CN101735944A - 毛细管 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及毛细管。本发明提供了适合于rtPCR应用的具有最优化体积与表面积比的塑料毛细管。此外，本发明提供了用于生产所述rtPCR塑料毛细管的新方法。更详细地，本发明提供了通过2步模塑方法生产的塑料毛细管。

Description

毛细管
技术领域和背景技术
本领域技术人员了解对于容器为了实时聚合酶链反应(rtPCR)之用的最优化，需要考虑几个方面。对于像这样的PCR，重要的是需要提供通过容器壁的快速和均匀的热传递。这个热传递参数与容器的壁厚度和表面积与体积比成比例。因此，薄的毛细管优选作为PCR容器。这个后果的缺点是随着PCR体积渐增，需要更长的毛细管，并且此种长毛细管对此种容器的材料和生产过程提出高要求。
根据现有技术，用于rtPCR应用的塑料以及玻璃毛细管是已知的。本领域技术人员将认识到用于rtPCR应用的毛细管应具有高表面积与体积比和薄壁，以提供良好的热传递性质，从而使得快速和准确的热循环是可能的。对于更高的表面积与体积比，玻璃毛细管是优选的，因为就容器的壁的厚度和长度而言，塑料设备的注射模塑限度在玻璃容器的限度之下。玻璃毛细管的缺点是与使用塑料的注射模塑相比较的高材料和生产成本。
商购可得的玻璃毛细管具有例如20μl的反应体积，其基于长度约17mm的反应单元，外径1.55mm和壁厚度0.175mm(Roche DiagnosticsGmbH，Cat.Nr.04929292001)。此外，具有100μl反应体积的玻璃毛细管也是可用的(Roche Diagnostics GmbH，Cat.Nr.03337090001)。
如果此种毛细管尺度预期使用注射模塑技术产生，那么人们将面对几个基本问题。
在模塑技术(本申请自始至终指定为1步模塑)现有技术中，在高压下将熔化的塑料块注射在核和模之间形成的腔内，以获得在一个末端处封闭的腔(WO 2004/054715)。如果预期具有薄壁和小直径的较长毛细管，那么需要对付至少下述基本障碍：
·由于熔化块的高压和模的小不准确性，在模的薄核处发生大剪切力，从而导致所述核的偏斜和模腔的不均匀填充(壁位移)。模的这种不均匀填充导致核力的不均衡增加(由于熔化块前进流的自供能作用)。
·对于rtPCR所需的透明材料(例如COC或PC)，脱气是重要的，以避免气泡的包埋，并且随着毛细管的渐增长度，所述脱气变得成问题。
这个基本障碍的后果是至少下述：
·模腔的不均匀填充导致毛细管的不均匀壁厚度分布，并且这在PCR的温度循环过程中提供不均匀的热膨胀。对于rtPCR，容器的这种变形将影响容器荧光的光学读数，并且此种容器不再合适。
·在PCR循环升高的温度的过程中，在模塑的毛细管内的冷冻张力预期将松弛，从而引起偏斜且因此影响光学读数。
·通过具有壁厚度分布的壁的热输入将是不均匀的，从而影响混合物的反应动力学。
·包埋的气泡将影响用于rtPCR应用的光学信息的检测。
概括来说，由于核的不足稳定性，具有足够质量用于rtPCR应用的在一个末端处封闭的薄壁设备的1步模塑产生就长度和直径而言受限制。
WO 2004/054715描述了具有薄至0.01mm的壁厚度、小至0.02mm的内径和长至50mm的长度的1步模塑塑料毛细管，但未提供可产生所述最小值的实验数据，任何所述塑料毛细管也不适合于rtPCR应用。
商购可得的是具有下述尺度的塑料毛细管：
·Roche Diagnostics提供了具有20μl反应体积的塑料毛细管(Id.nr.04924738001)。所述毛细管对于20μl反应体积具有0.3mm的壁厚度，1.7mm内径和约8mm的反应单元长度。
·从Osmetech Molecular Diagnostics也可获得具有20μl反应体积的塑料毛细管(SensiTubeTM)。所述毛细管对于20μl反应体积具有0.3mm壁厚度、1.5mm内径和约11mm的反应单元长度。
