CN101743321B - 包含光学侦测装置的生物检测系统、及生物分子的侦测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种生物检测系统，包括多个光学侦测器，该光学侦测器各包括具有光侦测器的基材，以及于该光侦测器上形成连接位置，该连接位置经处理后使上述生物分子固定于上述连接位置。上述连接位置位于上述光侦测器附近，与上述光侦测器的间隔为小于或等于100μm。上述光侦测器收集上述生物分子在接收讯号角度为0.8SI球面度(steridian)或以上发射的光。上述光学侦测器可进一步包括激发光源，其形成于上述基材上，提供光源用于激发附着于上述生物分子的荧光分子。

Description

包含光学侦测装置的生物检测系统、及生物分子的侦测方法
相关申请
本申请要求2007年10月25日提交的美国临时专利申请号60/996,016和2008年3月14日提交的美国临时专利申请号61/036,652的优先权的权益，将这两篇申请的全部内容通过题述以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及一种生物检测系统，包括多个光学侦测器，以及该生物检测系统用于侦测及分析生物分子，例如核酸的用途。本发明还涉及一种生物检测系统，包括至少10,000个光学侦测器，并行监测大量的荧光团(fluorophore)以侦测及分析该生物分子。
背景技术
人类基因组计划(HGP)刺激测序大量增加，导致测序成本相对降低。相较于人类基因组计划耗费13年接近三十亿美元的支出；最近完成的两个个人基因组测序，每一基因组(genome)的测序成本明显减少(McGuire et al.，Science 317：1687(2007))。未来在个人化医疗的治疗上，个人基因组测序代表一种新思维转换。根据大量完成的基因信息，药物基因组学(pharmacogenomics)的发展，将使个人化的药物设计开发更有效率。并藉由管理疾病的基因危险因子，照顾者可更轻易实施预防医学并提供个人专属的治疗。
为使个人专属医疗普及化，美国国家卫生研究院(NIH)的国家人类基因组研究机构(NHGRI)，设定完成一个人类基因组测序成本降低的目标，由目前约百万美元降至一千美元。传统高通量的毛细管电泳以及自动化的基因组测序技术不能满足的个体基因组测序持续加增的需求。现行的测序方法使用的影像取得及分析步骤较为复杂且易发生错误(error-prone)。例如，许多现行技术需要移动数组或侦测系统，以捕捉多重影像。得到的影像必须再被堆砌、排列及分析。影像的获得、加工及分析步骤皆可能产生错误并需要昂贵装备且耗费较长的时间。相反地，现行的系统不涉及可移动的光学装置，通常限制在中度的侦测通量。而且，现行装置不将被侦测分子放置于对应的侦测单位的附近，实质上限制讯号侦测的灵敏度。
因此，为了达到”1000元美金基因组”测序的目标，需要一种降低核酸测序成本的装置。该装置可并行测序多个分子，并具有简化的设计及制作过程，以及避免现行装置与方法的复杂及错误倾向的扫描与影像分析过程。而且，该装置应可测序单一分子，简化群集分子测序方法中核酸序列复制扩增的步骤，及避免群集分子测序时，不同分子反应不同步导致的长序列读序困难。
发明内容
本发明提供一种生物检测系统，包括多个光学侦测器，以及提供一种使用该生物检测系统侦测核酸的方法，例如核酸测序。本发明之生物检测系统可进行大量平行测序反应，即同时对大量的不同核酸模板进行测序。每一测序反应使用单一分子作为模板(即单一分子测序)。本发明提供的装置还具有简化的设计，排除现行装置所需的复杂、昂贵、及有错误倾向的扫描与侦测步骤。本发明系统的简化设计及功能一部分基于直接对应被侦测核酸连接于其上的侦测连接位置(linker site)(直接连接或如经由聚合酶分子连接)，同时可侦测一个或多个的侦测单位(如光侦测器)，一部份基于连接位置与侦测单位间的短距离。本发明的一些实施方案中，核酸与该侦测单位间的短距离，以侦测的大的接收讯号角度(solid angle)方式表现。
本发明一方面提供一种生物检测系统，在侦测单位上辨识单一生物分子。此生物检测系统包括多个光学侦测器，该光学侦测器各包括具有光侦测器的基材，以及于该光侦测器上形成的连接位置，该连接位置经处理后使该生物分子固定于该连接位置，其中该连接位置邻近于上述光侦测器上。本发明的实施方案中，上述连接位置与上述光侦测器的间隔距离为小于或等于100μm，上述光侦测器收集上述生物分子在接收讯号角度为0.8SI球面度(steridian)或以上发射的光。上述光学侦测器可进一步包括激发光源，其形成于上述基材上，提供光源以激发附着于上述生物分子上的荧光团(fluorophore)。
本发明另一发明方面提供一种核酸的侦测方法，藉由于本发明的光学侦测器的上述连接位置上连接至少一个核酸(直接连接，或连接于核酸聚合酶，该核酸聚合酶连接于上述连接位置)，侦测在对应的光侦测器上的核酸。本发明的实施方案中，侦测上述核酸的杂交作用，例如杂交至具有标记的探针。本发明的实施方案中，上述核酸通过在上述光学侦测器上进行核酸测序而侦测。本发明的实施方案中，该核酸测序方法选自碱基延伸测序、末端磷酸标记的测序、及摇摆测序(wobble sequencing)。本发明的特定实施方案中，上述测序反应为碱基延伸反应。本发明的特定实施方案中，上述碱基延伸测序反应进一步包括在上述光学侦测器中加入具有阻断基与标记的核苷酸的步骤。本发明的特定实施方案中，上述核苷酸以荧光团(fluorophore)标记。
另一方面，本发明亦提供一种侦测样本分子的方法。本发明的实施方案中，此方法包括将标记的样本分子固定于本发明的光学侦测器上的连接位置，在对应的光侦测器上侦测该样本分子。本发明的实施方案中，上述样本分子以连结分子固定至连接位置。本发明的实施方案中，上述连接分子包括：(1)捕捉分子，适合连接上述样本分子，及(2)核酸标签。本发明的特定实施方案中，将上述样本分子涂铺于本发明的光学侦测器，其中该光学侦测器上的连接位置上已固定有连接分子。其它实施方案中，样本分子可与连接分子结合，形成结合复合物，然后将此结合复合物涂铺于上述光学侦测器，使其固定在连接位置。本发明的特定实施方案中，上述样本分子为生物分子，例如多肽、核酸、脂质、多糖、或代谢物。
本发明的具体实施详细说明如下，然而以下的实施方案仅用于进一步公开本发明之技术内容，不应藉以限制本案的发明范畴。
附图简述
第1图显示本发明的生物检测系统的上视图，包括一光学侦测器阵列。
第2图显示本发明的一个实施方案的光学侦测器，为第1图的AA线下的剖面图。
第3图显示本发明的光学侦测器的尺寸详细说明的剖面图。
第4图显示本发明的一个实施方案的光学侦测器，为第1图的AA线下的剖面图。
第5图显示本发明的一个实施方案的滤光层构成表。
第6图显示本发明的装置的连接位置上连接核酸的情形。
第7图显示在以阻断与标记核苷酸进行一个循环的碱基延伸后，该装置的连接位置上连接核酸的情形。
第8图显示如第7图的碱基延伸测序反应的另一实施方案。
第9图显示以碱基延伸测序并行测序数个核酸的一个循环。
发明详述
1.生物检测系统
本发明的生物检测系统可用于并行监测大数目(例如一些实施方案中10,000个以上)的单一生物分子。本发明的生物检测系统可包括多个光学侦测器。每一个光学侦测器，藉由侦测该荧光团(fluorophore)发射的光子，可感测该单一分子上的荧光团(fluorophore)存在。经由并行操作上述光学侦测器，本发明的生物检测系统可以高通量(high throughput)辨识组织样本中的基因组序列或表达基因的型态。
如第1图显示本发明的生物检测系统1。生物检测系统1包括生物检测基材10及多个光学侦测器20形成于基材10上。每一个光学侦测器20可独立运作，侦测及辨识其固定的单一生物分子。例如单链DNA序列的辨识，可经由逐步进行碱基延伸及以光学侦测器20侦测与该延伸的碱基偶联的荧光团(fluorophore)所发出的光。藉由在基材10上整合大数量的光学侦测器20，可并行侦测及辨识大数量的单一生物分子。生物检测系统1可根据选择的设计，可包括至少10,000个、250,000个、2,000,000个、10,000,000个或以上的光学侦测器20形成于基材10上。
生物检测系统1可进一步包括侦测与记录系统2，其与基材10连接，用以控制光学侦测器20的运作，及记录光学侦测器20所得的数据。而且，生物检测系统1可进一步包括激发光源(图未显示)。此激发光源可产生激发光，诱导荧光团(fluorophore)发射出荧光。本发明的一个实施方案中，该激发光源可单独设置，不在光学侦测器20或生物检测基材10上。在另一实施方案中，该激发光源可设置于光学侦测器20或生物检测基材10上。
在本发明的特定实施方案中，如第1图所示，光学侦测器20由上向下观看可为圆形。光学侦测器20可具有其它几何图形，例如矩形、多角形、卵形、或其它类似形状。而且，第1图显示多个光学侦测器20排列成矩形晶格图案。光学侦测器20亦可排列成其它图案，例如三角晶格图案、蜂巢晶格图案、或其它类似图案。
由于生物检测系统1的多个光学侦测器20独立运作，以下仅以一个光学侦测器20说明本发明的其它实施方案。虽然仅描述一个光学侦测器20，但可以了解生物检测系统1中的不同光学侦测器20不需相同。可根据本发明不同实施方案的需要设计，建构不同型态的光学侦测器20。
第2图显示本发明的一个实施方案中，沿第1图中AA线所示的光学侦测器20剖面图。如第2图所示，光学侦测器20包括光侦测器210，其形成于基材10上，及连接位置220，其形成于光侦测器210上。而且，光学侦测器20可进一步包括控制回路215，其形成于基材10上，用以控制光侦测器210的运作。控制回路215可连接于侦测与记录系统2，以接收来自侦测与记录系统2的控制指示，并传送侦测讯号至侦测与记录系统2。在本发明的实施方案中，基材10可为玻璃基材、半导体基材(如硅)、或塑料基材。本发明的实施方案中，每一光侦测器210可对应一个或多个的控制回路215。
