JP2010148495A - キャピラリー - Google Patents

Abstract

【課題】ｒｔＰＣＲ（リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応）増幅に適当な最適化した表面積対体積率を有するプラスチックキャピラリー及び、上記ｒｔＰＣＲプラスチックキャピラリーの新規な製造方法を提供する。
【解決手段】ａ）一端が閉じられているキャピラリー部分、ｂ）両端が開いているチューブ部分、及びｃ）上記キャピラリー部分と上記チューブ部分の間のリンケージ、を備え、ここで上記リンケージは上記キャピラリー部分の開口端が上記チューブ部分の開口端の一方と永久的に連結するように設計された融合接合部であり、これにより１つの開口を有する反応容器を形成し、上記融合接合部は照明において光散乱を産生することを特徴とする反応容器。上記のプラスチックキャピラリーは２段階成形方法により製造される。
【選択図】なし

Description

リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＰＣＲ）に対する容器の最適化のためには、いくつかの観点を考慮しなければならないことが当業者に知られている。ＰＣＲには、例えば容器の壁を介する迅速かつ均一な熱伝達を供する必要があることは重要である。この熱伝達パラメーターは、容器の壁厚及び表面積対体積率に比例する。したがって、ＰＣＲ容器として細いキャピラリーが好ましい。この結論の欠点は、ＰＣＲ体積を増加させるために長いキャピラリーが必要となり、このような長いキャピラリーは、かかる容器の材料及び製造方法に高度な要求を提示する。

先行技術によれば、ｒｔＰＣＲ用としてプラスチックならびにガラス製のキャピラリーが知られている。当業者は、ｒｔＰＣＲ用のキャピラリーは、良好な熱伝達特性を提供し、迅速かつ正確な温度サイクリングを可能とするために、高い表面積対体積率と薄い壁を有する必要があると理解するであろう。容器の壁厚及び長さに関して、プラスチック装置の射出成形の制限はガラス容器の制限に劣るため、より高い表面積対体積率にするためには、ガラスキャピラリーが好ましい。ガラスキャピラリーの欠点は、プラスチックを用いる射出形成と比較して高い材料及び生産コストにある。

商業的に入手可能なガラスキャピラリーは、例えば長さ約１７ｍｍの反応部分、外径１．５５ｍｍ及び壁厚０．１７５ｍｍに基づく２０μｌの反応体積を有する(Roche Diagnostics GmbH, Cat. Nr.04929292001)。更にまた、１００μｌの反応体積を有するガラスキャピラリーも入手可能である(Roche Diagnostics GmbH, Cat. Nr.03337090001)。

このようなキャピラリーの寸法は、射出形成技術を用いて製造することが意図される場合、いくつかの根本的な問題に直面する。

成形技術（本願において１段階成形を意味する）において、一端が閉じたキャビティを得るため、コアとモールド間に形成されるキャビティに、高圧下で溶融プラスチック・マスが射出される(WO 2004／054715)。薄い壁かつ小さな直径を有する長いキャピラリーが意図される場合、少なくとも以下の根本的な障害を対処する必要がある：
・ 融解マスの高い圧力及びモールドの小さな誤差のために、大きなせん断力が、モールドの薄いコアに生じ、コアのたわみやモールドキャビティの不均一な充填（filling)をもたらす（壁面変位）。このモールドの不均一な充填は、コア力の不釣合いな増加をもたらす（融解マスの進出流による自己加圧作用（self-energizing effect)）。
・ ｒｔＰＣＴに必要な透明材料（例えば、ＣＯＣ又はＰＣ）のために、気泡の包埋を避けるための脱気が重要であるが、脱気はキャピラリー長が増加するにつれ問題となる。

この根本的な障害の結果は少なくとも以下のとおりである：
・ モールドキャビティの不均一な充填は、キャピラリーの不均質な壁厚分布をもたらし、これはＰＣＲの温度サイクルにおいて不均一な熱膨張を供する。ｒｔＰＣＴにおいて容器の変形は容器の蛍光の光学的な読み取りに影響し、かかる容器は適当ではない。
・ 成形したキャピラリー内の冷凍圧力は、ＰＣＲサイクリングの上昇温度により緩和し、たわみを生じるため、その結果、光学的な読み取りに影響する。
・ 壁厚分布を有する壁を介する入熱は不均一となり、混合物の反応速度に影響する。
・ ｒｔＰＣＴの適用において、包埋した気泡は光学的な情報の検出に影響する。

