JP2010519923A - 雑種ラクツカ・サティバ(Lactucasativa)種子の作製 - Google Patents
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Abstract
Description
ラクツカ・サティバはまた、風による授粉はしない。
開花の期間が短く且つ早朝であるために、虫が花を訪れることの確認を困難にする。
開花が1度しかないために、最大数の雄性不稔花の受粉を確実にするためには、選択された授粉する虫が花を毎日訪れる虫でなければならない。
今日、F1雑種レタス変種で、流通スケールで作製されているものはない。
「栽培レタス」は、ラクツカ・サティバ種を意味する。基本的な栽培レタスの5つの栽培品種群(cultigroups)が存在する(図1を参照):ラクツカ・サティバ変種 アングスタナ(angustana)(アスパラガス(asparagus)レタス); ラクツカ・サティバ変種 カピタタ(capitata)(バターヘッド(butterhead)レタス); ラクツカ・サティバ変種 クリスパ(crispa)(バタビア(batavia)又はアイスバーグ(Iceberg)レタス); ラクツカ・サティバ変種 ロンギフォリア(longifolia)(ロマイネ(Romaine)レタス)及びラクツカ・サティバ変種 アセファラ(acephala)(フリシー(frisee)レタス、カッティング(cutting)レタス)。本発明は、これらの様々な型のレタスの各々の使用を包含する。
「自家生殖の」なる用語は、2つの配偶子が同じ個体に由来する、植物の自己授粉する能力を意味する。
「他殖性の」は、ある個体の花が他の1又は複数の個体からの花粉で受精する表現型を意味する。
「授粉する虫」は、花の研究において(例えば蜜を研究する場合)、雄蕊を摺ることにより花粉の数粒を収穫し、その後これを別の花に置いてくる虫を意味する。
「対立遺伝子」は、所与の染色体位置(遺伝子座)に位置する特定の遺伝子内での変異である。遺伝子の異なる対立遺伝子は、異なる形質の発現をもたらす。
「優性遺伝子」は、1対の2つの染色体に存在するか1つだけに存在するかにかかわらず、表現型を提供する遺伝子を意味する。
「劣性遺伝子」は、それが2つの相同染色体のうちの各々に存在する場合、1の表現型のみを提供する遺伝子を意味する。
「相互優性(co-dominanace)」は、2つの対立遺伝子が決定する表現型的特徴の、一方及び他方を発現する遺伝子特性を意味する。異種接合体において、物質が2つの相互優性の対立遺伝子を有すると、遺伝子型はこれらの遺伝子によりもたらされた情報に従ってその表現型で完全に発現する。
「異種接合体」は、染色体の同じ対の既定の遺伝子座上の2つの異なる対立遺伝子を有する細胞又は個体を意味する。
「同型接合体」は、染色体の同じ対の規定の遺伝子座上の2つの同一の対立遺伝子を有する細胞又は個体を意味する。
「雑種」なる用語は、異なる遺伝子構成の、好ましくは同一種由来の個体間の交配産物を意味する。
「戻し交配」は、雑種とその親の一方との間の交配を意味する。
「栽培品種」は、ある変種を意味する。
「遺伝子型」は、個体からもたらされた遺伝物質であって、その遺伝形質を構成するものの全てを意味する。
「表現型」は、遺伝子型の発現比率と外部環境により決定される現象の両方に対応する、個体の、明らかな形態的又は機能的特徴の組を意味する。
「農業で注目の表現型」なる用語は、例えば2つの同型接合遺伝子型間での交配から得られた表現型であって、農業的観点から注目の特性、例えば様々な病原菌又は虫への耐性の蓄積、雑種強勢(すなわち、雑種形質の平均は、2つの親のものの平均より高い)、恒常性、非生物ストレスに適応する能力、形態学的特徴、例えば色、形、葉の柔軟性又は剛性の性質、栄養組成物又は植物の味質等を伴う表現型を意味する。
「雑種強勢(heterosis又はhybrid vigour)」とは、F1雑種が、一又は複数の特徴の点で、特に強勢(vigour)に関して、その最良の親よりも顕著に優勢である表現型を意味する。
「恒常性」とは、環境又は複数の環境的特徴まで適応する、植物の能力を意味する。
「不稔性雄」とは、花の雄的要素の不稔性が原因で、自己授粉により繁殖できない植物を意味する。例としては、花粉が非機能的である、又は雄性繁殖器官、例えばタペータム構造的異常がある可能性がある。
「細胞質雄性不稔性」とは、細胞質型の遺伝により、その母から均一に遺伝する不稔性を意味する。
「核(又は遺伝子的)雄性不稔性」とは、劣性遺伝又は優性遺伝のいずれに依存してもよいが、核のDNAによりもたらされる、メンデル遺伝による不稔性を意味する。
「一遺伝子的雄性不稔性」とは、単一の遺伝子によりもたらされる雄性不稔性を意味する。
「多遺伝子的雄性不稔性」とは、複数の遺伝子によりもたらされる雄性不稔性を意味する。
「耐性」とは、病原又は有害生物にとって、類似する環境且つ圧力条件下で、感受性の高い変種と比較して、既定の病原又は有害生物及び/又はそれが引き起こす障害の増殖及び発展を制限する様々な能力を意味する。ただしこれらの変種は、病原又は有害生物の圧力が高い場合、病気のいくつかの症状又はいくつかの障害を発現する可能性がある。