本发明的实施方案中，光侦测器210可包括单一光导光子侦测器(photoconductive photon detector)或一组光导光子侦测器。在另外的实施方案中，光侦测器210可包括单一光电光子侦测器(photovoltaic photon detector)或一组光电光子侦测器。在另外的实施方案中，光侦测器210可包括单一光二极管(photodiodes)或一组光二极管。在另外的实施方案中，光侦测器210可包括单一雪崩光二极管(avalanche photodiodes)或一组雪崩光二极管。在另外的实施方案中，光侦测器210可包括单一光敏晶体管(phototransistor)或一组光敏晶体管。
本发明的实施方案中，光学侦测器20可进一步包括遮光片230于光侦测器210上。遮光片230可包括小孔235。在本发明的实施方案中，小孔235可为圆形，具有直径D1小于或等于1,000、500、300、200、150、或100nm。小孔235可具有其它形状，例如卵形、矩形、或其它类似形状。本发明的实施方案中，遮光片230可包括不透明材料，以阻挡不想要的光到达光侦测器210。因此经由小孔235使所希望的光到达光侦测器210。
连接位置220可形成于小孔235附近。在第2图所示的实施方案中，连接位置220形成于小孔235内。在本发明的实施方案中，连接位置220形成于小孔235附近，与光侦测器210的距离H1为小于或等于100μm的距离。在另外的实施方案中，距离H1可为小于或等于75、50、25、15、10、5、3μm的距离。
光学侦测器20可进一步包括滤光层240(选择性)及微透镜250(选择性)，于光侦测器210及遮光片230间。虽然第2图显示滤光层240形成于微透镜250之上，但可了解滤光层240也可形成于微透镜250之下。在本发明的实施方案中，滤光层240可包括单一透明层，或多个具有不同反射系数的透明次层。当滤光层240包括多个亚层时，可经由逐步在基材10上沉积该亚层，形成滤光层240。在本发明的实施方案中，具有较高反射系数的亚层可由两个具有较低反射系数的亚层以三明治形式沉积。在另外的实施方案中，具有较低反射系数的亚层可由两个具有较高反射系数的亚层以三明治形式沉积。在本发明的实施方案中，滤光层240可包括具有单一区域的层，或多个于不同波长范围具有不同透明度的亚区域。
如第2图所示，连接位置220可经处理后使单一生物分子30固定于其上。在实施方案中，生物分子30可包括单链DNA分子32及连接于DNA分子32的末端引物34。生物分子30可经由末端连接引物34固定于连接位置220。而且，DNA分子32可以荧光团(fluorophore)36标记。当以第一波长λ1激发光被激发时，荧光团36可发射出第二波长λ2的荧光。在本发明的实施方案中，第一波长λ1较第二波长λ2短。在另外的实施方案中，第一波长λ1较第二波长λ2长，例如在多光子激发中。然后光侦测器210侦测自荧光团36发出的荧光，辨识荧光团36所附着的碱基，因而逐步辨识DNA分子32的序列。
第3图显示本发明实施方案的光学侦测器20的剖面图。如第3图所示，遮光片230形成于光侦测器210之上，与光侦测器210的垂直间隔距离H1。具有一厚度T的遮光片230，包括半径R1(直径D1的一半)的小孔235。在此实施方案中，连接位置220可形成于小孔235中，与生物分子连接(图未显示)。
当在连接位置220上的第一位置36A发现荧光团36且第一位置36A与连接位置220距离H2时，半径R2的光侦测器210可收集荧光团36在第一接收讯号角度(solid angle)θ1发射的光。当在第二位置36B发现荧光团36且荧光团36几乎接触到连接位置220(即距离H2接近0或小于1μm)时，然后光侦测器210收集荧光团36在第二接收讯号角度θ2发射的光。第二接收讯号角度θ2大于第一接收讯号角度θ1，提供实质上较强的信号。
为了使光侦测器210暴露在由荧光团36经小孔235发出的荧光，光侦测器210的半径R2必须大于或等于第二接收信号角度θ2投射在光侦测器210的上表面的半径。藉由使遮光层230(或连接位置220)更接近光侦测器210(即减少距离H1)，然后光侦测器210收集在接收信号角度内较集中的光(即较强的光信号)。在实施方案中，遮光片230(或连接位置220)及光侦测器210具有一小距离H1，因此第二接收信号角度θ2具有至少0.8SI球面度(steridian)。
第4图显示本发明的实施方案，沿第1图中AA线所示的光学侦测器20剖面图。此实施方案中，激发光源40位于光学侦测器20上。如第4图所示，激发光源40形成于光学侦测器20的遮光片230上。本发明是实施方案中，激发光源40可包括p型及n型半导体层(410及430)，发光层420位于层410与层430的接面区。层410与层430可与电源连接。根据层410、420、及430使用的材料及/或材料的物理与原子结构，激发光源40可为发光二极管(LED)、发光激光二极管(LD)、有机发光二极管(OLED)、或聚合物发光二极管(PLED)。无机材料，例如砷化镓、磷化铟、锑化镓、及氮化镓；有机材料，例如与聚(对苯乙炔)骨架共轭的聚合物，皆为可用于制造发光的接面二极管的半导体材料。
另外的实施方案中，激发光源40可形成遮光片230或形成于遮光片230内。在本发明的实施方案中，激发光源40位于光学侦测器20中，发出一波长带的光或多个波长带的光。激发光源40可在一时间发出一波长带的光或数种波长带的光。
如第4图所示，激发光源40可在其中心部位包括孔穴450，使小孔235暴露出来。在此实施方案中，连接位置220不形成于小孔235内。而且，连接位置220可形成于孔穴450内，并接近小孔235。此实施方案中，激发光源40形成遮光片230或形成于遮光片230之内时，孔穴450形成小孔235或形成于小孔235之内。本发明的实施方案中，小孔235可使用适当方法，藉由例如蚀刻遮光片230及层410，形成于层410与遮光片230的中心部位。
而且，经由金属接点415形成于较低层410上以及金属接点435形成于较上层430上，激发光源40可与电源440连接。电源440可单独存在，由侦测与记录系统2控制，或整合于侦测与记录系统2中。
激发光源40的发光层420可发出激发光，如第4图的发光层的箭头方向，沿水平方向发光至孔穴450。此实施方案中，激发光沿着实质平行于遮光片230的上表面发出。因此，激发光不会干扰荧光到达光侦测器210。本发明的光学侦测器20因此较传统装置更正确地辨识生物分子。
2.核酸的侦测
本发明的生物检测系统(包括例如单一或多个的光学侦测器)可作为分子侦测系统的一部份或用于分子侦测的方法或步骤中，例如核酸测序。本发明的生物检测系统及使用的方法或步骤，有效作为分析及诊断应用。这些应用可为私人、公众、商业、或产业用途。
本发明的实施方案中，本生物检测系统适合于大规模并行的核酸测序。由于该生物检测系统的连接位置及光侦测器间的直接对应关系，和/或连接位置与光侦测器非常接近(实施方案中，显示接收信号角度大)，本发明的生物检测系统可用于测序核酸，而无需昂贵、复杂、及有错误倾向的扫描与分析系统，例如可移动的扫描透镜或可移动的装置平台及之后的影像分析，因此可减少错误与成本。本生物检测系统可藉由大幅增强的信号强度而侦测光信号，使单一分子得以被分析。
本发明的生物检测系统可用于多样的测序模式，且适合测序单一分子。而且，相较于现行的生物芯片装置，本发明的光学侦测器具有简化设计、组合、及生产。例如被测序的核酸可随机固定于阵列上的连接位置，避免使用费时且昂贵的机械在预定位置上进行放置或合成核酸。
本发明的生物检测系统可作为生物分子侦测方法及步骤中的系统的一部分，包括核酸杂交或测序，例如对全基因组测序、转录图谱(transcriptionalprofiling)、比较转录图谱(comparative transcriptional profiling)、或基因鉴定。生物分子的侦测也可包括连接作用的侦测及/或测量，例如蛋白质/蛋白质、抗体/抗原、受体/配体、及核酸/蛋白质。这些应用可作为分析或诊断的步骤及方法。
适合于本发明系统侦测的核酸，在实施方案中，可为连接分子(linkingmolecule)的一部份，固定适合分析连接作用(binding interaction)的分子在本发明提供的装置的连接位置，该分析的连接作用的分子例如蛋白质、其它核酸、碳氢化合物分子部份、或小分子。本发明的实施方案中，上述的连接分子进一步包括捕捉分子，与被分析连接作用的分子连接。在连接分子中的核酸经由例如直接测序或杂交，作为该连接分子中捕捉分子的鉴定标签。
本发明的方法通常包括将欲侦测分子固定于本发明提供的装置的地址阵列。本发明的实施方案中，上述地址阵列包括具有多个小孔235的遮光片230，及连接位置220，形成于小孔235中或周围。如第1、2图的实施方案所示。因此，本发明的生物检测系统可同时读取百万个核酸片段。假设每一片段为1000个碱基长度，装置可获得十亿个片段信息，使例如全基因组测序及再测序成为可能。
2.1侦测的分子
适合本发明方法侦测的核酸可包括任何核酸，包括例如DNA、RNA、PNA(肽核苷酸)，且可包括任何已知及未知的序列，包括天然发生的序列或人造序列。该核酸可为天然衍生的、重组产生的、或化学合成的。该核酸可包括天然发生的核苷酸、自然界不存在的核苷酸类似物、或修饰核苷酸。侦测的核苷酸长度根据实际的应用而异。在本发明的实施方案中，核酸包括至少10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000个碱基或以上。本发明的实施方案中，核酸可为10-20、10-50、10-100、50-100、50-500、50-1000、50-5000、500-2,000、500-5,000、或1,000-5,000个碱基。