概要すると、コアの不十分な安定性の結果として、ｒｔＰＣＴの適用のために十分な品質を有する、一端が閉じた薄壁のデバイスの一段階の成形製造は、長さと直径に関して制限される。

WO 2004/054715は、壁厚０．０１ｍｍ、内径０．０２ｍｍ及び長さ５０ｍｍを有する１段階成形プラスチックキャピラリーについて記載しているが、上記最小値が生産可能であること、又は記載されたプラスチックキャピラリーがｒｔＰＣＲに適当であることのデータは何ら供されていない。

以下の寸法を有するプラスチックキャピラリーが商業的に入手可能である：
・ Roche Diagnosics は２０μｌの反応体積を有するプラスチックキャピラリーを提供している（Id. nr. 04924738001)。該キャピラリーは、壁厚０．３ｍｍ、内径１．７ｍｍ及び反応部位の長さ約８ｍｍの２０μｌの反応体積を有する。
・ Osmetech Molecular Diagnosticsより、２０μｌの反応体積を有するプラスチックキャピラリーが入手可能である（SensiTube^TM)。該キャピラリーは、壁厚０．３ｍｍ、内径１．５ｍｍ及び反応部位の長さ約１１ｍｍの２０μｌの反応体積を有する。
・ 他のプラスチックキャピラリーは、E urogentech, Eliod及びGenaxxonより入手可能である。

本発明は、ｒｔＰＣＲアプリケーションに適当な最適化した表面積対体積率を有するプラスチックキャピラリーを提供する。さらに、本発明は、該ｒｔＰＣＲプラスチックキャピラリーの製造のための新規な方法を提供する。

本発明の１態様は、プラスチック材料から作製されたリアルタイム核酸増幅用の反応容器であって、
ａ）一端が閉じられているキャピラリー部分、
ｂ）両端が開いているチューブ部分、及び
ｃ）上記キャピラリー部分と上記チューブ部分の間のリンケージ、
を備え、ここで該リンケージは上記キャピラリー部分の開口端が上記チューブ部分の開口端の一方と永久的に連結するように設計された融合接合部であり、これにより１つの開口を有する反応容器を形成し、上記融合接合部は照明において光散乱を産生することを特徴とする反応容器、である。本発明の他の態様は、本発明の反応容器を製造するための射出成形方法であって、該方法が、
ａ）コアを有する第１モールドを提供する段階、
ｂ）第１射出段階を行い、上記反応容器のチューブ部分を産生する段階であって、該チューブ部分が上記コアを部分的に包囲している、段階、
ｃ）上記チューブ部分により部分的に包囲されたコアを第２モールドに入れる段階、及び
ｄ）第２射出段階を行い、上記反応容器のキャピラリー部分を産生する段階、
を含み、ここで上記第２射出段階において上記キャピラリー部分が上記チューブ部分と永久的に連結するようになり、１つの開口を有する反応容器を形成することを特徴とする方法、である。

上記本発明の製造方法の第１段階において、まず、コアの両端におけるガイダンスによりコアが安定化され、一方融解プラスチックで部分的にコーティングされる。コアの両端における上記ガイダンスに基づき、第１射出段階においてコアは融解マスの圧力に耐えることができ、周囲キャビティ内に同心的にとどまる。プラスチックにより部分的に包囲されたコアは、その後、第１射出段階においてガイダンス内に突き刺さっているコアの先端が、第２射出段階において融解プラスチックによって包囲されるように、第２キャビティに挿入される。

この２段階製造方法に基づき、ｒｔＰＣＲにおいて重要な、均質な厚さ分布を伴う薄壁を有する、一端が閉じられたキャピラリーが得られる（壁面変位なし、温度サイクル間の変性なし、包埋された気泡なし）。

さらに、上記２段階製造方法は、２回の射出段階におけるモールドの脱気を容易にし、プラスチック材料中の気泡の形成を防ぐことができる。

本発明の２段階製造方法は、薄壁を有する長いキャピラリーを製造するための可能性を提供するだけでなく、高い精度でこれらを製造することを可能にし、この精度は、より高感度のｒｔＰＣＲアプリケーションに適用するために十分である。ｒｔＰＣＲアプリケーションにおいて、温度サイクルの間にキャピラリーが変形しないこと、キャピラリーを介した熱伝達が均一であること、及びキャピラリー壁に気泡が包埋しないことは極めて重要である。