·其他塑料毛细管可从Eurogentech、Eliod和Genaxxon获得。
基于现有技术的缺点，本发明的目的是提供新模塑技术，以产生高质量毛细管用于灵敏的rtPCR应用，所述模塑技术使得能够生产适合于rtPCR应用的更薄和更长的塑料毛细管。
发明内容
本发明提供了适合于rtPCR应用的具有最优化体积与表面积比的塑料毛细管。此外，本发明提供了用于生产所述rtPCR塑料毛细管的新方法。
本发明的一个方面是由塑料材料制成的用于实时核酸扩增的反应容器，其包括
a)在一个末端处封闭的毛细管部件，
b)在两个末端处开放的管形部件，和
c)在所述毛细管部件和所述管形部件之间的连接，
其中所述连接是设计为使所述毛细管部件的开放末端和所述管形部件的所述开放末端之一永久连接的融合接头，从而形成具有一个开口的反应容器，所述融合接头在光照后产生光散射。本发明的另一个方面是生产根据本发明的反应容器的注射模塑方法，所述方法包括
a)提供具有核的第一个模，
b)执行第一个注射步骤，以产生所述反应容器的管形部件，所述管形部件部分围绕所述核，
c)将由所述管形部件部分围绕的所述核放置在第二个模中，和
d)执行第二个注射步骤，以产生所述反应容器的毛细管部件，
其中在所述第二个注射步骤过程中，所述毛细管部件变得与所述管形部件永久连接，以形成具有一个开口的所述反应容器。
在根据本发明的生产方法的第一个步骤过程中，核最初由在核的2个侧面上的导板稳定，同时用熔化塑料部分包被。基于核的2个侧面上的所述导板，核在第一个注射步骤过程中抵抗熔化块的压力，并且在周围腔内保持同心。由塑料部分围绕的核随后放置到第二个腔内，从而使得在第一个注射步骤过程中粘在导板中的核的尖端在第二个注射步骤过程中变得由熔化塑料围绕。
基于这种2步生产方法，可以获得具有均匀厚度分布的薄壁的在一个末端处封闭的毛细管，其在rtPCR领域中具有重要性(无壁位移，在温度循环过程中无变形，无包埋的气泡)。
此外，2步生产方法使得模能够在2个注射步骤过程中容易脱气，从而使得可以避免在塑料材料中形成气泡。
根据本发明的2步生产方法不仅提供生产具有薄壁的长毛细管的可能性，而且还以高精确度生产它们，所述精确度足以使它们应用于高灵敏度的rtPCR应用。对于rtPCR应用，最重要的是毛细管在温度循环过程中不变形，通过毛细管壁的热传递是均匀的，并且无气泡包埋在毛细管壁中。
关于温度变形的需求对于这样的毛细管甚至更高，所述毛细管应在应用毛细管的旋转运动的rtPCR机器中使用，以使它们放置在检测位置内(例如Roche Diagnostics GmbH的
Figure G2009102224913D0000041
装置)。此处，除热应力外，还需要平衡离心力。如果不可避免毛细管的此种变形，那么就检测光学器件而言的位置在不同毛细管之间将不同，并且所述毛细管的可比性不再得到保证。
发明详述
本发明的一个方面是由塑料材料制成的用于实时核酸扩增的反应容器，其包括
a)在一个末端处封闭的毛细管部件，
b)在两个末端处开放的管形部件，和
c)在所述毛细管部件和所述管形部件之间的连接，
其中所述连接是设计为使所述毛细管部件的开放末端和所述管形部件的所述开放末端之一永久连接的融合接头，从而形成具有一个开口的反应容器，所述融合接头在光照后产生光散射。根据本发明的反应容器经由连接由2个部件装配，其中在2个部件之间的所述连接通过热确立，所述热足以熔化在界面处的所述部件，并且连接在所述界面的后续冷却过程中形成。在界面的后续冷却过程中形成的所述连接在本发明自始至终称为融合接头。
从毛细管部件、管形部件和作为2个部件之间的连接的融合接头装配反应容器具有下述优点：所述反应容器的生产可以分成子步骤。这提供生产具有特定几何尺寸和/或特定质量的反应容器的机会，所述反应容器无法通过1步生产获得，因为对于作为最终反应容器的部分的每个部件，所需尺寸和/或质量更容易满足。换言之，作为反应容器的2个部件之间的连接的融合接头提供了例如增强质量、减少壁厚度和/或增加容器长度的可能性。
