CN101760449A - 表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，该方法是通过将eplife培养基与诱导培养基进行不同比例的混合，使表皮干细胞有充足的时间适应eplife培养基不断减少诱导培养基逐渐增加，并有利于减少向表皮分化，增加向目的细胞转变的几率。本发明方法既简单又非常有效的将表皮干细胞定向诱导驯化为肌肉细胞。并克服了本领域技术人员的偏见，首次颠覆表皮干细胞是单能干细胞的论断，证明其具有多向分化潜能。

Description

表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种诱导细胞的方法，具体地说是利用表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法。

背景技术

人类对表皮干细胞的研究，已有几十年历史，但由于其难以诱导分化一直被认为是单能干细胞，即仅能分化成为表皮的相关成分。再生医学在医学领域中炙手可热，干细胞的研究在再生医学领域中已占据了重要的低位，干细胞由于其具有多分化潜能，在特定的条件下可以分化为各种组织器官的能力得到科学家们的关注。胚胎干细胞是一种全能干细胞，其能分化为除胎盘外的所有组织和器官。但由于胚胎干细胞的研究涉及伦理学的诸多问题，所以本领域技术人员一直致力于寻找另外一种全能干细胞来替代胚胎干细胞。

人们把目标逐渐锁定在成体干细胞上。目前，本领域技术人员已经成功的将MSC(间充质干细胞)，ADSC(脂肪干细胞)等成体干细胞诱导分化为其他类型的细胞，如软骨细胞、骨细胞、心肌细胞等。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，因此，目前将MSC作为一种骨组织工程的种子细胞与支架材料可修复损伤的组织在临床已普遍应用。间充质干细胞(MSCs)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。但是利用MSC诱导分化肌肉细胞的弊端为：MSC的来源有限，取材又很麻烦，从取材上比较受局限；MSC诱导培养周期长，培养过程复杂，不易培养和扩增，因此MSC的应用遇到很多阻碍。

表皮干细胞又称专一性干细胞或单能细胞，是指只能产生一种细胞类型，但具有自更新属性的细胞。本领域技术人员一直将表皮干细胞归为单能细胞。对于表皮干细胞的应用范围也受单能细胞的影响而受限。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种将具有多潜能的成体干细胞通过驯化诱导定向分化为肌肉细胞的方法。为以后临床组织工程的应用提供一种潜在的种子细胞，可以广泛应用在创伤修复、基因治疗、美容等方面，为人类提供方便。

为了达到上述目的，本发明的思路为：在对表皮干细胞的深入研究中，我们了解到表皮的附件毛囊、汗腺都存在多向分化潜能的干细胞，并且与表皮毗邻的真皮也存在这样的干细胞，难道作为机体含量最丰富的干细胞，就是仅仅只能分化表皮细胞的单能干细胞吗？带着这个疑问，我们开始对表皮干细胞多能性进行了漫长的研究。

在研究过程中，我们充分认识了表皮干细胞的相关特性，也了解到表皮干细胞在Eeplife培养系统问世之前是一种非常难以培养的干细胞，它必须培养在低钙离子浓度或无钙离子的培养系统中才能维持其干性减少向表皮分化。Eplife培养系统不仅为其提供了这样的环境还加入了许多生长因子更加有利于表皮干细胞的干性的维持，且在我们的实验过程中也发现在原代培养后可以使表皮干细胞的干性上升。但这种生长特点又给诱导分化带来了难题，诱导分化的目的细胞需要一定浓度的钙离子存在，这是其发育所必须的。

因此怎样保持表皮干细胞的干性相对稳定和积极引导其向目的细胞分化成为本发明需解决的首要问题。由于Eeplife培养系统对表皮干细胞干性的维持具有明确的意义(已被实验证实)，因此我们选择了像调制鸡尾酒一样的方法将Eeplife培养基与诱导培养基进行不同比例的混合，使表皮干细胞有充足的时间适应Eeplife培养基不断减少诱导培养基逐渐增加，并有利于减少向表皮分化增加向目的细胞转变的机率。我们将这种培养过程称之为驯化。

