CN101768577A - 蛋清中溶菌酶的提取及蛋清蛋白的综合利用 - Google Patents

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孙维军
孟庆文
王超
孙京新
李兆顺
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Abstract

本发明涉及一种从禽蛋(鸡蛋、鸭蛋或鹅蛋)中提取溶菌酶的新方法，通过酸盐(盐酸或乳酸、氯化钾)控温组合法酶提取分离、冷却、离心、调pH值、中空纤维超滤膜法酶浓缩提纯、喷雾干燥法等一系列工艺联合制取蛋清溶菌酶。该工艺简单可行，操作方便，适合于工业化生产，既能保证产品质量，又能降低生产成本。提取后剩余的蛋清蛋白既可以真空干燥制成蛋白片又可利用细菌中性蛋白酶水解法制备成蛋清活性肽粗品。

Description

蛋清中溶菌酶的提取及蛋清蛋白的综合利用
技术领域
本发明是关于一种溶菌酶的提取方法，更具体的说，是关于一种从蛋清中提取溶菌酶的方法，以及溶菌酶提取后剩余蛋清蛋白的综合利用如干燥制成蛋白片或采用酶法降解制取活性肽。
背景技术
溶菌酶(lysozyme)，又称胞壁质酶，是由129个氨基酸构成的单纯蛋白质，化学性质非常稳定，pH值在1.2～11.3范围内剧烈变化时，其结构几乎不变；酸性环境中对热的稳定性也很强，pH4～7，100℃处理1分钟仍保持原酶活性。溶菌酶的研究和应用目前在我国尚处于起步阶段，主要功能是分解细菌细胞壁，使细菌溶胀破裂，对大多数革兰氏阳性菌及阴性菌均有溶菌作用，在食品、医疗及生物工程等方面具有广泛的应用。
目前实际应用的、业已商品化的大多是鸡蛋清溶菌酶。鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的3.4％～3.5％，作为溶菌酶类的典型代表，是目前重点的研究对象，也是了解最清楚的溶菌酶之一。
在目前已公开的文献中，如公开号为CN1475567A的专利文献，一般是采用将蛋清用树脂吸附，然后再用盐溶液洗脱，接着进行透析、盐析、干燥的方法来制备溶菌酶能得到较高产率的溶菌酶，但同时蛋清中的大部分蛋白质被破坏，致使无法进行蛋清蛋白的后续加工应用，并且溶菌酶干燥的方法大多是真空干燥或冷冻干燥，不仅干燥时间长，而且干燥品的活性受影响较大，一般均在6000个单位/mg左右，且干燥后所得到的溶菌酶产品非均匀粉末状，不利于做成制剂。
本研究充分利用溶菌酶的特点，采用控制温度75℃，加食品级盐酸(2％)或乳酸(6％)，加氯化钾量4％的最优化分离工艺将溶菌酶分离，之后利用超滤浓缩到原体积的1/8～1/9，达到理想的脱盐率，最后经80～85℃的进风温度喷雾干燥得干制品。
发明内容
本发明的目的是提供一种优化的从蛋清中提取溶菌酶的方法，该工艺简单可行，操作方便，适合于工业化生产，既能保证产品质量，又能降低生产成本。提取后剩余的蛋清蛋白既可以干燥制成蛋白片又可利用中性蛋白酶水解法制备成活性多肽。
本发明的技术方案
1.蛋清中溶菌酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)工艺流程：
Figure GSA00000045546800021
(2)具体实施步骤：
①蛋清液的制备：蛋清以打蛋机慢速搅打(10～20r/min)均匀且不发泡(加适量0.1％～0.2％色拉油)为度。
②酶提取(酸盐控温组合法)：将一定量的食品级盐酸(2％)或乳酸(6％)、氯化钾(4％)溶于与蛋清相等体积的纯净水中，然后在75℃温度下与蛋清混合均匀。整个混合过程控制在10min内完成。
③冷却及离心：上述混合液混匀后保温10min，再迅速冷却到25℃以下。4000r/min离心6～8min。上清液用食品级NaOH调pH到中性。
④超滤(中空纤维超滤膜法)：采用截留量为11000的中空纤维超滤膜，控制氮气压力为0.20MPa，进行超滤脱盐及浓缩。浓缩到原始体积的1/8～1/9左右时，尚能保持11.0～12.0L/min·m2的超滤速度和89％～90％的脱盐率。
⑤喷雾干燥：以80～85℃进风温度进行喷雾干燥，之后测定产品的水分含量及活力。其水分含量控制在4.3％～4.8％之间，产品活力可达10000u/mg。
2.提取后剩余的蛋清蛋白的综合利用
(1)提取后剩余的蛋清蛋白于45～55℃普通干燥烘干或真空干燥(真空度0.08～0.10MPa)制成成品蛋白片(水分含量5％以下)。
(2)将提取后剩余的蛋清蛋白利用细菌中性蛋白酶水解法制备活性多肽酶解制备活性多肽工艺：
提取后剩余的蛋清蛋白→加入一定量的纯净水定量(底物浓度为60％～70％)→调pH值至6.5～7.0→加入一定量的细菌中性蛋白酶(1.5％～2.0％，酶活10万u/g)→一定范围温度水解(45～50℃)一定的时间(5～6h)→沸水浴15min灭活酶→5000r/min离心20min弃去沉淀→取上清液(液氨基态氮含量达到1100～1200mg/kg)→冷冻干燥→蛋清活性肽粗品
本发明具有以下优点：
1.2％的食品级盐酸或6％的乳酸的添加量既不会破坏溶菌酶，又便于杂蛋白的沉淀，使溶菌酶得到分离纯化。
2.溶于纯净水中的食品级盐酸或乳酸、氯化钾，与蛋清在75℃温度下混匀不仅有利于杂蛋白变性、脱除，而且还能保持较高的产品活力。
3.以80～85℃进风温度进行喷雾干燥得干制品，既能保证产品质量，又能降低生产成本。
4.采用这种方法从蛋清中提取溶菌酶不仅得到了较高产率和纯度的溶菌酶，而且提取后剩余的蛋清蛋白既可以干燥制成蛋白片，又可采用中性蛋白酶水解法制备活性多肽，可谓一举多得。
具体实施方式
下面举例对本发明做更详尽的描述。
实例一
(1)溶菌酶的提取
用禽蛋(鸡蛋、鸭蛋或鹅蛋)分离器将蛋黄与蛋清分开，机械搅打蛋清以均匀且不发泡为度。将2％的食品级盐酸或6％的乳酸、4％氯化钾溶于蛋清相等体积的纯净水中，然后在75℃下与蛋清混合均匀。整个混合过程控制在10min内完成。上述混合液混匀后保温10min，再迅速冷却到25℃以下。4000r/min离心7min。上清液用食品级NaOH调pH到中性。采用截留量为11000的中空纤维超滤膜，控制氮气压力为0.20MPa，进行超滤脱盐及浓缩。浓缩至原始体积的1/8时，尚能保持12.0L/min·m2的超滤速度和89％的脱盐率。以82℃的进风温度进行喷雾干燥，之后测定产品的水分含量及活力。其含水量为4.6％，溶菌酶活力高达10009u/mg。
(2)提取后剩余的蛋清蛋白的综合利用
①提取后剩余的蛋清蛋白50℃普通干燥烘干或真空干燥(真空度0.09MPa)制成成品蛋白片(水分含量5％以下)。
②将提取后剩余的蛋清蛋白利用细菌中性蛋白酶水解法制备活性多肽。
提取后剩余的蛋清蛋白加入一定量的纯净水定量使其底物浓度为65％，调pH值至7.5加入一定量的细菌中性蛋白酶(1.6％，酶活10万u/g)，48℃恒温水解5.5h，沸水浴15min灭活酶后5000r/min离心20min弃去沉淀，取上清液测得液氨基态氮含量达到1138mg/kg，冷冻干燥得蛋清活性肽粗品。

