱子的入口，和可供血液通过而离开柱子的出口，并且所述入口和出口被设置成使通过入口进入的血液在通过出口离开柱子之前与所述肝素化的固体基质接触。
装置的固体基质可以优选地包括具有大的表面积的材料。装置的固体基质可以包括微粒(microparticles)或中空纤维，但是其它类型的固体基质也可以使用。所述固体基质的总表面积可以是0.1-20m2的范围，优选0.5-3m2的范围。在本发明的某些实施方案中，所述固体基质的材料选自：玻璃、纤维素、醋酸纤维素、甲壳素(chitin)、壳聚糖(chitosan)、交联右旋糖酐、交联琼脂糖、交联海藻酸盐(alginate)、聚乙烯、聚丙烯、聚砜(polysulfone)、聚丙烯腈(polyacrylonitrile)、有机硅(silicone)、含氟聚合物(fluoropolymer)(例如聚四氟乙烯)和聚氨酯(polyurethanes)。
固体基质可以包括颗粒或珠子。在本发明装置的一个实施方案中，其中固体基质是颗粒或珠子，所述颗粒或珠子可以优选地包括选自下组的材料：聚氨酯、聚烯烃(polyolefin)、有机硅、含氟聚合物(例如聚四氟乙烯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、玻璃、交联海藻酸盐、和交联多糖，例如琼脂糖、右旋糖酐、纤维素、壳聚糖和淀粉。也可以使用其它在医用微粒中通常使用的材料。在本发明的另一个实施方案中，固体基质包括交联多糖。
在本发明装置的一个实施方案中，其中该固体基质包括中空纤维，所述中空纤维可以优选地包括选自下组的材料：聚砜、聚酰胺、聚腈(polynitriles)、聚丙烯、交联海藻酸盐、和纤维素。也可以使用其它在医用中空纤维中通常使用的材料。中空纤维可以优选地包括聚砜。
装置的固体基质当然也可以采取其它可提供大表面积的形状或形式。
对于每种应用或处理应当选择固体基质的尺寸和孔隙度，以便允许合适的血液流速以对装置可以接受的压力通过装置。对于某些需要高血流速度和低压力降的应用，需要较大直径的颗粒、孔、中空纤维或其它固体基质。在其它不需要高血液流速和低压力降的应用中，可以使用较小直径的颗粒、孔、中空纤维或其它固体基质。因此，在本发明的一个实施方案中，其中固体基质以颗粒的形式存在，颗粒直径的范围是10μm-5mm。颗粒直径的范围还可以是10μm-1000μm。一般地，可以使用20-200μm范围的颗粒尺寸，但是在高流速的应用中，可能需要更大的颗粒。固体基质可以包括一种或多种中空纤维。在本发明的一个实施方案中，其中固体基质以中空纤维的形式存在，所述纤维的内径范围是1μm-1000μm。一般地，20-200μm范围的内径是可用的，但是在某些应用中，可以采用更大或更小直径的纤维。
本发明的装置应当优选地具有合适的尺寸，以适合预期应用所需的血液流速。作为非限制性实例，用于肾血液透析的体外循环回路的血液流速的范围一般是200-500mL/min，而用于氧合的体外循环回路的血液流速范围一般是2000-7000mL/min。在某些应用中，例如在用于处理急性脓毒症的体外循环回路中，血液流速可以更低，例如1-100mL/min范围。
因此，在一个实施方案中，本发明的装置适合于200-500mL/min的血液流速。在另一个实施方案中，本发明的装置适合于2000-7000mL/min的血液流速。在另外一个实施方案中，本发明的装置适合于1-100mL/min的血液流速。
已经知道，在接触血液的体外循环用医疗装置中(in blood contactingmedical devices for extracorporeal circulation)，局部的血流模式可以通过静止区(stagnant zone)中的血小板的剪切激活(shear activation)和凝聚而影响血凝块(clot)的形成。因此，本发明的装置应当设计成不产生这些问题的方式。
在一个实施方案中，本发明装置被设置在静脉至静脉或动脉至静脉体外旁路中。这样的回路可以进一步包括泵、管道(tubing)和插管(cannulae)。该装置优选地可以适合于不同医学程序所需的血流。