侦测的核酸可为单链。单链核酸模板可由已知方法衍生自双链分子，例如加热、碱处理或其它化学处理。单链核酸模板也可由如化学合成或试管内合成而制造。
本发明的实施方案中，侦测的核酸以其5’端或3’端连接至连接位置。本发明实施方案中，该核酸进一步包括一个或多个的末端连接引物，偶联至该核酸的5’端、3’端、或5’端及3’端。在特定实施方案中，该末端连接引物固定于该核酸的3’端。末端连接引物可用于固定欲侦测的核酸至装置上的连接位置，提供一个或多个侦测引物的互补序列，该侦测引物例如测序引物。
2.1.1末端连接引物
末端连接引物为短核酸分子，通常由少于100个核苷酸所组成。本发明的实施方案中，该末端连接引物为至少5、10、15、20、25、30、50、75、90个核苷酸或以上的长度。在特定的实施方案中，末端连接引物为8-25、10-20、10-30、或10-50个核苷酸长。在本发明的实施方案中，该末端连接引物不具有分支，然而在其它实施方案中，该末端连接引物具有分支。
该末端连接引物可用于使欲侦测核酸附着至地址阵列上的连接位置。本发明的实施方案中，该末端连接引物可将该核酸直接连接至阵列表面，例如藉由共价连接(如酯或硫键)或非共价连接，例如抗原/抗体或生物素(biotin)/抗生物素蛋白(avidin)连接，如第6、7图所述。本发明的实施方案中，该末端连接引物将核酸间接连接至阵列表面，例如藉由连接一中间分子，如聚合酶，如第8图所示。因此，该末端连接引物可包括修饰核苷酸或其它修饰以加速连接至连接位置，以本领域已知的方法，例如二硫、硫酯、酰胺、磷酸二酯、或酯键；或藉由抗原/抗体或生物素(biotin)/抗生物素蛋白(avidin)连接，例如该末端连接引物包含核苷酸，该核苷酸包括抗原部份或生物素化核苷酸。在特定的实施方案中，修饰核苷酸位于末端连接引物的3’端。在本发明的实施方案中，末端连接引物的5’端包括修饰核苷酸。
该末端连接引物也可作为用于侦测该核酸的一个或多个的引物的补体，例如测序引物。本发明的实施方案中，该引物用于以杂交侦测该核酸，例如该引物包含可侦测标记，例如荧光或放射性同位素标记。本发明的实施方案中，该末端连接引物的5’端包括互补于测序引物的序列。本发明的实施方案中，将互补于该测序引物的末端连接引物序列定位，因此该测序引物的3’端立即相邻于被测序的核酸中第一个核苷酸。
如第6图显示一实施方案中被测序的核酸固定于本发明的光学侦测器20的表示图。单链核酸32、末端连接引物34、及黏合的测序引物346，被固定于经处理具有反应官能基的连接位置220，使修饰的核苷酸344连接于末端连接引物34。本发明的实施方案中，核酸32藉由其5’端连接至连接位置220，末端连接引物34连接于核酸32的3’端，作为测序引物346的补体。
本发明的实施方案中，以连接酶(ligase)使末端连接引物添加于欲侦测的核酸上，该连接酶例如DNA连接酶。在本发明的实施方案中，在连接(ligation)前，末端连接引物及欲侦测的核酸皆为单链。在另外的实施方案中，两者皆为单链。在其它的实施方案中，一为单链、另一为双链。连接(ligation)为本领域中已知的方法。例如，在聚合酶群落测序方法(polony sequencingmethod)中，薛杜尔等人使用新英格兰生物试验(NEB)快速连接试剂盒，使T30末端连接引物(32pb)连接至样本DNA片段(Shendure et al.，2005，Science，309：1728-1732)。此述的连接反应溶液包括在1X快速连接缓冲液中含有DNA 0.26pMole、T30末端连接引物0.8pMole、T4DNA连接酶4.0μl。混合后，将此反应液在室温下培养约10分钟，然后放在冰上。此连接反应以加热样本至65℃、10分钟终止。
在其它实施方案中，末端连接引物合成于欲侦测的核酸上。例如，该末端连接引物可为均聚物，通过例如末端转移酶加入。例如哈利斯等人将多聚A尾(poly A tail)加到DNA模板上，作为病毒基因组的单一分子测序中多T测序引物的补体(Harris et al.，2008，Science 320：106-109)。
2.1.2测序引物
测序引物为单链寡核苷酸，互补于侦测的核酸片段或其相关的末端连接引物。本发明的实施方案中，测序引物为至少8、10、15、20、25、30、35、40、45、50个核苷酸，或以上的长度。在特定实施方案中，测序引物可为8-25、10-20、10-30、或10-50个核苷酸长度。测序引物可由任何型态核苷酸组成，包括天然发生的核苷酸、自然界不存在的核苷酸类似物、或修饰核苷酸。在特定实施方案中，在以侦测的核酸杂交测序引物后，可修饰测序引物的5’端，以加速连接至地址阵列上的连接位置，包括一个或多个的末端连接分子。
本发明的实施方案中，测序引物包含修饰的核苷酸，例如锁住的核酸(LNAs、修饰的核糖核苷酸、或在多核酸中提供提高的碱基堆叠交互作用者)。例如使用LNA的说明，拉芬等人显示含有LNA的引物，相较于未锁住的引物，具有改良的特异性及呈现较强的连接(Levin et al.，2006，NucleicAcid Research 34(20)：142)。包含3个LNA核苷酸(在cap处)于不同位置的MCP1引物(5’-cttaaattttcttgaat-3’)的三种变异体为：MCP1-LNA-3’(5’-cttaaattttCtTgaAt-3’)；MCP1-LNA-5’(5’-CtTaAattttcttgaat-3’)；及MCP1-LNA-even(5’-ctTaaatTttctTgaat-3’)。所有LNA-取代的引物具有升高的Tm，然而，MCP1-LNA-5’引物展现独特的提高的测序正确性(Phred Q30counts)。因此，在特定的实施方案中，测序引物可包括在5’区域中至少一种锁住核苷酸，即在测序引物的5’的一半、三分之一、或四分之一。
测序引物及单链样本核酸(即欲侦测的核酸包括至少一个末端连接引物)在应用于本发明的光学侦测器前可被杂交。经由混合样本核酸与过量摩尔的测序引物在含盐溶液中，例如5X SSC(或5X SSPE)、0.1％Tween 20(或0.1％SDS)、及0.1％BSA缓冲液，使摩尔测序引物与样本核酸杂交。此混合物可加热至65℃至少5分钟，缓慢冷却至室温，使引物/模板黏合。残余的引物可由适当方法去除，例如分子筛。
包括末端连接引物及测序引物，引物可以适当方法设计，包括序列的可视调查或计算机辅助的引物设计。多种软件包皆可用于辅助引物设计，包括DNAStarTM(DNAStar，Inc.，Madison，WI)、OIGO 4.0(NationalBiosciences，Inc.)、Vector
Figure G2008800184262D00121
(Invitrogen)、Primer Premier 5(Premierbiosoft)、及Primer 3(Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)。设计引物应考虑如测序的分子、特异性、长度、所需要的解链温度、二级结构、引物二元体、GC含量、缓冲液的pH及离子强度、及使用的酶(即聚合酶或连接酶)(Joseph Sambrook and David Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press；3rd ed.(2001))。
2.1.3连接至阵列表面
在黏合测序引物及欲侦测的核酸(包括一个或多个的末端连接引物)之后，将此复合物存于适当缓冲液中，涂铺于地址阵列的表面，使其连接。本发明的实施方案中，样本核酸(欲侦测的核酸及一个或多个的末端连接引物)固定于连接位置，之后涂铺测序或侦测的引物。另外的实施方案中，在涂铺于该装置之前使该复合物杂交。已知只有一个样本核酸连接的连接位置为有效的地址。在特定的实施方案中，将该复合物涂铺到上述的光学侦测器，且该样本核酸固定至该地址阵列上的任意的连接位置。另外的实施方案中，可以适当方法将样本核酸涂铺至该地址阵列上的预定的连接位置，适当的方法例如经由机械或液体处理装置。
使核酸固定至固体支持物上的适当方法已知。本发明的实施方案中，样本核酸直接以共价连接固定在连接位置，例如以二硫键、硫酯键、酰胺键、磷酸二酯键、或酯键；或以非共价连接固定，例如抗体/抗原或生物素/抗生物素蛋白连接。本发明的实施方案中，以插入分子(intervening molecule)使样本核酸固定至连接位置。本发明的实施方案中，该插入分子可为聚合酶，例如DNA聚合酶。
关于核酸的直接共价连接，阿迪西等人改良引物的5’端，包括SH官能基(Adeesi et al.，2000，Nucleic Acid Research，28：87)。根据阿迪西等人的方法，核酸以50μM磷酸缓冲盐溶液(PBS)(NaPi：0.1M NaH2PO4、pH6.5、0.1MNaCl)制备。然后将约1-5μl引物溶液涂铺于硅烷化(silanised)玻璃玻片表面，在室温下湿度控制箱中培养约5小时，使该引物连接至芯片表面。在连接反应完成后，将该PBS溶液在室温下震动清洗两次，每次5分钟，移除未连接的DNA。清洗后，将10mMβ-巯基乙醇加入该PBS溶液中，在室温下润湿该地址阵列表面，使未连接的DNA的巯基去活化。其次，清洗该阵列表面，例如一次以5X SSC 0.1％Tween及一次以5X SSC缓冲液清洗。因此，本发明的实施方案中，使用阿迪西等人的方法，使样本核酸固定至连接位置，例如，经由测序引物或样本核酸的5’端。