温度変性に対する要求性は、キャピラリーの回転運動を適用するｒｔＰＣＲ機器において使用されるキャピラリーでは、これらを検出位置に入れるためにさらに高い（例えば、Roche Diagnostics GmbHのLightCycler（登録商標）装置）。それ故、熱ストレスに加えて、遠心力もバランスをとる必要がある。かかるキャピラリーの変性を回避できない場合には、検出光学部位に対する位置は異なるキャピラリー間で相違し、もはや上記キャピラリーの比較可能性は保証されないであろう。

発明の詳細な説明
本発明の１態様は、プラスチック材料から作製されたリアルタイム核酸増幅用の反応容器であって、
ａ）一端が閉じられているキャピラリー部分、
ｂ）両端が開いているチューブ部分、及び
ｃ）上記キャピラリー部分と上記チューブ部分の間のリンケージ、
を備え、ここで該リンケージは上記キャピラリー部分の開口端が上記チューブ部分の開口端の一方と永久的に連結するように設計された融合接合部であり、これにより１つの開口を有する反応容器を形成し、上記融合接合部は照明において光散乱を産生することを特徴とする反応容器、である。本発明の反応容器は、リンケージを介して２つの部分から成り、ここで２つの部分の間のリンケージは熱により定着される。この熱はインターフェースにおける上記部分を融解するために十分であり、そしてリンケージは、その後のインターフェースの冷却により形成される。その後のインターフェースの冷却によって形成するリンケージは、本発明において、融合接合部と称する。

キャピラリー部分、チューブ部分、及びその両方の部分間のリンケージとしての融合接合部からの反応容器の組み立ては、該反応容器の製造をサブステップに分けることができるという利点を有する。これは、１段階の製造によって得ることができない一定の幾何学的寸法及び／又は一定の品質を有する反応容器を製造するための機会を与える。これは、最終反応容器の一部としての各々の部分に必要とされる寸法及び／又は品質を実現することが容易であるためである。換言すれば、反応容器の２つの部分間のリンケージとしての融合接合部は、例えば品質を高め、壁厚を減少し、そして／あるいは容器の長さを増大するといった可能性を与える。

本発明の好ましい反応容器において、上記リンケージ、上記キャピラリー部分及び上記チューブ部分は、同一のプラスチック材料から作製される。

好ましくは、全体の反応容器の光学特性が可能な限り均一となるように、両方の部分及びリンケージは同じ材料から作製される。しかしながら、同じ材料にしてもなお、該部分間のインターフェースにおいて異なる光学特性を有する一定の領域が存在し（図５の写真を参照のこと）、該インターフェースにおける光学特性の上記相違はリンケージ材料の異なる形態構造に基づく。

上述のとおり、本発明のリンケージは、２つの部分間のインターフェースを局所的に溶解する加熱によって形成される。当業者は、プラスチックの分子構造が製造手順に大きく依存することを理解するであろう。本発明において、分子構造とは、３次元構造（換言すれば、材料の形態的又は物理的構造）を形成するための分子の配置を記述するための用語として使用される。このため、同一の分子組成を有する材料であっても、異なる分子構造を形成しうる。したがって、融合接合部を産生するためのインターフェースの一時的な局所的溶解は、例えば均一なモールドからの制御された冷却に基づく構造と比較して、異なる形態構造をもたらすため、プラスチックのリンケージは、分子配置に関して該反応容器の残りの部分とは異なる。

本発明の反応容器の好ましいセットアップにおいて、キャピラリー部分、ならびにチューブ部分は射出成形品である。リンケージとしての融合接合部を産生するために、第２製造段階において上記キャピラリー部分を形成するために必要な溶解プラスチックは、予め形成されたチューブ部分と接触し、これによりチューブ部分の境界を一時的に溶解し、そしてモールドの冷却中に両部分間に融合接合部を作る。

本発明の他の好ましい反応容器において、上記リンケージの材料は、上記キャピラリー部分とチューブ部分の両方の材料とは異なる分子構造を有する。プラスチック材料の分子構造内のこのような変化は、光散乱を産生する光学インターフェースを構築する。したがって、好ましくは、該反応容器の上記リンケージは、核酸増幅のリアルタイム検出において最小の効果を伴う位置に提供される。