本发明所采用的具体的技术方案为：

一种表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，其特征在于，该方法的具体步骤是

(1)将表皮干细胞经培养后，取密度大于60％的表皮干细胞，首先在肌肉诱导培养基和干性维持培养基的混合培养基中培养3～5天，肌肉诱导培养基和干性维持培养基的浓度比为3∶5～8；

(2)后将肌肉诱导培养基和干性维持培养基的浓度比更换为3∶2～5继续培养3～5天；

(3)3天后完全更换为肌肉诱导培养基，并以肌肉诱导培养基诱导其分化至少10～20天以上。

上述的表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，在步骤(1)开始前1～2天用PBS缓冲液洗细胞2-3次，然后更换新鲜的Eplife培养基培养24小时以上。

上述的表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，所述的肌肉诱导培养基成分及用量为：

85％～95％基础培养基(IMDM)；1uM地塞米松(Dexamethasone)；0.2mM吲哚美辛(indomethacin)；0.5mM胰岛素(insulin)；0.5mM异丁甲基黄嘌呤(isobutyl-methylxanthine)；10％胎牛血清(FBS)。

上述的表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，所述干性维持培养基的成分及用量为：

94～98％Epilife、1％PS双抗和1～5％HKGS添加剂。

上述的表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，所述步骤(1)中所使用的表皮干细胞的制备步骤如下：

(1)取离体时间1～4h，4℃保存的人表皮组织浸泡于稀碘伏溶液中1min，PBS/生理盐水冲洗3次，去除脂肪组织，修剪成1cm²组织块；

(2)将组织块置于含中性蛋白酶溶液中4℃处理14～16h或直接置于37℃孵箱处理3h以上；

(3)4℃的PBS冲洗标本3次；分离表皮；

(4)剪碎后加入等体积0.25％Typsin-EDTA 3～8ml，于37℃处理30～90min，用3～8ml MEFs培养基终止消化，再通过剧烈振荡分层；

(5)吸取中层的细胞悬液转移到另一支离心管中，离心600～1000rpm3～8min；

(6)弃上清，用人表皮干细胞培养基重悬；

(7)移至培养瓶中，静置30～90min后，弃培养上清并用PBS冲洗2～3次，更换新鲜表皮干细胞培养基；置于37℃、5％CO²孵箱继续培养。

所述人表皮干细胞培养基组成94～98％Epilife、1％PS双抗、1％HKGS添加剂。

一般现有技术分离培养的表皮干细胞也可以应用于本发明中，只要满足培养密度大于60％即可，本发明所述的表皮干细胞培养方法培养的表皮干细胞更适合于本发明诱导驯化方法，推荐使用本发明所述方法

本发明的优点及效益是：本发明发明人经过多次试验证实，本发明方法既简单又非常有效的将表皮干细胞定向诱导驯化为肌肉细胞，并克服了本领域技术人员的偏见，首次颠覆表皮干细胞是单能干细胞的论断，证明其具有多向分化潜能。

附图说明

图1为免疫荧光检测表皮干细胞特征标记CD90，CD24，CD29，其中CD29阳性率大于15％，CD24阳性率大于80％，CD29阳性率大于90％；

图2为流式细胞仪检测人包皮基底层来源的未分化角质化细胞。CD90，CD24，β1 integrin为分化角质化细胞的表面标记。其中每组图左图为对照组，右图为检测的表皮干细胞组。结果显示获得的角质化细胞干性强；

图3为RT-PCR鉴定培养的各时间点的表皮干细胞中干性基因OCT4，SOX2，Klf4，Nanog，c-myc，CRIPTO，REX1，KRT14，分化标记KRT1，KRT5，KRT10，KRT19，其他细胞标记MTTF，TYR，c-kit的表达情况；

图4为表皮细胞的起始状态及诱导两天后的变化；

图5为成人未分化的角质化细胞通过血清驯化诱导的方式产生肌肉细胞；B左为诱导前的成人角质化细胞，右图为驯化诱导一天后，大多圆的未分化的角质化细胞开始漂浮，一些再贴回去的迅速分化的细胞形成岛样的聚集；C为10天后免疫荧光involucrin检测分化的表皮细胞；D免疫荧光检测SMA；