在根据本发明的优选反应容器中，所述连接、所述毛细管部件和所述管形部件由相同塑料材料制成。
优选2个部件和连接由相同材料制备，从而使得整个反应容器的光学性质尽可能均匀。然而，即使用相同材料，也将存在在部件之间的界面处具有不同光学性质的特定区域(参见图5的照片)，在界面处在光学性质中的所述差异基于连接材料的不同形态学结构。
如前文提及的，本发明自始至终的连接通过热形成，以局部熔化在2个部件之间的界面。如本领域技术人员将认识到的，塑料的分子结构高度依赖生产程序。本发明自始至终的短语分子结构用作描述分子排列以形成三维结构(换言之，材料的形态学或物理结构)的术语，且因此，具有相同分子组成的材料仍可以形成不同分子结构。因此，就其分子排列而言，连接的塑料将不同于反应容器的其余部件，因为界面的短暂、局部熔化产生融合接头将导致与例如基于来自均匀模的受控冷却的结构相比较不同的形态学结构。
在根据本发明的反应容器的优选配置中，毛细管部件以及管形部件是注射模塑的物品。为了生产作为连接的融合接头，允许在第二个生产步骤中形成所述毛细管部件所需的熔化塑料接触预形成的管形部件，从而短暂熔化管形部件的边界且在模冷却过程中产生2个部件之间的融合接头。
在根据本发明的另一个优选反应容器中，所述连接的材料具有与所述毛细管部件和所述管形部件的材料不同的分子结构。塑料材料的分子结构内的此种变化构成将产生光散射的光学界面。因此，优选反应容器的所述连接在对核酸扩增的实时检测具有最低限度作用的位置处提供。
图5中根据本发明的反应容器的照片(用标准数码相机获得)显示沿着容器的融合接头的光散射，并且因此，这是使毛细管部件与管形部件永久连接的融合接头的固有性质，以在光照后产生光散射。
在根据本发明的另外一个优选反应容器中，所述毛细管部件和所述管形部件是注射模塑的物品。
用于毛细管部件和管形部件的注射模塑的物品是优选的，主要是因为在2个部件之间形成连接是生产过程的直接结果。如果反应容器的2个部件相继产生，并且第二个部件与第一个部件接触直接模塑，那么第二个部件的熔化塑料将局部熔化第一个部件的塑料且在冷却后形成连接。
在根据本发明的更优选的反应容器中，所述毛细管部件具有0.2-0.4mm的壁厚度。
在根据本发明的另一个更优选的反应容器中，所述毛细管部件具有0.7-2mm的内径。
主要地，存在需要最优化以获得适合于实时核酸扩增的反应容器的2个几何参数，即壁厚度和表面积与体积比。核酸扩增要求在靶溶液内精确的温度线图，并且因此，必须通过反应容器的壁以2个方向快速传递热。因此，显而易见的是壁厚度对于设计所述反应容器具有重要性。
此外，热传递与界面的表面积成比例，并且用于反应容器内的热平衡的时间与反应体积成比例增加。因此，本领域技术人员将认识到反应容器应具有大表面积与体积比。就用于PCR的反应容器而言，理想的几何学是长且薄的毛细管。
在根据本发明的另外一个优选反应容器中，在与所述毛细管部件的开放末端永久连接的开口处，所述管形部件具有与所述毛细管部件相同的壁厚度和相同的内径。
尽管根据本发明的反应容器包含永久连接在一起的2个部件，但反应容器尽可能均匀是必要的。因此，优选调整2个部件的壁厚度，从而使得反应容器至少在反应单元内不显示梯级，其中此种梯级将产生另外的光散射。
在本发明自始至终，反应单元定义为将用预期用于反应容器的试剂填充的反应容器部分。此外，在本发明自始至终，该反应单元的几何学与反应容器的性能相关，并且因此对于容器的这个部分计算表面积与体积(S/V)比。
就毛细管而言反应容器的表面积与体积比仅依赖于容器的内和外半径(rin和rout)，并且不依赖于其长度l(S/V＝2πroutl/πrin 2l＝2rout/rin 2；忽略毛细管底部的小表面积)。因此，如果应增加毛细管的体积而不影响S/V比，那么必须增加毛细管的长度而不改变其半径。
在根据本发明的另外一个优选反应容器中，所述管形部件具有有不同直径的部分。
