CN101762651B

CN101762651B - 一种测定阿巴芬净含量和杂质的高效液相色谱方法

Info

Publication number: CN101762651B
Application number: CN 200810233325
Authority: CN
Inventors: 易中宏; 付晓泰; 罗杰; 林蒙; 樊斌
Original assignee: Chongqing Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Chongqing Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: CN101762651A

Abstract

本发明为一种高效液相色谱(HPLC)法分离测定阿巴芬净(Abafungin)及其制剂的含量和杂质的方法，涉及医药技术领域。其技术方案为样品用适当预处理方法制备成供试品溶液，以乙腈-甲醇-缓冲液为流动相，在十八烷基硅烷键合硅胶柱上将主成分阿巴芬净和有关的杂质进行分离，用紫外检测器或质谱检测器进行检测。此方法可以有效地分离测定阿巴芬净及其制剂中的杂质，特别是可将阿巴芬净与几种类似物杂质分离，并可准确测定阿巴芬净及其制剂的含量。该方法可用于控制阿巴芬净及其制剂的质量，方法专属性强，准确度高，操作简便。

Description

一种测定阿巴芬净含量和杂质的高效液相色谱方法

技术领域

本发明属分析化学领域，涉及阿巴芬净与其杂质的分离测定。具体涉及色谱柱和流动相的优化条件，从而实现用高效液相色谱(HPLC)法测定阿巴芬净原料或其制剂中阿巴芬净的含量和杂质，达到控制阿巴芬净原料药及其制剂质量的目的。

背景技术

阿巴芬净是氨基噻唑类抗真菌药物，它的适应症包括指(趾)甲真菌病、阴道念珠菌病、外阴阴道炎(特别是在细菌卷入时)，各种皮肤细菌性皮炎和某些可能的痤疮。其结构式为：

化学名为N-[4-[2-(2，4-二甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氢-2-嘧啶胺。在合成该化合物的过程中，起始原料2，4-二甲酚中含有少量的邻甲酚、对甲酚、2，6-二甲酚、3，5-二甲酚，参与反应最终成为反应副产物(即通常药品质量控制中的杂质)，这些反应副产物的性质与阿巴芬净极为相似，分离难度大，质量难以控制，可能会由于去除不完全而影响药物的纯度和质量。阿巴芬净合成过程中由起始原料引入的反应副产物主要有四个，分别是N-[4-[2-(2-甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氢-2-嘧啶胺(简称：杂质A)，N-[4-[2-(4-甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氢-2-嘧啶胺(简称：杂质B)，N-[4-[2-(2，6-二甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氢-2-嘧啶胺(简称：杂质C)，N-[4-[2-(3，5-二甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氢-2-嘧啶胺(简称：杂质D)；反应过程中在强碱作用下醚键断裂生成少量N-[4-(2-羟基-苯基)-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氢-2-嘧啶胺(简称：杂质E)。它们的结构式分别为

杂质A 杂质B

杂质C 杂质D

杂质E

因此，实现阿巴芬净及反应副产物的有效分离在阿巴芬净的合成和制剂过程的质量控制方面具有重要的现实意义。

在分析方法的研究过程中，曾试用Inertsil ODS-2、Inertsil ODS-3、ZORBAX SB-C18、EclipseXDB-C18等色谱柱，选择了不同的缓冲溶液体系，但阿巴芬净的峰形很差(峰对称因子均小于0.5)，且阿巴芬净与反应副产物(杂质C、杂质D)难以有效分离。经反复试验发现，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(ZORBAX Extend C18或Crest Premium C18，250mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈-甲醇-二乙胺缓冲溶液(1％，V/V，磷酸调节pH至7.5)＝50∶25∶25为流动相，可以将阿巴芬净及其杂质进行有效分离，从而可以准确控制阿巴芬净原料药及制剂的质量。本发明的方法能简便、快速、准确地分析阿巴芬净的纯度和含量并能有效的控制其杂质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离测定阿巴芬净或其杂质的高效液相色谱方法，从而实现对阿巴芬净原料药及制剂的质量控制。

本发明的一种测定阿巴芬净或其制剂中杂质和含量的高效液相色谱方法，包括将含阿巴芬净的供试品溶液，注入到色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱的色谱仪中，进行分离检测阿巴芬净的含量或其有关的杂质，其中，流动相为有机溶剂和缓冲溶液的混合物，检测器为紫外检测器或质谱检测器。