在另一个实施方案中，本发明装置包括输送血液通过该装置的泵。在一个具体的实施方案中，该装置作为一个独立(stand-alone)单元存在，其可以独立于其它设备进行操作。
在本发明第一个方面的一个实施方案中，该装置是被设置成与体外循环回路一起使用的柱子。该柱子包括含有肝素化固体基质的外壳，所述柱子具有可供血液通过而进入柱子的入口，和可供血液通过而离开柱子的出口，并且所述入口和出口被设置成使通过入口进入的血液在通过出口离开柱子之前与所述肝素化的固体基质接触。肝素化的固体基质包被有共价端点连接的全长肝素，表面浓度为大约10μg/cm2。
根据本发明的装置可以用于例如脓毒性休克(septic shock)、败血症、弥散性血管内凝血、自身免疫性疾病、移植排斥等症候(indication)的治疗或预防。其它的临床应用包括清除微生物(例如疟疾、丙型肝炎和HIV)和肝素结合性毒物(例如蛇毒)。本发明装置与常规的体外循环用回路--包括氧合器和血液透析机--联合使用，可降低与这些回路的长期使用相关的发病率和致死率。
本发明的有害物质可以是例如促炎症媒介(pro-inflammatorymediators)，例如促炎症细胞或促炎症蛋白。然而，本发明的装置不仅限于除去促炎症细胞和促炎症蛋白。任何具有对肝素的结合亲和力的内源或外源分子均可用本发明的装置来加以除去。另外，包含具有肝素结合亲和力的分子的微生物也可以用本发明的装置除去。可以用根据本发明的装置从血液中除去的微生物和分子包括例如选自下组的微生物：细菌、病毒、寄生物，以及由这些微生物编码或与之相关的蛋白或其它分子。
在一个实施方案中，所述有害物质是病毒。在一个更具体的实施方案中，所述病毒选自下组：单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、甲型流感病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒。在另一个更具体的实施方案中，所述病毒选自下组：单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型。
在另一个实施方案中，所述有害物质是细菌。在一个更具体的实施方案中，所述细菌选自下组：链球菌(streptococci)例如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，葡萄球菌(staphylococci)例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，大肠菌(coli)，例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，假单胞菌(pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aureginosa)，和肺炎球菌(pneumococci)例如2型肺炎球菌(Pneumococcus type 2)。在一个优选实施方案中，所述有害物质是金黄色葡萄球菌。
在另外一个实施方案中，所述有害物质是寄生物。在一个更具体的实施方案中，所述寄生物选自下组：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi).
在一个进一步的实施方案中，促炎症媒介可以是选自下组的炎性细胞：炎性淋巴细胞、炎性巨噬细胞和炎性粒细胞。
在另一个进一步的实施方案中，促炎症媒介可以是促炎症蛋白，例如促炎症细胞因子。促炎症蛋白的实例包括含有肝素结合基团的蛋白，例如在J.Biol.Chem.，2007，Mar 30；282(13)：10018-27中公开的，和选自下组的蛋白：肿瘤坏死因子、白细胞介素-1、白细胞介素-6、蛋白C、白细胞介素-8、高泳动族框-1蛋白(high-mobility group box-1 protein)或巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migratory inhibitory factor)。在一个更具体的实施方案中，所述促炎症细胞因子选自下组：肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)。