在根据本发明的另一个优选反应容器中，所述毛细管部件具有有不同直径的部分。
在根据本发明的另外一个优选反应容器中，在不与所述毛细管部件连接的开口处所述管形部件的直径大于在与所述毛细管部件永久连接的开口处的直径。
在根据本发明的另外一个优选反应容器中，在与所述管形部件连接的开口处所述毛细管部件的直径大于朝向所述毛细管部件的封闭末端的直径。
提供具有大开口和朝向其封闭末端渐减的直径的反应容器具有几个优点。首先，这个几何学简化反应容器由试剂的装载。此外，在使用模塑技术用于生产反应容器的情况下，这个几何学使得能够从模的核处容易取出容器。
在根据本发明的另一个优选反应容器中，在不与毛细管部件连接的开口处所述管形部件的内径是2-10mm。
在反应容器的开口处的所述内径需要对于预期应用进行调整。例如，如果所述反应容器设计为用于自动化实时PCR扩增的容器，那么这个内径需要关于预期使用的PCR机器的容纳装置进行调整。
在根据本发明的另外一个优选反应容器中，这样设计不与所述毛细管部件连接的所述管形部件的所述开口，从而使得可获得具有关闭工具的气密密封。
在本发明自始至终，优选反应容器具有仅构成整个反应容器的部分的反应单元。所述反应单元放置在反应容器的封闭末端处，并且优选所述反应单元由整个毛细管部件，和需要时管形部件的部分组成。依赖于毛细管的设计，毛细管部件和管形部件之间的连接可以是反应单元的部分。
如前文提及的，反应容器的连接具有与容器的毛细管以及管形部件不同的分子结构，并且因此，所述连接将产生特定量的光散射。基于这个推理，将优选这样设计反应容器，从而使得连接不在反应单元内。但是，如后文就根据本发明的方法而言讨论的，毛细管部件的质量在一定程度上也依赖于其长度。概括来说，可以优选设计具有短毛细管部件的反应容器，即使连接随后在反应单元内。
在根据本发明的另外一个优选反应容器中，所述管形部件具有有不同壁厚度的部分。
与毛细管部件的壁厚度形成对照，无需使管形部件的壁厚度在其整个程度上降到最低，因为仅管形部件的至少部分也是反应单元的部分，并且仅反应单元的壁厚度影响容器性能。
因此，可以扩大并非反应单元部分的管形部件的壁厚度，以对反应容器提供稳定性，以提供使得能够气密密封的合适的开口，或提供在分析设备内的安全固定。
类似于就壁厚度而言的上述讨论，反应容器涉及长度和体积的要求可以分为对于容器性能关键或不关键的要求。反应单元的长度和体积对于反应容器的性能是重要的，因为这些参数定义表面积与体积比。另一方面，整个反应容器的总体体积和长度不影响性能，但对于诸如稳定性、用于特定分析仪的适合性或用试剂填充方面具有关联性。
在根据本发明的另外一个优选反应容器中，所述反应容器具有30-55mm的长度。
在根据本发明的另外一个优选反应容器中，所述反应容器在其封闭末端处具有有恒定壁厚度的反应单元，所述反应单元具有10-30μl的体积。
在根据本发明的更优选的反应容器中，所述反应单元具有10-30mm的长度。
如前文提及的，反应单元的长度是反应容器优选的几何参数，以限定容器体积而不影响S/V比。
在根据本发明的反应容器的另一个优选实施方案中，至少反应单元不是圆柱状的。但即使在这个实施方案中，也优选壁厚度对于整个反应单元是恒定的。
在根据本发明的优选反应容器中，所述反应单元是圆锥形反应单元。
在根据本发明的更优选的反应容器中，所述圆锥形反应单元具有0.5°-2°的锥角。
如前文就反应容器而言提及的，如果容器使用模塑技术产生，那么反应单元的圆锥形状是特别优选的，因为这个特别形状增强容器从模的核处的取出。
在根据本发明的另一个优选反应容器中，所述反应单元具有1-15mm-1的表面积与体积比。
在根据本发明的另外一个优选反应容器中，所述塑料材料是环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)或聚碳酸酯(PC)。
一般而言，适合于根据本发明的反应容器的塑料材料必须使非常高水平的光透射与在PCR循环的热条件下良好的热稳定性组合。