本发明另外的实施方案中，该样本核酸可包含例如生物素化核酸，连接至在该连接位置表面的抗生物素蛋白。另一实施方案中，该样本核酸可包括抗原部份，例如BrdU或洋地黄毒苷(digoxigenin)，以抗体(或抗体片段)连接于该连接位置。”抗体”已知包括免疫球蛋白分子片段，包括例如一个或多个的CDR区域；或可变重链或可变轻链。抗体可以是天然地发生、重组或合成的。抗体也可包括例如多株抗体及单株抗体的变异体。本发明的实施方案中，抗体连接其抗原的结合常数为至少106、107、108、109M或以上。抗体的结构、功能及制造为已知技术(Gary Howard and Matthew Kasser，Making and Using Antibodies：A Practical Handbook CRC Press；1st ed.(2006))。
另外的实施方案中，样本核酸可由聚合酶固定至连接位置，例如DNA聚合酶。熟知此技术的人了解应考虑保留酶功能的可获取信息，例如酶的初级、次级、及三级结构。例如已知的Taq及Phi29聚合酶的结构(Kim et al.，Nature，376：612-616(1995)和Kamtekar et al.，Mol.Cell，16：609-618(2004))。聚合酶固定于表面的方法，如美国专利申请案2008/0199932及Korlach等人(PNAS 105：1176-1181(2008))所记载的保留活性。第8图显示本发明的实施方案的表示图，该样本核酸(即欲测序的核酸32、末端连接引物34、及测序引物346)经由以工具384已经连接于连接位置220的聚合酶38，连接至连接位置220，该工具384例如直接非共价吸收、抗体、生物素、或化学连接，如酰胺键。
本发明的实施方案中，连接位置的醛修饰表面以含醛的硅烷试剂处理。醛容易与蛋白质表面的一级胺形成希夫(Schiff)碱连接。由于许多蛋白质表面呈现赖氨酸，而且通常在NH2-端反应性较强的α-胺，这些蛋白质可以各种定位连接至玻片，使该蛋白质的不同面与溶液中的其它蛋白或小分子作用。另一实施方案中，以UV光活化作用使photoNHS(N-羟基琥珀酰亚胺羧酸分子连接至具有碳链连接物的叠氮硝基苯(azidonitrobenzene)分子)连接至该装置上的胺修饰表面。这些实施方案中，UV光激发叠氮硝基苯(azidonitrobenzene)的部份，去除氮后，产生高反应性的氮烯(nitrene)。氮烯(nitrene)容易与上述装置表面的NH2作用，形成联胺(hydrazine)键。此连接物的其它端为NHS羧酸酯，与聚合酶表面的赖氨酸，形成酰胺共价键。另一实施方案中，该NHS羧酸酯与上述装置表面的伯胺在缓冲环境中反应。UV光用于活化叠氮硝基苯(azidonitrobenzene)的部份，形成高反应性氮烯(nitrene)作为电子缺少组，容易与聚合酶上的赖氨酸残基的伯胺反应。此方法将详细描述于以下的实施例4。
2.2测序形式
本发明的生物检测系统可以已知方法用于侦测及测序核酸(如美国专利案6,946,249及Shendure et al.，Nat.Rev.Genet.5：335-44(2004))。本发明的实施方案中，测序方法根据DNA聚合酶或DNA连接酶的特异性决定，包括例如碱基延伸测序(单一碱基依序延伸)、合成的多碱基测序(包括如端标记的核苷酸的测序)、及摇摆(wobble)测序，基于连接作用而决定。这些方法通常需要单链样本核酸，包括至少一个末端连接引物(直接或间接)固定于连接位置上。然后以测序引物(基于连接酶的测序通常为锚引物(anchorprimer)，与测序引物为相似目的)开始测序。
关于所有测序形式，本发明提供可再测序单一分子的优点。例如，在完成测序读取后，测序引物及延伸的核苷酸可自样本核酸去除，清洗上述装置，重复测序。在多个实施方案中，再测序可以相同或不同方法进行。关于再测序相同分子，预期测序错误降低为测序读取数量的平方。例如当单一读取的每一碱基错误率为10-3，则两次读取后，会降低至(10-3)2，即10-6。这对单一分子测序有特别的优点，因为测序用的修饰核苷酸可失去其标记或保护基(blocking group)而导致如伪缺失。
2.2.1碱基延伸测序：逐步延伸
在实施方案中，本发明的光侦测装置可用于进行碱基延伸测序(美国专利案5,302,509)。本发明的实施方案中，碱基延伸测序开始于使包括欲测序的单链核酸32、连接于欲测序的单链核酸32的3’端的末端连接引物34、及被黏合的测序引物346的部份双链样本核酸，连接至连接位置220，如第6图所示。在实施方案中，然后将聚合酶38与修饰的核苷酸在适当缓冲液中涂铺于上述的光侦测装置上。在实施方案中，上述样本核酸复合物通过连接位置上的聚合酶被固定于连接位置。在实施方案中，上述核苷酸包括共价连接的可侦测标记，例如荧光标记，及保护基以避免任何次级延伸。因此，在测序引物346的3’端加上单核苷酸后停止测序。
第7图显示一实施方案中碱基延伸测序反应的第一步骤。将带有荧光保护基364的核苷酸362以DNA聚合酶38加入至测序引物346的3’端。在一些实施方案中，荧光标记作用如保护基。在另外的实施方案中，荧光标记为分离部份。单核苷酸附于测序引物346的3’端，根据对应的光侦测器210辨识其标记。然后移除该荧光标记及保护基，例如使用化学或酶胞溶，允许额外增加的碱基延伸循环。在特定实施方案中，该标签与保护基可同时、之后、或以任何顺序移除。经由编辑加入的碱基顺序，样本核酸的序列以3’向5’的方向追溯，一次一个碱基。第9图显示各样本核酸并行进行延伸、侦测、及去保护/去标记的一个循环。
通常，有两种方法辨认在逐步延伸时加入的核苷酸。一种情形为，四种核苷酸皆有相同可侦测标记，但是以预定的顺序，一次加入一种。根据延伸反应中核苷酸加入的顺序，辨识延伸的核苷酸。另一种情形为在延伸时辨认加入的碱基，将四种核苷酸同时加入，每一种连接不同、可区分的标记。在不同的实施方案中，标记的激发或发光的光谱及/或强度可能不同。加入延伸反应中的核苷酸由侦测标记的强度及/或波长(即激发或发光光谱)辨识。这两种方法的实施方案于以下实施方案5中说明。
2.2.2以合成方法测序：多步骤延伸
在一些实施方案中，合成方法测序以多步骤无中断的延伸反应进行，例如不使用保护基。这些实施方案中，以侦测核苷酸三磷酸水解后的磷酸释放，例如β及γ磷酸复合物的释放，监测聚合反应。这些复合物可直接被侦测，例如藉由该复合物上的荧光部份，或间接被侦测，例如使焦磷酸连接至化学或生物荧光侦测系统。
一些实施方案中，上述样本核酸必须连续以末端-磷酸标记的核苷酸测序。末端磷酸标记的核苷酸及其使用方法的例子，例如美国专利案7,361,466及美国专利公开案2007/0141598。简单地说，使用于本发明装置的核苷酸，当在聚合反应时水解，则标记的焦磷酸可被对应的光侦测器侦测。一些实施方案中，四种核苷酸皆包括一种标记，且可同时加入。一些实施方案中，核苷酸包括不能辨别，例如相同的标记，并以预定顺序依序加入。带有无法辨别的标记的核苷酸，依序、循环的添加，仍然可进行多步骤、无中断的聚合步骤，例如以均聚物的顺序。
2.2.3基于连接酶的测序
其它实施方案中，样本核酸以本发明的光学侦测器经基于连接酶的测序方法测序。基于连接酶的测序方法例如如美国专利案5,750,341及薛杜尔等人(Shendure et al.，2005，Science，309：1728-1732)所公开。在薛杜尔等人的方法中，两个末端连接引物位于未知的单链DNA样本的两侧，并固定于固体支持物上。未知序列上的特定位置(例如接近特定的末端连接引物的第n个碱基)，以所谓锚引物(类似测序引物)黏合于末端连接引物之一来检查，然后在此混合物中加入4个简并的九元体(degenerate nonamer)。此四个九元体皆具有独特的荧光标记，并在所有位置皆会简并，除了有疑问的位置，每个九元体检视不同的碱基-A、C、G、或T。清洗样本、荧光扫描，辨识有疑问的碱基。然后去除样本核酸中的锚引物及连接的九元体，清洗该装置，并重复步骤、寻找其它有疑问的位置。此方法的优点在于无累进性，即碱基不需依顺序寻找。因此，错误不会累积。而且，此方法可寻找从5’或3’方向有疑问的位置，即不需如传统标准以5’向3’方向的DNA合成。总共约13个碱基的样本核酸通常可用此方法测序。
2.3应用
本发明的生物检测系统可同时侦测百万个核酸片段。如果每一片段例如为1000个碱基长度，一装置可依此进行十亿个以上的碱基序列。以下讨论为上述装置的额外应用及其方法。
2.3.1整段基因组测序
本发明的生物检测系统可用于进行例如细菌、真菌、真核生物、或脊椎动物，例如哺乳类，例如人类的整段或部份基因组测序。
基因组DNA可切成至少20、50、100、200、300、500、800、1200、1500个核苷酸长度或以上的片段，进行测序。一些实施方案中，切断的基因组DNA可为20-50、20-100、20-500、20-1000、500-1200或500-1500个核苷酸长度。在一些实施方案中，预测序的核酸沿着相关末端连接引物制成单链，黏合至测序引物，并涂铺于本发明的装置，进行如上述的测序。
2.3.2基因表达型态
在其它实施方案中，本发明之生物检测系统可用于测序cDNA以了解基因表达型态。例如，mRNA的量可由测量装置上侦测的特定序列的相对频率而定量。数百万个cDNA分子可在本发明的装置上并行测序。假如一细胞包含平均350,000个mRNA分子，在每个细胞中即使以一个拷贝呈现的转录物，预期在一百万测序反应中也可测序约3次。因此，本发明的装置适合具有单一复制数量灵敏度的单一分子测序。
cDNA合成为已知，通常包括具有选择性富有mRNA的完整RNA。由mRNA形成cDNA的步骤包括，例如在第一链合成时的反转录作用；RNA酶处理移除剩余的RNA；随机六元体(random hexamer)引发该第一链，及DNA聚合酶合成第二链。所得的cDNA适合在本发明的装置上测序。分离及制备DNA及RNA的方法为已知(Joseph Sambrook and David Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press；3rd ed.(2001))。
