CN101724653A

CN101724653A - 一种含利钠肽基因的药物及制备方法和应用

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Publication number: CN101724653A
Application number: CN200810224249A
Authority: CN
Inventors: 刘旭阳; 曹桂群; 闫乃红; 马嘉
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2008-10-14
Filing date: 2008-10-14
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2028-10-14
Also published as: CN101724653B

Abstract

本发明提供了一种重组质粒，含有如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。本发明还提供了一种药物组合物，它含有所述的重组质粒。本发明还提供了该药物组合物的制备方法和用途。本发明是采用基因治疗的途径，即将利钠肽基因慢病毒表达载体导入大鼠玻璃体腔，观察到目的基因的表达高，有明显的降低活体动物眼压的效果，并且不良反应少，成本低廉，效果肯定，为青光眼治疗开创新的思路。

Description

一种含利钠肽基因的药物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种含利钠肽基因的药物，具体的说，是一种可以降低眼压，治疗青光眼的基因药物，及其制备方法。

背景技术

青光眼是一种视神经病变，是目前主要致盲原因之一。据统计，每年全世界大约700万人因本病导致失明。尽管青光眼的发病机制尚未完全清楚，但眼压(intraocular pressure，IOP)升高是主要的危险因素之一。因此，降眼压一直是青光眼的主要治疗手段，及时有效地降低眼压可减缓病程及降低对视功能的损害。目前临床应用的降眼压药物均局限在能影响酶活性的小分子化合物，如碳酸酐酶抑制药，或影响受体活性的小分子药物，如前列腺素受体兴奋药、肾上腺素β受体阻滞药、肾上腺素α受体兴奋药和乙酰胆碱受体兴奋药等。

由于如何能有效的控制青光眼病人的眼压是青光眼治疗的关键问题所在，目前大多降眼压药存在费用高，疗效不理想，患者依从性和毒副作用等问题。并没有一种非常理想的控制眼压的药物。

利钠肽是一种大分子的生物活性肽，包括心房利钠肽(atrialnatriuretic peptide，ANP)，脑利钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)和C型利钠肽(C-type natriuretic peptide，CNP)。所有利钠肽均通过结合细胞膜上特异性的利钠肽受体(NPR)而发挥作用。已知cGMP(guanosine3’，5’-cyclic monophosphate)及可增加眼组织cGMP的制剂(如一氧化氮供体)可降低眼压。利钠肽能增加细胞cGMP的生成，影响房水生成，因此有降眼压的作用。其作用机制与可溶性鸟苷酸环化酶通路有关。cGMP激活依赖cGMP的蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，PKG)，PKG使能构成运转体或离子通道的特异底物蛋白磷酸化，从而影响其生物效应，减少房水生成。

利钠肽可通过激活其在组织中的相应受体参与眼压调节，有明显的降压效果。由于利钠肽可被中性内肽酶水解后清除，所以需反复给药以维持治疗效果，但又由于利钠肽角膜通透性差，只能通过结膜下、玻璃体腔注射进入眼内(前者效差)；而反复结膜下、玻璃体腔注射无临床实用意义，因此利钠肽未能广泛应用于青光眼的治疗。

现有技术中，利用利钠肽基因药物治疗青光眼国内外未尚见报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种重组质粒，其含有如SEQ IDNO.1的核苷酸序列，质粒载体为逆转录病毒或腺病毒；优选的载体选择逆转录病毒，进一步地，优选载体为慢病毒，最优选的载体为pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-CNP慢病毒表达载体。

本发明还提供一种药物组合物，它含有权利要求1～5任一一项所述的重组质粒。

本发明还提供制备权利要求6所述药物组合物的方法，克隆含有如SEQID NO.1的核苷酸序列，将其与表达载体链接，然后包装成病毒颗粒，再制备成药物制剂，所述表达载体为pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-CNP慢病毒表达载体。

本发明也提供所述的组合物在制备治疗青光眼药物中的应用，所述药物优选为注射剂。

本发明是采用基因治疗的途径，即将利钠肽基因慢病毒表达载体导入大鼠玻璃体腔，我们观察到目的基因的表达高，有明显的降低活体动物眼压的效果，并且不良反应少，成本低廉，效果肯定，为青光眼治疗开创新的思路。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

附图说明

图1RT-PCR从大鼠肾脏组织总RNA中合成并扩增CNP基因

M：核酸分子量标准；泳道1：RT-PCR产物

图2限制性核酸内切酶消化鉴定重组质粒pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-CNPM：核酸分子量标准；泳道1，2，3：双酶切pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-CNP质粒；泳道4：pCDF1-MCS2-EF1-copGFP质粒。

