CN101747275B - 一种泡沫分离法分离千层塔中石杉碱甲的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种泡沫分离法分离千层塔中石杉碱甲的方法，所述的方法为：千层塔浸膏溶于乙醇，然后和阴离子表面活性剂加入泡沫分离塔内，搅拌均匀后从塔底连续鼓入空气，形成泡沫，收集泡沫直至无泡沫产生，得到的泡沫由塔顶排出得到泡沫液，泡沫液离心，取离心沉淀物溶于NaOH水溶液，搅拌反应，过滤取滤饼得石杉碱甲粗品，用重结晶溶剂进行重结晶，干燥得石杉碱甲成品；所述阴离子表面活性剂为烷基磺酸钠、烯基磺酸钠或烷基苯磺酸钠。本发明与现有技术相比，缩短了工艺路线和工时，生产成本大幅减少，还省时、省力，成本低，并且工艺稳定、低能耗、环境友好，容易工业化，其工艺技术非常适合于一般中型药厂现有设备。

Description

一种泡沫分离法分离千层塔中石杉碱甲的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种泡沫分离法分离千层塔中石杉碱甲的方法。

(二)背景技术

石杉碱甲(HuperzineA)为可逆的、高选择性的、低毒性的胆碱酯酶抑制剂，可以增加大脑中的乙酰胆碱含量，有恢复和增强记忆的疗效，为我国首创的治疗良性记忆障碍和阿尔茨海默氏痴呆的药物，疗效高于他克林，毒扁豆碱和加兰他敏。国内用于治疗老年痴呆的石杉碱甲新药“双益平”和“哈伯因”已经成功生产上市。石杉碱甲对有机磷中毒，以及重症肌无力症治疗也有显著疗效。石杉碱甲易透过血脑屏障，口服生物利用度高，作用时间长的特点，无严重不良反应，在国际上已被列为第二代胆碱酯酶的抑制剂，是目前国内外上述病症最有效的药物。

在中国南方，民间用石松类全草治疗风湿麻痹、跌打损伤、发热等症。1881年，从L.complanatum分离得到了第一个石松生物碱；自1986年刘嘉森从石松类植物蛇足石杉[Huperzia seratta(Thunb)，Trev(Huperziaceae)]中分离得到了石杉碱甲以来，石杉碱甲成为药学界持续研究的热点之一。

但是，石杉碱甲在植物中含量约为10万分之2至9不等，同时还伴有一些成分复杂、结构类似的其它石松类生物碱，如：locopodine，lycodine，fawcettimine，phlegmarine。目前，已报道的天然的石松生物碱超过180个。这使得运用常规方法获得大量的天然石杉碱甲相当困难。石杉碱甲具有复杂的桥联三环结构并具有多个手性中心，难以通过人工合成，更难以取得单旋的活性体，而实验已经证明(-)-石杉碱甲药效是外消旋体的2倍，是(+)-石杉碱甲的33倍。目前，市面上的石杉碱甲目前仍主要从石松(lycopodium)类植物中分离获取石杉碱甲。浙江省南部与西部山地主产石松及其近缘植物，国内南方各省山区也均有产。

传统的石杉碱甲分离方法有酒石酸浸泡、盐酸渗漉、Soxhlet抽提以及用乙醇回流提取、硅胶柱层析等，这些方法缺点是耗时、有机试剂用量多、得率低以及杂质较多。盐酸渗漉法以生药粗粉用2％HCl渗漉，继而以阳离子树脂交换，所得总碱用胶G柱层析低压分离，再以乙醇-冰醋酸洗脱。按色带不同分成6部分，不同部分再进一步分离，利用制备性薄层层析分离得到石杉碱甲。此法步骤繁琐，使用的试剂较多，成本高，得率低，不适合工业化，只适用于实验室少量分离。乙醇提取法是以95％的乙醇浸泡提取石松生物碱，再以稀NaOH溶液萃取，所得的酚性生物碱再以碱性硅胶柱层析，接着用氯仿-甲醇洗脱，各流份以薄层层析检查，最后用丙酮进行重结晶得到石杉碱甲晶体。此法提取分离石杉碱甲相对来说工艺流程缩短了，但是提取不完全，得率低，费用高。沈生荣等用氯仿制成总碱浸膏再用盐酸进行萃取的方法分离得到石杉碱甲。查圣华，李秀男等利用微波协助提取及超声提取石杉碱甲等法，与传统提取方法相比有固液分离次数少，处理时间短，操作简便；溶剂耗量少，成本低；选择性好，杂质较少；能量传输效果好等优点，但是费用高，不便用于产业化。