在上述的流动相中，有机溶剂与缓冲溶液的体积比为60∶40～85∶15，优选80∶20～65∶35，最优选75∶25；其中，所述的有机溶剂为乙腈、甲醇或乙腈与甲醇的混合溶液，优选乙腈与甲醇的混合溶液，其体积比为4∶1～1∶3，优选体积比为2∶1；所述的缓冲液由碱性物质和酸性物质组成，其中：碱性物质为三乙胺、二乙胺或其混合物，优选二乙胺；酸性物质为磷酸。所说的缓冲液，当碱性物质分别为三乙胺、二乙胺时，其缓冲液分别称为三乙胺缓冲液和二乙胺缓冲液，其中，二乙胺缓冲液的浓度为0.1％～2％(V/V)，优选1％(V/V)，缓冲液的pH值为6.0～9.0，优选pH值为7.0～8.0，更优选pH值为7.5。

本发明所述的用高效液相色谱法分离测定阿巴芬净及其制剂的含量和杂质的方法，优选的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱(ZORBAX Extend C18或Crest Premium C18，250mm×4.6mm，5μm)，更优选的色谱柱为ZORBAX Extend C18或Crest Premium C18柱。

上述所说的液相色谱法是指高效液相色谱法或是高效液相色谱法与质谱法联合应用。

在具体实施方案中，所述的本发明的液相色谱方法，包括将含阿巴芬净的供试品溶液，注入到色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱仪中，进行分离检测阿巴芬净的含量或其有关的杂质，流动相为乙腈∶甲醇∶二乙胺缓冲溶液的混合溶液，其比值为50∶25∶25，缓冲液为含二乙胺的水溶液，二乙胺浓度为1％(V/V)，用磷酸调节pH至7.5。

本发明的方法，用于适用于阿巴芬净的原料药的分离测定，也适用于含有阿巴芬净的组合物如制剂中阿巴芬净或其有关物质(杂质)的分离测定，特别是与阿巴芬净结构相似的杂质的分离，如N-[4-[2-(2-甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氢-2-嘧啶胺(杂质A)，N-[4-[2-(4-甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氢-2-嘧啶胺(杂质B)，N-[4-[2-(2，6-二甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氢-2-嘧啶胺(杂质C)，N-[4-[2-(3，5-二甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氢-2-嘧啶胺(杂质D)。

上述本发明的方法，还进一步包括以下过程：

(1)配制流动相；取乙腈或/和甲醇与二乙胺缓冲液按一定体积比混合而得，用磷酸调pH范围6.0～9.0，优选pH值为7.5；

(2)取阿巴芬净样品适量，用甲醇溶解样品并用流动相稀释制成每1mL中含阿巴芬净0.05～5.0mg的供试品溶液，优选0.2mg/ml；若为含阿巴芬净制剂样品，则用相应的样品预处理方法制备成每1mL中含阿巴芬净0.05～5.0mg供试品溶液，优选0.2mg/ml。

(3)设置流动相流速为0.5～2.0ml/min，优选为1.0mL/min。检测波长为220～250nm，优选为240nm；柱温为室温至40℃，优选室温。

(4)取供试品溶液5～50μL注入液相色谱仪，完成阿巴芬净与其它杂质的分离与检测。

本发明的方法，在有机溶液与缓冲溶液的体积比为60∶40～85∶15，优选80∶20～65∶35，最优选75∶25的条件下，阿巴芬净与其类似物杂质容易被分离，并得到有效的检测，有利于阿巴芬净的产品的质量控制。

附图说明

图1、实施例1的HPLC图，图中1号峰为杂质E，2号峰为杂质A、B的合峰，3号峰为杂质C、D的合峰，4号峰为阿巴芬净，在该条件下阿巴芬净主峰可以和类似物杂质完全分离。

图2、实施例2的HPLC图，图中1号峰为杂质E，2号峰为杂质A、B的合峰，3号峰为杂质C、D的合峰，4号峰为阿巴芬净，在该条件下阿巴芬净主峰和相邻杂质峰的分离度为1.02。