「標準的又は高い耐性」とは、感受性の高い変種と比較して、通常の圧力条件下で既定の病原又は有害生物の増殖又は発展を強力に制限する様々な能力を意味する。ただし、これらの変種は、病原又は有害生物の圧力が高い場合、症状又は障害を発現することもある。
「中程度又は調整的な耐性」とは、既定の病原又は有害生物の増殖及び発展を制限するが、高い/標準的な耐性変種と比較すると、症状又は障害をより発現し得る能力を意味する。中程度の耐性変種は、類似する環境及び/又は病原又は有害生物にとっての圧力条件下で、感受性の高い変種で観察されたものより、重篤性の低い症状又は障害を示す。
「分子マーカー」とは、個体の全ゲノムにおいて確認され得る、及び注目の遺伝子を局在化させるために、又は親生物からのある特定の特徴が遺伝した個体であるかを検証するために使用できる、DNAの特定の断片を意味する。それはコード配列であってもそうでなくてもよい。遺伝的交配において、注目の遺伝子は、一般的に分子マーカーと連結した状態である。つまり、分子マーカーの検出とは、注目の遺伝子が存在する個体が、その遺伝子の配列を知る必要なく、セレクションできることを意味する。
核雄性不稔性は、その核のDNAから遺伝した雄性不稔性の、1又は複数の遺伝子により引き起こされ、この1又は複数の遺伝子は、優性でも劣性でもあり得る。
核雄性不稔性は、優性であっても劣性であってもよい。具体的には、本発明は雄性不稔性が優性の一遺伝子的である場合に関する。より具体的には、本発明は雄性不稔性が、上記記載の優性のMs7遺伝子により提供される場合に関する。
表現型的に「雌」親として使用される雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物、及び表現型的に「雄」親として使用される雄性稔性ラクツカ・サティバ植物を、互いに近接した状態で、閉鎖環境中で栽培するステップであって、2つの親の一方が、雄性不稔性以外の検出可能な表現型をそれに提供する遺伝子の同種接合体であるという追加的な特徴を有し、他方の親はこの遺伝子を保有しないものであるステップ、
植物の開花の際に、1m2当たり100匹以上の濃度で、好ましくは1m2当たり少なくとも250匹の濃度で、閉鎖環境へ導入する双翅目を用いて授粉するステップ、及び
雄性不稔性植物により作られる種子を収穫するステップ、
を含んでなる方法に関する。
使用する双翅目は好ましくは短角類(brachycera)であり、例えばシクロラファ・ブラキセラ(cyclorhapha brachycera)、より好ましくはイエバエ科(Muscidae)又はクロバエ科(Calliphoride)由来の短角類、例えばカリホラ・ボミタリア(Calliphora vomitaria)、カリホラ・エリトロセファラ(Calliphora erythrocephala)又はルシリア・カエサル(Lucilia Caesar)である。
同様に、閉鎖環境中での雄性不稔性植物の数が、雄性稔性植物の数より大きくなると、通常より良好な収率が得られる。閉鎖環境中の雄性不稔性植物の数は、例えば少なくとも200、及び雄性稔性植物の数は、例えば少なくとも1000である。
好ましくは、雌親として使用する植物のゲノムは、650〜700ヌクレオチドの、例えば655〜695、660〜690、665〜685、670〜680、673〜677ヌクレオチドの、又は674、675又は676ヌクレオチドの二本鎖DNA配列を含んでなり、ここで、各2つの5'末端は、配列「5' TGCGTTCCAC 3'」(配列番号1)から開始する。好ましい実施態様に従うと、「雌」親として使用する植物のゲノムは、図8に示すヌクレオチド配列(配列番号2)を含んでなるか、又は1〜10個の、好ましくは1〜5個又はより好ましくは1〜3個のヌクレオチドが他のものにより置換、削除又は付加される前記配列に由来する配列を含んでなる。
核雄性不稔性の優性遺伝子の異種接合体であるラクツカ・サティバ植物と、不稔性遺伝子を保有しない雄性稔性のラクツカ・サティバ植物との間で交配するステップ、
当該交配から得られる種子を栽培するステップ、及び
雄性稔性表現型を有する植物を除去するステップ、
を含んでなる方法により得ることができる。
「雌」親として以下に記載の種々の試行で使用される雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物は、Ms7不稔性遺伝子を保有した。当該植物は、INRA、USDA等の種々の研究組織から入手できるMs7遺伝子(X Girelle 94-9538-1)を保有する温室バターヘッドレタスの第5代戻し交配(BC5)由来であった。
第一の試行の環境としては、
Nacre/Cambria Dm18/R38栽培品種(クラスター2からのDm18耐性遺伝子及びクラスター4からのR38耐性遺伝子)由来のバターヘッドレタスとの、Ms7バターヘッドレタスの第3代戻し交配(BC3)由来の450個の温室バターヘッドレタスラクツカ・サティバ植物は、ブレミア・ラクツカエ品種24(Bl24)に感受性の高い組み合わせであり、これが「雌」親として使用され(その約半分は不稔性雄);及び