图3pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-CNP测序结果

图4慢病毒包装流程图

图5CNP基因在mRNA水平表达的RT-PCR检测

图中泳道依次为100bpMarker、质粒阳性对照、重组质粒转染DNAse处理组、重组质粒转染组、空载体转染组和阴性对照。

图6检测CNP转染后细胞内cGMP的表达

图7放射免疫法检测大鼠睫状体cGMP水平

图8Tonolab眼压计测量大鼠眼压和真实眼压的相关性

图9双眼眼压在不同时间段眼压的比较图，横坐标的时间段1、2、3.....为与表3.2中No.1、2、3对应的时间段

图10本发明基因药物注射后大鼠眼压的比较

具体实施方式

实施例1CNP基因的扩增、克隆

1材料

1.1质粒与细胞株

1)Lentivector expression systems(pPACKF1^TM Packaging Mix)：购自美国SBI公司，由pCDF1-MCS2-EF1-copGFP、pFIV-34N及pVSV-G三个质粒一定比例混合而成。

2)293FT细胞株：来自美国Invitrogen公司，本实验室保种。

1.2工具酶及主要试剂

1)Reagent、Lipofectamine^TM 2000和消化用胰酶(Tyrisin)：购自美国Invitrogen公司

2)TakaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)和焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)：购自日本TakaRa公司

3)质粒大抽试剂盒PureYield^TM Plasmid Midiprep System：购自美国Promega公司

4)限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶：购自美国MBI Fermentas公司

5)DNA琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒EZ-10 Spin Column DNA GelExtraction Kit：购自美国BioBasic公司

6)大肠杆菌DH5a：购自北京TIANGEN公司

7)DNAmarker：购自美国MBI Fermentas公司

8)RNA酶抑制剂：购自日本TaKaRa公司

9)dNTP：购自美国Promega公司

10)Tryptone、Yeast extract：购自英国OXOID公司

1.3细胞培养试剂

1)DEME培养基：购自美国Hyclone公司

2)胎牛血清(FBS)：购自美国Gibico BRL公司

3)胰酶(Trypsin)：购自美国Gibico BRL公司

4)依地酸二钠(EDTA)：购自美国Gibico BRL公司

5)青霉素、链霉素为国产注射用药

6)二甲基亚砜(DMSO)：购自美国Sigma公司

1.4试剂配制

1.4.1细菌培养基

1)LB液体培养基：Bacto-tryptone 10g，Yeast extract 5g，，NaCl 10g，蒸馏水溶解、定容至1000ml，高温高压灭菌20min；

2)选择性LB液体培养基：临用前在灭菌后的普通LB液体培养基中加入100mg/ml的氨苄青霉素贮存液，使其终浓度为100μg/ml。

3)选择性LB固体培养基：在普通LB液体培养基中加入琼脂粉(终浓度为1.5％)，灭菌后冷却至55℃左右时加入氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)，混匀后倒入己经消毒备用的玻璃培养皿，室温固化后置4℃保存备用。

1.4.2碱裂解法质粒抽提试剂

1)溶液I：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH8.0)，15psi压力下灭菌15min，4℃保存；

2)溶液II：0.2M NaOH，1％SDS，现用现配；

3)溶液III：冰乙酸11.5ml，5M乙酸钾(KAc)60ml，ddH2O 28.5ml。

1.4.3DNA电泳缓冲液(TAE)

1)50×的储存液pH8.5，Tris碱242g，冰醋酸57.1ml，Na₂EDTA-2H₂O37.2g，加ddH2O定容至1L；

2)工作液：取50×的储存液100ml加ddH₂O定容至5L。

1.4.4磷酸盐缓冲溶液(PBS)

在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24gKH₂PO₄，用HCl调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L，高压下蒸气灭菌20min，室温保存。

1.4.5细胞培养溶液

1)细胞培养基：

①青霉素及链霉素双抗溶液：取青霉素及链霉素各100万单位，无菌操作下溶于40ml三蒸水中，分装，置-20℃冰箱保存。

②DMEM高糖培养基：配置10％的胎牛血清加双抗培养基，置4℃冰箱保存。

2)细胞保种液：二甲基亚砜与胎牛血清1∶9混匀。

3)胰蛋白酶/EDTA消化液：称取0.25g胰蛋白酶和0.02gEDTA溶解于100ml的Hank′s液，于37oC水浴中置20分钟，待完全溶解后，以除菌滤器过滤，经无菌实验检查无菌生长后分装，置4℃冰箱保存。