図５における本発明の反応容器の写真（標準的なデジタルカメラで撮影した）は、容器の融合接合部に沿った光分散を示し、したがってこれは、キャピラリー部分とチューブ部分を永久的に連結する融合接合部の固有の特性であり、照明において光散乱を産生する。

本発明の更に他の好ましい反応容器において、上記キャピラリー部分及び上記チューブ部分は射出成形品である。

主に、２つの部分の間のリンケージの形成は、製造手順の直接的な結果であるため、キャピラリー部分とチューブ部分は射出成形品が好ましい。該反応容器の２つの部分が連続的に製造され、そして第１部分と直接的に接触する第２部分が成形される場合、該第２部分の溶解プラスチックは第１部分のプラスチックを局所的に溶解し、冷却によりリンケージを形成するであろう。

本発明のより好ましい反応容器において、上記キャピラリー部分は、０．２〜０．４ｍｍの壁厚を有する。

本発明の他のより好ましい反応容器において、上記キャピラリー部分は、０．７〜２ｍｍの内径を有する。

リアルタイム核酸増幅に適当な反応容器を得るために、最適化が必要とされる２つの幾何学的パラメーター、特に壁厚と表面積対体積率がある。核酸増幅は、標的溶液中の正確な温度特性を必要とするため、反応容器の壁を介して両方向において熱を素早く伝達する必要がある。したがって、壁厚が上記反応容器の設計において重要であることは明らかである。

更に、熱伝達はインターフェースの表面に比例し、そして反応容器内の熱平衡時間は、反応体積と比例して増加する。したがって、当業者は、反応容器は、大きな表面積対体積率を有するべきであることを理解するであろう。ＰＣＲ用の反応容器に関して理想的な形状は、長くかつ細いキャピラリーである。

本発明の更に他の好ましい反応容器において、上記チューブ部分は上記キャピラリー部分の開口端に永久的に連結する開口におけるキャピラリー部分と同じ壁厚及び同じ内径を有する。

たとえ本発明の反応容器が、永久的に連結された２つの部分を含んでいても、該反応容器は可能な限り均一である必要がある。したがって、両部分の壁厚は、該反応容器が少なくとも反応容器内で更なる光散乱を生じるような段差を示さないように調整することが好ましい。

本発明において、反応部分は反応容器の一部として定義され、反応容器の意図される用途の試薬で満たされる。更に本発明において、この反応部分の形状は反応容器の性能に関与し、したがって表面積対体積（Ｓ／Ｖ）率は、容器のこの部分について計算される。

キャピラリーの形状における反応容器の表面積対体積率は、該容器の内縁半径と外縁半径（ｒ_in及びｒ_out）に依存し、そして長さｌからは独立している（Ｓ／Ｖ＝２πｒ_outｌ／πｒ_in ²ｌ＝２ｒ_out／ｒ_in ²；キャピラリー底の微細な表面は無視する）。したがって、Ｓ／Ｖ比に影響することなくキャピラリーの体積を増加させる場合には、その半径を変えることなくキャピラリーの長さを増加させなければならない。

本発明の更に他の好ましい反応容器において、上記チューブ部分は異なる直径を伴う部分を有する。

本発明の他の好ましい反応容器において、上記キャピラリー部分は異なる直径を伴う部分を有する。

本発明の更に他の好ましい反応容器において、上記キャピラリー部分に連結していない開口における上記チューブ部分の直径は、上記キャピラリー部分に永久的に結合している開口における直径よりも大きい。

本発明の更に他の好ましい反応容器において、上記チューブ部分に連結している開口における上記キャピラリー部分の直径は、上記キャピラリー部分の閉口端に対する直径よりも大きい。

大きな開口及び閉口端に向かって減少する直径を有する反応容器を提供することは、いくつかの利点を有する。まず第１に、かかる形状は反応容器の試薬の充填を単純にする。更に、反応容器の製造のために成形技術を用いる場合、かかる形状は、モールドのコアから容器の容易な取り外しを可能にする。

本発明の他の好ましい反応容器において、キャピラリー部分と連結していない開口における上記チューブ部分の内径は、２〜１０ｍｍである。

反応容器の開口における上記内径は、意図される適用のために調整する必要がある。例えば、上記反応容器が、自動化リアルタイムＰＣＲ増幅用の容器として設計される場合、この内径は、使用が意図されるＰＣＲ機器の保持装置に対して調整することが必要である。