BRA Dm18/R37温室バターヘッド栽培品種(クラスター2からのDm18耐性遺伝子及びクラスター1からのR37)由来の100個のラクツカ・サティバ植物は、B124に対して耐性のある組み合わせであり、「雄」親として使用された。
この2つの遺伝的父はまさに同時に開花し、これは受精を可能な限り均一にできることを意味する。
「雄」親として使用される植物を、密封囲いの端に沿って2列に配置し、植物は20cmずつ間隔をあけ、及び
「雌」親として使用される植物を、「雄」植物の2列の間であって、そこから50cmの距離の点に、7列で配列し、植物は15cmずつ、且つ列は25cmずつ間隔をあけた。
Ms7遺伝子の優性性質のための、雄性稔性表現型を持つ雌親として使用される植物の精製(除去)のためのステップが必要であった。本ステップは、Ms7/ms7植物が花粉を持たず、Ms7/ms7(雄性不稔性)植物の花頭が、ms7/ms7植物(雄性稔性)のものより長期間開いた状態であるという事実を利用して、主に26週と27週の間で行った。
雌親として使用される450植物のうち、217は雄性不稔性であり、効率的に使用された。
「ウジ虫(maggots)」として知られる(キンバエ(bluebottle)又はニクバエ(blowflie)としても知られる)、カリホラ・ボミタリア及びカリホラ・エリトロセファラハエは、15〜20℃で取り扱い、及び
「ピンキーズ(pinkies)」として知られるラクツカ・カエサーハエ(キンバエ(greenbottle)としても知られる)は、20〜25℃で取り扱った。
授粉する虫は、28週〜31週の間に隔週で、ハエが1m2当たり300匹となる濃度で添加した。
自己授粉制御として使用される、雄性不稔性植物(「雌」親)及び雄性稔性植物(「雄」親)も、33週で収穫した。植物を乾燥させ、脱穀し、その後種子の洗浄を完了させるとともに残存した軽量ごみを除去するため、パルスエアのカラムを通し、重さと幅を調整した。
同様に第二の試行を、336m2の虫を密閉して封じる囲いの中で(長さ:56m、幅:6m、高さ:3m)、より大きなスケールで実施した。
Nacre/Cambria Dm18/R38栽培品種との、Ms7バターヘッドレタスの第4代戻し交配(BC4)由来の30000個の温室バターヘッドレタスラクツカ・サティバ植物、ブレミア(Bl24に感受性の高い組み合わせ)を、「雌」親として使用し(その約半分は雄性不稔性である);及び
B124に対して耐性のある、BRA Dm18/R37温室バターヘッド栽培品種由来の1500個の対応する(parallel)植物を、「雄」親として使用した。
「雄」親として使用される植物は4列に配置し、密封囲いの各端に沿って(80cmのところに)1列、中央に2列を(20cmの間隔をあけて)配置し、配置において植物はねじれており、15cmの間隔をあけ;及び
「雌」親として使用される植物を、稔性雄親の列の間にそこから65と70cmの距離の点に8列で配置し、植物は15cmずつ、列は25cmずつ間隔をあけた。
播種は12週目に、植え付けは16週目に行った。
雌親として使用される3000植物のうち、1250は雄性不稔性であり、効率的に使用された。
16のms7/ms7植物(雄性稔性)を保存したが、精製の間に、自己受精コントロールとして使用されるための、虫を通過させないようなネットで構成された、密封して封じられた囲いの中で自己受精した。
授粉する虫は、25週〜29週の間に毎週、ハエが1m2当たり1100匹となる濃度で添加した。
植物を乾燥させ、脱穀し、その後種子の洗浄を完了させるとともに残存した軽量ごみを除去するため、パルスエアのカラムを通し、重さと幅を調整した。
第一の試行では、217の雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物(雌親)から730グラムの種子、すなわち1植物当たり3.36グラムの収率で得られ、自己受精コントロールの15.30%の比率に相当した(雄親)。
第二の試行では、1170の雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物(雌親)から7.730kgの種子、すなわち植物あたり6.60グラムの収率で得られ、自己受精コントロールの2つ(「雄」親とms/ms雄性稔性「雌」親、精製の間保存され、虫密閉の下で受精した)の平均の50%の比率に相当した。
2つの試行では、F1雑種のTSW(1000種子質量)が、自己受精コントロールの30%以上であった。
第二の試行で得られた種子由来の植物は、B124に耐性であった。
異なる種類のバターヘッド及びバタビアのレタスを用い、(Ms7遺伝子を保有するラクツカ・サティバ植物と稔性ラクツカ・サティバ植物との間の戻し交配に由来する50%の雄性不稔性である)「雌」親として使用される8つのラクツカ・サティバ植物と、「雄」親として使用される4つの雄性稔性ラクツカ・サティバ植物を各々含有する、換気された温室に置いた、虫試験用の3.3m×1.1mケージ中で、6つの同様の試行を同時に開始した。