图6定向诱导后肌肉(SMA)特异性染色阳性；

图7为驯化诱导表皮干细胞产生肌肉细胞，图示A为肌肉诱导培养一天后很多再贴回到板上生长的细胞，在一周(B)，两周(C)，三周(D)诱导后分别进行SMA免疫荧光检测，B中箭头和D中箭头分别代表肌纤维和双核的肌细胞。

图8为诱导三周后RT-PCR分析基因的表达，M，marker；K，分化的角质化细胞；S，sample。

具体实施方式

实施例1诱导驯化前表皮干细胞的制备

一、表皮干细胞的制备：

直接来源和原始来源：经患者同意取自301医院外科门诊健康包皮环切术患者。

(1)取新鲜的成人包皮(离体时间约1～4h，4℃保存)；

(2)将包皮浸泡于稀碘伏溶液(含碘伏20％)中1min；

(3)PBS/生理盐水冲洗3次洗去血块(防止影响酶的消化)；

(4)修剪包皮，去除脂肪组织，再用PBS/生理盐水冲洗数次，最后剪成1cm²左右的组织方块；

(5)将组织块置于含中性蛋白酶(3mg/ml；D-hanks做溶剂)溶液的6cm皿中4℃处理14-16h，如果处理不够还可置于37℃孵箱(也可直接置于37℃孵箱处理3h以上——随时观察处理效果)；

(6)4℃的PBS冲洗标本3次；

(7)分离表皮(用消毒镊撕取)；

在小瓶中剪碎后加入等体积0.25％Typsin-EDTA中(胰酶的浓度为0.25％，EDTA的浓度为0.05％，将上述浓度的胰酶和EDTA按1∶1混合)共4ml，于37℃处理30～90min(样本年龄越小消化时间也越长，一般＜30岁37℃消化60min至90min，一般＞30岁37℃消化45min)，用4ml含血清的培养基(MEFs培养基)终止消化，再通过剧烈振荡分层：角质层(上层)、细胞层(中层)、组织(下层)；

(8)小心吸取中层的细胞悬液转移到另一支离心管中，离心1000rpm 5min；

(9)弃上清，用人表皮干细胞培养基重悬；

(10)移至培养瓶(用100μg/ml IV型胶原预处理过)中，静置60min(干细胞惰性，先贴壁)后，弃培养上清并用PBS冲洗2次，更换新鲜表皮干细胞培养基；置于37℃、5％CO²孵箱继续培养。

注：人表皮干细胞培养基组成98％Epilife(Cascade Biologics，cat.no.M-EPI-500-CA)；1％PS(双抗Invitrogen，cat.no.15070)；1％、添加剂(HKGS，Cascade Biologics，cat.no.S-001-5)。

二、表皮干细胞诱导驯化前的生长状态：

1、新鲜的表皮干培养1天后，更换培养基(目的是除去死细胞)。

2、一般培养3天后，更换人表皮干细胞培养基。这时细胞大多贴壁生长，呈卵石路样，细胞为梭形和卵圆形(细胞壁界限清)，并见数量较多的小圆亮细胞，生长在贴壁细胞的上层且呈克隆性生长。

三、表皮干细胞的鉴定：

以上方法获取的表皮干细胞是否是我们所需要的表皮干细胞，结合干细胞特征性的分子标记，以及表皮干细胞的特征我们采用RT-PCR(图3)、免疫荧光(图

1)、流式细胞术(图3)检测表皮干细胞的标记。

1、鉴定方法：

为确定上面贴壁的细胞为我们所要的表皮干细胞，我们采用RT-PCR，及其免疫荧光的方法检测其干性分子及特定的分子标记。

1.1RT-PCR

1.1.1RNA的提取

(1)将准备好的IPS细胞、表皮干细胞、MEF细胞中的培养基吸弃，用PBS洗细胞两遍。

(2)每个六孔板加入4℃预冷的Tribule裂解液1ml，看到细胞均被裂解开，大约5min。

(3)用无核酶枪尖将细胞裂解液吸到1.5ml离心管中。

(4)加入200ul氯仿，上下剧烈震荡四到五次，使其充分混匀。

(5)12000rpm，5min 4℃.液体分三层，吸取上层透明液体层到新的1.5ml离心管中。

(6)加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀四五次，室温静止10min。

(7)12000rpm，5min，4℃此时可见RNA沉淀，弃上清，注意小心操作勿将沉淀块吸出。

(8)加预冷的70％乙醇700ul，12000，2min，4℃，弃上清，重复操作一次。

(9)将RNA中残留的液体晾干，视沉淀体积量加入无核酶水溶解RNA(注意RNA太干不易溶解)