在本发明的第二个方面中，本发明提供一种用于体外除去哺乳动物血液中的有害物质的方法，其包括如下步骤：
a)提供哺乳动物血液样品，
b)使所述样品与通过共价端点连接固定在固体基质上的全长肝素在允许所述有害物质与所述肝素结合的条件下接触，
c)将样品从固体基质分离，从而使所述有害物质至少部分地保留在固体基质上，和
d)回收含有降低量的所述有害物质的所述样品。
在本发明第二个方面的一个实施方案中，方法中的步骤b)和c)用由本发明第一个方面定义的装置进行。根据本发明第二个方面的方法的其它的实施方案在有害物质、炎症细胞、炎症蛋白、哺乳动物血液、固体基质和肝素固定化方面与上文根据本发明第一个方面的装置中所规定的相同。
在本发明的第三个方面中，本发明提供了一种用于处置罹患由有害物质导致或加重的病症的哺乳动物受试者的方法，包括如下步骤：
a)从受试者提取血液，
b)使所提取的血液与通过共价端点连接固定在固体基质上的全长肝素在允许所述有害物质与肝素结合的条件下接触，
c)将含有降低量的所述有害物质的血液再次导入受试者的血流。
在本发明第三个方面的一个实施方案中，方法的步骤b)是用由本发明第一个方面定义的装置进行的。根据本发明第三个方面的方法的进一步的实施方案在有害物质、炎症细胞、炎症蛋白、哺乳动物血液、固体基质和肝素固定方面，与上面关于根据本发明第一个方面的装置中所规定的相同。
在一个实施方案中，本发明的方法可以用于除去哺乳动物血液中的促炎症细胞因子。
在本发明的第四个方面中，本发明提供了用于体外循环血液或血液成分的设备，包括常规的体外血液处理装置和如本文所述的用于除去有害物质的装置。
对患者的脓毒症(sepsis)或肾衰竭等症候的治疗经常涉及在包含血液透析设备的体外回路中对患者的血液进行处置。在体外血液处理中使用的处理方法本身就可能诱导炎症细胞因子的活化，导致接受治疗的患者的血流内这些物质增加。例如，在通过体外血液处理系统的管道、连接和部件输送的过程中施加在血液上的机械应力可能导致细胞因子的活化。这一点在例如用于氧合血液(例如在外伤后的急性肺衰竭期间)的氧合器中会造成严重的问题。特别地，通过窄径孔或通道输送血液可能对血液中的血细胞产生剪切应力。此外，与血液发生接触的不同部件的表面材料可能影响血液中炎症细胞因子的活化。根据本发明的设备可减少常规血液处理装置中促炎症细胞因子激活的相关问题。
根据本发明第四个方面的方法的实施方案在有害物质、炎症细胞、炎症蛋白、哺乳动物血液方面，与上面关于根据本发明第一个方面的方法中所规定的相同。
在该设备的一个实施方案中，所述常规体外血液处理装置是用于血液氧合的装置。
在该设备的另一个实施方案中，所述常规体外血液处理装置是用于血液透析的装置。
还考虑了将其它类型的常规体外血液处理装置用于本发明的设备。
在本发明的设备中，用于除去有害物质的装置优选地设置在常规体外血液处理装置的下游。
在本发明设备的优选实施方案中，用于除去有害物质的所述装置包括固定化在固体基质上的肝素。
用于除去有害物质的装置的固体基质可以优选地包括具有大表面积的材料。装置的固体基质可以包括微粒或中空纤维，但是其它类型的固体基质也可以使用。所述固体基质的总表面积可以是0.1-20m2，优选是0.5-3m2的范围。
固体基质可以包括颗粒或珠子。在该设备的一个实施方案中，其中固体基质是颗粒或珠子，所述颗粒或珠子优选地包括选自下组的材料：聚氨酯、聚烯烃、有机硅、含氟聚合物(例如聚四氟乙烯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、玻璃、交联海藻酸盐、和交联多糖，例如琼脂糖、右旋糖酐、纤维素、壳聚糖和淀粉。也可以使用其它在医用微粒中通常使用的材料。在另一个实施方案中，固体基质包含交联多糖。
在该设备的一个实施方案中，其中固体基质包括中空纤维，所述中空纤维可以优选地包括选自下组的材料：聚砜、聚酰胺、聚腈、聚丙烯、交联海藻酸盐、和纤维素。也可以使用其它在医用中空纤维中通常使用的材料。
该设备的固体基质当然也可以为其它可提供大表面积的形状或形式。