播種を22週目に、植え付けを27週目に行い、31週目の開花の兆候で雄性稔性「雌」植物から雄性不稔性を分類し、ハエを32、33及び34週の3週間にわたり1週間当たりのある量、すなわちハエ約100匹/m2を添加し、37週目に収穫を行った。
ケージ1: CHARLIN(68/12624)* CHARLIN (バターヘッド)
1種の雌性植物:9.20 g
1種の雄性植物:28.30 g
ケージ2:CHARLIN(BC/77)* CHARLIN (バターヘッド)
1種の雌性植物:5.45 g
1種の雄性植物:19.40 g
ケージ3:BRA 68/12588 (温室リンゴレタス)* BRA 68/12588
6種の雌性植物:
植物1:7.00 g
植物2:2.00 g
植物3:5.20 g
植物4:3.40 g
植物5:9.60 g
植物6:8.40 g
平均:5.9 g/植物
1種の雄性植物:34.40 g
ケージ4: BRA 68/12588 * BRA 68/12588
4種の雌性植物:
植物1:11.95 g
植物2:7.15 g
植物3:15.90 g
植物4:11.90 g
平均:11.25 g/植物
1種の雄性植物:29.00 g
ケージ5:BVA 68/12553 (温室バタビアレタス)* BVA 68/12553
5種の雌性植物:
植物1:.50 g
植物2:1.30 g
植物3:2.20 g
植物4:1.70 g
植物5:4.20 g
平均:3.30 g/植物
1種の雄性植物:3.60 g
ケージ6:BVA 68/12553 * BVA 68/12553
3種の雌性植物:
植物1:4.60 g
植物2:3.20 g
植物3:3.70 g
平均:3.80 g/植物
1種の雄性植物:23.40 g
「雌」親の産物の平均は、3.3g〜11.2g/植物であり、バタビア類型物(BVA 68/12553)は、約8.5g/植物のバターヘッド類型物(Charlin, BRA 68/12588)と比較して、かなり低い収率(約3.5g/植物)であり、当該類型物はその最終収率に寄与すると考えられる。
新規な作製試行を、開放地面上の換気された温室内に置いた、直径0.40mの測定用の虫小さな試験用ケージ中で行った。
播種を22週目で、再植え付けを25週目で行い、30週目の開花の兆候で雄性稔性植物から「雌」植物を分類し、31週目で植え付けし、ハエを32、33及び34週の3週間にわたり1週間当たりのある量、すなわちハエ約100匹/m2を添加し、35週目に収穫を行った。
バタビアレタス(BVA 68/12553)で得られた産物の平均は、自己受精コントロールの1.7g/植物に対して約1 g/植物であり、且つ温室バターヘッドレタス(Charlin)で得られた産物の平均は、約1 g/植物であり自己受精コントロールとほぼ同じであった点で、結果は満足のいくものであった。
2つの優性遺伝子、Dm3及びDm18であって、クラスター2に属し同じ遺伝子座に位置する品種24(B124)及び品種23(B123)の、ブレミア・ラクツカエ耐性用遺伝子を蓄積するF1雑種レタスは、上記記載の試行で記載された方法を用いて得た。
以下の5つの交配を行った。
06/30443/01 (MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-01) Dml8/R38 * Rex Dm3、
06/30443/10 (MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-10) Dml8/R38 * Rex Dm3、
06/30443/02 (MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-02) Dml8/R38 * Melina Dm3、
06/30443/03 (MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-03) Dml8/R38 * Melina Dm3、
06/30443/04 (MS7/21xNACRExDEVONIAxCAMBRIA-04) Dml8/R38 * Melina Dm3。
装置:
植物原料は、1植物当たり及び1品種当たり5ディスクの数で、1起源当たり10植物及び2つのブレミア・ラクツカエ品種で(Dm18/R38蓄積を攻撃し、且つDm3がそれに対する耐性を与えるB124、及びDm3/R38蓄積を攻撃し、且つDm18がそれに対する耐性を与えるB123)、1.5cm直径の葉ディスクからなる。すなわち、総数で80の植物を2つの品種で試験した。
葉ディスクに、ブレミアB123及びB124を独立に伴ったスポロシストを噴霧することにより植菌を行った。
1植物当たり5つの葉ディスクを除去し、2重の厚みの湿ったブロット紙の上に配列させた。各皿には、6列の試験するディスク及び1列の感受性の高いコントロールを入れた。
2/植菌:
6皿の葉ディスクを植菌するために必要な植菌材料の量は11mlであった。100 mlの脱塩水に4滴のTween 80を使用することにより、Tween 80溶液を調製した。植菌材料の容積のための抽出溶液の量は、100mlの植菌材料当たり5 mlのTweenストック溶液であった。植菌材料は、5%のTween 80ストック溶液を補充した水道水中で、スポロシストを分離することにより作製した。スポロシストを、108胞子/ml近傍のスポロシスト濃度を得るため、1植物/mlの植菌材料量で除去した。250mlビーカーに、ガーゼを通して溶液を通過させて濾過を行った。
3/噴霧:
植菌は、葉ディスクを採取した日に行った。植菌材料溶液の容積を測定し、その後配置した皿に植菌した。植菌材料を、各ディスクの表面全体に、微細な液滴で均一に噴霧した。この皿を密封し、15℃で、日光14時間、夜間10時間の単位で7日間インキュベートした。
植菌の結果を、以下の表6〜13に示す(S=感受性、R=耐性)。種々の交配から得られる雑種は2つの品種B123及びB124に耐性であり、クラスター2由来の2つの遺伝子Dm18及びDm3の存在を示すものである。
2つの分子マーカーを用いることで、ラクツカ・サティバにおいて、優性であり且つ2つのブレミア・ラクツカエ種に耐性である、2つの密接に関連した遺伝子(同じ遺伝子座に位置する)の蓄積を証明することができる。
1/植物原料:
植物原料は、1植物当たり1ディスクで、1.5cm直径の葉ディスクからなる。遺伝子型当たり5〜10植物(すなわち総数で50植物)由来のDNAを、CTAB/クロロホルム抽出により得て、その後5ng/μlの濃度で、TE 0.1×溶液中で懸濁として溶解させた。
Maisonneuve等による[10]及びKuang等による[11]で報告された、SCW09及びB1マーカーを前記50植物の遺伝子型決定のために使用した(表14)。PCR条件は表15に記載する。
SCW09及びB1のPCRサイクルはそれぞれ以下の通りである:
94℃/30秒−94℃/1分、60℃/1分、72℃/2分;40サイクル−72℃/5分−4℃;
94℃/30秒−94℃/1分、63℃/1分、72℃/2分;40サイクル−72℃/5分−8℃。
SCW09マーカーは、移行ステップの前にTaqI酵素での酵素的消化を受けた(バッファ1×、BSA1×及びTaqI 1U)。電気泳動を、2%(SCW09)又は1.5%(B1)のアガロースゲルを用い、TBE1×バッファ中で、1時間(B1)又は1時間30分(SCW09)、定電圧220Vで泳動した。電気泳動プロファイルは、UVランプ下、エチジウムブロミド(ETB)での染色により明らかになった。
結果を表16並びに図4及び5に示す。REX及びMELINAの遺伝子型は、Dm18−/Dm18−且つDm3+プロファイルであった。06/30443遺伝子型はDm18+/Dm18+且つDm3−プロファイルであった。親(REX又はMELINA)の一方又は他方との交配の組は、Dm18+/Dm18−及びDm3+プロファイル、すなわちDm18及びDm3に耐性であった。
以下に記載のラクツカ・サティバ(レタス)中の雄性不稔性Ms7に関連する分子マーカーを得るための方法を、指示する目的で提供する。
1−レタス(ラクツカ・サティバ)中で核雄性不稔性Ms7と関連するマーカーの開発用の群の構成
Ms7雄性不稔性であるレタス用の異なる類型の2つの群を、戻し交配で作製した。結果として得られた、200植物の反復第4代群(BC4)の2つを雄性不稔性表現型に対応する「生花粉の不存在」形質で表現型検査を行った。2つの表現型グループを、雄性稔性(F)又は雄性不稔性(S)として1:1の比率で同定した。
この比率は、Ms7遺伝子座で異種接合体の親により提供される、雄性不稔性の優性一遺伝子的性質を裏付けるものであった。
DNAは、修正CTABプロトコル(Tomas等, 1989 [20]; Doyle 等, 1990 [15]; Edwards 等, 1991 [16])を用い、新鮮な幼葉を使用して抽出した。
1.5ml管を用いて得た新鮮な葉ディスクを、500μlの抽出バッファ(Tris−HCl 0.1M、NaCl 0.7 M、EDTA 10 mM、CTAB 1%、βメルカプトエタノール 1%)中に置いた。この置いた原料を65℃で1時間インキュベートし、インキュベーション中に2〜3回反転させて混合した。
その後、200μlの24:1のクロロホルム:イソアミル溶液を添加し、反転させて混合した。6000rpmで10分間、20℃で遠心分離後に、400μlの上澄みを回収し、400μlのイソプロパノールと混合した。
−20℃で1時間後、混合物を6000rpmで10分間、4℃で遠心分離した。管の中身を出した。管底に付着したDNA残基は12時間空気中で乾燥させた。
このDNAを、200μlのTE 0.1×溶液(tris−HCl 1 mM、EDTA 0.1 mM)中で懸濁として溶解させた。終濃度を、1%アガロースゲル上で、Lambda DNA-HindIII消化アッセイにより測定した。
雄性不稔性に関連する分子マーカーMs7を同定する目的で、Operon Technologies Inc.(Huntsville, AL 35805、米国)製のRAPD(登録商標)10merキット及びBuIk Segregant Analysis法(Michelmore 等, 1991 [17] 及び Paran 等, 1991 [18])を使用した。