1.1.2逆转录RNA为CDNA

(10)按反转录试剂盒配置反转录体系，见表1

表1

*RNA加入的多少应视沉淀量而定，最后无核酶水的量应补足到10ul

按上表加入好后，37℃，15min，85℃，5s。-20保存待用。

1.1.3PCR扩增

(11)PCR反应体系如下

PCR mixture     12.5ul

Primer 1        1ul

Primer 2        1ul

CDNA            1ul

dd H2O          9.5ul

(11)PCR反应条件，见表2

表2

基因名称及别名	上游引物	下游引物	退火温度(℃)	循环数
					Oct4(POU5F1)-new	CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG	GAACATGTGTAAGCTGCGGCCCTTG	62	40
Sox2	GCTGCACATGAAGGAGCACCC	CGGACTTGACCACCGAACCCA	58	33
					Klf4	CAAGTCCCGCCGCTCCATTAC	TGGCTGGGCTCCTTCCCTCAT	58	33
c-Myc	ACTCTGAGGAGGAACAAGAA	TGGAGACGTGGCACCTCTT	58	33
					Nanog	CCCAAAGGCAAACAACCCACT	ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT	58	33
CRIPTO(TDGF1)	TGCCCAAGAAGTGTTCCCTGT	GCAGCAGCCTTTACTGGTCAT	60	33
					REX1	CGCTGACACCATCCTCATCGG	GGCGTCATCGCTTGGTCTTGG	55	33
KRT1	AGGATGTGGATGGTGCTTAT	GCTTTGCTCTTCTGGGCTAT	58	33
					KRT5	CTGGACACCAAGTGGACCCT	GCTCCGCATCAAAGAACATC	58	33
KRT10	TGATAATGCCAACATCCTGC	CCTCCTCGTGGTTCTTCTTC	68	33
					KRT14	GGAGATGATTGGCAGCGTGGA	GGACCTGCTCGTGGGTGGACA	62	33
KRT15	AGCCTACCTGAAGAAGAACCACG	TGGCATAGCGGCACTCTGTCT	58	33

基因名称及别名	上游引物	下游引物	退火温度(℃)	循环数
					KRT19	GCGACTACAGCCACTACTACACGAC	CGACCTCCCGGTTCAATTCTT	58	33
MITF	GACAGAAGAAACTGGAGCACG	ATCAGTGACACCGACGGGAGA	62	33
					TYR	TAGTCCACTTACTGGGATAGCG	AGTCTGGGTCTGAATCTTGTAG	62	33
β-actin	AAAGACCTGTACGCCAACAC	GTCATACTCCTGCTTGCTGAT	62	32

*PCR反应的条件(循环数)，不同的基因片段差异很大，所以试验过程中我们需要摸索出最好的条件。

1.1.4琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段

(1)称取1g电泳级琼脂糖，加100ml 1xTBE，微波炉中加热使琼脂糖完全溶解；

(2)待胶冷却到50-60℃，加入终浓度为0.5ug/ml的EB染液摇匀；

(3)用胶条封好胶板，倒入冷却到30-40℃配置好的凝胶；

(4)待凝胶凝固，电泳槽中加入一定量的电泳液，将胶条卸下，胶槽放到电泳槽中，使电泳液没过胶槽。轻轻拔下梳子；

(5)取Marker5ul上样，将扩增好的PCR产物取8ul上样电泳，刚开始时，100V电压，待样品跑出胶孔，60V，待样品到胶2/3时，停止电泳，紫外灯下观察，拍照。

1.2免疫荧光

(1)取状态较好的IPS克隆细胞，PBS洗细胞两遍，加1ml4％多聚甲醛固定30min

(2)弃固定液，PBS洗细胞3次，每次5min

(3)加1ml 0.05％通透液30min

(4)弃通透液，用PBS洗细胞3次，每次5min

(5)加500ul羊血清封闭液，1h。一抗稀释液按所需比例稀释一抗

(6)加入稀释好的一抗，置湿盒中，4℃冰箱过夜

(7)次日取出一抗孵育的细胞，用PBS涮洗一次，在用PBS洗3次，每次10min

(8)PBS配置二抗，弃PBS，将稀释好的二抗500ul加到细胞中(取出二抗以后的操作都应避光！)孵育1h45min.

