CN101762630A

CN101762630A - 一种用于青霉素现场快速检测的分子印迹生物传感器的制备方法

Info

Publication number: CN101762630A
Application number: CN201010300061A
Authority: CN
Inventors: 张娟琨; 张子怡; 李丽; 李敏
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2010-01-06
Filing date: 2010-01-06
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2030-01-06
Also published as: CN101762630B

Abstract

本发明涉及一种用于青霉素现场快速检测的分子印迹生物传感器的制备方法，步骤是：(1)溶胶的配制；(2)电极涂膜；(3)洗脱。本发明提供的分子印迹膜制备方法简单，将目标分子、功能单体、交联剂、溶剂、催化剂按比例直接混合即可，同时在形成膜以后，对膜的各种参数进行实验分析，得到了最优的膜配比、使用最佳pH值、使用温度以及重复使用次数等参数，不仅提供了简单膜的制备方法，还提供了本膜的使用方法，进一步完善了青霉素检测的方法，实现了青霉素的快速简单检测。

Description

一种用于青霉素现场快速检测的分子印迹生物传感器的制备方法

技术领域

本发明属于快速化学检测技术领域，涉及一种青霉素检测，尤其是一种用于青霉素现场快速检测的分子印迹生物传感器的制备方法。

背景技术

青霉素是治疗奶牛和其他食用动物疾病的常用药物之一，残留在动物性食品中的青霉素类药物会对人体、环境造成巨大的危害，青霉素临床不良反应主要以过敏性皮疹、过敏性休克和胃肠道反应为主。引起人产生不同程度的过敏药疹反应，发病的几率约为8％。吴永娥等报道，青霉素对人过敏反应以药疹为主要临床表现。另外还有一些罕见的不良反应，如过敏性心肌炎、血小板减少等，目前迫切需要开发快速、廉价、易于操作的检测方法对其进行检测。

青霉素的检测方法有很多，如微生物检测法是一种较为传统的抗生素残留检测手段，应用广泛主要有杯碟法、TTC法、亮黑还原法、CHARM抑制法等，其测定原理是基于抗生素对微生物的生理机能和代谢的抑制作用，国内外已对青霉素的残留进行了多方面研究，像早期的微生物检测法，还有目前的胶体金检测技术等。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种制备方法简单、使用方便、检测灵敏的青霉素快速检测检测分子印迹膜传感器的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于青霉素现场快速检测的分子印迹生物传感器的制备方法，制备的步骤是：

(1)溶胶的配制：将功能单体、交联剂、溶剂、催化剂混合形成初始溶胶，加入含有目标分子的甲醇溶液，混合后得到印迹溶胶；

(2)电极涂膜：将印迹溶胶涂抹在修饰过的玻碳电极表面，甩至电极表面只有一层溶胶，氮气中烘干形成凝胶，形成涂膜电极；

(3)洗脱：先将涂膜电极放在水溶液中洗脱，直到涂膜电极在铁氰化钾溶液中的电流值不再升高时换甲醇洗脱，直至电流值不再升高，说明已经洗脱完全，就制得了涂有分子印迹膜的传感器。

而且，所述步骤(1)中功能单体为苯基三甲氧基硅烷，交联剂为正硅酸乙酯，溶剂为甲醇，催化剂为0.1mol/L盐酸，目标分子为青霉素。

而且，所述步骤(1)中目标分子：功能单体：交联剂的质量比为1∶1∶0.1。

而且，所述涂膜时最佳溶胶量为15μL。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明提供的分子印迹膜制备方法简单，将目标分子、功能单体、交联剂、溶剂、催化剂按比例直接混合即可，同时在形成膜以后，对膜的各种参数进行实验分析，得到了最优的膜配比、使用最佳pH值、使用温度以及重复使用次数等参数，不仅提供了简单膜的制备方法，还提供了本膜的使用方法，进一步完善了青霉素检测的方法，实现了青霉素的快速简单检测。

2、本发明的青霉素检测分子印迹膜制备时加入目标分子，与在制备时没有加入目标分子得非印迹聚合物相比，形成更多的识别目标分子的作用位点，因此特异性识别能力强。

附图说明

图1为本发明印迹膜厚度与最大吸附量对应曲线；

图2为本发明pH对吸附效果的影响曲线；

图3本发明分子印迹膜的重复使用能力曲线；

图4本发明浓度和电流的线性关系曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种用于青霉素快速检测检测的分子印迹生物传感器的制备方法，步骤如下：

1、溶胶的配制：将82.6μL功能单体苯基三甲氧基硅烷、363.3μL交联剂正硅酸乙酯、288μL溶剂甲醇、催化剂0.1mol/L盐酸128.2μL混合30min、形成初始溶胶，然后加入含有26.4mg目标分子青霉素的甲醇溶液247μL，混合10min后就得到印迹溶胶。