上記記載の2つのBC4群の表現型検査から開始するため、10植物の混合物の2つのサンプルを、2つのグループ「雄性不稔性」及び「雄性稔性」用として作製した。OPA-01〜OPBH-20の1200個のプライマー(Operon Biotechnologies Inc. (Huntsville, AL 35805、米国))を、William 等, 1990 [22] 及び Welsh 等, 1990 [21]により報告されたRAPD技術を用いて、1群当たり4サンプルを試験した。「雄性不稔性」サンプルに特異的なバンドを表し且つ読みやすい電気泳動プロファイルを有するプライマーを選択した。
増幅産物を、2%アガロースゲルで、以下の電気泳動条件下で分離した:移動バッファTBE 1×(tris−ホウ酸塩−EDTA)、190Vで2時間15分。
RAPD BA05-675マーカーの感受性及び特異性の計算からは、類型によって異なる値が得られ、それぞれ平均値は96%及び94%であった(表17及び18を参照)。
上記のms7のために解体されたBC4の群由来の200植物を基に、Ms7に関連するBA05-675マーカーの遺伝子マッピング(William 等, 1993 [23])を、JoinMap(登録商標)4 (Stam 等, 1996 [19]) 及び CarteBlanche (Keygene N P, P O Box 216, 6700 A E Wageningen, The Netherlands)を用いて実施した。優性のBA05-675マーカーについて、メンデル型1:1比率のゼロ仮定を、X2統計的検定で確認した(検定はp > 0.05で有意性がない)(表19を参照)。3.0以上の可能性ある比率(又はLODスコア)での結合試験により、Ms7の1.8 cMマーカーをマップできた(図6)。
アガロースゲル電気泳動プロファイルから、675bpのDNA断片を単離し、TEバッファ(10 mM tris-HCl、1 mM EDTA)中で懸濁物として溶解させ、その後上記のPCR条件下で再増幅させた。この再増幅した単離断片を、市販のPCR(登録商標)4-TOPO(登録商標)キット(Invitrogen, Carlsbad, California 92008, 米国)を用いてクローン化した。クローニングの確認後、DNA抽出(Midiprep system)は、Promegaカラム精製キット((Madison, WI, 米国)を用いて行った。
75 ng/μlに濃縮した精製クローンを、Cogenics (38944 Meylan, フランス)により配列決定した。すなわち、図8に記載のBA05-675マーカーの配列が得られた(配列番号2)。
本発明者等が実施した研究により、RAPDマーカー、BA05-675(配列番号2)の特徴づけが可能となった。その配列は、図8に示され、Ms7から1.8cMの距離で(図7)、且つレタスの類型について個別にそれぞれ平均96%及び94%の感受性及び特異性を有する(表18)。2つのBC4群由来の個別の植物でのこのマーカーの評価から、不稔性の雄性植物を同定するための平均予測値(Altman 1994a [13])が97%近傍であるという推定ができる。
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Claims (47)
- 雑種ラクツカ・サティバ(Lactuca sativa)種子であって、それが
雄性不稔性遺伝子型を有するとともに、
検出可能な表現型を当該種子に由来する植物に提供する、少なくとも1つの特徴的遺伝子の異種接合体であること、
を特徴とする種子。 - 前記雄性不稔性遺伝子型が、少なくとも1の核遺伝子を含有し、且つ前記種子が雄性不稔性の原因である1又は複数の遺伝子の異種接合体である、請求項1に記載の種子。
- 前記雄性不稔性が一遺伝子的である、請求項2に記載の種子。
- 前記雄性不稔性の遺伝子が優性である、請求項3に記載の種子。
- 前記雄性不稔性遺伝子型がMs7不稔性遺伝子により提供される、請求項1に記載の種子。
- ゲノムが、650〜700ヌクレオチドの二本鎖DNA配列を含んでなり、ここでその2本の鎖の各々の5'末端が配列 5' TGCGTTCCAC 3'(配列番号1)で開始することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の種子。
- 前記表現型が農業で注目の表現型である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の種子。
- 前記表現型が、ウイルス、細菌、虫又は真菌による感染に対して、標準的又は中程度に耐性である遺伝子により提供される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の種子。
- 前記表現型が、