(9)用PBS稀释DAPI染液，按1∶2500的比例加入含有二抗的染液中，继续孵育30min

(10)弃培养皿中的液体，PBS涮洗一次，在用PBS洗3次，每次10min

(11)加少量PBS，置荧光显微镜下观察

1.3流式细胞仪的检测

(1)将通过四型胶原贴壁选择的(贴壁1小时后更换培养基时)表皮干细胞，用TE消化细胞，DTI终止消化，将消化下来的细胞用预冷的含10％FBS的PBS洗细胞三遍，12000rpm，5min。

(2)用上述的PBS重悬细胞，计数稀释细胞数为5×105.

(3)每份样品用100ul含3％BSA的PBS悬起细胞，加入相应抗体：10ulCD29，10ul CD90，10ul CD24，4度冰箱孵育30min。

(4)用冷的PBS洗细胞三遍，12000rpm，5min。

(5)用3％的含BSA的PBS稀释二抗，兔抗(1∶400)，鼠抗(1∶200)

(6)4度冰箱孵育20-30min，重复步骤四，左后用500ul冷的含BSA的PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。

2、鉴定结果：

如图1所示，免疫荧光检测表皮干细胞特征标记CD90、CD24、CD29，其中CD29阳性率大于15％、CD24阳性率大于80％、CD29阳性率大于90％。如图2所示，流式细胞仪检测人包皮基底层来源的未分化角质化细胞，CD90、CD24、β1integrin为未分化角质化细胞的表面标记，其中每组图左图为对照组，右图为检测的表皮干细胞组，结果显示获得的角质化细胞干性强。如图3所示，RT-PCR鉴定培养的各时间点的表皮干细胞中干性基因，OCT4、SOX2、Klf4、Nanog、c-myc、CRIPTO、REX1、KRT14，分化标记KRT1、KRT5、KRT10、KRT19，其他细胞标记MTTF、TYR、c-kit的表达情况。

目前分离干细胞的技术还达不到使分离得到的细胞纯度为100％，通过流式细胞仪检测到的结果显示我们分离得到的细胞纯度很高，其中CD29检测率达99％。同时我们用免疫荧光检测了其他细胞的分子标记，检测结果显示其他细胞存在的数量极少。

实施例2表皮干细胞定向诱导驯化为肌肉细胞

1、培养基组成

(1)肌肉诱导培养基成分及用量为：90％IMDM(博纳特)；1uM Dexamethasone(sigma D1756)；0.2mM indomethacin(sigma，cat.no.17378)；0.5mMinsulin(sigma，cat.no.19278)；0.5mM isobutyl-methylxanthine(sigma，cat.no.17018)；10％FBS(Gibco，cat.no.10437010)。

(2)干性维持培养基的成分及用量为：98％Epilife(Cascade Biologics，cat.no.M-EPI-500-CA)、1％PS双抗(双抗Invitrogen，cat.no.15070)和1％HKGS添加剂(HKGS，Cascade Biologics，cat.no.S-001-5)。