本発明の更に他の好ましい反応容器において、上記キャピラリー部分に連結していない上記チューブ部分の開口は、密閉手段を伴う気密シールが得られるように設計される。

本発明において、該反応容器は全反応容器の一部のみを構成する反応部分を有することが好ましい。上記反応部分は該反応容器の閉口端に位置し、そして該反応部分は、全キャピラリー部分、及び必要な場合には、チューブ部分の一部から構成されることが好ましい。キャピラリーの設計に依存して、該キャピラリー部分とチューブ部分の間のリンケージは該反応部分の一部であってよい。

上述のとおり、該反応容器のリンケージは、該容器のキャピラリーならびにチューブ部分と異なる分子構造を有しており、これにより、上記リンケージは一定量の光散乱を産生する。この理由により、該反応部分内にリンケージが存在しないように反応容器を設計することが好ましいであろう。しかしながら、本発明の方法に関して後述するとおり、キャピラリー部分の品質はその長さにも依存する。概要すると、リンケージが反応部分内に存在したとしても、短いキャピラリー部分を有する反応容器を設計することが好ましい場合がある。

本発明の更に他の好ましい反応容器において、上記チューブ部分は異なる壁厚を伴う部分を有する。

キャピラリー部分部の壁厚とは対照的に、チューブ部分の壁厚はその全体にわたって最小化する必要はない。これは、該チューブ部分の少なくとも一部だけが反応部分であり、そして該反応部分の壁厚が容器の性能に影響するためである。

したがって、反応容器の安定性を提供するため、気密シールを可能にするために適当な開口を提供するため、あるいは分析装置内の確実な固定を提供するために、反応部分の一部ではないチューブ部分の壁厚を増大することができる。

壁厚に関する上述の議論と同様に、長さ及び体積に関する反応容器の要件は、容器の性能にクリティカルな要件又はクリティカルでない要件に分けることができる。反応部分の長さ及び体積は反応容器の性能に必須である。これは、これらのパラメーターが表面積対体積率を決定するためである。一方、全反応容器の全ての体積及び長さは性能に影響しないが、例えば、一定の分析装置又は試薬の充填の安定性、適合性には関係する。

本発明の更に他の好ましい反応容器において、上記反応容器は３０〜５５ｍｍの長さを有する。

本発明の更に他の好ましい反応容器において、上記反応容器は、その閉口端において、一定の壁厚を伴う反応部分を有し、上記反応部分は１０〜３０μｌの体積を有する。

本発明のより好ましい反応容器において、上記反応部分は１０〜３０ｍｍの長さを有する。

上述のとおり、該反応部分の長さは、Ｓ／Ｖ比に影響することがない、容器の体積を決定するための反応容器の好ましい幾何学的パラメーターである。

本発明の反応容器の他の好ましい実施形態において、少なくとも反応部分は円筒状ではない。しかしながら、このような実施形態においても、壁厚は全反応部分について一定であることが好ましい。

本発明の好ましい反応容器において、上記反応部分は円錐状の反応部分である。

本発明のより好ましい反応容器において、上記円錐状の反応部分は０．５°〜２°の円錐角を有する。

反応容器に関して上述したとおり、該容器が成形技術を用いて製造される場合、該反応部分の円錐形状が特に好ましい。これは、この特別な形状がモールドのコアからの容器の取り外しを向上するためである。

本発明の他の好ましい反応容器において、上記反応部分は１〜１５ｍｍ^-1の表面積対体積率を有する。

本発明の更に他の好ましい反応容器において、上記プラスチック材料は、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）又はポリカーボネート（ＰＣ）である。

一般に、本発明の容器に適当なプラスチック材料は、ＰＣＲサイクリングの熱条件下において、極めて高レベルの伝達と良好な熱安定性を兼ね備える必要がある。

上述の好ましい材料に関して、ＣＯＣ及びＣＯＰは極めて良好な安定性を提供する。更に、ＣＯＣは低レベルの自己蛍光性を示すが、該自己蛍光性は、当然に、蛍光検出に基づくｒｔＰＣＲの重要なパラメーターである。一部のＣＯＰ材料は、材料の退色を防ぐために処理の間カバーガスとして窒素を必要とする。ＰＣは安価であるため、経済的な利点がある。ＣＯＰは極めて良好な技術的特性を有するが、やや高額である。