就上文提及的优选材料而言，COC和COP提供非常好的稳定性。此外，COC显示低水平的自身荧光，而所述自身荧光当然是对于基于荧光检测的rtPCR关键的参数。特定COP材料在加工过程中需要氮作为覆盖气体，以避免材料的脱色。PC具有便宜的材料价格，并且因此，它在经济上是有利的。COP具有非常好的技术性质，但它相对高定价。
合适的材料是例如COC材料Topas 5013S、PC材料Makrolon CD2005或COP材料Zeonex 690R。
本发明的另一个方面是生产根据本发明的反应容器的注射模塑方法，所述方法包括
a)提供具有核的第一个模，
b)执行第一个注射步骤，以产生所述反应容器的管形部件，所述管形部件部分围绕所述核，
c)将由所述管形部件部分围绕的所述核放置在第二个模中，和
d)执行第二个注射步骤，以产生所述反应容器的毛细管部件，
其中在所述第二个注射步骤过程中，所述毛细管部件变得与所述管形部件永久连接，以形成具有一个开口的所述反应容器。
在第一个注射步骤过程中，熔化塑料的流动方向优选与核平行。这个流动方向推动与核平行的在模内的空气朝向脱气点且避免气泡的封入。
在根据本发明的优选方法中，所述核在所述第一个注射步骤b)过程中在两个末端处固定。
在根据本发明方法的这个优选实施方案中，所述核这样排列，从而使得核的2个部分固定，以确保核在熔化块的流动场内的稳定定位。核的这种固定使得能够增加可生产的反应容器长度。
在根据本发明的更优选的方法中，所述核在其第一个末端处悬浮，并且所述核的第二个末端形状上配合(form-fits)到所述第一个模的凹进内，从而使得具有2个开放末端的管形部件在所述核周围形成。
优选熔化塑料在形成反应容器开口的悬浮部分处开始在形成反应容器的毛细管部件的核固定部分的方向上沿着核流动。因此，脱气在核和所述核的凹进固定之间的界面处发生。
在根据本发明的另外一个优选方法中，所述第一个注射步骤使用至少2个注射口来执行。
由于用于第一个注射步骤的2个注射口的使用，可以达到在毛细管长度中的另外增加。这基于通过2个注射口产生的熔化块的2个不同流动场及其剪切力的至少部分平衡。这与仅基于一个注射口的注射技术现有技术形成对照，其中负剪切力的平衡仅可以通过模温度和注射压力进行尝试。
优选通过2个注射口的块流动是相等的，从而使得在反应容器内的张力降到最低，并且提供与核平行的均匀流动场。
对于后续加工步骤，仍由管形部件围绕的第一个注射步骤的核用作用于第二个注射步骤的模的核。
在根据本发明的更优选的方法中，在步骤d)中，从步骤b)中形成的管形部件伸出的所述核的所述第二个末端放置在所述第二个模内，以在所述第二个注射步骤过程中形成毛细管部件，所述毛细管部件由于所述管形部件的局部熔化与所述管形部件连接。
在第二个注射步骤过程中，熔化塑料的流动方向优选与核垂直，并且脱气再次在第一个注射步骤过程中产生的核和管形部件之间的界面处发生。这个脱气程序围绕核推动空气，并且基于最优化流动概况可能避免在毛细管部件的光学敏感区域中的脱气。
在根据本发明的另外一个优选方法中，所述第二个注射步骤使用一个注射口来执行。
对于产生反应容器的毛细管部件的第二个注射步骤，由于几个方面仅用一个注射口执行模塑是合适的。
对于毛细管部件的生产，不再可能如对于第一个注射步骤那样固定核的2侧。因此，优选设计具有小毛细管部件的反应容器，因为对于长的毛细管部件，核的自由末端易受在流动场中变形的影响，从而使遭受产生不均匀容器的危险。
因为至少与管形部件相比较，毛细管部件是小的，仅需要少量熔化塑料，所以即使用一个注射口也可以满足关于这个注射步骤的要求。
此外，整个毛细管部件在反应单元内，并且因此，同质性是容器的光学性质所必需的。因此，优选仅具有一个注射口，因为每个注射口将产生在最终产品内具有不均匀性的区域。这个陈述还适用于脱气口，并且因此，优选使脱气安排在毛细管和管形部件之间的界面处，所述界面给容器的连接提供无法避免的不均匀性。
在根据本发明的优选方法中，具有240-290℃温度的熔化塑料用于所述第一个注射步骤。
