CN101784183B

CN101784183B - 杂交莴苣种子的生产

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Publication number: CN101784183B
Application number: CN200880007108.6A
Authority: CN
Inventors: 埃尔韦·米歇尔; 蒂埃里·苏森
Original assignee: Vilmorin SA
Current assignee: Vilmorin SA
Priority date: 2007-03-05
Filing date: 2008-03-05
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2028-03-05
Also published as: FR2913304A1; EP2476307A2; AU2008244195B2; CA2679333A1; AU2008244195A1; MA31298B1; CN104472338B; MX2009009498A; CN104472338A; CN101784183A; JP2010519923A; WO2008132310A8; JP2014168478A; US20100306882A1; RU2593940C2; WO2008132310A2; EP2114126A2; RU2009131326A; US20140298546A1; WO2008132310A3

Abstract

本发明涉及杂交莴苣的种子，这些种子呈现雄性不育的遗传型，并对于至少一个赋予由这些种子生长的植株可检测表型的不同的基因而言是杂合子。本发明还涉及生产杂交莴苣种子的方法，包括下列步骤：在封闭介质中栽培有雄性不育表型的植株和有雄性可育表型的植株的步骤；在植物的开花期把双翅目昆虫引入封闭介质进行授粉的步骤；以及采集雄性不育植株产生的种子的步骤。

Description

杂交莴苣种子的生产

本发明涉及杂交莴苣(Lactuca sativa)的种子以及生产该种子的方法。本发明同样涉及杂交莴苣植株以及杂交莴苣植株的细胞。

在大规模生产植物杂交种子的几个原因中，人们特别考虑杂种优势(或者杂交活力)、内环境稳定(植物在不同环境中的稳定性)、将对昆虫、真菌、细菌或病毒的抗性基因组合的可能性、或者还有对非生物性逆境的适应性，诸如对极端温度、即5℃以下或30℃以上的温度的耐受性、或者还有对低照度的耐受性。

在莴苣(栽培莴苣)中，在纯合子谱系中使某些抗性基因组合被证实是不可能的或者非常困难的，尤其是当所考虑的基因处于同一基因座上(在每个等位基因上)或者在一些非常接近的基因座上时。

特别是F1杂交栽培莴苣的获得，使并合了由位于同一基因座或者非常接近的基因座上的不同等位基因所携带的在农业上有意义几个共显性或显性基因的杂种的商业规模生产成为可能，故具有巨大的效益。

莴苣属包括100多个种，其中有莴苣(Lactuca sativa)(栽培种)、Lactucasaligna(野生种)、毒莴苣(Lactuca serriola)(野生种)和毒莴苣(Lactuca virosa)(野生种)。

莴苣是二倍体物种(2n＝18)，一般自花受精，通过自花受粉的种子生产占98％。雄蕊(雄性器官)是成组的，形成雄蕊管，其中花药的花粉囊打开。雌蕊(雌性器官)包括子房、花柱和二裂的柱头。花开时，雄蕊管内部的长形花柱以及柱头被花粉覆盖，于是该植株自体受精。根据栽培条件，植株莴苣一般产生重0.5至6克，甚至10克的种子，每克一般有600至1000粒种子。

大规模生产杂交植物的传统技术包括，彼此相近地种植用作“亲本”的两个品种，并利用昆虫授粉，亲本之一具有雄性不育性，以避免自花传粉造成的污染。接着在该雄性不育的亲本上采集种子。

这种技术允许在每一个亲本中使以纯合子的形式出现的感兴趣的基因组合，但仍旧保留试验田的同质性，F1代在采集阶段上(花开之前)呈现100％的均一表型。

用这个技术大规模生产杂交栽培莴苣(Lactuca sativa)被证实是非常困难的。事实上，莴苣只在一天中的某个时刻(早晨一早)开花一次，开花持续仅仅几个小时，例如，1至4小时，这时传粉昆虫，诸如某些种的蜂(蜜蜂(Apismellifera))或者熊蜂(Bombus spp.)尚未活动。

莴苣的授粉也不靠风来实现。

于是，鉴别可以用来生产杂交莴苣的传粉昆虫碰到许多困难，特别是：

-开花期既短又早，这使鉴别飞临这些花朵的昆虫变得困难；

-该花只开一次，因而，选定的传粉昆虫应该是一种整日都飞临这些花朵的昆虫，以便保证给最大数目的雄性不育花朵授粉。

另一方面，生产杂交F1需要设置“雄性”系和“雌性”系。“雌性”系可以通过对植物进行人工去雄的办法而获得。然而，在莴苣的情况下，每朵花只开一次，而且花期非常短(几小时)，由于需要的人工费非常高，这个方法难以以商业规模实施。

“雌性”系同样可以通过引入基因型不育(或者核型不育)或者细胞质型不育的办法而获得，表现为无花药、空花药或者花粉无活力。这种不育在核不育(或者基因不育)的情况下部分地传给子代，或者在细胞质不育的情况下完全传给子代。

Goubara和Takasaki(动物昆虫学应用(Appl.Entomo.Zool).38(4)：571-581，2003[I])在其工作中进行了开放式和封闭式田间试验，目的在于鉴别可以用来生产杂交莴苣(Lactuca sativa)的有授粉潜力的昆虫。所观察的22种昆虫(21个种的蜂和一个种的用花蜜饲养的蝇，蚜蝇科长尾管蚜蝇(SyrphidaeEristalis tenax))中，发现蜂Lagioglossum villosulum trichopse(软毛隧蜂)是最佳的潜在授粉者。

Goubara和Takasaki(Appl.Entomo.Zool.39(1)：163-169，2004[2])也在封闭介质中在蜂Lagioglossum villosulum trichopse存在的情况下进行了携带雄性不育基因的莴苣和雄性可育莴苣之间的小规模的杂交试验。作者披露，获得了F1杂交莴苣，但是产量非常低。

至今，尚未看到利用传粉昆虫生产杂交莴苣的任何其他试验。

至今，尚未以商业规模生产出任何品种的F1杂交莴苣。

按照本发明，下列术语理解如下：

-栽培莴苣是指物种莴苣(Lactuca sativa)。栽培莴苣有5个主要栽培组(见图1)：莴苣var.angustana(芦笋莴苣)；莴苣var.capitata(苹果形莴苣，黄油莴苣)；莴苣var.crispa(荷兰莴苣或者冰山莴苣)；莴苣var.longifolia(罗马莴苣)和莴苣var.acephala(皱叶菊苣，收割莴苣)。本发明包含这些不同类型莴苣中每一种的应用。

-授粉是指把花药的花粉输送到同一朵花或者另一朵花的柱头。这种有性生殖系统是开花植物(被子植物和裸子植物)天然的繁殖模式。它允许花粉颗粒达到柱头，接着经过花柱形成通到胚珠的花粉管，以便授精。

-自花授粉是指通过其适当的花粉进行个体或者生物型的授粉，结果个体自花授粉。

-自花受精是指植物自花受精的能力，两个配子出自同一个体。

-异花授粉是指一个个体的花由来自一个或者几个其他个体的花粉授精的现象。

-传粉昆虫是指利用探索花(例如，寻求花蜜)的昆虫(其中有蜂、蝴蝶、双翅目昆虫或某些鞘翅目昆虫)摩擦雄蕊，从而收集几粒花粉，然后弃置在另一朵花上。

-基因座(locus)是指基因或者等位基因在染色体上占据的位置。

-等位基因是指一个物种中处于染色体给定位置(基因座)上的基因的变异体，。一个基因的不同等位基因引起不同的特性表达。

-基因簇(cluster)是指位于同一染色体上彼此靠近的位置的两个或多个基因。Kesseli等人[12]特别描述了在莴苣中鉴别出抗性基因基因簇(clusters)。

-显性基因是指在一对染色体的两个染色体或一个染色体上出现的赋予表型的基因。

-隐性基因是指当其出现在两个同源染色体中的每一个上时不赋予表型的基因。

-共显性是指两个等位基因在该表型中彼此表达由它们所决定的特征的特性。在携带两个共显性等位基因的杂合体中，就这些基因所携带的信息而言，该遗传型在该表型中被完全表达。

-杂合子是指在同一对染色体的一个给定基因座上具有两个不同的等位基因的细胞或个体。

-纯合子是指在同一对染色体的一个给定基因座上具有两个相同的等位基因的细胞或个体。

-术语杂种是指不同遗传结构的个体(优选是同一品种)之间杂交的产物。

-F1杂种是指通过不同遗传结构的个体之间杂交而产生的第一代。因而，F1杂种对于至少一个基因而言是杂合子。

-回交(或者回交杂交或者“回交”)是指杂种与其亲本之一之间的杂交。

-栽培品种是指变种。

-基因型是指个体所携带的并构成其基因遗传型(patrimoine hereditaire)的遗传材料的总体。

-表型是指个体显现的形态或者功能特性的总体，它们既响应基因型的表达部分，也响应由外部介质决定的一些现象。

-农业上感兴趣的表型是指例如两个纯合基因型之间杂交所产生的、表现出从农业的观点看感兴趣的特征的表型，其中，诸如对不同病原体或昆虫的抗性特性组合，杂种活力(就是说，杂种特性的平均水平超过两个亲本的平均水平)、内环境稳定、对非生物性逆境的适应能力、形态特征，诸如，颜色、形状、叶子的刚柔软性、该植物的营养素成分或味觉质量。