適当な材料は、例えばＣＯＣ材料のTopas 5013S、ＰＣ材料のMakrolon CD 2005又はＣＯＰ材料のZeonex 690Rである。

本発明の他の態様は、本発明の反応容器を製造するための射出成形方法であって、該方法が、
ａ）コアを有する第１モールドを提供する段階、
ｂ）第１射出段階を行い、上記反応容器のチューブ部分を産生する段階であって、該チューブ部分が上記コアを部分的に包囲している、段階、
ｃ）上記チューブ部分により部分的に包囲されたコアを第２モールドに入れる段階、及び
ｄ）第２射出段階を行い、上記反応容器のキャピラリー部分を産生する段階、
を含み、ここで上記第２射出段階において上記キャピラリー部分が上記チューブ部分と永久的に連結するようになり、１つの開口を有する反応容器を形成することを特徴とする方法、である。

第１射出段階の間、融解プラスチックの流動方向は、好ましくはコアに対して平行である。この流動方向は、該コアに平行なモルト内の空気を脱気スポットに押し出し、そして気泡の封入を防止する。

本発明の好ましい方法において、上記コアは第１射出段階ｂ）の間、両端において固定されている。

本発明の方法の好ましい実施形態において、上記コアは、融解マスの流動フィールド内におけるコアの安定な位置調整を保証するために該コアの両方の部分が固定されるように配置される。このコアの固定は、生産可能な反応容器の長さを増加することができる。

本発明のより好ましい方法において、上記コアは、その第１端においてサスペンドされており（suspended)、そして上記コアの第２端は上記第１モールドの凹部（recess)に適合(form-fit)されており、これにより２つの開口端を有するチューブ部分が上記コアの周囲に形成する。

融合プラスチックは、該反応容器のキャピラリー部分を形成するコアの固定された部分の方向において、反応容器の開口を形成するサスペンド部分において出発するコアに沿って流れる。

本発明の更に好ましい方法において、上記第１射出段階は、少なくとも２つの射出ポートを使用して行われる。

第１射出段階のための２つの射出ポートの使用により、該キャピラリーの長さの更なる増大が達成できる。これは、２つの射出ポート及びこれらのせん断力（shear force)の少なくとも部分的な平衡度によって産生される融解マスの２つの異なる流動フィールドに基づく。これは負のせん断力の平衡度がモルト温度及び射出圧力によってのみ試みることができる、１つの射出ポートのみに基づく先行技術の射出技術とは対照的である。

両方の射出ポートを介するマス流動は、反応容器内の張力が最小となりかつコアに対して平行な均一な流動フィールドが提供されるように等しいことが好ましい。

その後の処理段階のために、チューブ部分によって依然として包囲されている第１射出段階のコアは、第２射出段階のモールドのコアとして使用される。

本発明のより好ましい方法において、段階ｄ）において、段階ｂ）において形成されるチューブ部分から突き出した上記コアの第２端は、上記第２射出段階中にキャピラリー部分を形成するように上記第２モールド内に入れられ、上記キャピラリー部分は上記チューブ部分の局所的な融解によって上記チューブ部分と連結する。

第２射出段階の間、融解プラスチックの流動方向は、好ましくは該コアと垂直であり、そして該コアと第１射出段階で産生したチューブ部分とのインターフェースにおいて再度脱気が生じる。この脱気手順はコアの周囲の空気を押し出し、そして最適化された流動プロフィールに基づき、キャピラリー部分の光学的に感受性である領域における脱気を回避することが可能である。

本発明の更に他の好ましい方法において、上記第２射出段階は、１つの射出ポートを使用して行われる。

反応容器のキャピラリー部分を産生する第２射出段階のために、いくつかの観点から、１つのみの射出ポートによって成形を行うことが適当である。

キャピラリー部分の製造のためには、第１射出段階のためのコアの両端を固定することは出来ない。したがって、小さなキャピラリー部分を有する反応容器を設計することが好ましい。これは、長いキャピラリー部分では、流動フィールドにおいてコアのフリーな先端が変形しやすく、不均一な容器が製造される恐れがあるためである。

少なくともチューブ部分と比較して、キャピラリー部分は少量の融合プラスチックしか必要ないため、この射出段階は１つの射出ポートでも実行することができる。

更に、全てのキャピラリー部分は反応部分内にあるため、容器の光学特性のために均一性は不可欠である。このため、１つの射出ポートのみを有することが好ましい。これは、各々の射出ポートが最終製品における不均一性を伴う領域を生じうるためである。このことは、脱気ポートにも当てはまり、したがって、キャピラリーとチューブ部分間のインターフェースにおいて脱気を配置することが好ましく、上記インターフェースは不可避な不均一性を伴う容器のリンケージを供する。