泡沫分离技术是以气泡作为分离介质，利用原料液中不同组分表面活性的差异，使具有表面活性的物质被吸附在气泡表面，通过收集泡沫相，富集表面活性物质，实现分离和纯化的一种新型技术，

表面活性剂具有亲水基和亲油基，即表面活性剂具有双亲结构，能形成胶团，对天然药物有效成分具有增溶作用，能提高浸出效能和提取率，能显著地降低溶液的表面或界面张力，且表面活性剂可使溶液形成稳定、丰富的泡沫。因此表面活性剂参与的分离过程一般都有效率高、能耗低的特点。

表面活性剂的泡沫分离集分离和浓缩两项功能于一身，是以界面吸附为基础的分离技术。根据文献中的物理模型，吸附在泡沫表面的表面活性剂与溶质的作用力有两种：一种是表面活性剂与溶质间离子-离子作用力，它有良好的选择性和高的提浓率，表面活性离子在气/液界面上吸附，形成定向离子层，此离子层对反离子有电性引力，不同的反离子，吸引力亦不同，利用这种性质，可以把溶液中的某些物质(离子性的)随所形成的泡沫分离出来。特别是对于浓度很稀、含量很少的物质，其他方法往往不易于分离，使用此法可得到较好的效果；另一种是离子-偶极间作用力。因此，基于表面活性剂的泡沫分离能够更有效进行物质分离，达到分离效率高、耗能低、污染小的优点。

依据泡沫分离法的以上种种优点，石杉碱甲是一种低含量的石松类生物碱，我们从分子结构的角度进行研究，发明了泡沫分离法分离石杉碱甲，这是一种非色谱的高效分离方法。该方法省时、省力，成本低，并且工艺稳定、低能耗、环境友好，容易工业化，其工艺技术非常适合于一般中型药厂现有设备。

(三)发明内容

本发明的目的就是利用阴离子表面活性剂的特点，提供一种高效率的分离石杉碱甲的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种泡沫分离法分离千层塔中石杉碱甲的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：

(1)先检测千层塔浸膏中石杉碱甲的含量，然后将千层塔浸膏溶于乙醇，得到总碱稀溶液，然后和阴离子表面活性剂加入泡沫分离塔内，搅拌均匀后从塔底连续鼓入空气，所述空气的气体流量以原料液总的体积量计为300～600ml/(min·L)，形成泡沫，收集泡沫直至无泡沫产生，得到的泡沫由塔顶排出得到泡沫液；所述阴离子表面活性剂为如式I所示的烷基磺酸钠、如式II所示的烯基磺酸钠或如式III所示的烷基苯磺酸钠；所述的千层塔浸膏为以酸为提取剂以渗漉法获得提取液浓缩后得到，可市售获得或以原料千层塔采用以酸为提取剂以渗漉法获得提取液浓缩后得到，这里说的酸为无机酸或有机酸，通常是盐酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸或苹果酸，以硫酸为最佳选择；所述的乙醇的用量以千层塔浸膏的质量计为2～3ml/g，所述的阴离子表面活性剂与石杉碱甲的物质的量比为2～3∶1。