-杂种优势或杂种活力是指F1杂种在一个或几个特性上，特别是涉及活力方面，明显地优于其亲本的较佳者的现象。

-内环境稳定是指植物适应其环境，甚至几个环境特征的能力。

-术语雄性不育是指由于花的雄性要素的不育性而不能通过自花受粉繁殖的植物。例如，该花粉可能不起作用，或者可能雄性繁殖器官有结构畸形，例如，在花药(绒毡层)的滋养绒毡层水平上的结构畸形。

-细胞质雄性不育是指细胞质类型的经母性遗传一致性地传递的不育性。

-细胞核(或基因)雄性不育是指由(细)胞核的DNA所携带的孟德尔遗传性的不育性，它或者可能由隐性基因决定，或者可能由显性基因决定。

-单基因雄性不育性是指由一个基因引起的雄性不育。

-多基因雄性不育性是指由几个基因引起的雄性不育。

-抗性是指，与敏感的变种相比，在类似的条件、环境和病原体或害虫的压力下，一个变种抑制给定病原体或害虫生长和发育和/或其所引起的损害的能力。但是，这些变种在病原体或者害虫的强大压力的情况下可能表现出几种病害的症状或者表现几种损害。

-标准抗性或者高抗性是指在病原体和害虫的普通压力条件下，与敏感的变种相比，变种有力地抑制给定病原体或害虫的生长和发育的能力。但是，在该病原体或该害虫的强大压力的情况下，这些变种可能表现出一些症状或损害。

-中等抗性或适度抗性是指变种抑制给定病原体或害虫的生长和发育的能力，但是与高/标准抗性变种相比，可能表现出更多的症状或损害。该中等抗性变种在类似的条件、环境和/或病原体或害虫的压力下，表现出的症状或损害，与在敏感变种上所观察到的相比，较不严重。

-分子标记是指，在个体完整的基因组中可以鉴别出的，而且可以用来确定感兴趣基因的位置，或者查核一个个体是否遗传了一个亲本机体特定特征的特定DNA片段。它可能涉及或不涉及编码序列。在遗传杂交中，一般将感兴趣的基因与分子标记相连接。于是，对分子标记的检测则允许选择出呈现感兴趣基因的个体，而不必知道该基因的序列。

在农学领域中，分子标记的利用允许在选择的过程中迅速地测试植物，并允许保留拥有所需特征的植物。在某些情况下，与一个特性相关的标记的存在，使育种者能够免除某些测试或表型的观察。具体地说，雄性不育基因(优选是雄性不育显性基因)的特定分子标记的利用，允许在雄性不育植物开花期之前提前进行选择。这种选择允许清除在杂交种子的生产中，例如，在利用雄性不育显性基因的情况下，可能构成对计划用作“母本”(雄性不育)植株的污染的一部分雄性可育植株，并因而减小与这些雄性可育植株的自花受精相关的污染的危险。

本发明的目的是杂交植物莴苣(Lactuca sativa)的种子、植株和细胞，其特征在于，它们属雄性不育基因型，而且对于至少一个不包含在雄性不育中的基因而言是杂合子，而且赋予该植物一种可检测的表型。

植物莴苣的种子、植株或者细胞所带的雄性不育性可以来自细胞核或细胞质。在它们是细胞质雄性不育的情况下，该不育性是母性遗传的。它们往往是由细胞质中存在的线粒体和一些细胞核基因之间的相互作用造成的。该细胞质雄性不育的特征在于，在母本基因组中不存在育性恢复基因时，出现100％雄性不育表型的子代。当母本”基因组中存在育性恢复(Rf)基因时，该雄性育性可以在该子代水平上进行恢复。

更具体地说，本发明涉及雄性不育基因型包含至少一个细胞核基因的情况，或者种子、细胞或植物对该雄性不育来源的一个或几个基因而言是杂合子的情况。

细胞核雄性不育是由细胞核DNA传递的一个或几个雄性不育基因引起的，这一个或几个基因可以是显性基因或隐性基因。

在这些雄性不育基因中，人们特别是考虑Ryder(美国园艺协会杂志(J.Amer.Soc.Hort.Sci)96(6)826-828，1971[8])所描述的细胞核显性基因Ms7。雄性不育植株是杂合子-Ms7ms7。可育植株是纯合子ms7ms7。显性基因Ms7Ms7纯合子的获得仍旧是非常困难的，甚至是不可能的。另外，按照Ryder的教导，对于杂交莴苣的生产，这种雄性不育显性基因特性包括该基因的效用抑制(frein a l′utilite)。按照本发明的方法所获得的包含基因源Ms7的莴苣种子样本于2007年2月13日以保藏号NCIMB 41470保藏于英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(NCIMB)(NCIMB Ltd.，弗格森大厦，克瑞斯通工业区，巴克斯本，阿伯丁，A21 9YA，苏格兰，英国(Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，A21 9YA，Scotland，UK))。另一方面，由本发明人开发的分子标记RAPD BA05-675(SEQ ID NO：2)，其效益尤其在于，它允许在开花期之前的提前阶段上投入分子测试，以便鉴别出随后用于杂交的雄性不育植株，帮助选择雄性不育莴苣Ms7植株。该标记(该序列示于图8)的检测，对所有混淆的(confondues)莴苣类型，允许以平均96％案例鉴别雄性不育植株(表18)。

三个雄性不育隐性基因-ms1、ms2和ms3也由lindqvist(Heriditas 46：387-470，1960[3])鉴别出来，而其他三个ms4、ms5和ms6同样被Ryder(Proc.Am.Soc.Hort.Sci 83：585-595，1963[6]，Proc.Am.Soc.Hort.Sci 91：366-368，1967[7])鉴别出来。但是，Ryder在其1979年发表的文献(多叶沙拉蔬菜(LeafySalad Vegetables)，p.30[9])中披露，不育基因ms1、ms2、ms3、ms4、ms5、ms6和Ms7均为细胞核不育基因，不太可能用于F1杂种生产。尽管如此，本发明人已经成功地利用细胞核来源的雄性不育获得杂交的种子、植株细胞。

该细胞核雄性不育性可以是多基因的或者单基因的。在它们是多基因的情况下，例如，可以借助于多个隐性基因，例如，上述基因ms1、ms2和ms3的组合获得。本发明优选涉及雄性不育是单基因的情况。

细胞核雄性不育性可以是显性的或者隐性的。具体地说，本发明涉及该雄性不育基因是显性单基因的情况。更具体地说，本发明涉及该雄性不育是由上述显性基因Ms7赋予的情况。

本发明的种子、植株或细胞的基因组优选包含650至700个核苷酸，例如，655至695、660至690、665至685、670至680、673至677个核苷酸，或者674、675或676个核苷酸的双链DNA序列，其中两条链中每一条的5′末端均由“5′TGCGTTCCAC 3′”(SEQ ID No.1)的序列开始。按照优选的实施方案，本发明的种子、植株或细胞的基因组包含图8所示的核苷酸序列(SEQ ID No.2)或这个序列衍生的序列，其中1至10个，较优选1至5个，更优选1至3个核苷酸被其他核苷酸取代、被缺失或加入。

本发明优选涉及由一个或几个杂合基因赋予的可检测表型是农业上感兴趣的表型的情况，所述表型例如为对不同病原体或昆虫的抗性、杂种活力(或者杂种优势)、内环境稳定(在不同环境中植株的稳定性)、对非生物性逆境，诸如例如，极端的温度或低照度的适应性、产量高于产生杂交的变种、形态特征，诸如颜色、形状、尺寸、叶子的刚柔、植株营养素成分或味觉质量。

另外，本发明人观察到，令人惊讶的是，由按照本发明的通过不同莴苣之间不同杂交产生的种子长出的杂交植株，在冬季和在气候温和的区域栽种生长更迅速，与在同一条件下栽种的亲本植株相比，平均提早7至10天成熟。还观察到，F1杂种的实验田内(在每块试验田约30植株的数目下)发育的一致性，优于谱系(亲本植株)试验田。换句话说，在其发育延缓和提前的植株数目上，与同一试验田的植株总体相比，在F1杂种试验田上明显小于谱系变种的试验田。因而，F1杂种的这些特征不仅缩短莴苣的生产周期，而且可以在较短的期限内集中收获。