在根据本发明的设备的一个实施方案中，其中固体基质处于颗粒的形式，颗粒的直径可以是10μm-5mm的范围。颗粒直径还可以是10μm-1000μm的范围。一般地，可以使用20-200μm范围内的颗粒尺寸，但在高流速应用中，可能需要更大的颗粒。固体基质可以包括一种或多种中空纤维。在本发明的一个实施方案中，其中固体基质处于中空纤维的形式，所述纤维的内径范围可以是1μm-1000μm。一般地，可以使用20-200μm范围的内径，但是在某些应用中，可以采用更大或更小直径的纤维。
用于除去有害物质的装置可以优选地是包括含有肝素化固体基质的外壳的柱子，所述柱子具有可供血液通过而进入柱子的入口，和可供血液通过而离开柱子的出口，并且所述入口和出口被设置成使通过入口进入的血液在通过出口离开柱子之前与所述肝素化的固体基质接触。
本发明的设备优选地具有合适的尺寸，以适合于其预期应用中需要的血流速度。因此，在一个实施方案中，本发明的设备适合于200-500mL/min的血流。在另一个实施方案中，本发明的设备适合于2000-7000mL/min的血流。在另外一个实施方案中，本发明的设备适合于1-100mL/min的血流。用于除去有害物质的装置应当优选地被设计成一定的形式，使之不会通过静止区血小板的剪切激活和凝聚而形成血块。
所述肝素的表面浓度可优选地是1-20μg/cm2的范围，优选地5-15μg/cm2。所述装置的固定化肝素可以优选地共价连接于固体基质。所述装置的固定化肝素通过稳定的二级氨基共价连接于所述固体基质。更优选地，所述装置的固定化肝素是共价端点连接的全长肝素。因此，在根据本发明第四个方面的设备的一个实施方案中，用于除去有害物质的装置可以是上文参考本发明第一个方面公开的装置。
在第五个方面中，本发明提供了如上定义的设备在体外处理血液或血液成分中的应用。
在一个实施方案中，如上定义的设备用于处理需要血液透析的患者。在这种实施方案中，所述血液或血液成分的流速可优选地是200-500mL/min的范围。
在另一个实施方案中，如上定义的设备用于处理需要氧合的患者。在这种实施方案中，所述血液或血液成分的流速可优选地是2000-7000mL/min的范围。
在另外一个实施方案中，如上定义的设备用于处理罹患急性脓毒症的患者。在这种实施方案中，所述血液或血液成分的流速优选地是1-100mL/min的范围。
本发明设备的进一步应用对于血液体外处理领域的技术人员而言是显而易见的。
在本发明一个进一步的方面中，提供了用于将全长肝素共价端点连接于固体基质的方法，所述方法包括如下步骤：
a)提供具有一级氨基官能团的固体基质，
b)将a)得所述固体基质与全长肝素和还原剂在含水介质中混合，
c)使肝素还原性地结合于氨基官能团，和
d)回收在其表面上具有共价结合的全长肝素的固体基质。
在一个实施方案中，混合物中全长肝素的初始浓度在20-50g/l的范围。本发明方法中使用的还原剂可以是有机合成领域技术人员认可的任何合适的还原剂。在一个实施方案中，还原剂是NaBH3CN。本发明方法的步骤c)中的还原性结合优选在介于3-5的pH值下进行。本发明方法的步骤c)中的还原性结合优选在高温下进行。在一个实施方案中，所述还原性结合在60℃下进行24h。该处理可以任选地包括在步骤c)的还原性结合期间再次添加NaBH3CN的附加步骤。
如本文所使用的，术语“血液”和“血液成分”是指哺乳动物全血、血浆和/或血细胞，例如红细胞或血小板。我们还预期，血液或血液成分可以经过稀释或者其它方式的改变。
如本文所使用的，术语“全长肝素”的意思是肝素或其衍生物，其尚未被裂解以获得用于连接在固体表面上的反应性末端基团。存在于体内的全长肝素分子量一般分布在大约3-40kDa的范围。在商业上可得的肝素制备物中，肝素分子量的分布范围一般是15-25kDa。全长肝素的平均分子量是大约21kDa。
