CN101726476B - 检测生物巯基分子的荧光探针及制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测生物巯基分子的荧光探针及制备和使用方法。它是由金属纳米粒子和吸附在金属纳米粒子表面的荧光标记聚合物组成的水溶液，水溶液的重量百分浓度为0.00001～10％，金属纳米粒子粒径为1～100纳米，金属纳米粒子与荧光标记聚合物的重量比为1～100∶0.1～100。通过对疏水性芘荧光小分子进行亲水性聚合物修饰，将所获得的水溶性两亲荧光标记聚合物作为发射荧光的能量给体，将金属纳米粒子做为吸收荧光的能量受体，通过两亲性聚合物在金属纳米粒子表面的吸附，制得生物巯基分子的荧光探针。本发明得到的荧光探针具有高荧光强度，良好的水溶性和稳定性在生物传感器等领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术，尤其涉及一种检测生物巯基分子的荧光探针及制备和使用方法。
背景技术
金属纳米粒子由于其独体的光学和电学性能在生物传感器中的应用受到了广泛的关注。由于金属纳米粒子在紫外和可见光区域很高的消光系数，使得它可以淬灭绝大多数荧光团，包括量子点，有机染料，以及荧光共轭聚合。细胞内巯基分子如半胱氨酸，谷胱甘肽等在人体的新陈代谢中起着重要的作用，巯基分子的含量直接与多种疾病相关，如癌症，帕金森症，心血管疾病等。因而发展快速，灵敏，成本低的检测巯基分子方法是很重要的。检测巯基分子含量的方法已经有很多种，如质谱，激光解析离子化质谱，高效液相色谱等，但这些方法耗时长，需要昂贵的设备，制样也比较复杂。基于金属纳米粒子的荧光检测方法由于其灵敏度高，方法简单逐渐发展起来。有研究者用荧光共轭聚合物稳定的金纳米粒子和吸附在金纳米粒子上的近红外染料来检测巯基分子，方法都是基于巯基与金纳米粒子的特异性作用以及金纳米粒子的超淬灭效应。但是荧光共轭聚合物制备复杂，需要多步反应，而近红外染料价格昂贵，如何设计一种成本低，制备简单，快速灵敏的荧光探针分子就非常有实际应用意义。
芘是一种常用的疏水染料，它的量子产率高，有规整的苯环结构，对环境的亲疏水性非常敏感，在亲水环境中，分子堆叠时会产生新的发射峰，广泛用于检测聚合物的临界胶束浓度(CMC)以及检测DNA，小分子等。但由于其疏水性，限制了它在水溶液中的广泛应用。研究者们发现，芘在聚合物胶束中的溶解度会增大，将芘结合在亲水性聚合物上可以有效增溶芘，但现在基于芘修饰的聚合物在生物监测方面的报道还很少。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测生物巯基分子的荧光探针及制备和使用方法。
检测生物巯基分子的荧光探针是由金属纳米粒子和吸附在金属纳米粒子表面的荧光标记聚合物组成的水溶液，水溶液的重量百分浓度为0.00001～10％，金属纳米粒子粒径为1～100纳米，金属纳米粒子与荧光标记聚合物的重量比为1～100∶0.1～100。
所述的金属纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子或钯纳米粒子。
所述的荧光标记聚合物的制备方法包括以下步骤：
1)将含羟基的芘溶于四氢呋喃中制备得到重量百分比浓度为0.1～10％的溶液，再加入与芘等质量的萘钾溶液，搅拌1～100分钟形成络合物，作为聚合反应的引发剂；
2)加入单体环氧乙烷，单体环氧乙烷与引发剂的重量比为1～20∶1～200，搅拌1～24小时，进行聚合反应；
3)加入0.5mL盐酸终止聚合反应，加入乙醚，使产物沉淀，过滤，真空干燥1～100小时得到荧光标记聚合物，乙醚与溶剂体积比为1～5∶1～50。
检测生物巯基分子的荧光探针的制备方法包括以下步骤：
1)将荧光标记聚合物溶于水中制成重量百分比浓度为0.01～20％的水溶液A；
2)将金属纳米粒子溶于水中制成重量百分比浓度为0.00001～1％的水溶液B；
3)将水溶液A与水溶液B按照1～100∶0.1～100的重量比混合，反应1～100分钟，让荧光标记聚合物吸附在金属纳米粒子表面，获得检测生物巯基分子的荧光探针。