农业上感兴趣的表型尤其可以由一个或几个对病毒、细菌、昆虫或者真菌传染的标准抗性或中等抗性基因赋予，更具体地说，对下列真菌之一：莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、小核盘菌(Sclerotinia minor)或核盘菌(Sclerotinia sclerotorum)、灰霉菌(Botrytiscinerea)、立枯丝核菌(Rhizictonia solani)、红色雪腐病菌(Microdochiumpanattonianum)、棉花黄萎病菌(Verticiulium dahliae)、白粉菌(Erysiphechicocearum)或腐霉菌(Pithium tracheiphilum)；对下列昆虫之一：莴苣蚜(Nasonovia ribisnigri)、桃蚜(Myzus persicae)、大戟长管蚜(Macrosiphumeuphorbia)、根腐线虫(Nematodes pratylenchus)或根结线虫(meloidogyne)，南美斑潜蝇(mineuses Liriomyza huidobrensis)或囊柄瘿绵蚜(Pemphigusbusarius)；对下列细菌之一：假单胞菌(pseudomonas)、黄单胞菌(xanthomonas)或根单胞菌(rhizomonas)；或还对下列病毒之一：LMV(莴苣花叶病病毒)、TSWV(番茄斑萎病毒)、“巨脉(Big vein)”(或由病毒LBW(莴苣巨脉病毒)和MILV(米拉菲奥里莴苣病毒)组成的大叶脉植物病害)、TBSV(番茄丛矮病毒)、LNSV(莴苣坏死斑点病毒)、TuMV(芜菁花叶病病毒)、CMV(黄瓜花叶病病毒)或BWYV(甜菜西部黄化病毒)。

在农业上感兴趣的表型由一个或几个对病毒、细菌、昆虫或真菌引起的传染病的标准或中等抗性基因赋予的情况下，赋予这种表型的所述一个或多个标准或中等抗性基因尤其可以在对盘梗霉(bremia)Dm10、R17、Dm5、Dm8、R36、R37(位于莴苣基因簇1的基因)、Dm1、Dm2、Dm3、Dm6、Dm14、Dm15、Dm16、Dm18(位于莴苣的基因簇2上的基因)、Dm4、Dm7、Dm11，R38(位于莴苣基因簇4上的基因)；或者还有(位于基因簇1上的抗TuMV基因Tu；位于基因簇2上的抗莴苣蚜(Nasonovia)基因Nr；或位于位于基因簇4上的抗LMV基因mol 1和mol 2中间选择。Michelmore R.W.(植物病理学(Plant Pathol).，1987，vol.36，no4：499-514[4]，遗传学理论应用(Theor.Appl.Genet.)，1993，vol.85，NO.8：985-993[5])特别定义了上述基因簇1、2和4。

可以更具体地说，在农业上感兴趣的表型是由对涉及莴苣盘梗霉(Bremialactucae)、在叶瓣内表面上诱发粉状微白的毛茸的真菌的主要植物病害标准或者中等抗性的一个或几个基因赋予的。另外，Bremia具有一种强大的适应潜力，后者会导致能够躲避(contourner)育种者在该变种中已经引入的抗性的新品种的出现。

本发明优选还涉及植物莴苣的种子、植株或细胞对至少两个没有包含在雄性不育中并赋予植株一种可检测的表型的基因而言是杂合子的情况。更优选的是，进一步赋予植株一种可检测的表型的该两个基因位于同一基因簇上，例如，在莴苣的基因簇1、2或者4这样的抗性基因基因簇上。

本发明的另一目的是表现雄性不育基因型的莴苣的杂交种子的种群，以及对于至少一个没有包含在该雄性不育中并赋予出自这些种子的植株一种可检测的表型的基因的杂合子，必要时呈现上述附加的特征，使得所述种群包括至少10⁵粒种子，优选至少10⁶粒，更优选至少10⁷粒种子。

在该种子是通过两个莴苣植株之间杂交获得的情况下，其中一个(“母本”)是一个或几个显性基因所赋予的细胞核雄性不育性的携带者，而且用作“母本”的植株本身是通过杂交产生的，该用作“母本”的植株对于不育基因而言是强杂合子。事实上，为了使它们成为所述对一个或多个显性雄性不育基因而言的纯合子，两种植株就应该由杂交产生，用作“母本”的植株本身应该是雄性不育基因携带者，然而若是如此，则该两棵植株之间的杂交是不可能的。

因而，按照本发明，由于减数分裂时染色体分离的现象，两个类型莴苣植株(其中之一(“母本”)是一个或几个显性基因所赋予的细胞核雄性不育的携带者)之间杂交产生的种子种群，由一个或多个雄性不育显性基因携带者莴苣的种子和并非所述一个或几个基因携带者的种子组成。在“母本”所带的雄性不育是单基因而且是显性的情况下，雄性不育种子的比例一般至少为40％。

本发明特别是在本发明人观察到以下事实之后实现的，即尽管双翅目昆虫并非莴苣花通常的传粉昆虫，而且已知并非吃花蜜的，但是这些昆虫，特别是，反吐丽蝇(Calliphora vomitaria)、红头丽蝇(Calliphora erythrocephala)和叉叶绿蝇(Lucilia caesar)，当在一个封闭介质中以过多的数量引入时，可起莴苣授粉者的作用。

同样，本发明还旨在利用双翅目昆虫在封闭介质中通过雄性可育植株，给雄性不育的莴苣植株进行授粉，特别是为了获得杂交莴苣植株。所用的雄性不育莴苣植株，优选拥有由仅由一个显性基因带来的雄性不育性，优选拥有上述Ms7雄性不育性。所利用雄性可育植株优选是莴苣植株，而且更优选栽培品种。

按照本发明，该封闭介质尤其可以是封闭的温室、笼子或者地道，面积优选超过30m²，更优选超过300m²，例如，30至1500m²或者50至1000m²。封闭介质的高度一般在2m和4m之间，优选在2.5m和3.5m之间，例如，3m。它尤其可以具有通风装置、喷淋装置、温度和照度控制装置。所述封闭介质优选是一个对昆虫封闭的空间。

所用的双翅目昆虫优选应该达到每m²至少100只双翅目昆虫的密度，优选每m²至少250只双翅目昆虫，例如，每m² 100至1000只双翅目昆虫。该密度同样可以按每m³确定双翅目昆虫的数目，优选每m³至少25只双翅目昆虫，更优选每m³至少50只双翅目昆虫，最优选每m³至少75只双翅目昆虫，例如，每m³ 25至500只双翅目昆虫或者每m³ 75至250只双翅目昆虫。

本发明同样旨在提出一种获得杂交莴苣种子的方法，包括以下步骤：

-在封闭介质中彼此接近地栽种用作“母本”的雄性不育表型的莴苣植株和用作“父本”的雄性可育表型的莴苣植株，两个亲本中，一个亲本作为补充特征，表现对于赋予不同于雄性不育的可检测表型的基因而言是纯合子的事实，另一个亲本不携带此基因的步骤；

-在植株的开花期在封闭介质中以每m²超过100只双翅目昆虫，优选每m²至少250只双翅目昆虫的密度引入的双翅目昆虫进行授粉的步骤；和

-采集由该雄性不育的植株产生的种子的步骤。

第二亲本对于另一个亲本不携带的、赋予雄性不育以外的可检测表型的至少一个基因而言，优选同样是纯合子。所述封闭介质优选是一个对昆虫密封的封闭空间。

已经观察到当双翅目昆虫有过多的数量时有较好的结果，同样，其密度优选每m²超过400只双翅目昆虫，更优选每m²超过500只双翅目昆虫。

这些双翅目昆虫可以在卵裂阶段以幼虫、蛹或成虫引入。它们优选采取蛹的形式引入。

所用的这些双翅目昆虫优选是一些短角亚目(brachyceres)昆虫，例如，短角环裂亚目(brachyceres cyclorhaphes)，更优选蝇科(Muscidae)或丽蝇科(Calliphorides)的短角(brachyceres)昆虫，例如，反吐丽蝇(Calliphoravomitaria)、红头丽蝇(Calliphora erythrocephala)或叉叶绿蝇(Lucilia caesar)。若在至少3至4周期间每周一次，优选每周两次引入双翅目昆虫，则一般获得较佳的产量。

同样，若在该封闭介质中雄性不育的植株的数目大于雄性可育植株的数目，则一般获得较佳的产量。在该封闭介质中雄性不育的植株数目例如，是至少2000株，而雄性可育植株的数目例如，是至少1000株。

按照本发明的方法的实施方案，两个亲本之间要有一致的开花期。这个特性可以通过在该特性上进行选择，或通过采取适当的培植措施而获得。

用作母本的植株的雄性不育性，优选是单基因的，显性的和细胞核的，更优选由基因Ms7赋予。

用作母本的植株的基因组，优选包含650至700个核苷酸，例如，655至695、660至690、665至685、670至680、673至677个核苷酸，或者674、675或者676个核苷酸的双链DNA序列，其中双链中每条链的5′末端由序列“5′TGCGTTCCAC 3′”(SEQ ID No.1)开头。按照一个优选实施方案，用作母本的植株的基因组包含图8所示的核苷酸序列(SEQ ID No.2)，或者这个序列中1至10个，优选1至5个，或更优选1至3个核苷酸被其他核苷酸取代、或缺失或插入而衍生的序列。