就注射温度而言，需要考虑2个方面。一方面，高温减少熔化塑料的粘性并且促进填充，但另一方面，在更高的温度下，材料可能变成黄色，这影响光透射。因此，熔化塑料在注射前的温度不应超过290℃。此外，过热的材料可能变脆。
在根据本发明的另一个优选方法中，熔化塑料以600-1000巴的压力注射用于所述第一个注射步骤。
在本发明自始至终，高注射压力是优选的，以快速填充腔，从而使得所述核的偏斜可以降到最低。
在根据本发明的更优选的方法中，用于所述第一次注射的压力是800巴。
在根据本发明的另外一个优选方法中，具有240-290℃的温度的熔化塑料用于所述第二个注射步骤。
在根据本发明的另外一个优选方法中，熔化塑料以200-400巴的压力注射用于所述第二个注射步骤。
在根据本发明的更优选的方法中，用于所述第一次注射的压力是300巴。
提供下述实施例和图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在附加权利要求中阐述。应当理解可以在所述程序中进行修饰而不背离本发明的精神。
附图说明
图1举例说明2步塑料毛细管的一个实施方案的示意图。
图2举例说明2步塑料毛细管的生产方法的横断面视图。
图3用于HybProbe CycA扩增的rtPCR曲线(a：640nm塑料；b：640nm玻璃；c：640/530nm塑料；d：640/530nm玻璃)。
图4用于SYBR Green I PBGD扩增的rtPCR曲线和解链曲线(a：塑料rtPCR；b：塑料TM；c：玻璃rtPCR；d：玻璃TM)。
图5包含在毛细管部件和管形部件之间的连接的毛细管部分的照片。
具体实施方式
用于下述实施例的根据本发明的塑料毛细管具有下述特征：
毛细管部件的壁厚度：0.3mm
毛细管部件的内径：1.09mm
反应容器长度：42mm
在不与毛细管部件连接的开口处的管形部件内径：3.98mm
反应单元体积：20μl
反应单元长度：19.26mm
圆锥形反应单元的锥角：1°
实施例1：具有HybProbe-形式的CycA
在这个实验中，根据本发明的塑料毛细管(20μl)与玻璃毛细管(20μl，Id.Nr.11 909 339 001，批次3529565-00，Roche)就CycA的rtPCR扩增进行比较，其中使用用于RNA的HybProbe形式，使用LightCycler(Roche，Software-Version：LCS4 4.0.5.415)。塑料毛细管使用COCTopas5013进行生产。
PCR根据下述程序执行：
试剂盒：LightCycler RNA Amplification Kit HybProbe，IdNr.12 015145001，批次13419720
引物/探针：正向引物CycA：SEQ ID NO：1
反向引物CycA：SEQ ID NO：2
3’荧光素探针CycA：GGC CAT GGA GCG CTT TGG GT-荧光素(SEQ ID NO：3)
5’Red 640探针CycA：Red 640-AAT GGC AAG ACC AGC AAGAAG ATC AC(SEQ ID NO：4)
模板：Universal Human Reference RNA(Stratagene目录号740000-41，具有浓度20、2ng/μl、200、20、2pg/μl的批次1139623)
主混合物：
  20x
  H2O   184
  LCRT-PCR反应混合物，5x   80
  MgCl2[25mM]   48
  CycA引物-探针-混合物[10x]   40
  LC RT-PCR酶混合物，50x   8
  总计   360μl
运行规程：18μl主混合物/毛细管加2μl RNA(3倍)
  循环   分析   温度   时间   速率   采集
RT 1x 50℃   10分钟 20℃/s -
变性 1x 95℃   1分钟   20℃/s用于玻璃毛细管1℃/s用于塑料毛细管   -