检测生物巯基分子的荧光探针的使用方法是：在检测生物巯基分子的荧光探针中加入浓度为1nM～1mM的生物巯基分子，通过生物巯基分子与金纳米粒子的竞争共价结合作用实现金属纳米粒子和荧光标记聚合物的距离增加，通过荧光信号的增强实现生物巯基分子的检测。
所述的生物巯基分子为谷胱甘肽或半胱胺酸。
本发明与现技术相比具有的有益效果：
1)采用聚合物增溶芘，使疏水性染料芘能应用于亲水环境监测，扩大了芘的应用范围；
2)芘修饰的聚合物制备简单，成本低，检测快速灵敏，检测巯基分子特异性好，具有很强的实用性。
附图说明
图1是亲水性修饰的芘荧光探针的核磁共振氢谱；
图2是亲水性聚氧化乙烯修饰对荧光探针芘的增溶效果。
具体实施方式
本发明公开了一种检测生物巯基分子的荧光探针及制备方法与用途。该探针的特征在于它是由金纳米粒子和吸附在金纳米粒子表面的荧光标记聚合物构成的。通过对疏水性芘荧光小分子进行亲水性聚合物修饰，将所获得的水溶性两亲荧光标记聚合物作为发射荧光的能量给体，将金纳米粒子做为吸收荧光的能量受体，通过两亲性聚合物在金纳米粒子表面的吸附，制得生物巯基分子的荧光探针。
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：
(1)荧光标记聚合物的制备
通过带羟基的芘分子引发环氧乙烷阴离子聚合制备得到的，具体过程如下：
①将聚合所用玻璃容器抽烤3次，加入0.5833g芘(2.5mmol)，加入100mL四氢呋喃溶解，再加入7.33mL萘钾(2.5mmol，0.38mol/L)，搅拌10分钟以形成络合物，作为聚合反应的引发剂；
②加入32.8mL环氧乙烷(29.16g，0.66mol)，室温下搅拌2天，进行聚合；
③加入0.5mL HCl(36％)终止反应，过滤除去氯化钾的沉淀，加入500mL乙醚使产物沉淀出来，重复两次，真空干燥24小时得到产物。
核磁证实所获得的产物具有预期的结构，凝胶渗透色谱(GPC)表征产物的分子量和单分散性。
(2)荧光探针的制备
①将荧光标记聚合物溶于水中制备成0.024mM的水溶液
②将柠檬酸钠保护的金纳米粒子溶液制备成1nM的水溶液
③在2mL荧光聚合物水溶液中加入300μL的金纳米粒子溶液，进行自组装反应5分钟，让荧光标记聚合物吸附在金属纳米粒子表面，获得检测生物巯基分子的荧光探针。
荧光光谱表明金纳米粒子会有效淬灭荧光标记聚合物的荧光，说明聚合物可以吸附到金纳米粒子表面。
(3)巯基分子的检测：
①半胱氨酸检测：在荧光探针溶液中加入不同量的半胱氨酸(1.21×10-5M)水溶液，通过生物巯基分子与金纳米粒子的竞争共价结合作用实现金属纳米粒子和荧光标记聚合物的距离增加，通过荧光信号的增强实现生物巯基分子的检测。稳定5分钟后，检测荧光强度，用发射峰位置荧光强度恢复程度对半胱氨酸浓度做曲线，得到检测半胱氨酸的标准曲线。
结果表明：发射峰位置荧光强度恢复程度与加入半胱氨酸浓度有很好的线性关系，荧光分子探针在水溶液中可以快速灵敏的检测半胱氨酸分子。
②特异性实验：在荧光探针溶液中加入各种不含巯基的其他各种氨基酸，终浓度为6×10-6M，稳定5分钟后检测荧光强度，比较其他氨基酸与半胱氨酸发射峰位置荧光强度恢复程度。
结果表明：荧光分子探针对半胱氨酸检测有很好的特异性，其他不含巯基的氨基酸不会影响检测。
实施例2
(1)荧光标记聚合物的制备
除改变加入环氧乙烷的量来改变聚合物的聚合度，其他同实施例1.加入19.5mL环氧乙烷(14.58g，0.33mol)。
核磁证实所获得的产物具有预期的结构，凝胶渗透色谱(GPC)表征产物的分子量和单分散性。
(2)荧光探针的制备：同实施例1.
荧光光谱表明金纳米粒子会有效淬灭荧光标记聚合物的荧光，说明聚合物可以吸附到金纳米粒子表面。
(3)巯基分子的检测：同实施例1.
结果表明荧光分子探针在水溶液中可以快速灵敏的检测半胱氨酸分子，并具有良好的特异性。
实施例3
(1)荧光标记聚合物的制备：同实施例1.
核磁证实所获得的产物具有预期的结构，凝胶渗透色谱(GPC)表征产物的分子量和单分散性。
(2)荧光探针的制备：
除所用金属纳米粒子为银纳米粒子，其他同实施例1.