如上所述，由于减数分裂时染色体分离的现象，不可能用传统的杂交技术获得用作“母本”的雄性不育显性基因携带者植株的均一种群。因而，在利用雄性不育显性基因情况下，用作母本的植株可以用包括下列步骤的方法获得：

-在对于细胞核雄性不育显性基因而言是杂合子的莴苣植株和不含不育基因的雄性可育莴苣植株之间进行杂交的步骤；

-栽培由所述杂交产生的种子的步骤；以及

-除去呈现雄性可育表型的植株的步骤。

除去呈现雄性可育表型的植株的步骤，例如，可以根据允许区分雄性不育的莴苣植株和雄性可育的莴苣植株的可见特性手工实现。例如，在不育与基因Ms7相关的情况下，可以利用雄性不育的植株的头状花序打开的时间比雄性可育的植株长，而雄性不育的植株不具有花粉的事实进行挑选。

按照一个可选实施方案，除去呈现雄性可育表型的植株的步骤，可借助于在每棵植株的样本中，检测雄性不育显性基因的特定分子标记的缺少来实现。例如，这可以指长度约为675对碱基(例如，650至700、655至695、660至690、665至685、670至680、673至677、674、675或者676对碱基)的RAPD(多态DNA的随机扩增)标记，其中双链中每条链的5′末端由序列“5′TGCGTTCCAC 3′”(SEQ ID No.1)开头，诸如，本发明人开发的标记BA05-675(SEQ ID No.2)或者标记SCAR(Sequenced Characterized AmplifiedRegion Marker(顺序特征扩增区标记))、标记CAPS(Cleaved AmplifiedPolymorphic Sequence(分裂扩增多态的序列))或者所有其他从标记RAPD衍生的一般称为STS(Sequence Tagged Site(序列标签基因座))的标记。按照优选的实施方案，雄性不育显性基因特定分子标记存在与否的检测是，在用作母本植株的开花期之前，优选在植株生长早期阶段，例如，长1至5片叶子的阶段，优选在长1至2片叶子的阶段实现。

所用的分子标记优选允许检测带有至少70％，75％，80％，85％，95％，98或者99％，或更优选100％灵敏度的雄性不育的植株，该灵敏度定义为出现分子标记(真肯定)的雄性不育植株的数目与真肯定的数目和不出现分子标记(伪否定)的雄性不育的植株数目的总和之比(见表17)。

同样，该所用的分子标记优选允许以至少70％，75％，80％，85％，95％，98或99％，或甚至100％的特异性，检测雄性不育的植株，该特异性定义为不出现分子标记(真否定)的雄性可育植株数目与真肯定的数目和出现分子标记(伪肯定)的雄性可育植株的数目的总和之比(见表17)。

按照本发明的方法获得的种子的MMS(千粒重(千粒种子的重量))，较之由用作“父本”的雄性可育莴苣植株自花授粉获得的种子的MMS，一般至少大10％，甚至至少大20％，更甚至至少大30％。

本发明同样涉及按照上述方法可能获得的种子的种群，而且它含有至少10⁵粒种子，优选10⁶粒种子，更优选10⁷粒。

附图的简要描述

图1：莴苣的系谱；

图2：在试验1过程中用作“父本”和“母本”的莴苣的安排；

图3：在试验2过程中用作“父本”和“母本”的莴苣的安排；

图4：试验10的50棵杂交植株的基因型：用TaqI消化之后分子标记SCW09的扩增图谱(profil)；该标记SCW09标记莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)抗性基因Dm6和Dm18。A＝对照(temoin)Dm18+/Dm18+、B＝对照(temoin)Dm18-/Dm18-；C＝对照(temoin)Dm6+；D＝未经TaqI消化。

图5：试验10的50棵杂交植株的基因型：标记Dm3对Bremia lactucae的抗性的分子标记B1的扩增概况(profil d′amplification)；A＝对照(temoin)+Dm3+；B＝对照(temoin)Dm3-。

图6：带有标记BA05-675(箭头)的引物(amorce)OPBA05的电泳图谱。在1.0％琼脂糖凝胶上在190V.M下电泳1小时45分：100-bp分子量标记梯(Pharmacia Biotech、ref.27.4001.01)；

图7：对于莴苣与基因座Ms7相关的分子标记BA05-675的基因图谱(按照Kosambi函数计算距离)。

图8：对于莴苣的与雄性不育Ms7相关的标记BA05-675的核苷酸序列5′-3′(SEQ ID No.2)。

实施例

实施例1：杂交莴苣种子的获得

在下面所描述的不同试验中用作“母本”的雄性不育莴苣植株是不育基因Ms7的携带者。这些植株由基因Ms7携带者(X Girelle 94-9538-1)-加有保护罩的(温室的)黄油莴苣(laitue beurre d’abri)的第五代(BC5)回交产生，所述携带者可以在不同的研究组织诸如法国国家农艺研究院(INRA)、美国农业部(USDA)等等获得。

Ms7基因是显性的，两个基因Ms7携带者植株之间的杂交是不可能的。因而，呈现雄性不育表型的植株对基因Ms7而言是强杂合子，而且只能通过Ms7/ms7(不育的)植株和ms7/ms7(可育)植株之间杂交的偏性获得。

结果是，为了清除雄性可育植株需要纯化步骤。由于植株Ms7/ms7没有花粉而且植株Ms7/ms7的头状花序开花时间比植株ms7/ms7长的事实，使这个步骤变为可能。

试验1：

在这第一试验框架内：

-栽培品种Nacre/Cambria Dm18/R38(基因簇2的Dm18抗性基因和基因簇4的R38抗性基因)与黄油莴苣Ms7的第三代回交产生的450棵加上保护罩黄油莴苣植株，与对Bremia lactucae品种24(B124)敏感性结合，用作“母本”(在它们之中约一半是雄性不育的)；和

-BRA Dm18/R37(基因簇2的Dm18和基因簇1的R37抗性基因)的100棵栽培品种加有保护罩(d′abri)的黄油莴苣植株，抗B124结合，用作“父本”。

这两个亲本在开花期上呈现完美的一致性，允许尽可能均匀的授粉。

这些植株以下列方法安排在一个36m²对昆虫密封的封闭空间(荷兰奶牛(hollandaise)型温室，具有控制大气湿度和温度的可能性，11mx3.30m)中(见图2)：

-用作“父本”的植株沿着封闭空间的边缘安排成2行，植株间距20cm，和

-用作“母本”的植株安排成7行，夹在2行“父本”之间，离开父本的距离为50cm，植株间距15cm，而行间距为25cm。

13周后进行播种，而16周后进行栽种。

由于基因Ms7显性特性，需要对呈现雄性可育表型的用作“母本”的植株采取纯化(除去)步骤。该步骤在26和27周后利用Ms7/ms7植株没有花粉和Ms7/ms7(雄性不育)开花期长于ms7/ms7(雄性可育)植株植株的头状花序的事实手工实现。

在用为母本的450棵植株中，217棵呈雄性不育，而且被有效地利用。

两种类型的双翅目昆虫和丽蝇科(Calliphorides)的昆虫用作传粉昆虫：

-蝇反吐丽蝇(Calliphora vomitaria)和红头丽蝇(Calliphora erythrocephala)所谓“蛆”(同样称为蓝蝇或者肉蝇)，工作在15-20℃，和

-反吐丽蝇(Lucilia caesar)所谓‘pinkies’(同样称为死尸绿蝇)工作在20-25℃.