Claims (6)

1.蛋清中溶菌酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)蛋清液的制备：蛋清以打蛋机慢速搅打(10～20r/min)均匀且不发泡(加适量0.1％～0.2％色拉油)为度。
(2)酶提取(酸盐控温组合法)：将一定量的食品级盐酸(2％)或乳酸(6％)、氯化钾(4％)溶于与蛋清相等体积的纯净水中，然后在75℃温度下与蛋清混合均匀。整个混合过程控制在10min内完成。
(3)冷却及离心：上述混合液混匀后保温10min，再迅速冷却到25℃以下。4000r/min离心6～8min。上清液用食品级NaOH调pH到中性。
(4)超滤(中空纤维超滤膜法)：采用截留量为11000的中空纤维超滤膜，控制氮气压力为0.20MPa，进行超滤脱盐及浓缩。浓缩到原始体积的1/8～1/9左右时，尚能保持11.0～12.0L/min·m2的超滤速度和89％～90％的脱盐率。
(5)喷雾干燥：以80～85℃进风温度进行喷雾干燥，之后测定产品的水分含量及活力。其水分含量控制在4.3％～4.8％之间，产品活力可达10000u/mg。
2.根据权利要求1所述的蛋清溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所加食品级盐酸的浓度为2％或乳酸的浓度为6％、氯化钾的浓度为4％、与蛋清的混合温度为75℃。
3.根据权利要求1所述的蛋清溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中浓缩液的体积浓缩至原始体积的1/8～1/9。
4.根据权利要求1所述的蛋清溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中进行喷雾干燥的进风温度应控制在80～85℃。
5.提取后剩余的蛋清蛋白的综合利用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取后剩余的蛋清蛋白于45～55℃普通干燥烘干或真空干燥(真空度0.08～0.10MPa))制成成品蛋白片。
(2)将提取后剩余的蛋清蛋白利用细菌中性蛋白酶水解法制备活性肽。
酶解制备活性肽工艺：
提取后剩余的蛋清蛋白→加入一定量的纯净水定量(底物浓度为60％～70％)→调pH值至6.5～7.0→加入一定量的细菌中性蛋白酶(1.5％～2.0％，酶活10万u/g)→一定范围温度水解(45～50℃)一定的时间(5～6h)→沸水浴15min灭活酶→5000r/min离心20min弃去沉淀→取上清液(液氨基态氮含量达到1100～1200mg/kg)→冷冻干燥→蛋清活性肽粗品。
6.根据权利要求5所述的提取后剩余的蛋清蛋白的综合利用，其特征在于，所述步骤(1)提取后剩余的蛋清蛋白的普通干燥烘干温度为45～55℃，真空干燥真空度为0.08～0.10MPa。
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