  循环   分析   温度   时间   速率   采集
扩增 50x 定量 95℃ 0秒   20℃/s用于玻璃毛细管1℃/s用于塑料毛细管   -
  55℃   10秒   20℃/s   单次
  72℃   18秒   3℃/s   -
  冷却   1x   40℃   30秒   20℃/s   -
在640nm执行的分析：
Figure G2009102224913D0000131
在640/530nm执行的分析：
Figure G2009102224913D0000141
概括：
Cp值和标准差对于塑料以及玻璃毛细管是相似的。对于在640/530nm的分析，与玻璃毛细管相比较，关于塑料毛细管的PCR曲线看起来相似，并且标准差甚至更低。
实施例2：具有SYBR Green I形式的PBGD
在这个实验中，根据本发明的塑料毛细管(20μl)与玻璃毛细管(20μl，Id.Nr.11 909 339 001，批次3529565-00，Roche)就PBGD的rtPCR扩增进行比较，其中使用用于DNA的SYBR Green I形式，使用LightCycler(Roche，Software-Version：LCS4 4.0.5.415)。塑料毛细管使用COCTopas5013进行生产。
PCR根据下述程序执行：
试剂盒：LightCycler-FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I，IdNr.03 515 885 001，批次13828500
引物：根据‘LightCycler h-PBGD Housekeeping Gene Set’(目录号03 146 073 001，Roche)
模板：cDNA合成使用RT-PCR的第1链cDNA合成试剂盒(’1ststrand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR’)(目录号11 483 188 001，Roche)来执行
主混合物：
  20x
  H2O   240
  PBGD for/rev[各5μM]   40
  SGI Master，5x   80
  总计   360μl
运行规程：18μl主混合物/毛细管加2μl RNA(3倍)
  循环   分析   温度   时间   速率   采集
变性 1x 95℃ 10分钟   20℃/s用于玻璃毛细管1℃/s用于塑料毛细管   -
扩增 45x 定量 95℃ 10秒   20℃/s用于玻璃毛细管1℃/s用于塑料毛细管   -
  58℃   10秒   20℃/s   -
  72℃   15秒   20℃/s   单次
  循环   分析   温度   时间   速率   采集
解链 1x   解链曲线 95℃ 0秒 20℃/s -
  42℃   15秒   20℃/s   -
  80℃   0秒   0.1℃/s   连续
  冷却   1x   40℃   30秒   20℃/s   -
分析Cp值：
Figure G2009102224913D0000151
分析解链曲线：
Figure G2009102224913D0000161
概括：
SYBR Green I作为检测形式使用根据本发明的塑料毛细管工作非常好。PCR曲线是良好形成的，并且与玻璃毛细管相比较，塑料毛细管的Cp值甚至更低。2种毛细管的标准差是可比较的。解链曲线是相似的，具有良好的标准差。
序列表
<110>F.Hoffmann-La Roche AG
<120>毛细管
<130>25478
<150>08020060.3
<151>2008-11-18
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工DNA，正向引物CycA
<400>1