在28至31周期间引入传粉昆虫，以每m²引入300只蝇的比率以两周的频率实现。

33周后收获雄性不育的植株(“母本”)和同样用作自花受精对照(temoin)的雄性可育植株(“父本”)。

将这些植株烘干、拍打，接着将种子送到空气柱上，以便完成清洗并消除轻的残余碎屑并按长度和宽度分类。

2007年2月13日以保藏号NCIMB 41470将试验1中获得的2500粒种子的样本保藏于NCIMB(NCIMB Ltd.，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，A21 9YA，Scotland，UK)。

试验2

在一个对昆虫密封的336m²的封闭空间(长度：56m，宽度：6m，高度：3m)中，以更大规模进行类似的第二试验。在这第二试验框架内：

-3000棵加上保护罩的黄油莴苣植株，其通过栽培品种黄油莴苣Nacre/Cambria Dm18/R38与Bremia(对B124敏感结合)黄油莴苣Ms7的第四代回交(BC4)产生，用作“母本”(它们之中约有一半是雄性不育的)；和

-1500棵B124抗性栽培品种加上保护罩的黄油莴苣植株BRA Dm18/R37，用作“母本”。

这些植株按以下方法(见图3)安排在封闭空间中：

-用作“父本”的植株安排成四行：一行沿着封闭空间的每个边缘(80cm)，而两行在中心(间距20cm)，这些植株安排成梅花形，间距15cm，和

-用作“母本”的植株在雄性可育植株各行之间安排成8行，离开雄性可育植株65和70cm，这些植株的间距15cm，行间距25cm。

12周后进行播种，而16周后进行栽种。

类似于试验1所作的，需要对呈现雄性可育表型的用作母本的植株进行纯化(除去)步骤。这个步骤在25和26周后利用植株Ms7/ms7没有花粉和植株Ms7/ms7(雄性不育的)植株的头状花序开花期长于植株ms7/ms7(雄性可育)的事实手工实现。

在3000棵用为母本的植株中，1250棵是雄性不育的并被有效利用。

但是，16棵植株ms7/ms7(雄性可育)在纯化时被保留，并在由网状物或者布构成不让昆虫穿过的封闭空间中自花授粉，以便用作自花受精的对照。

所用的传粉昆虫与试验1时相同。

在25至29周期间以一周的频率以平均每次引入每m² 1100只蝇的比率引入传粉昆虫。

同时，在纯化步骤中保留的10棵雄性可育植株(父本)和16棵可育植株ms7/ms7，在由网状物或者布构成不让昆虫通过的封闭空间中进行自花授粉，以便用作自花受精的对照。

33周后收获雄性不育的植株(“父本”)，以及在纯化步骤中保留10棵雄性可育植株(父本)和16棵可育植株ms7/ms7，用作自花受精的对照。

这些植株烘干、拍打，接着将种子在空气柱上穿过，接着用以完成清洗和消除轻的残余碎屑，并按长度和宽度分类。

播种所获得的种子样本并按照正式的协议GEVES(变种和种子研究和控制组)对所获得的植株对B124的抗性进行测验。这些植株被证实是抗B124的。

试验1和2的结果

试验1和2的结果列于下表。

表1：试验1和2期间收集的种子重量比较

表2：杂交种子和出自试验1和2期间自花受精产物对照的种子粒度分级的比较

表3：杂交种子和出自试验1和2期间自花受精产物对照的种子的MMS(种子千粒重量)比较

讨论

在第一试验的过程中，从217棵雄性不育的(母本)莴苣植株获得730克种子，每棵植株的产量为3.36克，对应于自花授粉对照(父本)的15.30％的比率。

在第二试验的过程中，从1170棵雄性不育莴苣(Lactua sativa)植株(母本)获得7.730kg种子，每棵植株的产量为6.60克，对应于自花授粉(在对昆虫密封的封闭空间中纯化和授精时保留的雄性可育“父本”和“母本”)两个对照平均的50％的比率。

第二试验时，F1杂种粒度分级之后有用种子的比率，比自花授粉对照高10％。

在两个试验中，F1杂种的MMS(种子千粒重)比自花授粉对照高20％至30％。

从按照第二试验获得的种子获得的植株很好地抗B124。

试验3至8

以不同类型的黄油莴苣和荷兰莴苣，在防止昆虫进入的3.3mx1.1m的笼子中，每个8棵用作“母本”的莴苣植株(雄性不育的50％，出自基因Ms7携带者莴苣植株和可育莴苣植株之间回交)，和4棵用作“父本”的雄性可育莴苣植株，设置在通风的温室中，平行地进行试验3至8共6个类似的试验。

22周后进行播种，27周后进行栽种，31周后在开花期的开始，在雄性不育的“母本”植株和雄性可育植株之间进行挑选，32、33和34周后，在三周过程中每周引入一次的比率或约100只蝇/m²引入蝇，并在37周后收获。

试验3至8的结果

-笼子1：CHARLIN(68/12624)*CHARLIN(黄油)

1棵雌性植株：9.20克

1棵雄性植株：28.30克

-笼子2：CHARLIN(BC/77)*CHARLIN(黄油)

1棵雌性植株：5.45克

1棵雄性植株：19.40克

-笼子3：BRA 68/12588(加上保护罩(d′abri)的苹果形的莴苣)*BRA68/12588

6棵雌性植株：

植株1：7.00克

植株2：2.00克

植株3：5.20克

植株4：3.40克

植株5：9.60克

植株6：8.40克

平均：5.9克/植株

1棵雄性植株：34.40克

-笼子4：BRA 68/12588*BRA 68/12588

4棵雌性植株：

植株1：11.95克

植株2：7.15克

植株3：15.90克

植株4：11.90克

平均：11.25克/植株

1棵雄性植株：29.00克

-笼子5：BVA 68/12553(加上保护罩的荷兰莴苣)*BVA 68/12553

5棵雌性植株：

植株1：3.50克

植株2：1.30克

植株3：2.20克

植株4：1.70克

植株5：4.20克

平均：3.30克/植株

1棵雄性植株：3.60克

-笼子6：BVA 68/12553*BVA 68/12553

3棵雌性植株：

植株1：4.60克

植株2：3.20克

植株3：3.70克

平均：3.80克/植株

1棵雄性植株：23.40克

讨论

“母本”平均产量为3.3克/植株至11.2克/植株，荷兰莴苣类型(BVA68/12553)的产量(约3.5克/植株)，较之黄油类型(Charlin，BRA 68/12588)的约8.5克/植株，明显较低，这可以使人认为，类型对最终产量有强烈的含义。

试验9

在对昆虫密封的直径0.40m的小笼子中设置有充足土壤的通风的温室，进行新的生产试验。

22周后进行播种，25周后进行换盆，30周后在开花期的开始时在雄性不育和雄性可育“母本”植株之间进行挑选，31周后栽种，32、33和34周后引入蝇，在3周期间每周引入一次，或者约100只蝇/m²，35周后收获。

结果

所获得的结果合成在下面的表4和5中。

表4：(加上保护罩的黄油莴苣)Charlin“父本”和“母本”进行的种子生产

母本Charlin	重量，克	父本Charlin	重量，克
				1	3.3	1	1.65
2	0.76	2	1.7
				3	0.44	3	3
4	1.1	4	1.18
				5	4.18	5	1.9
6	2.7	6	2.95
				7	1.72	7	1.9
8	1.78	8	2.3
				9	1.92
平均	1.99	平均	2.0725

表5：由BVA 68/12553(荷兰莴苣)“父本”和“母本”进行的种子生产

母本BVA 68/12553(巴达维亚(batavia))	重量，克	父本BVA 68/12553(batavia)	重量，克
				1	1.1	1	1.45
2	1.17	2	0.95
				3	1.2	3	2
4	1.48	4	1.6
				5	0.66	5	1.27
6	0.69	6	3
				7	0.55	7	1.8
8	1.22	8	1.9
				9	0.75	9	1.26
10	1.3	10	2.3
				11	1.57	11	1.15
12	0.52	12	1.4
				13	0.55
平均	0.98	平均	1.67

讨论

就荷兰莴苣(BVA 68/12553)所获得的平均产量而言，该结果是令人满意的，约为1克/植株，对比之下自花授粉对照为1.7克/植株，对于加有保护罩的黄油莴苣(Charlin)所获得的平均产量约为1克/植株，与自花授粉对照处于同一水平。

试验10：通过杂交结合的Dm3/Dm18组合(cumul)

按照上述几个试验描述的方法，分别获得了属于基因簇2并位于同一基因座上的、并合了两个抗Bremia lactucae品种24(B124)和品种23(B123)的显性基因Dm3和Dm18的F1杂种莴苣。

用作“母本”的植株(06/30443：MS7/2INACREXDEVONIAxCAMBRIA)是抗性基因Dm18和R38的携带者。用作“父本”的植株是加了保护罩的黄油抗性基因Dm3(BC：06/30443*Rex或者BC：06/30443*Melina)的携带者。

实现了下列这5个杂交：

-06/30443/01(MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-01)Dm18/R38*Rex Dm3

-06/30443/10(MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-10)Dm18/R38*Rex Dm3

-06/30443/02(MS7/21×NACREXDEVONIAXCAMBRIA-02)Dm18/R38*Melina Dm3

-06/30443/03(MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-03)Dm18/R38*Melina Dm3

-06/30443/04(MS7/21×NACREXDEVONIAXCAMBRIA-04]Dm18/R38*Melina Dm3

播种了这5个杂种产生的种子，并在F1植株上以及在“父本”(Rex/Melina)和“母本”上实现叶圆盘(disques foliaires)上的孕育测试和分子标记。

I-叶圆盘上的接种测试

材料：植物材料包括直径1.5cm的叶圆盘，以每个品种和每棵植株5片，每个来源10棵植株和Bremia lactucae的两个品种(攻击组合Dm18/R38，而Dm3赋予对其抗性的B124，和攻击组合Dm3/R38而Dm18赋予对其抗性的B123)的比率制成。于是，总共对两个品种进行80棵植株的测验。