如本文所使用的，术语“有害物质”(harmful agent)可以包括可导致哺乳动物疾病或病症的微生物，例如病毒、细菌或寄生物，以及作为疾病或病症的症状的有害物质，例如促炎症细胞因子。有害微生物的实例包括葡萄球菌、HIV、丙型肝炎、登革热病毒和导致疟疾的疟原虫。有害物质可以是例如病毒，例如单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、甲型流感病毒、巨细胞病毒或人免疫缺陷病毒。有害物质可以是例如选自下组的细菌：链球菌例如肺炎链球菌，葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌，大肠菌例如大肠杆菌，假单胞菌例如铜绿假单胞菌，和肺炎球菌例如2型肺炎球菌。有害物质可以是寄生物，例如恶性疟原虫或克氏锥虫。有害物质可以是炎症细胞，例如炎症淋巴细胞、炎症巨噬细胞和炎症粒细胞。有害物质还可以是例如促炎症蛋白，例如促炎症细胞因子，例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)、白细胞介素-1(IL-1)和白细胞介素-6(IL-6)。有害物质的上述实例不应当看作对本发明的范围构成限制。本领域技术人员可以容易地意识到，所有类型的肝素结合有害物质均可用如本发明公开的装置或设备或方法加以清除。
如本文所使用的，术语“促炎症细胞”的意思是，参与哺乳动物体内炎症应答的细胞。“炎症细胞”的实例包括炎症淋巴细胞、炎症巨噬细胞和炎症粒细胞。
如本文所使用的，术语“促炎症细胞因子”的意思是，与例如微生物感染或免疫作用(immunization)相关而释放的蛋白，例如细胞因子。
如本文所使用的，术语“细胞因子”的意思是，与微生物感染或免疫作用(immunization)关联而释放的蛋白，其选自下组：白细胞介素、干扰素、趋化因子和肿瘤坏死因子。
实施例
实施例1
用于表面固定化肝素定量的一般方法
本方法的原理是基于肝素和亚硝酸钠在酸性水溶液中的化学反应。肝素中的D-葡萄糖胺单元被转变成2，5-脱水-D-甘露糖(2，5-anhydroD-mannose)，同时糖苷键断裂。在六水合氯化铁(III)(FeCl3·6H2O)存在下，2，5-脱水甘露糖中的末端醛基与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate)(MBTH)反应，形成有色络合物。络合物的颜色强度用分光光度计在650nm波长下测量。
实施例2
Sephadex G10的胺化
将偏高碘酸钠(NaIO4，12.0g)溶于水(1.6L)中，并添加到Sephadex G 10(100g)。混合物在黑暗中震荡保持17h。过滤后，用水(4L)清洗，并最终用0.1M磷酸盐缓冲液(1L)，pH 7清洗。将终产物悬浮于含200mL(5％水溶液)的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7溶液(1.2L)中。
通过添加NaBH3CN水溶液使凝胶稳定。向凝胶混合物添加溶于0.1M磷酸盐缓冲液(200mL)，pH 7.0的氰基硼氢化钠(1.0g)。将混合物在室温下震荡保持24h。将凝胶滤出，并用水(2L)、0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.0(2L)、水(2L)、0.1M乙酸盐缓冲液pH 4.0(2L)和水(2L)清洗。将凝胶风干。
实施例3
聚乙烯珠子的胺化
蚀刻(etching)：
聚乙烯珠子(PE珠子)(直径约300μm，60g)在氯仿(200mL)中清洗，期间搅拌1小时。将珠子收集于玻璃滤器上，用3x50mL氯仿清洗，并风干。将高锰酸钾(KMnO4，1.2g)溶解于浓硫酸(600mL)中，并添加预先清洗过的珠子。将该悬浮物搅拌5min。将珠子收集于玻璃滤器上，并用水(5L)仔细清洗，并风干。
蚀刻珠子的胺化：
制备如下的溶液：
硼酸盐缓冲水溶液：向水(5.0L)中添加硼酸(53.0g)和氯化钠(3.5g)。通过添加氢氧化钠颗粒调节最终溶液的pH值到9.0。
S1：硼酸盐缓冲水溶液(5.0L)添加巴豆醛(1.7mL)和
Figure G200880025586XD00131
(5.0mL，5％水溶液)，得到溶液S1。
S2：向水(5.0L)中添加氯化钠(146.5g)和硫酸右旋糖酐(0.5g)。通过添加1M盐酸将所得溶液的pH值调节到3.0，得到溶液S2。