一些实施方案中，cDNA的测序如美国专利案6,812,005及7,361,488所公开。简单地说，cDNA以适应物多核酸连接，该适应物经特殊化限制酶加工，最后该加工过的核酸连接至固定于本发明装置的连接位置的互补的寡核苷酸。特定的实施方案中，该适应物分子为末端连接引物。
本发明的实施方案中，mRNA的聚A尾可作为适当的末端连接引物，其互补于聚A测序引物。
2.3.3侦测及/或测量连接作用
其它实施方案中，上述生物检测系统可用于侦测多种连接作用，包括例如DNA/DNA、RNA/RNA、或DNA/RNA碱基配对、核酸/蛋白质作用、抗原/抗体、受体/配位体连接、及酶/底物连接。样本分子通常固定于包含一辨识核酸标签(ID)的连接分子。一些实施方案中，该连接分子进一步包括连接样本分子的捕捉分子。连接分子也包括连接至连接位置的方法，例如加速共价化学连接的部份，例如二硫键、硫酯、酰胺、磷酸二酯、或酯连接；或非共价连接，例如抗体/抗原或生物素/抗生物素蛋白连接。在一些实施方案中，连接分子以ID卷标固定于上述阵列中。
样本分子涂铺于本发明的装置上，并藉由其连接分子固定至随机连接位置，例如藉由连接位于该连接分子上的捕捉分子。一些实施方案中，混合样本分子及连接分子，使其连接，然后涂铺至本发明的装置。一些实施方案中，该连接分子首先涂铺至该装置，使其固定于连接位置，然后再涂铺该样本分子。然后，以本发明方法(如藉由杂交或测序)侦测ID，辨识相关的样本分子。多个样本分子种类可固定于相同阵列，由其卷标区分，而使用其连接的捕捉分子的独特ID作为其连接作用的特征。因此，一些实施方案中，侦测卷标样本分子的方法，包括使用包括核酸标签(ID)的连接分子，使样本分子连接至本发明的装置的连接位置，进行该ID的核酸测序，并侦测标记的样本分子。特定的实施方案中，该核酸测序为碱基延伸测序，或末端磷酸标记的核苷酸测序。
使用核苷酸”小段(bits)”，可在本发明的生物检测系统上固定及辨识最多至4n可区别的捕捉分子，其中n为代表ID测序的长度的整数。例如，5个核苷酸可提供千个以上独特的ID，而12个核苷酸提供1千6百万以上的组合。例如，连接分子固定于本发明的装置，以侦测其对应ID卷标确定其位置。该连接分子然后可作为探针，例如调查与一个或多个标记的样本分子的连接作用。即固定一个或多个连接分子的装置可作为探针阵列。
特定的实施方案中，标记的样本分子为荧光标记。当连接于连接分子的捕捉分子时，标记的样本分子由对应该连接位置的光侦测器侦测，该连接分子固定于该连接位置。因此，一些实施方案中，本发明的方法进一步包括将标记样本分子涂铺于本发明的装置上，并侦测该标记的样本分子。特定实施方案中，该装置具有包括核酸卷标(ID)的连接分子，固定于其连接位置上。多种标记的样本分子可同时涂铺于探针阵列，并藉由例如其荧光标记的强度及/或波长，由其标记分化。样本分子与标记的询问分子间的连接作用的分离数，根据在标记的询问分子的固定浓度下，动力学(如进入/移出比例)及统计学(如任何固定时间内样本分子在连接或未连接状态的分配)，受到干扰。
一些实施方案中，连接分子的ID至少为5、10、15、20、25、30、40、50、75、90、100、150、200个或以上的核苷酸长度。在一些实施方案中，该ID为5-10、20、40、80、或160；或为10-20或50；或为20-35个核苷酸长度。该ID包括独特的核酸序列，即欲侦测的核酸。特定的实施方案中，该独特的核酸序列可为至少1、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24、30个或以上的核苷酸长度。一些实施方案中，该独特的核酸序列为4-10、12、15、或20个核苷酸长度；或10-20个核苷酸长度。该ID包括至少一个末端连接引物，即该ID包括互补于测序引物的序列，一些实施方案中，该ID经修饰连接于连接位置，如藉由包括生物素化的核苷酸。在一些实施方案中，该ID的末端连接引物部份为3’端至该独特核酸序列。一些实施方案中，该ID的末端连接引物部份为5’端至该独特核酸序列。其它的实施方案中，末端连接引物表达在该独特核酸序列的3’端及5’端。
在特定实施方案中，样本分子与捕捉分子包括一部份选自碳水化合物、脂质、蛋白质、肽、抗原、核酸、激素、小有机分子(如医药)、或维生素部份；或其组合。这些部份可为天然发生(如生化上纯化的)或合成的(如化学合成或重组产生的)。而且，这些基质可不包含非原始组成物、包含一些非原始组成物、或包含的皆非原始组成物(如非天然的氨基酸、保护基(blockinggroup)或保护基(protecting group)等)。在特定的实施方案中，样本分子或捕捉分子为蛋白质，例如生长因子、肽抗原、抗体、或受体。
使核酸连接至连接分子或连接位置的多种方法为已知(美国专利公开案2004/0038331)。美国专利公开案2004/0038331公开形成连接于固相支持物上的蛋白寡核苷酸的方法。美国专利案第4,748,111提供一例，使蛋白质连接至核酸的3’端。其中，首先使用端转移酶在该分子的3’部份加上核糖残基。然后进行过碘酸氧化反应，在该核酸上产生3’醛基，然后与蛋白质的酰胺基形成共价键。当蛋白质连接至该ID的3’端时，该ID的5’端连接至连接位置。
一些实施方案中，捕捉分子例如蛋白质，连接至该ID的5’端。这些实施方案中，该ID的3’端或测序引物的5’端用于将捕捉分子固定至连接位置。例如美国专利案6,013434公开寡核苷酸聚酰胺的连接，该连接是经由该寡核苷酸的5’端。美国专利案6,197,513公开PNA与DNA皆藉由该核酸的5’端，连接于带有羧酸部份的分子，例如蛋白质。该PNA与DNA分子包括芳基胺或胺基氧基乙酰基部份。美国专利案6,153,737公开包括至少一个2’官能化核苷酸的寡核苷酸，适合连接各种分子。
2.3.4额外的侦测方法
2.3.4.1FRET
一些实施方案中，本发明的光学侦测器以福斯特共振能量转移(
Figure G2008800184262D00201
resonance energy transfer；FRET)侦测分子，亦称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer)。如本技术领域中所周知，FRET出现在当激发的提供者分子非放射性转移能量至接受者分子时，此转移会发出能量，通常是光的形式。FRET可协助减轻背景信号，藉由例如在对欲侦测分子进行有效激发与发出波长间，提供较大的光谱分离。FRET通常用于侦测相近的分子作用，因为其有效地衰败成为位于提供者与接受者分子距离间的第六力。例如曾等人以FRET侦测的核酸杂交(Zhang et al.，NatureMaterials 4：826-31(2005))。其中，将生物素化的核酸目标连接至抗生物素蛋白包覆的量子点提供者，然后，激发Cy5-连接的DNA探针。本发明的实施方案中，标记的捕捉分子与标记的样本分子可形成提供者/接受者(反之亦然)对以FRET侦测。
本发明的核酸测序的实施方案中，荧光标记的核苷酸作用如接受者荧光团(chromophore)，对连接于聚合酶或连接酶的提供者荧光团(chromophore)。因此，在这些实施方案中，位于聚合酶或连接酶的提供者荧光团，激发该样本分子上聚合的或连接的核苷酸上的接受者荧光团。不接近于聚合酶的核苷酸不被激发，因为FRET效能快速下降的原因。本发明的实施方案中，提供者分子为例如另一荧光团(fluorophore)，例如量子点。量子点，例如半导体量子点为此技术领域中所已知(WO03/00015)。偶合量子点的工具，例如已知的生物分子在例如(Mednitz et al.，Nature Materials4：235-46(2005)；USP 2006/0068506、2008/0087843)中进行了综述。在一些实施方案中，量子点连接至DNA聚合酶分子，进一步描述于以下的实施方案3。如上述已讨论的使酶连接至连接位置，熟知此项技术者无疑地可了解当连接荧光团至例如DNA聚合酶或连接酶时，须注意保留酶功能，藉由减轻荧光团连接于初级、次级、三级结构酶的任何影响。
2.3.4.2多光子激发
本发明的实施方案中，荧光团被两种或以上的光子激发。例如，在本发明的实施方案中，FRET的提供者或接受者荧光团的激发，是经过两种或以上的光子。两光子及多光子的激发进一步讨论于美国专利案6,344,653及5,034,613。
2.3.4.3时间分辨的侦测(Time Resolved Detection)
本发明的实施方案中，本发明的装置中的光源与光侦测器，可调整具有独特的相移动(phase shift)。例如公开于美国专利公开案2008/0037008的已知方法，由本发明的装置上侦测到的分子发出的光，可由对应的光侦测器测量，而无来自激发光源的干扰。
3.使用本生物检测系统的生物分子分析服务
本发明亦提供一种生物分子分析服务，根据本发明的实施方案使用该生物检测系统。本发明的实施方案中，此方法包括从服务需求者提供包括欲分析的生物分子的样本，给服务提供者，及服务需求者从服务提供者收到分析结果，其中，该结果来自本发明的装置。本发明的实施方案中，此方法可考虑报酬，例如无服务费或契约服务同意。而且，该样本可直接由服务需求者运送至服务提供者，或者中间经由一卖家。在一些实施方案中，服务提供者或卖家可位于美国领土以外的地区，例如其它国家。
关于此所引述的所有专利案、专利申请案、或其它参考文献，应可了解其诊体作为本发明内容参考的目的及引用的陈述。任何介于参考文献与本发明内容的冲突，以本发明内容为主。
由本说明书内引述的参考资料的教示，可最充分了解本说明书。本说明书中的实施方案提供本发明的具体实施的说明，不应作为构成本发明范围的限制。熟知此技术领域之人可容易了解本发明包含多种其它的实施方式。此所引用的所有公开物及专利案全文作为参考。关于参考文献所使用的材料或与本说明书中不一致之处，本发明可置换任何该等材料。此引述的任何参考文献并不意指为本案的先前技术。