本発明の好ましい方法において、上記第１射出段階のために、２４０〜２９０℃の温度を有する融解プラスチックが使用される。

射出温度に関しては２つの点を考慮する必要がある。１つは、高温が融解プラスチックの粘度を減少し、そして充填を促進する点であるが、もう１つは、高温では、材料が黄色く変色し、光透過率に影響する点である。それ故、射出前の融解プラスチックの温度は２９０℃以上にすべきではない。更に、過熱した材料は脆弱と成りうる。

本発明の他の好ましい方法において、上記第１射出段階において、融解プラスチックは６００〜１０００ｂａｒの圧力で射出される。

本発明において、キャビティを迅速に充填するために、上記コアのたわみが最小となるような高い射出圧力が好ましい。

本発明のより好ましい方法において、上記第１射出のための圧力は８００ｂａｒである。

本発明の更に他の好ましい方法において、上記第２射出段階のために、２４０〜２９０℃の温度を有する融解プラスチックが使用される。

本発明の更に他の好ましい方法において、上記第２射出段階において、融解プラスチックは２００〜４００ｂａｒの圧力で射出される。

本発明のより好ましい方法において、上記第２射出のための圧力は３００ｂａｒである。

以下の実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は付随の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神と離れることなく、記載された手順において改変できることが理解される。

２段階プラスチックキャピラリーの１実施形態を説明する概略図である。 ２段階プラスチックキャピラリーの製造方法を説明する断面図である。 HybProbe CycA増幅のためのｒｔＰＣＲ曲線である（ａ：６４０ｎｍプラスチック；ｂ：６４０ｎｍガラス；ｃ：６４０／５３０ｎｍプラスチック；ｄ：６４０／５３０ｎｍガラス）。 SYBR Green I PBGD増幅のためのｒｔＰＣＲ曲線及び融解曲線である（ａ：プラスチックｒｔＰＣＲ；ｂ：プラスチックＴＭ；ｃ：ガラスｒｔＰＣＲ；ｄ：ガラスＴＭ）。 キャピラリー部分とチューブ部分の間のリンケージを含むキャピラリーの一部の写真である。

以下の実施例に使用された本発明のプラスチックキャピラリーは、以下の特徴を有する：
キャピラリー部分の壁厚：０．３ｍｍ
キャピラリー部分の内径：１．０９ｍｍ
反応容器の長さ：４２ｍｍ
キャピラリー部分に連結していない開口におけるチューブ部分の内径：３．９８ｍｍ
反応部分体積：２０μｌ
反応部分の長さ：１９．２６ｍｍ
円錐状反応部分の円錐角：１°

例１：HybProbe-FormatによるCycA
この実験において、LightCycler（Roche, Software-Version: LCS4 4.0.5.415)を使用するRNAのためのHybProbe-Formatを用いたCycAのrtPCR増幅について、本発明のプラスチックキャピラリー（20 μl）とガラスキャピラリー（20 μl, Id.Nr. 11 909 339 001, Lot 3529565-00, Roche）を比較する。該プラスチックキャピラリーはCOC Topas5013 を使用して製造した。

ＰＣＲは以下の手順に従って行った：
キット：
LightCycler RNA増幅キットHybProbe, IdNr. 12 015 145 001, Lot 13419720
プライマー／プローブ：
フォワードプライマーCycA：配列番号１
リバースプライマーCycA：配列番号２
３’フルオレセインプローブCycA：GGC CAT GGA GCG CTT TGG GT-フルオレセイン（配列番号３）
５’Red 640プローブCycA：Red 640-AAT GGC AAG ACC AGC AAG AAG ATC AC（配列番号４）
鋳型：
Universal Human Reference RNA (Stratagene Cat.No.740000-41, Lot 1139623, 濃度20, 2 ng/μl, 200, 20, 2 g/μl)

要約：
プラスチックならびにガラスキャピラリーについて、Ｃｐ値及び標準偏差は類似している。６４０／５３０ｎｍにおける分析について、プラスチックキャピラリーのＰＣＲ曲線は、ガラスキャピラリーと比較して類似しており、標準偏差はより低い。