ggccgcgtct cctttgag                                            18
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工DNA，反向引物CycA
<400>2
cgagttgtcc acagtcagca atg                                      23
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工DNA，3’荧光素探针CycA
<400>3
ggccatggag cgctttgggt                                           20
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工DNA，5’Red 640探针CycA
<400>4
aatggcaaga ccagcaagaa gatcac                                    26

Claims (15)

1.一种由塑料材料制成的用于实时核酸扩增的反应容器，其包括
a)在一个末端处封闭的毛细管部件，
b)在两个末端处开放的管形部件，和
c)在所述毛细管部件和所述管形部件之间的连接，
其中所述连接是设计为使所述毛细管部件的开放末端和所述管形部件的所述开放末端之一永久连接的融合接头，从而形成具有一个开口的反应容器，所述融合接头在光照后产生光散射。
2.根据权利要求1的反应容器，其中所述连接、所述毛细管部件和所述管形部件由相同塑料材料制成。
3.根据权利要求2的反应容器，其中所述连接的材料具有与所述毛细管部件和所述管形部件的材料不同的分子结构。
4.根据权利要求1-3的反应容器，其中所述毛细管部件具有0.2-0.4mm的壁厚度。
5.根据权利要求1-4的反应容器，其中所述毛细管部件具有0.7-2mm的内径。
6.根据权利要求1-5的反应容器，其中这样设计不与所述毛细管部件连接的所述管形部件的开口，从而使得可获得具有关闭工具的气密密封。
7.根据权利要求1-6的反应容器，其中所述反应容器在其封闭末端处具有有恒定壁厚度的反应单元，所述反应单元具有10-30μl的体积。
8.根据权利要求7的反应容器，其中所述反应单元具有10-30mm的长度。
9.根据权利要求7-8的反应容器，其中所述反应单元是圆锥形反应单元。
10.根据权利要求1-9的反应容器，其中所述反应单元具有1-15mm-1的表面积与体积比。
11.根据权利要求1-10的反应容器，其中所述塑料材料是环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)或聚碳酸酯(PC)。
12.一种生产根据权利要求1-11的反应容器的注射模塑方法，所述方法包括
a)提供具有核的第一个模，
b)执行第一个注射步骤，以产生所述反应容器的管形部件，所述管形部件部分围绕所述核，
c)将由所述管形部件部分围绕的所述核放置在第二个模中，和
d)执行第二个注射步骤，以产生所述反应容器的毛细管部件，
其中在所述第二个注射步骤过程中，所述毛细管部件变得与所述管形部件永久连接，以形成具有一个开口的所述反应容器。
13.根据权利要求12的方法，其中所述核在其第一个末端处悬浮，并且所述核的第二个末端形状上配合到所述第一个模的凹进内，从而使得具有2个开放末端的管形部件在所述核周围形成。
14.根据权利要求13的方法，其中在步骤d)中，从步骤b)中形成的管形部件伸出的所述核的所述第二个末端放置在所述第二个模内，以在所述第二个注射步骤过程中形成毛细管部件，所述毛细管部件由于所述管形部件的局部熔化与所述管形部件连接。
15.根据权利要求12-14的方法，其中所述第一个注射步骤使用至少2个注射口来执行。
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