除非有特别说明，所有整数、反应条件等使用于本说明书(包括申请专利范围)中的代表量化的数字，皆可被修饰为“约”。因此，除非有特别说明为相反者，数字参数为大约数值，且可根据本发明欲获得的所需性质而改变。为了不限制本案申请专利范围的均等范围，每一数字参数应由明显数字及已知方法所使用的数字所构成。
除非有特别说明，“至少”一词在多个组件前，可了解其依序意指每一组件。熟知此技术的人士可辨认或确认惯例试验中所使用者为本发明之特定实施方案中的均等物。以下的申请专利范围亦包含该述之均等物。
实施例
实施例1高通量生物检测系统的制造
生物检测系统1的制造方法将于以下并第1-4图详细说明。首先，在该硅基材10上表面具有多个光侦测器210，以商业可购得的0.25μm半导体制程，形成一般具逻辑的光学装置。光侦测器210为光二极管光子侦测器，每一光侦测器具有直径24μm，曝光区域452μm2。每一光侦测器彼此相邻排列，因此光侦测器210的512栏与512列阵列形成于基材10上。
多个控制线圈215形成于没有光侦测器210的基材10的上表面。此实施方案中，控制线圈215对应至光侦测器210，并控制对应的光侦测器210及控制光侦测器210及侦测与记录系统2间的联系。
此实施方案中，滤光层240形成于光侦测器210与控制线圈215的上表面。在形成滤光层240前，对光侦测器210及控制线圈215的上表面进行全面平坦化制程。滤光层240包括多个亚层。此实施方案中，滤光层240的形成，首先由具有较高反射系数的亚层沉积于上述光侦测器210及控制线圈215的平坦化的上表面。然后，具有较低反射系数的亚层沉积于已形成的具有较高反射系数的亚层上。藉由连续沉积较高反射系数及较低反射系数的亚层，直到大量如上述的亚层沉积后，形成滤光层240。此实施方案中，滤光层240包括101个亚层。
第5图为总结滤光层240建构的实施方案的表。第5图中，较小编号的亚层表示较接近滤光层240底面的亚层，较大编号的亚层表示较接近滤光层240上表面的亚层。如第5图所示，在此特定的实施方案中，滤光层240的奇数号的亚层由例如氧化铌(Nb2O5)构成，具有较高的反射系数。偶数号的亚层由例如氧化硅(SiO2)构成，具有较低的反射系数。这些亚层可使用溅镀系统形成，例如使用自由基辅助溅镀系列RAS1100型(Shincron Co.，Ltd；Shinagawa-ku，Tokyo，JAPAN)。此实施方案的每一亚层厚度亦显示于第5图。所获得的滤光层240，对于荧光团Cy5的荧光，滤光层240具有高透光性，对于自氦-氖激光以约633nm波长发出的光，滤光层240具有低透光性，该氦-氖激光可作为一外在光源激发荧光团Cy5。
关于第2及4图，具有小孔235的遮光片230形成于滤光层240上。于滤光层240或基材10上形成具有小孔235的遮光片230的制造方法，将详述于下。
首先，藉由例如在滤光层240上旋转涂布光阻材料，当滤光层240选择性形成于光侦测器210及控制线路215的上表面时，在该滤光层240上形成光阻层，或者当该滤光层未形成时，在光侦测器210及控制线路215的平坦化上表面上形成光阻层。之后，使该光阻层显影，在小孔区域形成光阻图案。该光阻图案系使用光罩覆盖该小孔区域而形成，并曝光该光阻层，因此只有光罩覆盖的区域保留在滤光层240或光侦测器210及控制线路215的平坦化上表面。
然后，将金属层沉积于滤光层240上形成光阻图案处。此实施方案中，该金属层包含铬(Cr)，藉由磁控溅镀步骤，沉积于滤光层240或光侦测器210及控制线路215的平坦化上表面。
之后，移除在该小孔区域的部分金属层及光阻图案，形成具有小孔235的遮光片230。
另一实施方案中，遮光片230的形成由首先沉积金属层(如Cr)于滤光层240上，然后在该金属层上形成罩幕，使该金属层的部分上表面曝光。然后蚀刻该曝光的金属层部分，直到露出滤光层240，在该金属层上形成小孔。然后，自该金属层移除罩幕，在滤光层240上形成具有小孔235的遮光片230。
如第2及4图所示，此实施方案中，连接位置220的形成系藉由将支持材料填充至小孔235或孔穴450。该支持材料可为聚合物或无机材料，对于荧光团36发出的荧光具有透光性。
虽然第1图仅显示12个光学侦测器20，但是可了解至少10,000个光学侦测器20可形成于基材10上。此实施方案中，例如每个光学侦测器20为具有半径约5μm或以下的圆形，面积约100μm2。对于面积1平方英寸(即2.54x2.54cm2)的基材10，可建构六百万个以上的光学侦测器20于基材10上。由于同时操作六百万个光学侦测器20，可高通量地侦测生物分子。
实施例2高通量生物检测系统中生物分子的附着及侦测
使用荧光染色Cy5标记的核酸，测试上述侦测系统。Cy5及生物素分别固定于60元体(60-mer)寡核苷酸的3’及5’端。该标记与生物素化的DNA溶于TrisMg(10mM Tris，10mM NaCl，100mM MgCl2，pH8.0)缓冲液，沉积于该地址阵列上，于潮湿环境(wet chamber)中培养。约30分钟后，以Tris缓冲液洗去未连接的DNA。
激发光形成于遮光片上，由635nm发光二极管提供。为了读取每一像素的信号，激发光存在约1-5秒，记录每一像素的信号，重复此循环100回。然后计算每一像素的代表平均信号及标准差。比较DNA样本沉积前后的信号，具有平均信号差大于3倍标准差的总合的像素，视为正像素，即(沉积后的平均值-沉积前的平均值)＞3x(沉积后的标准差+沉积前的标准差)。
实施例3聚合酶的连接量子点
以下为官能化量子点连接至聚合酶分子上的伯胺的两种方法。第一种方法使用胺活化点，第二种方法使用羧基活化点。
3.1胺EVITAGTM对DNA聚合酶的共轭
胺EVITAGTM(如Evident Technologies，cat#E2-C11-AM2-0620；EVITAGTM合适的QD产物亦以商标eFluorTM由eBioscience，Inc.，San Diego，CA贩卖)官能化的量子点(QD)，由BS3(双-(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸)、同质双官能化的水溶性交联剂活化，胺EVITAGTM官能化的量子点(QD)在8碳的间隔臂(spacer arm)的每一端包括一胺反应性N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)酯。NHS酯与QD表面的伯胺在pH7-9反应，形成稳定的酰胺键，并释放出N-羟基磺基琥珀酰亚胺离去基。Taq DNA聚合酶或Phi29DNA聚合酶具有数个伯胺(例如赖氨酸(K)残基与每一多肽的N端)为NHS酯交联的目标。
3.1.1.量子点的表面活性
以25μL 10mM BS3(双-(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸；Pierce，Part#21580)及25μL 10xPBS(磷酸缓冲盐溶液，pH7.4)，添加去离子水使终体积为250μL，活化2.0mmol的EVITAGTM。培养30分钟后，使用PD-10柱(AmershamBiosciences，产品编号17-0851-01)使此溶液脱盐，以1xPBS洗提。染色部分包含活化的QD。
3.1.2.DNA聚合酶的偶联
于上述混合物中加入于0.1M碳酸钠缓冲液的100μg的DNA聚合酶，pH9.2，使聚合酶偶联。充分混合后，该样本培养于4℃倾斜旋转2小时。
3.1.3.QD-共轭的聚合酶的纯化
将此连接物以30K微旋转过滤器(Pall Corporation，Part#OD 100C33)6000rpm离心5-10分钟，浓缩至总体积～200μl。在30K微旋转过滤器上以去离子水清洗该连接物两次。
接着，以Superdex 30/75树脂(GE Healthcare，part#17-0905-10或17-1044-10对小蛋白及肽)体积排除，纯化上述连接物。该柱先以去离子水进行预先平衡，再添加浓缩的上述连接混合物，使其进入柱床。该样本在黑光激发下以去离子水洗提，收集荧光部分。集合该荧光部分，并以100K微旋转过滤器以6,000rpm离心5-10分钟，浓缩至总体积为～100μl。此纯化及浓缩的连接物储存于4℃。
3.2羧基EVITAGTM对DNA聚合酶的共轭
羧基EVITAGTM(如Evident Technologies，cat#E2-C11-CB2-0620)官能化的量子点(QD)，经由EDC-媒介的磺基-NHS酯连接反应活化。该胺反应的磺基-NHS酯与例如Taq DNA聚合酶或Phi29DNA聚合酶上的伯胺的侧链赖氨酸(K)残基反应。
3.2.1.量子点的表面活性
将2.0nmol的EVITAGTM稀释于25mM MES pH5.0缓冲液中。使用前，将EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐；Pierce，part#22980)溶于冷的25mM MES pH5.0，使浓度为50mg/ml。另外，同样准备于25mMMES pH5.0中的磺基-NHS酯(Pierce，part#24525)溶液50mg/ml。
接着，再将50μl的EDC溶液及50μl的磺基-NHS溶液加入该EVITAGTM溶液中。将此混合物均匀混合，以慢倾斜旋转室温下培养30分钟。然后使用PD-10柱(Amersham Biosciences，产品编号17-0851-01)去除该混合物的盐，以pH9.2的0.1M碳酸钠缓冲液洗提。收集含有活化QD的颜色部分。
3.2.2.DNA聚合酶偶联
将pH9.2的0.1M碳酸钠缓冲液中的100μg的DNA聚合酶加入上述混合物中。充分混合后，将此样本以倾斜旋转培养于4℃2小时。