例２：SYBR Green I フォーマットによるPBGD
この実験において、LightCycler（Roche, Software-Version: LCS4 4.0.5.415)を使用するRNAのためのSYBR Green I フォーマットを用いたPBGDのrtPCR増幅について、本発明のプラスチックキャピラリー（20 μl）とガラスキャピラリー（20 μl, Id.Nr. 11 909 339 001, Lot 3529565-00, Roche）を比較する。該プラスチックキャピラリーはCOC Topas5013を使用して製造した。

ＰＣＲは以下の手順に従って行った：
キット：
LightCycler-FastStart DNA Master^PLUS SYBR Green I, IdNr.03 515 885 001, Lot 13828500
プライマー：
'LightCycler h-PBGD Housekeeping Gene Set'に従う（Cat.No. 03 146 073 001, Roche)
鋳型：
cDNA合成は'1st 鎖 cDNA Synthesis Kit （Cat.No.11 483 188 001, Roche)を使用して行った。

要約：
本発明のプラスチックキャピラリーを使用した、検出フォーマットとしてのSYBR Green Iは極めて良好に作用する。ＰＣＲ曲線が良好に形成され、そしてプラスチックキャピラリーのＣｐ値はガラスキャピラリーと比較して低い。両キャピラリーの標準偏差は同程度である。融解曲線は類似しており、優れた標準偏差を有する。

Claims (15)

1. プラスチック材料から作製されたリアルタイム核酸増幅用の反応容器であって、
   ａ）一端が閉じられているキャピラリー部分、
   ｂ）両端が開いているチューブ部分、及び
   ｃ）上記キャピラリー部分と上記チューブ部分の間のリンケージ、
   を備え、ここで上記リンケージは上記キャピラリー部分の開口端が上記チューブ部分の開口端の一方と永久的に連結するように設計された融合接合部であり、これにより１つの開口を有する反応容器を形成し、上記融合接合部は照明において光散乱を産生することを特徴とする反応容器。
2. 前記リンケージ、前記キャピラリー部分及び前記チューブ部分が同一のプラスチック材料から作製されている、請求項１に記載の反応容器。
3. 前記リンケージの材料が、前記キャピラリー部分と前記チューブ部分の両方の材料とは異なる分子構造を有する、請求項２に記載の反応容器。
4. 前記キャピラリー部分が、０．２〜０．４ｍｍの壁厚を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の反応容器。
5. 前記キャピラリー部分が、０．７〜２ｍｍの内径を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の反応容器。
6. 前記キャピラリー部分と連結していない前記チューブ部分の開口が、密閉手段による気密シールが得られるように設計されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の反応容器。
7. 前記反応容器が、その閉口端において一定の壁厚を有する反応部分を有し、該反応部分が１０〜３０μｌの体積を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の反応容器。
8. 前記反応部分が１０〜３０ｍｍの長さを有する、請求項７に記載の反応容器。
9. 前記反応部分が円錐状反応部分である、請求項７又は８に記載の反応容器。
10. 前記反応部分が１〜１５ｍｍ^-1の表面積対体積率を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の反応容器。
11. 前記プラスチック材料が、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）又はポリカーボネート（ＰＣ）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の反応容器。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の反応容器を製造するための射出成形方法であって、該方法が、
    ａ）コアを有する第１モールドを提供する段階、
    ｂ）第１射出段階を行い、上記反応容器のチューブ部分を産生する段階であって、該チューブ部分が上記コアを部分的に包囲している、段階、
    ｃ）上記チューブ部分により部分的に包囲されたコアを第２モールドに入れる段階、及び
    ｄ）第２射出段階を行い、上記反応容器のキャピラリー部分を産生する段階、
    を含み、ここで上記第２射出段階において上記キャピラリー部分が上記チューブ部分と永久的に連結するようになり、１つの開口を有する反応容器を形成することを特徴とする方法。
13. 前記コアが、その第１端においてサスペンドされ、そして前記コアの第２端が前記第１モールドの凹部に適合されており、これにより２つの開口端を有するチューブ部分が前記コアの周囲に形成する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記段階ｄ）において、段階ｂ）で形成されるチューブ部分から突出している前記コアの第２端が第２モールド内に収められ、第２射出段階においてキャピラリー部分を形成し、上記チューブ部分の局所融解により、上記キャピラリー部分が上記チューブ部分と連結される方法。
15. 前記第１射出段階が、少なくとも２つの射出ポートを用いて行われる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。