其中：由于目标分子和功能单体的基团键合，目标分子与功能单体的物质的量相等，而交联剂是在溶胶中连接成为刚性结构的框架，所以物质的量大大多于目标分的量，催化剂是为了提供酸性环境加速目标分子和功能单体的连接，通过实验：确定目标分子：功能单体：交联剂的物质的量比为1∶1∶0.1。

2、电极涂膜：将印迹溶胶涂抹在修饰过的玻碳电极表面(玻碳电极市场上可以买到)，甩至电极表面只有一层溶胶，氮气中烘干形成凝胶，形成涂膜电极，对涂膜后的电极做循环伏安法电化学检测，如电流值降低则表明涂膜成功。

其中：在涂膜过程中随着膜的厚度增加，对目标分子的最大吸附量也在增大，但是当涂膜量为16μL时，膜有点太厚，在洗脱的过程中膜容易裂，剥离玻碳电极表面，所以导致增加溶胶的量，并没有增加吸附量，根据以上数据，涂膜时都采用15μL溶胶。

3、洗脱：①先将涂膜电极放在水溶液中洗脱，直到涂膜电极在铁氰化钾溶液中的电流值不再升高时换甲醇洗脱，直至电流值不再升高，说明已经洗脱完全，就制得了涂有分子印迹膜的传感器。

4、吸附量检测：将涂有印迹膜的电极依次放在水、5ppb、10ppb、20ppb、30ppb、40ppb的青霉素水溶液中吸附3min后测在铁氰化钾溶液中的循环伏安线，分别记录在各个浓度下的峰电流值，然后用峰电流和青霉素浓度作直线。

其中：根据实验分析，在吸附时，应尽可能用制备聚合物时的溶剂配制目标分子的溶液，以免发生类似的溶胀作用而影响检测结果；在实际应用中，应尽量调整pH值为5.0-6.0的时候测量，才能保证印迹聚合物对目标分子的特异识别性，因而结果才值得信赖。

青霉素分子印迹膜传感器的优化实验如下：

1、分子印迹膜合成的研究

采用溶胶凝胶的方法合成分子印迹膜中，目标分子、功能单体、交联剂、溶剂、催化剂的比例直接影响了印迹膜的特性，要制备检测青霉素的传感器，就要制备出对目标分子具有特异性的分子印迹膜，所以要先确定所用试剂的比例。由于目标分子和功能单体的基团键合，目标分子与功能单体的物质的量相等，而交联剂是在溶胶中连接成为刚性结构的框架，所以物质的量大大多于目标分的量，催化剂是为了提供酸性环境加速目标分子和功能单体的连接。分子印迹膜的特性依据电化学方法检测，分子印迹膜洗脱前后对目标分子的吸附量的多少确定膜的优良程度。依据以上反应原理结合电化学检测来确定实验中的目标分子、功能单体、交联剂的物质的量比。

表3-1分子印迹膜合成条件优化

物质的量比	2∶1∶0.05	2∶1∶0.1	2∶1∶0.2	1∶1∶0.05	1∶1∶0.1	1∶1∶0.2
物质的量比	2∶1∶0.05	2∶1∶0.1	2∶1∶0.2	1∶1∶0.05	1∶1∶0.1	1∶1∶0.2	吸附量(mA)	27.29	30.65	28.47	30.72	33.14	31.98

根据表3-1以上结果，确定目标分子：功能单体：交联剂的物质的量比为1∶1∶0.1。

2、分子印迹膜厚度的确定

本实验中分子印迹膜的厚度由滴加到玻碳电极表面的溶胶体积确定，膜太薄对目标分子的吸附量少，膜太厚易剥离电极表面，所以膜的厚度的选择对于传感器的制备至关重要。

将制备的分子印迹膜先在18ml水中吸附来作为阴性对照，然后加入1ppb青霉素溶液2mL，得到0.1ppb的青霉素溶液，吸附3min后检测电化学信号，依次在0.2ppb、0.3ppb、0.4ppb、0.5ppb、0.6ppb、0.7ppb、0.8ppb、0.9ppb、1.0ppb、1.1ppb、1.2ppb、1.3ppb青霉素溶液中做电化学检测。结果如下：

由上图1可知，膜的厚度增加，对目标分子的最大吸附量也在增大，但是当涂膜量为16霯时，膜有点太厚，在洗脱的过程中膜容易裂，剥离玻碳电极表面，所以导致增加溶胶的量，并没有增加吸附量。根据以上数据，涂膜时都采用15μL溶胶。