(2)步骤(1)得到的泡沫液离心，取离心沉淀物溶于5～10wt％NaOH水溶液，搅拌反应，过滤取滤饼得石杉碱甲粗品，石杉碱甲粗品用重结晶溶剂进行重结晶，干燥得石杉碱甲成品；所述的重结晶溶剂为氯仿、乙醇或甲醇；

R₁CH₂CH₂SO₃NaR₂CH＝CHCH₂SO₃Na

I    II

式I、式II或式III中，R₁、R₂或R₃各自独立为C10～C14的烷基。

本发明所述的步骤(1)中，泡沫分离塔中的温度为25～40℃。

所述泡沫分离塔的柱高与内径比为14～16∶1。

本发明所述的泡沫分离塔为本领域技术人员所熟知的设备，可以购买得到，也可自制得到。

所述步骤(1)中阴离子表面活性剂优选为十二烷基苯磺酸钠，十二烷基磺酸钠，α-十四烯基磺酸钠。

所述空气的气体流量以原料液总的体积量计为300～600ml/(min·L)，所述原料液即为总碱稀溶液和阴离子表面活性剂的混合液，所述原料液的体积以乙醇的体积计算。

所述步骤(2)中离心为在10000-20000rpm转速下离心15～25分钟。

所述步骤(2)中NaOH水溶液的质量分数为5～10wt％。

所述步骤(2)中NaOH水溶液的用量为以离心沉淀物的质量计为2～4ml/g。

所述步骤(2)中重结晶溶剂的用量以石杉碱甲粗品的质量计为2～3ml/g。

本发明所述的千层塔浸膏为市售或以原料千层塔以酸为提取剂采用渗漉法获得提取液浓缩后得到，通常可以按照如下方法制得：将原料千层塔粉碎后在罐中用酸动态循环浸泡38～60小时，放液3～6次收集得到渗漉液，然后将渗漉液在50℃～65℃温度下真空减压浓缩至原体积的1～10％，得到所述千层塔浸膏，所述的酸通常是盐酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸或苹果酸，最优选硫酸。所述方法是本领域技术人员普遍知晓的。

发明人从分子结构的角度进行研究，经过多次的实验，筛选出了适合于石杉碱甲的阴离子表面活性剂，该阴离子活性剂的-SO₃ ^-不仅与石杉碱甲的--NH₃ ⁺进行酸碱结合，而且在分子间匹配上也是最合适的，因此选用的基于该阴离子表面活性剂的泡沫分离法可以对石杉碱甲进行有效分离，这是一种非色谱的高效分离方法。

发明人利用泡沫分离技术对石杉碱甲进行分离纯化，得到产品收率高达86％，并随气体流量、石杉碱甲的初始进料浓度、泡沫分离柱的高度和内径的增加而增大。泡沫分离所得石杉碱甲的质量纯度达到65％。

本发明的优点在于：我们所发明的方法基本上没有使用有毒有机试剂，从而减少了常规方法使用大量有机试剂所带来有毒试剂排放、污染等一系列问题，有效的达到了减排、环保的功能。而且，以该方法代替柱层析，不仅缩短了三分之一的工艺路线，缩短一半工时，生产成本为层析方法的十分之一，还省时、省力，成本低，并且工艺稳定、低能耗、环境友好，容易工业化，其工艺技术非常适合于一般中型药厂现有设备。

(四)具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1：

将称取千层塔浸膏(市售，西安三维生物技术有限公司)100克(石杉碱甲含量1％)，溶于200ml乙醇中搅拌均匀，得总碱稀溶液。然后将总碱稀溶液和活性剂十二烷基磺酸钠(3克)投入泡沫分离塔(Terada Pump寺田泵制作所MS-S小型泡沫分离器，总容量2L，下同)中，泡沫分离塔的柱高与内径比为14∶1，控制泡沫分离塔中的温度为30℃，搅拌均匀，经塔底引入空气，空气的气体流量为120ml/min，进行鼓泡，得到的泡沫由塔顶排入贮槽，得到泡沫液，收集泡沫直至无泡沫产生。将泡沫液10000rpm离心15分钟，取离心沉淀物投入到12ml 10wt％的NaOH水溶液中充分反应，进行搅拌，过滤取滤饼得到石杉碱甲粗品，石杉碱甲粗品用7ml甲醇进行重结晶、真空冷冻干燥，得到石杉碱甲成品2.2克，其成品纯度为40％(液相色谱/LC-20A岛津液相色谱仪检测)，收率高达88％。