3.2.3.QD-结合的聚合酶之纯化
以30K微旋转过滤器(Pall Corporation，part#OD100C33)6,000rpm离心5-10分钟浓缩此连接物至～200μl的总体积。在30K微旋转过滤器上以去离子水清洗两次。接着，使用Superdex 30/75树脂体积排除，纯化此连接物。
此柱以去离子水预先平衡。然后将浓缩的偶联混合物加入该柱中，使其进入柱床。此柱在黑光激发下以去离子水洗提，收集荧光部分。集合荧光部分，以100K微旋转过滤器6,000rpm离心5-10分钟浓缩至～100μl的总体积。此纯化及浓缩的结合物储存于4℃。
实施例4：连接聚合酶至该装置
以下说明使用photoNHS(N-羟基琥珀酰亚胺羧酸酯分子连接至带有碳链连接物的叠氮硝基苯(azidonitrobenzene)分子)附加于酶(例如聚合酶)以连接至装置的两种方法。
4.1UV表面活化
使用photoNHS附加于聚合酶以连接于该装置的胺修饰表面，经UV光活化。UV光激发该叠氮硝基苯(azidonitrobenzene)部分，藉由去除氮分子，形成高反应性的氮烯(nitrene)基。氮烯(nitrene)与该装置的表面NH2作用，形成联胺键。该连接物的另一端为NHS羧酸酯，与该聚合酶上的赖氨酸残基形成酰胺共价键。
4.1.1.表面制造
将1mM的photoNHS(Sigma，Art No.A3407，分子量390.35)溶液准备于95％乙醇中。胺修饰表面先以碳酸缓冲液(pH9.3)、然后95％乙醇清洗。接着，将此photoNHS溶液涂铺于该胺修饰表面。以254-365nm UV光照射该表面3分钟，再以95％乙醇润湿三次。
4.1.2.胺的终止加盖(end-cap)
准备10mM N-乙酰氧基琥珀酰亚胺溶液于碳酸缓冲液(pH9.3)，并涂铺于该表面，使任何未反应的胺终止加盖(end-cap)。将此装置以温和摇晃培养于室温2小时。接着以碳酸缓冲液及蒸馏去离子水清洗该表面3次。
4.1.3.DNA聚合酶的偶联
接着，将碳酸缓冲液(pH9.3)中的1mM DNA聚合酶溶液涂铺于上述表面，在持续温和摇晃下室温培养2小时。然后以碳酸缓冲液及pH7.4的PBS(磷酸缓冲盐溶液)清洗上述表面3次。此聚合酶键连的表面储存于4℃。
4.2缓冲表面的活化
在另外的实施方案中，photoNHS可在缓冲环境下活化并结合至上述表面。然后在聚合酶存在下，使用UV光活化叠氮硝基苯(azidonitrobenzene)部分。同样，在UV光下形成高反应性氮烯(nitrene)为电子缺少基，容易与聚合酶表面的伯胺作用，形成共价键连接于上述表面。
4.2.1.表面的准备
1mM的photoNHS(Sigma，Art No.A3407，分子量390.35)溶液准备于碳酸缓冲液(pH9.3)中。以碳酸缓冲液(pH9.3)润湿胺修饰表面。将此photoNHS溶液涂于该胺修饰表面，在持续温和摇晃下培养2小时。然后以碳酸缓冲液润湿该表面3次。
4.2.2.胺的终止加盖(end-cap)
准备10mM N-乙酰氧基琥珀酰亚胺溶液于碳酸缓冲液(pH9.3)，并涂铺于该表面，使任何未反应的胺基终止加盖(end-cap)。将此装置以温和摇晃培养于室温2小时。接着以PBS缓冲液(pH7.4)润湿3次。
4.2.3.DNA聚合酶的偶联
接着，将PBS缓冲液(pH7.4)中的1mM DNA聚合酶溶液涂铺于上述终止加盖(end-cap)表面。以254-365nm UV光照射该表面3分钟，然后以PBS(pH7.4)清洗上述表面3次。此聚合酶键连的表面储存于4℃。
实施例5：碱基延伸测序模式
如上说明，有两种通用方法辨识在逐步延伸中加入的核苷酸：逐次加入四种相同标记的核苷酸；或者同时加入四种不同标记的核苷酸。每一种模式皆说明如下。
5.1逐次加入四种具有相同标记的核苷酸
5.1.1腺嘌呤(A)分子的延伸
将保护与标记的腺苷与适当的聚合酶加入测序的反应缓冲液溶液中(例如40mM Tris-HCl pH9、1mM MgCl2)。只有当欲侦测的核酸中相邻于末端连接引物5’端的核苷酸为胸腺嘧啶(T)时，腺嘌呤加在测序引物的3’端上。如果最接近引物3’端的核苷酸为鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、或腺嘌呤(A)时，则将不会再进行延伸。
5.1.2.延伸反应清除步骤
在延伸反应完成后，以5X SSC及0.1％SDS清洗阵列芯片一次，5X SSC清洗一次，移除腺嘌呤及未反应溶液。
5.1.3.荧光侦测及记录
读取连接位置的荧光信号，确认腺嘌呤是否进行延伸，腺嘌呤延伸表示侦测的核酸中有对应的胸腺嘧啶。
5.1.4.移除保护基及荧光基
侦测后，通过化学或酶切断，移除保护基及荧光基。
5.1.5.清除步骤
以5X SSC及0.1％SDS清洗阵列芯片一次，5X SSC清洗一次，移除切断的保护基及标记基。
5.1.6.校读及记录
确定该保护及荧光基自先前的延伸步骤中成功清除。如果有残留的保护及荧光基，该侦测及记录系统2中的侦测及分析软件将记录其位置。该测序反应的记录只有在之后的清除步骤中辨识保护及荧光基已移除后进行。
5.1.7.重复5.1.1-5.1.6，但是使用鸟嘌呤进行延伸反应。
5.1.8.重复5.1.1-5.1.6，但是使用胞嘧啶进行延伸反应。
5.1.9.重复5.1.1-5.1.6，但是使用胸腺嘧啶进行延伸反应。
5.1.10.使用A、G、C、T为一循环进行一回四次的延伸反应。藉由重复此反应，逐次辨识核酸的序列。
5.2同时加入四种不同标记的核苷酸
5.2.1.碱基延伸反应
将四种阻断的且可区别的标记DNA核苷酸(A、G、C、T)及核酸聚合酶加到阵列的测序缓冲液中。此延伸反应可只在测序引物的3’端进行。与测序的核酸的核苷酸互补的核苷酸最接近连接引物5’端，被加到测序引物的3’端，如第6图所示。
5.2.2.延伸反应清除步骤
在延伸反应完成后，以5X SSC及0.1％SDS清洗阵列芯片一次，5X SSC清洗一次，移除反应溶液中残余的材料。
5.2.3.荧光侦测及记录
侦测每一连接位置上的每一可区分的荧光团，辨识加入的核酸。
5.2.4.移除保护基及荧光基
侦测后，通过化学或酶切断，移除保护及荧光基。
5.2.5.清除步骤
以5X SSC及0.1％SDS清洗阵列芯片一次，5X SSC清洗一次，移除切断的保护及荧光基。
5.2.6.校读及记录
确认该保护基及荧光基自先前的延伸步骤中成功清除。如果有残留的保护基及荧光基，该侦测及记录系统2中的侦测及分析软件将记录其位置。该测序反应的记录只有在之后的清除步骤中确认保护及荧光基已移除后进行。
5.2.7.重复5.2.1-5.2.6。重复反应循环，确认核酸的序列。
实施例6：已知核酸的测序
将化学合成的60元体(60-mer)寡核苷酸，具有已知序列：生物素-5’-tcagtcag tcag tcag tcag tcag tcag tcag tcag tcag tcag tc ACACGGAGGTTCTA-3’，作为测序模板。将该测序模板连接于14元体(14mer)寡核苷酸测序引物(5’-TAGAACCTCCGTGT-3’)。该模板的5’端经修饰包含生物素分子。该模板分子固定于含有抗生物素蛋白(streptavidin)的反应物表面。此测序反应使用DNA聚合物在1X测序缓冲液及15mM DTT中，进行碱基延伸反应。每一延伸反应步骤只加入一种具有次级延伸保护(阻断)及荧光标记(例如Cy5)的核苷酸。如果相邻于测序引物3’端的DNA模板核苷酸，互补于该加上去的核苷酸，之后再加上荧光标记的碱基。洗去未反应的碱基材料后，侦测该荧光信号。如果加入的碱基没有互补，则不会侦测到荧光信号。侦测后，化学移除保护的荧光基，使用含盐溶液(例如5X SSC；0.1％SDS)再次清洗该阵列，再侦测一次以确认荧光标记已移除。移除及清洗步骤之后，没有侦测到荧光信号的位置被认为是荧光卷标已移除。在之后的反应循环中所得到的荧光信号，认为是之后延伸测序的信号。移除清洗后，仍侦测到荧光信号的位置，该位置以软件记录为具有未完全清除的反应。该位置产生的信号可持续被记录，直到在下一循环中确认该移除步骤。此方法为逐次加入四种反应碱基材料，并循环地进行反应。因此，可辨识该模板的序列。
虽然本发明已以优选实施方案公开如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此项技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

Claims (61)

1.一种辨识单一生物分子的装置，包括：
具有光侦测器的基材；及
连接位置，其形成于上述光侦测器上，该连接位置经处理后使上述生物分子固定于该连接位置；
遮光片，其形成于上述基材上，该遮光片包括具有直径的小孔，其中上述连接位置形成于该小孔附近；
其中该连接位置位于上述光侦测器附近，且与上述光侦测器隔开，该连接位置与该光侦测器的距离为小于或等于100μm；而且
该光侦测器收集接收讯号角度(solid angle)内该生物分子发出的光，该接收讯号角度为大于或等于0.8SI球面度(steridian)。
2.如权利要求1所述的辨识单一生物分子的装置，其中上述小孔的直径为小于或等于1，000nm。
3.如权利要求1所述的辨识单一生物分子的装置，其中上述小孔的直径为小于或等于200nm。
4.如权利要求1所述的辨识单一生物分子的装置，进一步包括滤光层，其形成于上述基材及上述遮光片之间。
5.如权利要求1所述的辨识单一生物分子的装置，进一步包括微透镜，其形成于上述基材及上述遮光片之间。
6.如权利要求1所述的辨识单一生物分子的装置，其中该距离为小于或等于25μm。
7.如权利要求1所述的辨识单一生物分子的装置，其中该距离为小于或等于6μm。
8.一种辨识单一生物分子的装置，包括：