荧光光谱表明银纳米粒子会有效淬灭荧光标记聚合物的荧光，说明聚合物可以吸附到银纳米粒子表面。
(3)巯基分子的检测：同实施例1.
结果表明荧光分子探针在水溶液中可以快速灵敏的检测半胱氨酸分子，并具有良好的特异性。
实施例4
(1)荧光标记聚合物的制备：同实施例1.。
核磁证实所获得的产物具有预期的结构，凝胶渗透色谱(GPC)表征产物的分子量和单分散性。
(2)荧光探针的制备：同实施例1.
荧光光谱表明金纳米粒子会有效淬灭荧光标记聚合物的荧光，说明聚合物可以吸附到金纳米粒子表面。
(3)巯基分子的检测：
除改变检测巯基分子为谷胱甘肽以外，其他同实施例1.
结果表明荧光分子探针在水溶液中可以快速灵敏的检测谷胱甘肽分子，并具有良好的特异性。
实施例5
(1)荧光标记聚合物的制备：
除改变加入环氧乙烷的量来改变聚合物的分子量，其他同实施例1.加入16.4mL环氧乙烷(17.34g，0.39mol)。
核磁证实所获得的产物具有预期的结构。凝胶渗透色谱(GPC)表征产物的分子量和单分散性。
(2)荧光探针的制备：同实施例1.
荧光光谱表明金纳米粒子会有效淬灭荧光标记聚合物的荧光，说明聚合物可以吸附到金纳米粒子表面。
(3)巯基分子的检测：同实施例1.
结果表明荧光分子探针在水溶液中可以快速灵敏的检测半胱氨酸分子，并具有良好的特异性。
实施例6
(2)荧光标记聚合物的制备：同实施例1.。
核磁证实所获得的产物具有预期的结构，凝胶渗透色谱(GPC)表征产物的分子量和单分散性。
(2)荧光探针的制备：
除所用金属纳米粒子为铂纳米粒子，其他同实施例1.
荧光光谱表明铂纳米粒子会有效淬灭荧光标记聚合物的荧光，说明聚合物可以吸附到铂纳米粒子表面。
(3)巯基分子的检测：同实施例1.
结果表明荧光分子探针在水溶液中可以快速灵敏的检测半胱氨酸分子，并具有良好的特异性。
实施例7
(1)荧光标记聚合物的制备：同实施例2.。
核磁证实所获得的产物具有预期的结构，凝胶渗透色谱(GPC)表征产物的分子量和单分散性。
(2)荧光探针的制备：同实施例3.
荧光光谱表明银纳米粒子会有效淬灭荧光标记聚合物的荧光，说明聚合物可以吸附到银纳米粒子表面。
(3)巯基分子的检测：同实施例4.
结果表明荧光分子探针在水溶液中可以快速灵敏的检测谷胱甘肽分子，并具有良好的特异性。
实施例8
(1)荧光标记聚合物的制备：同实施例5.。
核磁证实所获得的产物具有预期的结构，凝胶渗透色谱(GPC)表征产物的分子量和单分散性。
(2)荧光探针的制备：同实施例6.
荧光光谱表明铂纳米粒子会有效淬灭荧光标记聚合物的荧光，说明聚合物可以吸附到铂纳米粒子表面。
(3)巯基分子的检测：同实施例1.
结果表明荧光分子探针在水溶液中可以快速灵敏的检测半胱氨酸分子，并具有良好的特异性。
Claims (2)
1.一种检测生物巯基分子的荧光探针，其特征在于由金属纳米粒子和吸附在金属纳米粒子表面的荧光标记聚合物组成的水溶液，水溶液的重量百分浓度为0.00001～10％，金属纳米粒子粒径为1～100纳米，金属纳米粒子与荧光标记聚合物的重量比为1～100∶0.1～100；
所述的荧光标记聚合物的制备方法包括以下步骤：
1)将含羟基的芘溶于四氢呋喃中制备得到重量百分比浓度为0.1～10％的溶液，再加入与芘等质量的萘钾溶液，搅拌1～100分钟形成络合物，作为聚合反应的引发剂；
2)加入单体环氧乙烷，单体环氧乙烷与引发剂的重量比为1～20∶1～200，搅拌1～24小时，进行聚合反应；
3)加入0.5mL盐酸终止聚合反应，加入乙醚，使产物沉淀，过滤，真空干燥1～100小时得到荧光标记聚合物，乙醚与溶剂体积比为1～5∶1～50。
2.根据权利要求1所述的一种检测生物巯基分子的荧光探针，其特征在于所述的金属纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子或钯纳米粒子。
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