以下の真菌:ブレミア・ラクツカエ(Bremia lactucae)、フサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、スクレロティニア・マイナー(Sclerotinia minor)もしくはスクレロトラム(sclerotorum)、ボトリチス・シネレア(Botrytis cinerea)、リゾクトニア・ソラニ(Rhizictonia solani)、ミクロドチウム・パナットニアナム(Microdochium panattonianum)、ベルチシリウム・ダーリエ(Verticiulium dahliae)、エリシフェ・チコセアラム(Erysiphe chicocearum)又はピチウム・トラケイフィルム(Pithium tracheiphilum)の1種に対して、以下の虫:ナソノビア・リビスニグリ(Nasonovia ribisnigri)、マイザス・ペルシカエ(Myzus persicae)、マクロシファム・エウフォルビア(Macrosiphum euphorbia)、ネマトデス・プラチレクス(Nematodes pratylenchus)又はネコブ線虫(meloidogyne)、ハモグリバエ(leafminers)リリオマイザ・フイドブレンシス(liriomyza huidobrensis)又はペンフィガス・ブサリウス(Pemphigus busarius)の1種に対して、以下の細菌:シュードモナス(pseudomonas)、キサントモナス(xanthomonas)又はリゾモナス(rhizomonas)の1種に対して、又は以下のウイルス:LMV、TSWV、「ビッグベイン(Big vein)」、TBSV、LNSV、TuMV、CMV又はBWYVの1種に対する、標準的又は中程度の耐性である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の種子。 - 前記種子が、異種接合状態で、標準的又は中程度の耐性である、第二の特徴的遺伝子を提示する、請求項8又は9に記載の種子。
- 前記標準的又は中程度の耐性遺伝子が、以下の、ブレミア(bremia)耐性遺伝子:Dm10、R17、Dm5/Dm8、R36/R37(クラスター1)、Dm1、Dm2、Dm3、Dm6、Dm14、Dml5、Dml6、Dml8 (クラスター2)、又はDm4、Dm7、Dm11、R38 (クラスター4);又はTuMV耐性のTu遺伝子(クラスター1);ナソノビア(Nasonovia)耐性のNr遺伝子(クラスター2);又はLMV耐性の遺伝子mol1、mol2(クラスター4)から選択される、請求項8又は10に記載の種子。
- 雑種ラクツカ・サティバ植物であって、それが
雄性不稔性遺伝子型の異種接合体であるとともに、
検出可能な表現型を提供する、少なくとも1つの特徴的遺伝子の異種接合体であること、
を特徴とする植物。 - 前記雄性不稔性遺伝子型が核由来であり、且つ前記植物が雄性不稔性の原因である1又は複数の遺伝子の異種接合体である、請求項12に記載の植物。
- 前記雄性不稔性が一遺伝子的である、請求項13に記載の植物。
- 前記雄性不稔性の遺伝子が優性である、請求項14に記載の植物。
- 前記雄性不稔性遺伝子型が不稔性遺伝子Ms7により提供される、請求項12に記載の遺伝子。
- 雑種ラクツカ・サティバ植物由来の細胞であって、それが
雄性不稔性遺伝子型の異種接合体であるとともに、
植物中で検出可能な表現型を提供する、少なくとも1つの特徴的遺伝子の異種接合体であること、
を特徴とする細胞。 - 前記雄性不稔遺伝型が核由来であり、且つ前記植物が雄性不稔性の原因である1又は複数の遺伝子の異種接合体である、請求項17に記載の細胞。
- 前記雄性不稔性が一遺伝子的である、請求項18に記載の細胞。
- 前記雄性不稔性遺伝子が優性である、請求項19に記載の細胞。
- 前記雄性不稔性遺伝子型が不稔性遺伝子Ms7により提供される、請求項17に記載の細胞。
- 少なくとも105個の種子、好ましくは少なくとも106個の種子を含んでなる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の種子の集団。
- 少なくとも107種子を含んでなる、請求項22に記載の集団。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の種子を少なくとも40%含んでなる、ラクツカ・サティバ種子の集団。
- その他の種子が雄性不稔性遺伝子を含まない、請求項24に記載の集団。
- 雄性稔性植物による雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物の閉鎖環境中での授粉を実施するための、1m2当たり100匹以上、又は1m3当たり25匹以上の濃度での双翅目の虫の使用。
- 前記双翅目が、1m2当たり少なくとも250匹、又は1m3当たり少なくとも75匹の濃度で存在する、請求項26に記載の使用。
- 雑種ラクツカ・サティバ植物を得るための、請求項26に記載の使用。
- 前記雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物が、単一の優性遺伝子により、好ましくはMs7雄性不稔性遺伝子によりもたらされる雄性不稔性を有する、請求項26〜28のいずれか1項に記載の使用。