2、诱导驯化方法：

(1)驯化诱导前处理：

在细胞诱导开始前需用PBS洗细胞2-3次，目的是确定小圆细胞数目及更换新鲜pilife培养基，更换培养基后培养24h以上。

(2)将表皮干细胞经培养后，取稳定生长的密度大于60％的表皮干细胞(培养方法见上述)，首先在30％肌肉诱导培养基和70％干性维持培养基的混合培养基中培养3天；

(3)第3天在60％肌肉诱导培养基和40％干性维持培养基继续培养6天；

(4)第6天完全更换为肌肉诱导培养基分化10～20天以上。

实施例3目的细胞的鉴定及结果分析

一、免疫荧光鉴定诱导分化结果

1、鉴定方法：在诱导为肌肉细胞实验验证中，免疫荧光检测到肌肉细胞标记(a-SMA)鉴定方法如下：

(1)取诱导后一、二、三周细胞，PBS洗细胞两遍，加1ml4％多聚甲醛固定30min

(2)弃固定液，PBS洗细胞3次，每次5min

(3)加1ml 0.05％通透液30min

(4)弃通透液，用PBS洗细胞3次，每次5min

(5)加500ul羊血清封闭液，1h。一抗稀释液按所需比例稀释一抗

(6)加入稀释好的SMA一抗，置湿盒中，4℃冰箱过夜

(7)次日取出一抗孵育的细胞，用PBS涮洗一次，在用PBS洗3次，每次10min

(8)PBS配置二抗，弃PBS，将稀释好的二抗500ul加到细胞中(取出二抗以后的操作都应避光！)孵育1h45min.

(9)用PBS稀释DAPI染液，按1∶2500的比例加入含有二抗的染液中，继续孵育30min

(10)弃培养皿中的液体，PBS涮洗一次，在用PBS洗3次，每次10min

(11)加少量PBS，置荧光显微镜下观察。

2、鉴定结果：

分别在驯化诱导后10天、2周、3周免疫荧光检测到表皮细胞特异性标记(involucrin阳性)、肌肉细胞特异性标记(SMA阳性)。如图5所示，为成人未分化的角质化细胞通过血清驯化诱导的方式产生中胚层和神经细胞；B左为诱导前的成人角质化细胞，右图为驯化诱导一天后，大多圆的未分化的角质化细胞开始漂浮，一些再贴回去的迅速分化的细胞形成岛样的聚集；C为10天后免疫荧光involucrin检测分化的表皮细胞；D免疫荧光检测SMA阳性。

图4为表皮细胞起始状态及诱导两天后的状态。左图为起始诱导的表皮干细胞生长状态；右图为驯化诱导培养两天后的表皮干细胞的生长状态(可以作为参考指标)。

图6定向诱导后肌肉(SMA)特异性染色阳性。

图7为驯化诱导表皮干细胞产生肌肉细胞，图示A为肌肉诱导培养一天后很多再贴回到板上生长的细胞，在一周(B)，两周(C)，三周(D)诱导后分别进行SMA免疫荧光检测，B中箭头和D中箭头分别代表肌纤维和双核的肌细胞。