实施例2：

称取千层塔浸膏(市售，西安三维生物技术有限公司)120克(石杉碱甲含量2％)，溶于250ml乙醇中搅拌均匀，得总碱稀溶液。然后将总碱稀溶液和活性剂十二烷基苯磺酸钠(7克)倒入泡沫分离塔中，控制泡沫分离塔中的温度为30℃，经塔底引入空气，空气的气体流量为150ml/min，进行鼓泡，得到的泡沫由塔顶排入贮槽，得到泡沫液，收集泡沫直至无泡沫产生。将泡沫液进行离心，10000rpm离心20分钟，取离心沉淀物，投入到15ml 10wt％的NaOH溶液中充分反应，进行搅拌以便除去十二烷基苯磺酸钠，过滤取滤饼得到石杉碱甲粗品，石杉碱甲粗品用8ml乙醇进行重结晶，最后将其真空冷冻干燥，得到石杉碱甲成品3.6克，其成品纯度为52％(液相色谱/LC-20A岛津液相色谱仪检测)，收率高达78％。

实施例3：

称取千层塔浸膏(市售，西安三维生物技术有限公司)140克(石杉碱甲含量3％)，溶于280ml乙醇中，得总碱稀溶液。然后将总碱稀溶液和活性剂十二烯基磺酸钠(12克)倒入泡沫分离塔中，控制泡沫分离塔中的温度为30℃，经塔底引入空气，空气的气体流量为150ml/min，进行鼓泡，得到的泡沫由塔顶排入贮槽，得到泡沫液，收集泡沫直至无泡沫产生。将泡沫液进行离心，10000rpm离心25分钟，取离心沉淀物，然后将所得的沉淀物投入到24ml 10wt％的NaOH溶液中充分反应，进行搅拌，过滤，除去十二烯基磺酸钠，取滤饼得到石杉碱甲粗品，石杉碱甲粗品用14ml乙醇进行重结晶，最后将其真空冷冻干燥，得到石杉碱甲成品6克，其成品纯度为60％(液相色谱/LC-20A岛津液相色谱仪检测)，)，收率为85.6％。

实施例4：

称取千层塔浸膏(市售，西安三维生物技术有限公司)150克(石杉碱甲含量4％)，溶于300ml乙醇中，得总碱稀溶液。然后将总碱稀溶液和活性剂a-十四烯基磺酸钠(18克)倒入泡沫分离塔中，控制泡沫分离塔中的温度为30℃，经塔底引入空气，空气的气体流量为180ml/min，进行鼓泡，得到的泡沫由塔顶排入贮槽，得到泡沫液，收集泡沫直至无泡沫产生。将泡沫液进行离心，10000rpm离心15分钟，取离心沉淀物，然后将沉淀物投入到50ml 5wt％的NaOH溶液中充分反应，过滤，除去a-十四烯基磺酸钠，取滤饼得到石杉碱甲粗品，石杉碱甲粗品用18ml甲醇进行重结晶，最后将其真空冷冻干燥，得到石杉碱甲成品8.2克，其成品纯度为56％(液相色谱/LC-20A岛津液相色谱仪检测)，收率为76.5％。