3、聚合物的吸附性能测定

3.1温度对吸附特性的影响

虽然修饰在电极上的印迹膜物理性质很稳定，但吸附时性质是否稳定才是我们真正关心的问题，这里就研究了温度对吸附的影响。

(1)同时将两个修饰有分子印迹膜的电极放入相同浓度青霉素的甲醇溶液(1mmol/L)中，然后把其中一个电极放在25℃条件下磁力搅拌下吸附，另外一个放在4℃冰箱中吸附，10小时后同时取出，在电化学工作站直接测得在不同条件下吸附后的的电流值，从而作为判断温度对吸附影响的依据。

(2)结果：两种温度下最终测得的电流值几乎相同，也就是两种条件下进行吸附时，印迹聚合物的吸附量相差不大，即温度对聚合物吸附印迹分子这个过程没有影响。对这种现象解释的原因可能是因为聚合物在识别目标分子时，主要是依靠制备聚合物时形成的相互作用力，在不同的温度下，由于印迹聚合物的物理性质稳定，同样，原来所形成的″空穴″并没有因为温度的改变而发生变化，对目标分子的特异识别性就基本不变，因而形成的″空穴″对印迹分子的识别性能依然很好。这又从另一个角度证明了分子印迹聚合物在应用中有着巨大的市场，可以克服应用中温度对生产、测试所造成的影响。

3.2pH值对吸附效果的影响

分子印迹聚合物对底物的键合能力大小受其合成中的溶剂和键合时的溶剂的影响。实际上所有底物对印迹聚合物的结合都可以分为两类：特异结合和非特异结合。如果非特异键合占支配地位，将会观察不到聚合物的选择性；反之，如果特异结合占支配地位，选择性将会非常明显。

模板分子在低极性有机溶剂中可达到良好的识别能力，此时识别主要依靠分子间的静电作用，显示出高亲和力和选择性。为了使传感器更广泛的应用，本实验采用PBS作为吸附的介质，配制不同pH值的青霉素PBS溶液，进行吸附溶液pH值条件优化，结果如图2所示：

从图2中可以看出，当溶液的pH值小于7时，吸附容量随着溶液pH值的增大而增大，当pH等于7时，吸附容量趋于平衡，而当溶液的pH值大于7时，吸附容量随着溶液pH的增大而逐渐减少。这也符合原理中反应均为弱酸性的反应环境，中性的环境更有利于吸附青霉素。实验结果显示，在pH接近中性时电流强度变化最大。说明在中性溶液中青霉素分子更容易进入印迹孔穴与PTMOS形成π-π共轭作用，使孔穴封闭，并使Fe(CN)₆ ³⁺扩散受阻，导致玻碳电极表面Fe(CN)₆ ³⁺浓度减少，还原电流减小。因而在对青霉素印迹膜表征时先以青霉素PBS溶液(pH＝7)作为吸附介质，进行吸附特征实验。

3.3重复性实验

溶胶凝胶分子印迹膜修饰的电极具有对青霉素的特异选择性，为了扩大该传感器的应用，本实验对分子印迹膜的重复利用进行了研究。将涂覆有分子印迹膜的电极在吸附青霉素后用甲醇洗脱8h，将吸附的模板分子洗脱出来，再一次得到青霉素的分子印迹膜，如此反复，如图4所示。表明将分子印迹膜吸附后洗脱再利用到第四次的时候吸附容量有所降低，但是在前四次中增加相同浓度，电流强度的降低相差不多，证明再生后印迹膜对青霉素的特异性吸附并没有降低，所以该传感器可以被重复利用3次。

、青霉素浓度和电流的线性关系

为了将电流值和吸附的青霉素浓度关联，分别配制青霉素的PBS溶液0.1~2.μL^-1，将涂覆青霉素分子印迹膜的电极依次放入其中吸附，结果见图4。

如图4所示，在0.1μL^-1～1.8μL^-1浓度范围内，随着青霉素浓度增加，电流强度降低，在0.1μL^-1～1.8μL^-1范围内，青霉素浓度和电流强度成线性关系，由此可以通过电流强度求出吸附青霉素的浓度。

Claims

1.一种用于青霉素现场快速检测的分子印迹生物传感器的制备方法，其特征在于：制备的步骤是：

2.根据权利要求1所述的一种用于青霉素现场快速检测的分子印迹生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中功能单体为苯基三甲氧基硅烷，交联剂为正硅酸乙酯，溶剂为甲醇，催化剂为0.1mol/L盐酸，目标分子为青霉素。

3.根据权利要求1所述的一种用于青霉素现场快速检测的分子印迹生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中目标分子：功能单体：交联剂的质量比为1∶1∶0.1。

4.根据权利要求1所述的一种用于青霉素现场快速检测的分子印迹生物传感器的制备方法，其特征在于：所述涂膜时最佳溶胶量为15μL。