- 前記雄性稔性植物がまた、ラクツカ・サティバ植物、好ましくは栽培品種である、請求項26〜29のいずれか1項に記載の使用。
- 雑種ラクツカ・サティバ種子を得るための方法であって、
表現型的に「雌」親として使用される雄性不稔性ラクツカ・サティバ植物、及び表現型的に「雄」親として使用される雄性稔性ラクツカ・サティバ植物を、互いに近接した状態で、閉鎖環境中で栽培するステップであって、2つの親の一方が、雄性不稔性以外の検出可能な表現型をそれに提供する遺伝子の同種接合体であるという追加的な特徴を有し、他方の親はこの遺伝子を保有しないものであるステップ、
植物の開花の際に、1m2当たり100匹以上又は1m3当たり25匹以上の濃度で、好ましくは1m2当たり少なくとも250匹の又は1m3当たり少なくとも75匹の濃度で、閉鎖環境へ導入する双翅目を用いて授粉するステップ、及び
雄性不稔性植物により作られる種子を収穫するステップ
を含んでなる方法。 - 第二の親も、他方の親が有しない、雄性不稔性以外の検出可能な表現型をそれに提供する少なくとも1の遺伝子の異種接合体である、請求項31に記載の方法。
- 前記導入する双翅目の濃度が、1m2当たり400匹以上、好ましくは1m2当たり50匹以上である、請求項31又は32に記載の方法。
- 前記双翅目を蛹の状態で導入する、請求項31〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記閉鎖環境が虫に対して密閉されている、請求項31〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記双翅目が、短角類(ブラキセラ、brachycera)、好ましくはシクロラファ・ブラキセラ(cyclorhapha brachycera)である、請求項31〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記双翅目がクロバエ(Calliphorides)又はイヌバエ(Muscidae)ファミリーに属する、請求項36に記載の方法。
- 前記双翅目が、カリホラ・ボミタリア(Calliphora vomitaria)、カリホラ・エリトロセファラ(Calliphora erythrocephala)又はルシリア・カエサル(Lucilia Caesar)である、請求項37に記載の方法。
- 閉鎖環境中で、雄性不稔性植物の数が雄性稔性植物の数より多い、請求項31〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 閉鎖環境中で、雄性不稔性植物の数が少なくとも2000であり、雄性稔性植物の数が少なくとも1000である、請求項31〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 双翅目の導入を、少なくとも1週間に1度、3〜4週間にわたって繰り返す、請求項31〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 雌親として使用される植物の雄性不稔性が一遺伝子起源、優性且つ核性であるとともに、雌親として使用される植物が以下の、
優性の核雄性不稔性遺伝子の異種接合体であるラクツカ・サティバ植物と、不稔性遺伝子を保有しない雄性稔性のラクツカ・サティバ植物との間で交配するステップ、
前記交配から得られる種子を栽培するステップ、及び
雄性稔性表現型を有する植物を除去するステップ、
を含んでなる方法により得られる、
請求項31〜41のいずれか1項に記載の方法。 - 前記雄性稔性表現型を有する植物を除去するステップが、植物の各サンプルにおいて、雄性不稔優性遺伝子に特異的な分子マーカーの不存在を検出することにより実施される、請求項42に記載の方法。
- 雌親として使用される植物の雄性不稔性がMs7遺伝子により提供される、請求項42又は43に記載の方法。
- 雌親として使用される植物のゲノムが、650〜700ヌクレオチドの二本鎖DNA配列を含んでなり、ここでその2本の鎖の各々の5'末端が配列 5' TGCGTTCCAC 3'(配列番号1)で開始する、請求項31〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも105個の種子、好ましくは106個の種子及びより好ましくは107個の種子を含んでなる、請求項31〜45のいずれか1項に記載の方法を使用して得られる種子の集団。
- TSW(1000種子質量、thousand seed weight)が、「雄」親として使用される雄性稔性ラクツカ・サティバ植物の自己受精により得られる植物のTSWより、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%及びより好ましくは少なくとも30%大きい、請求項46に記載の集団。
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