S3：向水(2.5L)中添加
Figure G200880025586XD00132
(25mL，5％水溶液)，并用1M NaOH将pH调节到9.0，得到溶液S3。
包被程序：
1.把蚀刻PE珠子加入S1(2.5L)中。悬浮物在室温下搅拌10min。
2.将珠子收集于玻璃滤器上，并用水(2.5L)清洗。
3.把珠子加入S2(2.5L)中。悬浮物在60℃下搅拌10min。
4.将珠子收集于玻璃滤器上，并用水(2.5L)清洗。
5.用新鲜的S1重复步骤1。
6.将珠子收集于玻璃滤器上，并用水(2.5L)清洗。
7.用新鲜的S2重复步骤2。
8.将珠子收集于玻璃滤器上，并用水(2.5L)清洗。
9.把所得的珠子加入S3(2.5L)中，并将悬浮物在室温下搅拌10min。
10.将珠子收集于玻璃滤器上，并用水(5.0L)清洗，得到胺化的PE珠子。
实施例4
将亚硝酸降解的肝素(nitrous acid degraded heparin)共价端点连接到胺化的色谱凝胶上
将如实施例2所述胺化的Sephadex G 10(10g)悬浮于0.1M乙酸盐缓冲液pH 4.0(100mL)中，并添加亚硝酸降解的肝素(1.6g)。震荡15min之后，添加溶解于0.1M乙酸盐缓冲液pH 4.0(10mL)中的NaBH3CN(100mg)。将反应混合物在室温下震荡24h，并添加额外的溶解于0.1M乙酸缓冲液pH4.0(10mL)中的NaBH3CN(100mg)，在室温下继续震荡24h。
将凝胶过滤，并顺次用水(200mL)、0.17M硼酸盐缓冲液pH 9.0(250mL)和水(2L)清洗。将凝胶风干。
Sephadex G 10珠子的平均直径为大约100μm。粗略计算显示，1cm3含有106个珠子，提供300cm2/cm3的表面积。对该肝素化Sephadex凝胶的硫分析结果显示含0.024％硫。进一步，如果肝素仅连接在珠子的表面，肝素化的Sephadex G 10大约有7μg肝素/cm2。
实施例5
将亚硝酸降解的肝素共价端点连接在胺化PE珠子上
将如实施例3所述制备的胺化PE珠子按照实施例4所述进行肝素化。
按照实施例1所述的规程，测得该肝素化PE珠子含有2.6mg肝素/g珠子。
实施例6
将全长肝素共价端点连接在胺化的色谱凝胶上
将如实施例2所述胺化的Sephadex G 10(10g)悬浮在0.1M乙酸缓冲液pH 4.0(45mL)中，并添加NaCl(1.46g)和全长肝素(1.6g)。震荡0.5h后，添加溶解于0.1M乙酸盐缓冲液pH 4.0(5mL)中的NaBH3CN(100mg)。将反应混合物在60℃震荡24h。8h后，添加更多的NaBH3CN(100mg)。将凝胶滤出，并依次用水(200mL)，0.17M硼酸盐缓冲液pH 9.0(250mL)和水(2L)清洗。将凝胶风干。
Sephadex G 10珠子的平均直径为大约100μm。粗略计算显示，1cm3含有106个珠子，其提供300cm2/cm3的表面积。对肝素化Sephadex凝胶的硫分析结果显示含0.037％硫。进一步，如果肝素仅连接在珠子的表面，则肝素化的Sephadex G 10大约具有11μg肝素/cm2，即在使用全长肝素时固定的肝素比使用降解肝素时大约多36％(参考实施例4)。
实施例7
将全长肝素共价端点连接于胺化PE珠子
将如实施例3制备的胺化PE珠子按照实施例6所述的方法肝素化。
按照实施例1所述的规程，测得该肝素化PE珠子含有2.6mg肝素/g珠子。
实施例8
将亚硝酸降解的肝素共价端点连接于中空纤维的内腔
在本实施例中，使用了一种儿科haemoflow透析器。纤维用聚砜制成，内径200微米，壁厚40微米。接触血液的材料的总表面积为4000cm2，初给容积(priming volume)为28mL。
胺化程序如实施例3对PE珠子所述的那样进行，只是省略了蚀刻步骤。聚砜是亲水性的，不需要蚀刻。肝素的固定基本上按照实施例4所述进行，通过将含有亚硝酸降解的肝素的溶液与NaBH3CN一起泵入纤维中。
因为肝素量的测量是一个破坏性的过程，所以牺牲一个在相同条件下肝素化的参考透析器，对其纤维进行硫分析。结果显示，肝素含量为大约5μg肝素/cm2，相当于装置中20mg肝素的含量。