实施例5：

称取千层塔浸膏(市售，西安三维生物技术有限公司)200克(石杉碱甲含量5％)，溶于400ml乙醇中，得总碱稀溶液。然后将总碱稀溶液和活性剂a-十四烯基磺酸钠(25克)倒入泡沫分离塔中，控制泡沫分离塔中的温度为30℃，经塔底引入空气，空气的气体流量为240ml/min，进行鼓泡，得到的泡沫由塔顶排入贮槽，得到泡沫液，收集泡沫直至无泡沫产生。将泡沫液进行离心，10000rpm离心15分钟，取离心沉淀物，然后将所得的沉淀物投入到52ml 10wt％的NaOH溶液中充分反应，过滤，除去a-十四烯基磺酸钠，取滤饼得到石杉碱甲粗品，石杉碱甲粗品用30ml乙醇进行重结晶，最后将其真空冷冻干燥，得到石杉碱甲成品13.1克，其成品纯度高为65％(液相色谱/LC-20A岛津液相色谱仪检测)，收率高达85％。

实施例6：

称取千层塔浸膏(市售，西安三维生物技术有限公司)210克(石杉碱甲含量5％)，溶于500ml乙醇中，得总碱稀溶液。然后将总碱稀溶液和活性剂十二烷基苯磺酸钠(30克)倒入泡沫分离塔中，控制泡沫分离塔中的温度为40℃，经塔底引入空气，空气的气体流量为300ml/min，进行鼓泡，富集得到的泡沫由塔顶排入贮槽，得到泡沫液，收集泡沫直至无泡沫产生。将泡沫液进行离心，20000rpm离心15分钟，取离心沉淀物，然后将沉淀物投入到30ml 10wt％的NaOH溶液中充分反应，过滤，除去十二烷基苯磺酸钠，取滤饼得到石杉碱甲粗品，石杉碱甲粗品用30ml乙醇进行重结晶，最后将其真空冷冻干燥，得到石杉碱甲成品14.6克，其成品纯度为62.5％(液相色谱/LC-20A岛津液相色谱仪检测)，收率为87％。

Claims (8)

1.一种泡沫分离法分离千层塔中石杉碱甲的方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：

(1)先检测千层塔浸膏中石杉碱甲的含量，然后将千层塔浸膏溶于乙醇，得到总碱稀溶液，然后和阴离子表面活性剂加入泡沫分离塔内，搅拌均匀后从塔底连续鼓入空气，所述空气的气体流量以原料液总的体积量计为300～600ml/(min·L)，形成泡沫，收集泡沫直至无泡沫产生，得到的泡沫由塔顶排出得到泡沫液，所述原料液为总碱稀溶液和阴离子表面活性剂的混合液，所述原料液的总的体积量以乙醇的体积计算；所述阴离子表面活性剂为如式I所示的烷基磺酸钠、如式II所示的烯基磺酸钠或如式III所示的烷基苯磺酸钠；所述的千层塔浸膏为以酸为提取剂以渗漉法获得提取液浓缩后得到；所述的乙醇的用量以千层塔浸膏的质量计为2～3ml/g，所述的阴离子表面活性剂与石杉碱甲的物质的量比为2～3∶1；

(2)步骤(1)得到的泡沫液离心，取离心沉淀物加入NaOH水溶液，搅拌充分反应，过滤取滤饼得石杉碱甲粗品，石杉碱甲粗品用重结晶溶剂进行重结晶，干燥得石杉碱甲成品；所述的重结晶溶剂为氯仿、乙醇或甲醇；

式I、式II或式III中，R₁、R₂或R₃各自独立为C10～C14的烷基。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中泡沫分离塔中的温度为25～40℃。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中阴离子表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠，十二烷基磺酸钠或α-十四烯基磺酸钠。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中离心为在10000～20000rpm转速下离心15～25分钟。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中NaOH水溶液的质量分数为5～10wt％。

6.如权利要求1～5之一所述的方法，其特征在于所述泡沫分离塔的柱高与内径比为14～16∶1。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酸为盐酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸或苹果酸。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中NaOH水溶液的用量以离心沉淀物的质量计为2～4ml/g。