技术：通过粉碎孢子囊分别用Bremia品种B123和B124给该叶圆盘接种。

1/叶圆盘的提取：每棵植株提取5个叶圆盘并放置在两个厚度的加湿吸墨纸上。每盒包含6个谱系(lignes)的待测试盘和一个谱系的敏感对照。

2/接种：接种6盒叶圆盘所需要的接种物数量为11ml。以每100ml脱矿质水加入4滴吐温80的比率制备吐温(Tween)80母液。该接种物容积用的提取液数量是每100ml接种物5ml吐温80母液。接种物是通过在加有母液5％的吐温80的自来水中拆开孢子囊实现的。为了获得接近10⁸个孢子/ml的孢子囊密度，孢子囊以1棵植株/ml接种物的比率提取。过滤是在250ml的烧杯中让该溶液在纱布(chiffonnette)上面通过来实现的。

3/粉碎：接种在叶圆盘提取的同一天展开。测量接种物溶液的容积，然后接种这些展开的盒。均匀地研碎接种物，以细小滴加在每个盘整个表面上。重新密封地关闭这些盒并在7天期间白天14小时，夜晚10小时在15℃下在模块(module)中孵育。

结果：接种的结果列于下表6至13(S＝敏感，R＝抗性)。不同杂交的杂种对两个品种B123和B124有抗性，指示基因簇2的两个基因Dm18和Dm3的存在。

表6“雌性”植株30443(Dm18/R38)：

MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA：抗B123并对B124敏感。

基因型	植株	B123	B124
				06/30443	2	R	S
06/30443	3	R	S
				06/30443	4	R	S
06/30443	5	R	S
				06/30443	6	R	S
06/30443	7	R	S
				06/30443	8	R	S
06/30443	9	R	S
				06/30443	10	R	S

表7：“雄性”植株Melina(Dm3)：对B123敏感并抗B124(在10棵植株上测试)

基因型	植株	B123	B124
				MELINA	1	S	R
MELINA	2	S	R
				MELINA	3	S	R
MELINA	4	S	R
				MELINA	5	S	R
MELINA	6	S	R
				MELINA	7	S	R
MELINA	8	S	R
				MELINA	9	S	R
MELINA	10	S	R

表8：杂交06/30443/02*Melina(Dm18/R38*Dm3)＝MS7/21×NACREXDEVONIAXCAMBRIA-02*MELINA。

基因型	植株	B123	B124
				06/30443/02*MELINA	2	R	R
06/30443/02*MELINA	3	R	R
				06/30443/02*MELINA	4	R	R
06/30443/02*MELINA	5	R	R
				06/30443/02*MELINA	6	R	R
06/30443/02*MELINA	7	R	R
				06/30443/02*MELINA	8	R	R
06/30443/02*MELINA	9	R	R
				06/30443/02*MELINA	10	R	R

表9：杂交06/30443/03*Melina(Dm18/R38*Dm3)＝MS7/21×NACRExDEVONIAxCAMBRIA-03*MELINA.

基因型	植株	B123	B124
				06/30443/03*MELINA	2	R	R
06/30443/03*MELINA	3	R	R
				06/30443/03*MELINA	4	R	R
06/30443/03*MELINA	5	R	R
				06/30443/03*MELINA	6	R	R
06/30443/03*MELINA	7	R	R
				06/30443/03*MELINA	8	R	R
06/30443/03*MELINA	9	R	R
				06/30443/03*MELINA	10	R	R

表10：杂交06/30443/04*Melina(Dm18/R38*Dm3)＝MS7/21×NACREXDEVONIAXCAMBRIA-03*MELINA.

基因型	植株	B123	B124
				06/30443/04*MELINA	2	R	R
06/30443/04*MELINA	3	R	R
				06/30443/04*MELINA	4	R	R
06/30443/04*MELINA	5	R	R
				06/30443/04*MELINA	6	R	R
06/30443/04*MELINA	7	R	R
				06/30443/04*MELINA	8	R	R
06/30443/04*MELINA	9	R	R
				06/30443/04*MELINA	10	R	R

表11：“雄性”植株Rex(Dm3)：对B123敏感和耐受B124(在10棵植株上测试)

基因型	植株	B123	B124
				REX/1	1	S	R
REX/2	2	S	R
				REX/3	3	S	R
REX/4	4	S	R
				REX/5	5	S	R
REX/6	6	S	R
				REX/7	7	S	R
REX/8	8	S	R
				REX/9	9	S	R
REX/10	10	S	R

表12：杂交06/30443/01*Rex(Dm18/R38*Dm3)＝MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-01*REX.

基因型	植株	B123	B124
				06/30443/01*REX	2	R	R
06/30443/01*REX	3	R	R
				06/30443/01*REX	4	R	R
06/30443/01*REX	5	R	R
				06/30443/01*REX	6	R	R
06/30443/01*REX	7	R	R
				06/30443/01*REX	8	R	R
06/30443/01*REX	9	R	R
				06/30443/01*REX	10	R	R

表13：杂交06/30443/10*Rex(Dm18/R38*Dm3)＝MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-10*REX.

	植株	B123	B124
				06/30443/02*REX	2	R	R
06/30443/02*REX	3	R	R
				06/30443/02*REX	4	R	R
06/30443/02*REX	5	R	R
				06/30443/02*REX	6	R	R
06/30443/02*REX	7	R	R
				06/30443/02*REX	8	R	R
06/30443/02*REX	9	R	R
				06/30443/02*REX	10	R	R

II-分子标记

利用2个分子标记可以显现对莴苣中Bremia lactucae的两种菌株的抗性的、两个连接非常紧密(位于同一基因座上)的显性基因的组合。

方法：

1/植物材料：该植物材料包括直径1.5cm的叶圆盘，采用每棵植株一个盘的比率。从提取CTAB/氯仿出发，接着使之悬浮在浓度为5ng/μl的TE 0.1×溶液中，获得基因型(或者总共50棵植株)的5至10棵植株的DNA。

2/基因型分析：为了对50棵植株(表14)求出基因型，利用分别由Maisonneuve等人【10】和Kuang H.等人【11】所描述的标记SCW09和B1。

PCR的条件在表15中描述。SCW09和B1的PCR循环分别为：

-94℃/30s-94℃/1mn，60℃/1τnn，72℃/2min；40循环-72℃/5min-4℃；

-94℃/30s-94℃/1mn，63℃/1mn，72℃/2min；40循环-72℃/5min-8℃。

标记SCW09在迁移步骤之前被酶Taq I酶消化(缓冲液1×，牛血清清蛋白(BSA)1×和Taq I 1U)。在缓冲液TBE 1×中在1小时(B1)至1小时30分(SCW09)期间，以恒定的220V电压，在2％(SCW09)或者1.5％(B1)的琼脂糖凝胶上进行电泳。在紫外线灯下用溴化乙锭(BET)染色使电泳图谱显现。

表14：标记SCW09和B1的特征

基因座

试验

类型

引物

序列

Tm

GC％

多态性

SCW09

Dm18

CAPS

SCW09-A

GTGACCGAGTAGTCTTAACCTAGT(SEQ ID NO：3)

61.0

46％

共显性

SCW09-B

GTGACCGAGTGTAACAACGTAAAT(SEQ ID NO：4)

59.3

42％

B1

Dm3

SCAR

B1F.

GAGAATAGAGTCTTGTGATGGCA(SEQ ID NO：5)

58.9

43％

显性

B1R

CCCGTAAGACATGGAAGTTCTCT(SEQ ID NO：6)

60.6

48％

表15：标记SCW09和B1的PCR条件

化学品	SCW09	B1
			H₂O	qsp 20μl	qsp 20μl
缓冲液	1×	1×
			MgCl₂	2.5mM	1.5mM
dNTP	0.2mM	200μM
			正向引物	0.04μM	100nM
反向引物	0.04μM	100nM
			Taq聚合酶Cetus	lu	1U
DNA	5μl	5μl

结果：

结果列于表16并示于图4和图5。REX和MELINA的基因型是Dm18-/Dm18-和Dm3+图谱的基因型。基因型06/30443具有Dm18+/Dm18+和Dm3-图谱。亲本(REX或者MELINA)彼此杂交的总体具有图谱Dm18+/Dm18-和Dm3+，就是说，抗Dm18和Dm3。

表16用标记SCW09和B1进行基因型分析的结果(S＝敏感；R＝抗性)

NO基因

基因型

植株

B123(Dm18)

B124(Dm3)

Dm3(B1)

DH18(SCW09)