具有光侦测器的基材；及
连接位置，其形成于上述光侦测器上，该连接位置经处理后使上述生物分子固定于该连接位置；以及
遮光片，其形成于上述基材上，该遮光片包括具有直径的小孔，其中上述连接位置形成于该小孔附近；
激发光源，其形成于上述基材上；
其中该连接位置位于上述光侦测器附近，且与上述光侦测器隔开，该连接位置与该光侦测器的距离为小于或等于100μm；而且
该光侦测器收集接收讯号角度(solid angle)内该生物分子发出的光，该接收讯号角度为大于或等于0.8SI球面度(steridian)。
9.如权利要求8所述的辨识单一生物分子的装置，其中上述激发光源包括发光层，该发光层沿着平行于上述光侦测器表面的水平方向，向上述连接位置发出激发光。
10.如权利要求9所述的辨识单一生物分子的装置，进一步包括滤光层，其形成于上述基材与上述发光层之间。
11.如权利要求8所述的辨识单一生物分子的装置，其中上述激发光源选自发光二极管(LED)、有机发光二极管(OLED)、聚合物发光二极管(PLED)、及激光二极管(LD)。
12.如权利要求8所述的辨识单一生物分子的装置，其中上述激发光源提供第一波长范围的激发光，上述生物分子发出第二波长范围的光，该第一波长范围与该第二波长范围不重叠。
13.如权利要求8所述的辨识单一生物分子的装置，其中该距离为小于或等于25μm。
14.如权利要求8所述的辨识单一生物分子的装置，其中该距离为小于或等于6μm。
15.一种辨识单一生物分子的装置，包括：
具有光侦测器的基材；及
连接位置，其形成于上述光侦测器上，该连接位置经处理后使上述生物分子固定于该连接位置；
遮光片，其形成于上述基材上，该遮光片包括具有直径的小孔，其中上述连接位置形成于该小孔附近；
其中该光侦测器收集接受讯号角度(solid angle)内该生物分子发出的光，该接受讯号角度为大于或等于0.8SI球面度(steridian)。
16.如权利要求15所述的辨识单一生物分子的装置，进一步包括遮光片，形成于上述基材上，该遮光片包括具有直径的小孔，其中上述连接位置形成于该小孔附近。
17.如权利要求15所述的辨识单一生物分子的装置，其中上述小孔的直径为小于或等于1,000nm。
18.如权利要求15所述的辨识单一生物分子的装置，其中上述小孔的直径为小于或等于200nm。
19.如权利要求16所述的辨识单一生物分子的装置，进一步包括滤光层，其形成于上述基材及上述遮光片之间。
20.如权利要求16所述的辨识单一生物分子的装置，进一步包括微透镜，其形成于上述基材及上述遮光片之间。
21.一种辨识单一生物分子的装置，包括：
具有光侦测器的基材；及
连接位置，其形成于上述光侦测器上，该连接位置经处理后使上述生物分子固定于该连接位置；以及
遮光片，其形成于上述基材上，该遮光片包括具有直径的小孔，其中上述连接位置形成于该小孔附近；
激发光源，其形成于上述基材上；
其中该光侦测器收集接受讯号角度(solid angle)内该生物分子发出的光，该接受讯号角度为大于或等于0.8SI球面度(steridian)。
22.如权利要求21所述的辨识单一生物分子的装置，其中上述激发光源包括发光层，其形成于上述基材上，该发光层沿着平行于上述光侦测器表面的水平方向，向上述连接位置发出激发光。
23.如权利要求22所述的辨识单一生物分子的装置，进一步包括滤光层，其形成于上述基材与上述发光层之间。
24.如权利要求21所述的辨识单一生物分子的装置，其中上述激发光源系选自发光二极管(LED)、有机发光二极管(OLED)、聚合物发光二极管(PLED)、及激光二极管(LD)。
25.一种光学侦测系统，包括：至少10,000个如权利要求1-24中任一项所述的辨识单一生物分子的装置。
26.一种光学侦测系统，包括：至少250,000个如权利要求1-24中任一项所述的辨识单一生物分子的装置。
27.一种光学侦测系统，包括：至少2,000,000个如权利要求1-24中任一项所述的辨识单一生物分子的装置。
28.一种光学侦测系统，包括：至少10,000,000个如权利要求1-24中任一项所述的辨识单一生物分子的装置。
29.一种核酸的测序方法，包括：
将核酸分子固定于如权利要求1-24中任一项所述的装置的连接位置上；以及
对上述装置上的核酸分子进行核酸测序。
30.如权利要求29所述的核酸的测序方法，其中上述核酸藉由连接于固定于上述连接位置的聚合酶，固定于上述连接位置。
31.如权利要求29所述的核酸的测序方法，其中上述核酸测序包括于上述装置中加入标记的核苷酸。
32.如权利要求31所述的核酸的测序方法，其中上述核苷酸为荧光标记的。
33.如权利要求32所述的核酸的测序方法，其中上述核苷酸的荧光标记在其末端磷酸上。
34.如权利要求29所述的核酸的测序方法，其中上述核酸测序为碱基延伸测序，包括于上述装置中加入具有保护基及标记的核苷酸的步骤。
35.如权利要求34所述的核酸的测序方法，其中上述核苷酸为荧光标记的。
36.如权利要求35所述的核酸的测序方法，其中上述核苷酸具有相同的荧光标记，且逐次加入。
37.如权利要求35所述的核酸的测序方法，其中上述核苷酸具有各自不同荧光标记，且同时加入。
38.如权利要求29所述的核酸的测序方法，其中上述核酸测序为基于连接酶的测序。
39.如权利要求29所述的核酸的测序方法，其中上述核酸在核酸测序前于连接位置上被扩增。
40.如权利要求29所述的核酸的测序方法，其中上述核酸序列是未知的。
41.一种多个核酸分子的测序方法，包括：
使多个核酸分子固定于如权利要求25-28中任一项所述的光学侦测系统的连接位置上；以及
在上述光学侦测系统上并行进行上述核酸分子的核酸测序。
42.一种生物分子的侦测方法，包括：
使一个生物分子固定于如权利要求1-24中任一项所述的光学侦测器的连接位置上；以及
在上述装置上侦测该生物分子。
43.如权利要求42所述的生物分子的侦测方法，其中该生物分子包括标记。
44.如权利要求43所述的生物分子的侦测方法，其中该标记为荧光。
45.如权利要求44所述的生物分子的侦测方法，其中该生物分子选自多肽、抗体、脂质、维生素、及多糖的部分。
46.如权利要求45所述的生物分子的侦测方法，其中该生物分子藉由连接分子固定于上述装置的连接位置。
47.如权利要求46所述的生物分子的侦测方法，其中该连接分子包括捕捉分子。
48.如权利要求47所述的生物分子的侦测方法，其中该捕捉分子为蛋白质。
49.如权利要求47所述的生物分子的侦测方法，其中该捕捉分子为抗体。
50.如权利要求47所述的生物分子的侦测方法，其中该连接分子包括核酸标签。
51.如权利要求50所述的生物分子的侦测方法，进一步包括侦测在上述装置上的连接分子的上述核酸标签的步骤。
52.如权利要求51所述的生物分子的侦测方法，其中上述核酸标签通过核酸测序侦测。
53.如权利要求51所述的生物分子的侦测方法，其中上述核酸标签通过杂交于核酸探针侦测。
54.如权利要求53所述的生物分子的侦测方法，其中上述核酸探针为荧光标记。
55.如权利要求29-42或52中任一项所述的生物分子的侦测方法，其中上述核酸是以福斯特共振能量转移(Fster resonance energy transfer；FRET)激发的标记侦测的。
56.如权利要求29-42或52中任一项所述的生物分子的侦测方法，其中上述核酸是以时间分辨荧光技术(time-resolved fluorescence technology)的标记侦测的。
57.一种多个生物分子的侦测方法，包括：
将多个生物分子固定于如权利要求25-28中任一项所述的光学侦测系统的连接位置；以及
并行侦测在上述光学侦测系统上的生物分子。
58.一种辨识单一生物分子的装置的制造方法，包括：
于基材上形成光侦测器及控制线路；
于上述基材上形成具有小孔的遮光片；以及
于上述光侦测器上形成连接位置，且该连接位置接近上述小孔，
上述连接位置经处理后使上述生物分子固定于上述连接位置，
其中上述连接位置接近上述光侦测器，且与上述光侦测器隔开，且上述连接位置与上述光侦测器的间隔距离为小于或等于100μm；而且
该光侦测器收集接收讯号角度(solid angle)内该生物分子发出的光，该接收讯号角度为大于或等于0.8SI球面度(steridian)。
59.如权利要求58所述的辨识单一生物分子的装置的制造方法，进一步包括于上述基材与上述遮光片之间形成滤光层。
60.如权利要求59所述的辨识单一生物分子的装置的制造方法，其中形成上述遮光片包括：
于上述滤光层上形成不透明层；
于上述不透明层上形成光阻层；
图案化上述光阻层，使部分上述不透明层露出；
使用上述图案化光阻层作为罩幕，蚀刻上述不透明层，直到上述滤光层露出；以及
移除上述光阻层。
61.如权利要求60所述的辨识单一生物分子的装置的制造方法，其中上述不透明层包括金属。
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Application publication date: 20100616

Assignee: Ti Shiue Biotech Inc.

Assignor: Industrial Technology Research Institute

Contract record no.: 2019990000226

Denomination of invention: Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules

Granted publication date: 20140611

License type: Exclusive License

Record date: 20190709

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