二、RT-PCR鉴定诱导分化结果

1、RNA提取

(1)取诱导后三周细胞以及表皮干细胞做对照，用PBS洗细胞两遍；

(2)每个六孔板加入4℃预冷的Tribule裂解液1ml，看到细胞均被裂解开，大约5min；

(3)用无核酶枪尖将细胞裂解液吸到1.5ml离心管中；

(4)加入200ul氯仿，上下剧烈震荡四到五次，使其充分混匀；

(5)12000rpm，5min 4℃.液体分三层，吸取上层透明液体层到新的1.5ml离心管中；

(6)加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀四五次，室温静止10min；

(7)12000rpm，5min，4℃此时可见RNA沉淀，弃上清，注意小心操作勿将沉淀块吸出；

(8)加预冷的70％乙醇700ul，12000，2min，4℃，弃上清，重复操作一次；

(9)将RNA中残留的液体晾干，视沉淀体积量加入无核酶水溶解RNA(注意RNA太干不易溶解)。

2.逆转录RNA为CDNA

(1)按反转录试剂盒配置反转录体系，见表3：

表3

*RNA加入的多少应视沉淀量而定，最后无核酶水的量应补足到10ul

按上表加入好后，37℃，15min，85℃，5s。-20保存待用。

3.PCR扩增

(1)PCR反应体系如下

PCR mixture     12.5ul

Primer 1        1ul

Primer 2        1ul

CDNA            1ul

dd H₂O        9.5ul

(2)PCR反应条件见表4

*PCR反应的条件(循环数)，不同的基因片段差异很大，所以试验过程中我们需要摸索出最好的条件。

表4：

4.琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段

(1)称取1g电泳级琼脂糖，加100ml 1xTBE，微波炉中加热使琼脂糖完全溶解；

(2)待胶冷却到50-60℃，加入终浓度为0.5ug/ml的EB染液摇匀；

(3)用胶条封好胶板，倒入冷却到30-40℃配置好的凝胶；

(4)待凝胶凝固，电泳槽中加入一定量的电泳液，将胶条卸下，胶槽放到电泳槽中，使电泳液没过胶槽。轻轻拔下梳子；

(5)取Marker5ul上样，将扩增好的PCR产物取8ul上样电泳，刚开始时，100V电压，待样品跑出胶孔，60V，待样品到胶2/3时，停止电泳，紫外灯下观察，拍照。

如图8所示，为诱导三周后RT-PCR分析基因的表达，M，marker；K，分化的角质化细胞；S，sample。

三、诱导结果：

我们制备表皮干细胞的标本数130例，定向诱导10例，100％成功。经过上述定向诱导我们证明了表皮干细胞能成功定向分化肌肉细胞。

四、本发明用途：

表皮干细胞在非定向培养系统中，能定向分化成为肌肉细胞，证实了表皮干细胞非单能干细胞，它具有明确的多向分化潜能。表皮干细胞在人体分布广泛，取材容易，干细胞活性不受年龄限制又具有良好的体外扩增能力，这些都将为其在成体干细胞应用领域中增添优势。

Claims (7)

1.一种表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，其特征在于，该方法的具体步骤是：

(1)将表皮干细胞经培养后，取密度大于50％～90％的表皮干细胞，首先在肌肉诱导培养基和干性维持培养基的混合培养基中培养3～5天，肌肉诱导培养基和干性维持培养基的浓度比为3∶5～8；

(2)后将肌肉诱导培养基和干性维持培养基的浓度比更换为3∶2～5继续培养3～6天；

(3)后完全更换为肌肉诱导培养基，并以肌肉诱导培养基诱导其分化至少10～20天以上。

2.根据权利要求1所述的表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，其特征在于，在步骤(1)开始前1～2天用PBS缓冲液洗细胞2～3次，然后更换新鲜的Eplife培养基培养24小时以上。

3.根据权利要求1或2所述的表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，其特征在于，所述的肌肉诱导培养基成分及用量为：

85％～95％基础培养基IMDM；1uM地塞米松；0.2mM吲哚美辛；0.5mM胰岛素；0.5mM异丁甲基黄嘌呤；10％胎牛血清。

4.根据权利要求1或2所述的表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，其特征在于，所述干性维持培养基的成分及用量为：

94～98％Epilife、1％PS双抗和1～5％HKGS添加剂。

5.根据权利要求3所述的表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，其特征在于，所述干性维持培养基的成分及用量为：

94～98％Epilife、1％PS双抗和1～5％HKGS添加剂。

6.根据权利要求5所述的表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所使用的表皮干细胞的制备步骤如下：

(1)取离体时间1～4h，4℃保存的人表皮组织浸泡于稀碘伏溶液中1min，PBS/生理盐水冲洗3次，去除脂肪组织，修剪成1cm²组织块；

(2)将组织块置于含中性蛋白酶溶液中4℃处理14～16h或直接置于37℃孵箱处理3h以上；

(3)4℃的PBS冲洗标本3次；分离表皮；

(4)剪碎后加入等体积0.25％Typsin-EDTA 3～8ml，于37℃处理30～90min，用3～8ml MEFs培养基终止消化，再通过剧烈振荡分层；

(5)吸取中层的细胞悬液转移到另一支离心管中，离心600～1000rpm3～8min；

(6)弃上清，用人表皮干细胞培养基重悬；

(7)移至培养瓶中，静置30～90min后，弃培养上清并用PBS冲洗2～3次，更换新鲜表皮干细胞培养基；置于37℃、5％CO²孵箱继续培养。

7.根据权利要求6所述的表皮干细胞诱导驯化为肌肉细胞的方法，其特征在于，所述人表皮干细胞培养基组成94～98％Epilife、1％PS双抗、1％HKGS添加剂。

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