实施例9
将全长肝素共价端点连接于中空纤维的内腔
本实验如实施例8所述进行，只是使用全长肝素。结果显示，肝素含量为大约8μg肝素/cm2，相当于装置中32mg肝素的含量。
实施例10
血浆中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肝素化PE珠子的粘附
使用具有亚硝酸降解的肝素(按照实施例5所述制备)或全长肝素(按照实施例7制备)的肝素化PE珠子。向具有销钉连结盖(bayonet joint lid)的柱子(1mL)(MoBiTec，M1002)加入200mg珠子。
从来自一名人类患者的4mL血浆中用注射器抽取样品(0.5mL)。使血浆样品在30秒内通过各个柱子。用
Figure G200880025586XD00161
人TNF-α/TNFSF1A高灵敏度ELISA试剂盒(R&D Systems)，使用EVOLIS仪器(BioRad)，测量样品在通过柱子之前和之后的TNF-α含量。
在通过具有亚硝酸降解的肝素的200mg PE珠子的柱子之后，样品中剩余的TNF-α浓度为4.5pg/ml。在通过具有全长肝素的200mg PE珠子的柱子之后，样品中剩余的TNF-α浓度为4.1pg/ml。因此，通过用全长肝素(Mw 20kDa)肝素化的200mg珠子的血浆，其TNF-α浓度的下降大于通过用亚硝酸降解的肝素(Mw 8KDa)肝素化的珠子的血浆。
实施例11
抗凝血酶(AT)对肝素化PE珠子的粘附
使用具有亚硝酸降解的肝素(按照实施例5所述制备)或全长肝素(按照实施例7制备)的肝素化PE珠子。向具有销钉连结盖的柱子(2.5mL)(MoBiTec，M1002)加入200mg珠子。
向柱子添加溶于Tris缓冲液(pH 7.4)的2IU/ml人抗凝血酶III(Octapharma)溶液。温育15分钟后，通过用tris缓冲液清洗数次，除去结合于固定化肝素上的低亲和力位点的抗凝血酶。然后，用大体积的溶于tris缓冲液的1mg/ml肝素洗脱结合于固定化肝素上的高亲和力位点的抗凝血酶。所得洗脱物中的肝素-抗凝血酶复合物的含量用Sysmex CA 1500仪器(Sysmex)使用Berichrom Antithrombin III试剂(Sysmex)加以确定。结果如表1所示。
表1.结合于肝素的抗凝血酶量
  MBTH测定(实施例1)   抗凝血酶
  全长肝素   2.6mg肝素/g珠子   2.48IU/g珠子
  亚硝酸降解的肝素   2.6mg肝素/g珠子   1.65IU/g珠子
从这些结果可以清晰地看出，全长肝素每单位重量结合的抗凝血酶的量是亚硝酸降解的肝素的1.5倍。

Claims (41)

1.一种用于在体外除去血液或血液成分中的有害物质的装置，该装置包含通过共价端点连接而固定在固体基质上的全长肝素。
2.根据权利要求1的装置，其中所述全长肝素的平均分子量的范围是15-25kDa。
3.根据权利要求1的装置，其中所述全长肝素的平均分子量大于21kDa。
4.根据前述任一权利要求的装置，其中所述全长肝素的表面浓度为1-20μg/cm2。
5.根据前述任一权利要求的装置，其中所述全长肝素的表面浓度为5-15μg/cm2。
6.根据前述任一权利要求的装置，其中所述肝素通过稳定的二级氨基基团共价连接于所述固体基质。
7.根据前述任一权利要求的装置，其中所述固体基质的总表面积在0.5-3m2的范围。
8.根据前述任一权利要求的装置，其中所述固体基质包括颗粒和珠子。
9.根据权利要求8的装置，其中所述颗粒或珠子的直径在10-1000μm的范围。
10.根据权利要求9的装置，其中所述颗粒或珠子的直径在20-200μm的范围。
11.根据权利要求8-10中任一项的装置，其中所述颗粒或珠子包括选自下组的材料；聚氨酯、聚烯烃、有机硅、含氟聚合物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、玻璃、交联海藻酸盐、和交联多糖，例如琼脂糖、右旋糖酐、纤维素、壳聚糖和淀粉。
12.根据前述任一权利要求的装置，其中所述固体基质包含一种或多种中空纤维。