G02766

REX

1

S

R

Dm3+

Dm18-/Dm18-

G02767

REX

2

S

R

Dm3+

Dm18-/Dm18-

G02768

REX

3

S

R

Dm3+

Dm18-/Dm18-

G02769

REX

4

s

R

Dm3+

Dm18-/Dm18-

G02770

REX

5

s

R

Dm3+

Dm18-/Dm18-

G02771

06/30443/01*REX

2

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02772

06/30443/01*REX

3

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02773

06/30443/01*REX

4

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02774

06/30443/01*REX

5

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02775

06/30443/01*REX

6

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02776

06/30443/01*REX

7

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02777

06/30443/10*REX

3

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02778

06/30443/10*REX

4

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02779

06/30443/10*REX

5

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02780

06/30443/10*REX

6

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02781

06/30443/10*REX

7

R

′Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02782

06/30443/10*REX

10

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02783

MELINA

1

S

R

Dm3+

Dm18-/Dm18-

G02784

MELINA

2

S

R

Dm3+

Dm18-/Dm18-

G02785

MELINA

3

S

R

Dm3+

Dm18-/Dm18-

G02786

MELINA

4

S

R

Dm3+

Dm18-/Dm18-

G02787

MELINA

5

S

R

Dm3+

Dm18-/Dm18-

G02788

06/30443/02*MELINA

2

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02789

06/30443/02*MELINA

3

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02790

06/30443/02*MELINA

4

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02791

06/30443/02*MELINA

5

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02792

06/30443/02*MELINA

6

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02793

06/30443/02*MELINA

7

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02794

06/30443/03*MELINA

2

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02795

06/30443/03*MELINA

3

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02796

06/30443/03*MELINA

4

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02797

06/30443/03*MELINA

5

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02798

06/30443/03*MELINA

7

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02799

06/30443/03*MELINA

8

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02800

06/30443/04*MELINA

2

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02801

06/30443/04*MELINA

3

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02802

06/30443/04*MELINA

4

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02803

06/30443/04*MELINA

5

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02804

06/30443/04*MELINA

7

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02805

06/30443/04*MELINA

8

R

Dm3+

Dm18+/Dm18-

G02806

06/30443

1

R

S

Dm3-

Dm18+/Dm18+

G02807

06/30443

2

R

S

Dm3-

Dm18+/Dm18+

G02808

06/30443

3

R

S

Dm3-

Dm18+/Dm18+

G02809

06/30443

4

R

S

Dm3-

Dm18+/Dm18+

G02810

06/30443

5

R

S

Dm3-

Dm18+/Dm18+

G02811

06/30443

6

R

S

Dm3-

Dm18+/Dm18+

G02812

06/30443

7

R

S

Dm3-

Dm18+/Dm18+

G02813

06/30443

8

R

S

Dm3-

Dm18+/Dm18+

G02814

06/30443

9

R

S

Dm3-

Dm18+/Dm18+

G02815

06/30443

10

R

S

Dm3-

Dm18+/Dm18+

实施例2：基因Ms7的分子标记鉴别。

下面描述的获得与莴苣中雄性不育相关的分子标记的方法是作为实例给出的。

1-为了开发一个与莴苣(L.sativa)中细胞核雄性不育Ms7连接的标记构建种群。

通过回交实现了呈现雄性不育Ms7的不同莴苣的类型的两个种群。接着，对这样获得的200棵植株的第四代(BC4)的两个回归种群，在对应于雄性不育表型的“失去可存活的花粉”的特性上进行表型。按照1∶1的比率作为雄性可育(F)或雄性不育验明两组表型。

这个比率充分证实了由基因座Ms7上杂合子亲本带来的雄性不育的显性单基因性质。

2-莴苣植株DNA的提取

按照经过修改的协议CTAB(Tomas et al.，1989[20]；Doyle et al.，1990[15]；Edwards et al.，1991[16])在新鲜的嫩叶上进行DNA提取。

借助于1.5ml的管子制取的新鲜叶圆盘，在500μl提取缓冲液(tris-HCl0.1M，NaCl 0.7M，EDTA 10mM，CTAB 1％，β-巯基乙醇1％)中捣碎。在65℃下使捣碎之物孵化1小时，并在孵育过程中通过翻转混合2至3次。

接着加入200μl 24∶1氯仿∶异戊醇溶液并翻转混合。在20℃下以6000rpm离心分离10分钟之后，收回400μl漂浮物并混合在400μl异丙醇中。

在-20℃下1小时之后，在4℃下以6000rpm对混合物进行离心分离10分钟。卸空该管子。把固定在管底部的DNA沉淀物用空气烘干12小时。

使DNA悬浮在200μl的TE 0.1X(Tris-HCl 1mM，EDTA 0.1mM)溶液中。在1％琼脂糖凝胶上用λDNA-Hind III消化液(Lambda DNA-Hind III Digest)定量，测量最终浓度。

3-用BSA(Bulk Segregant Anaysis(体积分离分析)法搜索与莴苣(L.sativa) 中雄性不育Ms7相关的标记随机扩增多态DNA(RAPD)。

为了鉴别与雄性不育Ms7相关的分子标记，利用了操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.)(亨茨维尔(Huntsville)，AL 35805，USA)(公司)的第10试剂盒和体积分离法(Michelmore et al.，1991[17]et Paran etal.，1991[18])。

从上述两个种群BC4的表型出发，为“雄性不育”和“雄性可育”两组对10棵植株的混合物进行两次取样。用William等人于1990[22]和Welsh等人于1990[21]描述的RAPD技术对每种群的4个样本测试了OPA-01对OPBH-20的Operon Biotechnologies Inc.(Huntsville，AL 35805，USA)(公司)的1200个引物。选出了在“雄性不育”样本上显示出特定的带并显示出易于读出的电泳图谱的引物。

在由缓冲液PCR 1×，3mM的MgCl₂，200μM的dNTPs，400nM的引物，1单元DNA聚合酶AmpliTaq(Perkin-Elmer cetus)组成的总共25μl反应容积中实现了PCR反应。该PCR反应包括以下所描述的几个循环：步骤1在94℃下持续30秒；在94℃下持续1分钟45个循环，接着在35℃下持续1分钟，最后在72℃下持续2分钟，并将在72℃下持续5分钟，实现最终的延伸，接着在4℃下保持反应。

在下列电泳条件下：电泳缓冲液TBE 1×(三硼酸盐乙二胺四乙酸(Tris-Borate-EDTA))190V持续2小时15分，在2％琼脂糖凝胶上，分离扩增产物。

为了使所保持的引物RAPD生效，对两个种群BC4的200棵植株的每一棵都针对具有序列“5′TGCGTTCCAC3′”(SEQ ID No.1)并与其对应的与Ms7共分离的标记675bp，BA05-675(SEQ ID No.2)的引物OPBA05个别地进行测验。针对该标记而获得的电泳图谱示于图6。

在12种群的约25棵植株上实现的不同莴苣类型(荷兰莴苣、黄油莴苣、冰山莴苣、罗马莴苣、橡树叶莴苣和红叶生菜(lollo rossa))上都证明该标记是有效的。测试的实现条件与上述相同：提取、扩增和电泳步骤。标记RAPDBA05-675灵敏度和特异性的计算表明，依类型不同，数值也不同，而平均值分别为96％和94％(见表17和18)。

表17：所保留的分子标记的预测值、灵敏度和特异性的计算细节。

表18：莴苣类型和与Ms7相联系的分子标记BA05-675的灵敏度(S^*)和特异性(F^*)的计算平均值的结果。

4-与莴苣品种中的雄性不育Ms7相联系的标记BA05-675的遗传基因图的绘制。

从一个种群BC4的200棵植株出发，针对上述Ms7进行分离，与Ms7相关的标记BA05-675的遗传基因图的绘制(William et al.，1993[23])，是借助于程序(Stam et al.，1996[19J)et Carte BlancheR(主基因(Keygene)N.P.，P.O.Box 216，6700AE瓦赫宁根(Wageningen)，荷兰(The Netherlands))实现的。X2的统计测试允许查核显性标记BA05-675的1∶1比例的孟德尔型分离的零假说(测试不显著，p＞0.05)(见表19)。与相似性关系相关的测试(或者优势对数评分(LOD score))大于或等于3.0，就可以给这个1.8cM的Ms7标记绘图(图6)。

表19：与Ms7相关的分子标记BA05675的分离报告，和按照1∶1比例的孟德尔型分离的零假设进行X²至1ddl测试结果。(F：雄性可育植株的数目；S：雄性不育植株的数目)

位点	F∶S	X²(1∶1)
			BA05-675	103∶95	0.25

5-与莴苣(Lactuca sativa)中的雄性不育相关的分子标记RAPD BA05-675 的克隆和测序。

从琼脂糖凝胶上的电泳图谱出发，隔离了675bp的DNA片段，并使之在TE缓冲液(10mM的Tris-Cl，1mM的EDTA)中悬浮，接着按照上述PCR条件重扩增。借助于(英杰(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚(California)92008，USA)商业试剂盒，克隆了隔离重扩增片段。核实克隆之后，借助于净化试剂盒在普洛麦格(Promega)柱(麦迪逊(Madison)，威斯康辛州(WI)，USA)上进行DNA(米迪普瑞普系统(Midiprep system))的提取。

将提纯后的克隆物浓缩至75ng/μl，并用可基尼克斯(Cogenics)(38944梅朗(Meylan)，法国(France))排出序列。这样获得图8所示的标记BA05-675的序列(SEQ ID No.2)。

6-结果

本发明人所进行的研究允许定义标记RAPD，BA05-675(SEQ ID No.2)，其中该序列示于图8，与Ms7距离为1.8cM，并且不论莴苣的类型，均分别呈现96％和94％的平均灵敏度和特异性(表18)。在2个种群BC4的单个植株上对该标记的评价允许估计雄性不育的植株识别的预测值(Altman 1994a[13])平均约为97％。

参考文献

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2.Goubara & Takasaki(2004)Pollination effects of the sweat beeLasioglossum vilosulum trichopse on genic-male lettuce(蜜蜂Lasioglossumvilosulum trichopse对基因雄性莴苣的授粉作用)，Appl.Entomo.Zool(动物昆虫学应用).39(1)：163-169，2004.