1.5其他试剂均为进口或国产分析纯产品

2实验方法

2.1CNP基因的获得和扩增

2.1.1Norway大鼠肾脏组织总RNA的提取

将该步骤所使用的器材预先用0.1％的DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水处理，再按照Invitrogen公司

Reagent操作说明进行：

1)取新鲜正常Norway大鼠肾脏组织约100mg，剪碎后迅速加入液氮研磨；

2)加入1ml TRIZOL，继续研磨，直到组织完全破碎。

3)将上述组织的TRIZOL裂解液转入EP管中，在室温下放置5min；

4)在上述EP管中，加入0.2ml氯仿，盖上EP管盖子，用力震荡15sec，室温放置3min后，12,000g(4℃)离心15min；

5)取上层水相置于新EP管中，再加入0.5ml异丙醇，室温放置10min，12,000g(4℃)离心10min；

6)弃上清，加1ml 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7,500g(4℃)离心5min，弃上清；

7)让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

8)用100μl Rnase-free water溶解RNA沉淀，分装后置-80℃冰箱保存备用。

2.1.2扩增CNP基因

一、引物设计和合成

CNP序列(NM_053750)使用primer5.0软件设计引物，上游引物引入BamH I酶切位点，序列为：CNP F：5’-AGGATCCATCGG CACCATGCA-3’，下游引物引入EcoR I酶切位点序列为CNPR：5’-GGAATTCGCTGCACTAACATC-3’。送上海Invitrogen公司合成。

二、扩增CNP基因

按TaKaRa试剂盒One Step RNA PCR Kit(AMV)一步法RT-PCR操作说明进行(该步骤所使用的器材预先用0.1％的DEPC水处理)：

按下列组成在PCR反应管中配制反应液

按以下条件在PCR仪进行反应

取上述RT-PCR产物5μl，1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相保存。

三、鉴定扩增的CNP基因

根据CNP序列(Genbank NM_053750)使用primer5.0软件设计引物，扩增全长CNP基因，RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，结果显示清晰单一的410bp目的条带(图1)，与预期的扩增片段大小完全相符。

实施例2构建重组质粒

1pCDF1-MCS2-EF1-copGFP空载体和CNP基因PCR产物酶切回收

分别用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切pCDF1-MCS2-EF1-copGFP空载体和CNP基因PCR产物。双酶切反应体系如下，反应条件为37℃水浴4h。

质粒pCDF1-MCS2-EF1-copGFP双酶切后，0.7％琼脂糖凝胶电泳30min后，精确切割6749bp所在位置凝胶，然后胶回收。PCR产物双酶切后，1.5％琼脂糖凝胶电泳30min后，精确切割410bp所在位置凝胶，然后胶回收。

采用BioBasic公司的凝胶回收试剂盒回收酶切后的载体和PCR产物。

2构建pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-CNP质粒

2.1CNP基因与pCDF1-MCS2-EF1-copGFP Vector连接

胶回收后将CNP和pCDF1-MCS2-EF1-copGFP的回收产物使用promega公司T₄DNA连接酶做定向连接反应。

将连接产物及阳性对照质粒pUC19转化Tiagen公司的感受态细胞DH5α，过程如下：

1.取一支-80℃保存的100μl感受态细胞DH5α立即置于冰上解冻。

2.向感受态细胞中加入10μl的连接产物，轻柔吹打混匀后于冰上静置30分钟。

3.30分钟后将离心管于42℃水浴锅中热击90秒。

4.热击后立即将离心管置于冰上静置5分钟。

5.向离心管中加入900μl不含抗生素高压灭菌的LB培养基，混匀后于摇床中37℃，150rpm恢复培养2小时。

6.将高压灭菌后的固体培养基约100ml重新烧熔，待温度降至50℃左右时加入5μl的100mg/ml氨苄青霉素，混匀后倒四个平板。

7.将恢复培养的细菌液于4000rpm离心2分钟，弃上清，留约100μl，吹打混匀后涂在两个平板上。将pUC19涂一个平板做对照，将灭菌的LB培养基涂一个平板作为阴性对照。在室温静置20分钟，待菌液吸收后于37℃生化培养箱中过夜培养。

8、质粒提取

将过夜培养的平板取出挑克隆，将菌落置于已加入5μl浓度为100mg/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基中，在37℃，280rpm摇床中过夜培养。将菌液用碱裂解法提取质粒，试剂的配制及具体提取方法参考分子克隆手册。

2.3pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-CNP重组质粒的鉴定

1)酶切初步鉴定

按以下配制20μl酶切反应体系，置37℃，5h：

质粒双酶切后成为两个线性片段，分别为410bp和6749bp。取上述酶切产物5μl，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离得到预期的410bp的片段，证明连接产物酶切片段大小正确(图2)。