13.根据权利要求12的装置，其中所述中空纤维的内径在10-1000μm的范围。
14.根据权利要求13的装置，其中所述中空纤维的内径在20-200μm的范围。
15.根据权利要求12-14中任一项的装置，其中所述中空纤维包括选自下组的材料；聚砜、聚酰胺、聚腈、聚丙烯、交联海藻酸盐、和纤维素。
16.根据前述任一权利要求的装置，其中所述装置是包括容纳有所述肝素化固体基质的外壳的柱子，所述柱子具有可供血液通过而进入柱子的入口和可供血液通过而离开柱子的出口，并且所述入口和出口被设置成使通过入口进入的血液在通过出口离开柱子之前与所述肝素化的固体基质接触。
17.根据权利要求16的装置，其适用于2000-7000mL/min的血液流速。
18.根据权利要求16的装置，其适用于200-500mL/min的血液流速。
19.根据权利要求16的装置，其适用于1-100mL/min的血液流速。
20.用于体外除去哺乳动物血液中的有害物质的方法，包括如下步骤；
a)提供哺乳动物血液样品，
b)使所述样品与通过共价端点连接而固定在固体基质上的全长肝素在允许所述有害物质与所述肝素结合的条件下接触，
c)将样品与固体基质分离，使得所述有害物质至少部分保留在所述固体基质上，和
d)回收含有降低量的所述有害物质的所述样品。
21.根据权利要求20的方法，其中所述有害物质是促炎症细胞因子。
22.一种处置罹患由有害物质导致或加重的病症的哺乳动物受试者的方法，其包括如下步骤；
a)从所述受试者提取血液，
b)在允许所述有害物质与肝素结合的条件下，使所提取的血液与通过共价端点连接固定在固体基质上的全长肝素接触，
c)将含有降低量的所述有害物质的血液重新引入到所述受试者的血流中。
23.一种用于体外循环血液或血液成分的设备，包括常规的体外血液处理装置和用于除去有害物质的装置。
24.根据权利要求23的设备，其中所述用于除去有害物质的装置被设置在所述常规体外血液处理装置的下游。
25.根据权利要求23-24中任一项的设备，其中所述用于除去有害物质的装置包括固定在固体基质上的肝素。
26.根据权利要求25的设备，其中所述肝素的表面浓度为1-20μg/cm2。
27.根据权利要求25-26中任一项的设备，其中所述肝素是共价端点连接的全长肝素。
28.根据权利要求23-27中任一项的设备，其中所述常规的体外血液处理装置是用于血液透析的装置。
29.根据权利要求23-27中任一项的设备，其中所述常规的体外血液处理装置是用于血液氧合的装置。
30.如权利要求23-29中任一项定义的设备用于体外处理血液或血液成分的用途。
31.如权利要求28定义的设备用于处置需要血液透析的患者的用途。
32.根据权利要求31的用途，其中所述血液或血液成分的流速在200-500mL/min的范围。
33.如权利要求29定义的设备用于处置需要氧合的患者的用途。
34.根据权利要求33的用途，其中所述血液或血液成分的流速在2000-7000mL/min的范围。
35.如权利要求23-28中任一项定义的装置用于处置罹患急性脓毒症的患者的用途，其中所述血液或血液成分的流速在1-100mL/min的范围。
36.一种用于将全长肝素共价端点连接到固体基质上的方法，包括如下步骤；
a)提供具有一级氨基官能团的固体基质，
b)将a)所述的固体基质与全长肝素和以及还原剂在含水介质中混合，
c)让所述肝素还原性地结合所述氨基官能团，和
d)回收在其表面上具有共价结合的全长肝素的固体基质。
37.根据权利要求36的方法，其中全长肝素的浓度在20-50g/l的范围。
38.根据权利要求36-37中任一项的方法，其中所述还原剂是NaBH3CN。
39.根据权利要求36-38中任一项的方法，其中步骤c)中含水溶液的pH值在3-5的范围。
40.根据权利要求36-39中任一项的方法，其中步骤c)中的还原性结合在60℃进行24h。
41.根据权利要求36-40中任一项的方法，进一步包括在步骤c)的还原性结合期间再次添加NaBH3CN的步骤。
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