图3、实施例4的HPLC图，图中1号峰为杂质E，2号峰为杂质A、B的合峰，3号峰为杂质C、D的合峰，4号峰为阿巴芬净。

图4、实施例5的HPLC图，图中1号峰为杂质E、2号峰为杂质A，3号峰为杂质B，4号峰为杂质C，5号峰为杂质D，6号峰为阿巴芬净。

具体实施方式：以下实施例用于进一步解释本明发明，但不能限制本发明的范围。

实施例1

高效液相色谱仪：Agilent 1100LC

色谱柱：ZORBAX Extend C18，4.6mm×250mm，5μm

流动相：乙腈-甲醇-二乙胺缓冲液(1％，V/V，磷酸调节pH至7.5)＝50∶25∶25

流速：1.0ml/min

检测波长；240nm

柱温：室温

进样体积：20μL

实施步骤

分别取杂质A、B、C、D、E约5mg，阿巴芬净对照品约10mg，置50ml量瓶中，加甲醇适量超声处理使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为混合标准溶液。另分别称取单一杂质及阿巴芬净约5mg，分别置6个50ml量瓶中，加甲醇适量超声处理使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为杂质定性的对照溶液。

分别取各对照溶液和混合样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图1。

实施例2

流动相：乙腈-二乙胺缓冲液(1％，V/V，磷酸调节pH至7.5)＝80∶20

其它条件同实施例1。

实施步骤

取实施例1项下的混合标准溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图2。

实施例3

流动相：乙腈-二乙胺缓冲液(1％，V/V，磷酸调节pH至7.5)＝60∶40

其它条件同实施例1。

实施步骤

取实施例1项下的混合标准溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图4。

实施例4

流动相：乙腈-甲醇(2∶1，V/V)-二乙胺缓冲液(1％，V/V，磷酸调节pH至7.5)＝60∶40

其它条件同实施例1。

实施步骤

取实施例1项下的混合标准溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图5。

实施例5

色谱柱：Crest Premium C18，4.6mm×250mm，5μm

其它条件同实施例1。

实施步骤

取实施例1项下的混合标准溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果阿巴芬净保留时间为19.832分钟，杂质C与D的合峰保留时间为19.090分钟，杂质A与B的合峰保留时间为16.310分钟，杂质E的保留时间为3.431分钟，阿巴芬净与相邻杂质C与D的合峰的分离度为1.84。

实施例6

条件同实施例1。

实施步骤

称取阿巴芬净乳膏适量(约相当于阿巴芬净20mg)，置小烧杯中，加入甲醇20ml，于80℃的水浴中加热2分钟，并充分搅拌使阿巴芬净溶解，用甲醇转移至50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀；在0℃的冰浴中放置10分钟，取出，转入离心管中，离心(转速为3500转)10分钟，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液按上述色谱条件进样，记录色谱图。阿巴芬净保留时间为20.421分钟，阿巴芬净与相邻杂质C与D的合峰的分离度为1.94。

Claims

1.一种分离测定阿巴芬净含量和杂质的高效液相色谱方法，其特征在于：将含阿巴芬净的供试品溶液，注入到色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱的色谱仪中，进行分离测定阿巴芬净的含量或其有关的杂质，其中，流动相：有机相-1％二乙胺溶液用磷酸调节pH至7.5＝75∶25～60∶40，其中，有机相为乙腈、甲醇或它们的混合溶液；紫外检测器，波长为240nm。

2.根据权利要求1所述的方法，所说的十八烷基硅烷键合硅胶柱为ZORBAX Extend C18或Crest Premium C18柱。

3.根据权利要求1所述的方法，所述流动相：有机相-1％二乙胺溶液用磷酸调节pH至7.5＝75∶25。

4.根据权利要求1所述的方法，所述混合溶液，其中，乙腈与甲醇的体积比为4∶1～1∶3。

5.根据权利要求4所述的方法，所述乙腈与甲醇的体积比为2∶1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于进一步包括以下几个步骤：

(1)配制流动相；

(2)取阿巴芬净样品适量，用甲醇溶解样品并用流动相稀释制成每1mL中含阿巴芬净0.05～5.0mg的供试品溶液；若为含阿巴芬净制剂样品，则用相应的样品预处理方法制备成每1ml中含阿巴芬净0.05～5.0mg供试品溶液；

(3)设置流动相流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为240nm，柱温为室温至40℃；

7.根据权利要求6所述的方法，所述流动相流速为1.0ml/min，所述柱温为室温。