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9..Ryder，E.J.(1979)Leafy Salad Vegetables(叶子沙拉蔬菜)，Avi.Pub.Co.，page 30.

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序列表

<110>VILMORIN

MICHEL，Herve

SOUSSIN，Thierry

<120>杂交莴苣种子的生产

<130>B6739A

<140>尚不知道

<141>2008-03-05

<150>FR 07/01589

<151>2007-03-05

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>OPBA05引物

<400> 1

tgcgttccac 10

<210> 2

<211>675

<212>DNA

<213>莴苣(Lactuca sativa)

<400>2

tgcgttccac caccgagact tcgacacctg gctgccccat tcgaactacg ccctgcgtag 60

agattcgtac gcccagcgta cgtgcgaggg tgcatcccta taaaaggcat gtgagacctt 120

cgggtttgtt gctcaatatt tcttctcttc tccccttatt ctttctattt cttggtaatt 180

tataccctcg aaaccccagt attattctcg agacctgaag caagtcccga agccctgaga 240

atcccgagaa gtaaagtttt cgagccgaaa ctctgcccgc gagaatcccg gttttcaaga 300

aagcgtatcg gtttcaccga agaatactac tcttagagtc gtagtgttgt tcgatcatct 360

tttgatcaag tgagtgtata ttccttttct tctaacacat agatacgaag tattctctac 420

aaaatacgtg ttatgtgttt gtatattatt tgcttatttg aaataattgt tgaatgaatg 480

atttgtacac gttctaagtt gtatataaat gtatatattt ttatctacta atatgttggg 540

tagaacatgg gtagaaagtt gttgtgagat gaaataaaat gatgagaggc ctcgatgttg 600

atgttgttaa tctagtcatc tagcggagta tggatgacga tcacggactc ttcctagact 660

gtccagtgga acgca 675

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SCW09-A引物

<400>3

gtgaccgagt agtcttaacc tagt 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SCW09-B引物

<400>4

gtgaccgagt gtaacaacgt aaat 24

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>B1F引物

<400>5

gagaatagag tcttgtgatg gca 23

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>B1R引物

<400>6

cccgtaagac atggaagttc tct 23

Claims

1.杂交莴苣植株的细胞，其特征在于，

其呈现杂合子雄性不育基因型，和

其对于至少一个赋予该植株一种可检测表型的不同的基因而言是杂合子，其中，所述可检测表型是农业上感兴趣的表型，

它的基因组包含具有675个核苷酸的双链DNA序列，其中，双链的每条链的5'末端由序列TGCGTTCCAC(SEQ ID No.1)开头，所述具有675个核苷酸的双链DNA序列存在于保藏于英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心保藏号NCIMB41470包含Ms7基因的莴苣种子中。

2.根据权利要求1所述的细胞，其中，所述表型是由对病毒、细菌、昆虫或真菌感染有标准抗性或者中等抗性的基因赋予的。

3.根据权利要求2所述的细胞，其中，所述表型是对下列真菌之一：莴苣盘梗霉、尖孢镰刀菌、小核盘菌或核盘菌、灰霉菌、立枯丝核菌、红色雪腐病菌、棉花黄萎病菌、白粉菌或腐霉菌；对下列昆虫之一：莴苣蚜、桃蚜、大戟长管蚜、根腐线虫或根结线虫,南美斑潜蝇或囊柄瘿绵蚜；对下列细菌之一：假单胞菌、黄单胞菌或根单胞菌；或对下列病毒之一：LMV、TSWV、“Bigvein”、TBSV、LNSV、TuMV、CMV或BWYV的标准抗性或中等抗性。

4.根据权利要求2所述的细胞，其中，所述细胞具有以杂合子的形式出现的不同的标准抗性或中等抗性的第二基因。

5.根据权利要求2或4所述的细胞，其中所述标准抗性或中等抗性基因选自以下的基因：

对盘梗霉呈抗性的基因：Dm10、R17、Dm5/Dm8、R36/R37、Dm1、Dm2、Dm3、Dm6、Dm14、Dm15、Dm16、Dm18或Dm4、Dm7、Dm11、R38；

或者对TuMV呈抗性的Tu基因；

对莴苣蚜呈抗性的基因Nr；

或者对LMV呈抗性的基因mol.1、mol.2。

6.双翅目昆虫的应用，其中，双翅目昆虫以超过每m²100只双翅目昆虫，或者每m³25只双翅目昆虫的密度，用于在封闭介质中实施由雄性可育植株向雄性不育的莴苣植株的授粉，其中，所述双翅目昆虫是短角亚目，并且其中，所述雄性不育的莴苣植株的基因组包含具有675个核苷酸的双链DNA序列，其中，双链的每条链的5'末端由序列TGCGTTCCAC(SEQ ID No.1)开头，所述具有675个核苷酸的双链DNA序列存在于保藏于英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心保藏号NCIMB41470包含Ms7基因的莴苣种子中。

7.根据权利要求6所述的应用，其中该双翅目昆虫呈现每m²至少250只双翅目昆虫，或者每m³至少75只双翅目昆虫的密度。

8.根据权利要求6所述的应用，用以获得杂交莴苣植株。

9.根据权利要求6所述的应用，其中雄性可育植株同样是莴苣植株。

10.获得杂交莴苣种子的方法，包含下列步骤：

在封闭介质中彼此接近地栽培用作“母本”的雄性不育表型的莴苣植株和用作“父本”的雄性可育表型的莴苣植株，两个亲本之一，作为补充特征，表现对于赋予不同于该雄性不育性的可检测表型的基因而言是纯合子的事实，而另一个亲本不携带此基因；

在植株的开花期，在封闭介质中，以每m²超过100只双翅目昆虫，或每m³超过25只双翅目昆虫，其中，所述双翅目昆虫是短角亚目；以及

采集由该雄性不育植株产生的种子，

其中，所述用作母本的植株的基因组包含具有675个核苷酸的双链DNA序列，其中，双链的每条链的5'末端由序列TGCGTTCCAC(SEQ ID No.1)开头，所述具有675个核苷酸的双链DNA序列存在于保藏于英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心保藏号NCIMB41470包含Ms7基因的莴苣种子中。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，每m²至少250只双翅目昆虫或每m³至少75只双翅目昆虫的密度引入双翅目昆虫进行授粉。

12.根据权利要求10所述的方法，其中第二亲本对于赋予其不同于该雄性不育性的可检测表型的至少一个基因而言同样是纯合子，而另一个亲本不携带此基因。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述引入双翅目昆虫的密度，超过每m²400只双翅目昆虫。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述双翅目昆虫是以蛹的形式引入的。

15.根据权利要求10所述的方法，其中所述封闭介质是对昆虫密封的封闭空间。

16.根据权利要求10所述的方法，其中所述双翅目昆虫属于丽蝇科或蝇科。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述双翅目昆虫是反吐丽蝇，红头丽蝇或叉叶绿蝇。

18.根据权利要求10所述的方法，其中在该封闭介质中，雄性不育植株的数目大于雄性可育植株的数目。

19.根据权利要求10所述的方法，其中在该封闭介质中，雄性不育的植株的数目至少为2000棵，而雄性可育植株的数目至少为1000棵。

20.根据权利要求10所述的方法，其中双翅目昆虫的引入在3至4周期间至少每周重新开始一次。

21.根据权利要求10所述的方法，其中用为母本的植株的雄性不育性是由基因Ms7赋予的，而且其中用为母本的植株是由包括下列步骤的方法获得的：

在对于基因Ms7而言为杂合子的莴苣植株和不携带不育基因的雄性可育莴苣植株之间进行杂交的步骤；

栽培所述杂种产生的种子的步骤，以及

除去呈现雄性可育表型的植株的步骤。

22.根据权利要求21所述的方法，其中除去呈现雄性可育表型的植株的步骤，是借助于在每棵植株的样本上检测基因Ms7的特定分子标记的缺失而实现的。

23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述分子标记是具有675个核苷酸的双链DNA序列，其中双链的每条链的5'末端由序列TGCGTTCCAC(SEQ ID No.1)开头，所述具有675个核苷酸的双链DNA序列存在于保藏于英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心保藏号NCIMB41470包含Ms7基因的莴苣种子中。