经北京三博远志公司3730测序仪测序验证，测序引物为5’-tcgtttagtgaaccgtcagat-3’。序列经Blast同源性分析，从第一个方框内的起始密码开始到第二个方框内的终止密码为止，克隆得到的序列与GenbankCNP基因(NM_053750)序列相比仅有一处多态性改变，即第310位上G--T，但不影响所编码的氨基酸(丙氨酸)，其他序列完全相同，证明CNP基因克隆成功(图3)。

实施例3慢病毒的包装

经脂质体Lipofectamine2000介导的pPACKF1^TM Packaging Plasmid Mix和表达质粒(空载体pCDF1-MCS2-EF1-copGFP或重组质粒pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-CNP)共同转染293FT细胞，包装病毒。病毒包装流程图(图4)。

病毒的收获、浓缩及滴度的检测

293FT细胞转染后48及72h，收获培养基上清。经离心过滤，去除细胞碎片。然后进行超速离心，将沉淀用PBS重悬，即收获了浓缩的含重组质粒的慢病毒(将连接上CNP基因的pCDF1-MCS2-EF1-copGFP Vector包装进病毒的蛋白质包壳)FIV-CNP和含空载体的慢病毒(将未连接CNP基因的pCDF1-MCS2-EF1-copGFP Vector包装进病毒蛋白质包壳)病毒储存液。

将FIV-CNP病毒液和FIV-GFP感染293细胞，病毒原液孔几乎所用细胞均表达GFP，在稀释至第6孔时绿色荧光细胞的数量(＜5个)，计算病毒滴度：10⁷Tu/ml。

实施例4重组CNP基因表达检测

一、CNP基因在mRNA水平表达的RT-PCR检测

转染后48h的293细胞收集，用Trizol处理后抽提总RNA，使用逆转录试剂盒做逆转录反应得到cDNA，再以cDNA为模板用RT-PCR方法检测CNP在mRNA水平上的表达，反应条件为：94℃2min；94℃10s，56.8℃30s，72℃1min(共35个循环)；72℃10min。反应完毕后，在1.5％琼脂糖凝胶电泳35min同时，用RT-PCR的方法做GAPDH在mRNA水平表达的检测。如图5。

“图中泳道依次为100bpMarker、质粒阳性对照、重组质粒转染DNAse处理组、重组质粒转染组、空载体转染组和阴性对照。”

二、检测CNP基因转染后cGMP的表达

A、体外表达：

将普通293细胞均匀种在24孔板上，待细胞贴壁且出现正常形态后分别做重组质粒和空载质粒的转染，24h后将转染后细胞的培养基移除，每孔加入200μl浓度为10^-3M的IBMX(将IBMX溶于DMEM中)，于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育40min，移除IBMX，每孔用200μl 8％次氯酸，于冰浴裂解细胞40min；每孔加入40μl 2mol/L的K₂CO₃，混合均匀，然后将细胞裂解物移入干净无菌的500μl离心管中，于3000g离心10分钟，将上清移入另一干净无菌的500μl离心管中，使用放射性免疫试剂盒检测含目的基因的质粒和空载体对cGMP表达的影响，见图6。(cGMP放射免疫试剂盒：购自上海中医药大学同位素室)

含CNP基因的重组质粒转染的细胞，其cGMP表达显著增高。

B、体内表达

放射免疫法检测大鼠睫状体cGMP水平

1、取材

于注射病毒后20天，断颈法处死大鼠(n＝6)，摘取眼球，浸入PBS液中。将眼球置于在显微镜下，从视神经做3条巩膜放射状切口，小心取出晶状体及附着其上睫状体，并小心剪除附着的视网膜组织，最后将睫状体剥离，立即放入液氮中保存备用^[5]。

2、放射免疫法检测

从液氮中取出睫状体，放入0.2ml预冷(4度)含1mmol/L的IBMX的50mmol/L醋酸缓冲液中。冰浴下用组织均浆器均浆，取均浆液，用0.2ml无水乙醇洗涤均浆器后，将洗涤液和均浆液混合，静置5分钟，3500转/min离心15分钟，收集上清夜。再用75％乙醇0.2ml清洗离心管内沉淀，混均，3500转/min离心15分钟，将上清夜与第一次收集的上清夜混合，60℃烘干，称量使治疗组和对照组等量。100μl醋酸缓冲液溶解烘干等量组织，按放射免疫试剂盒(上海中医药大学同位素室)操作说明检测。实验重复两次。

3、放射免疫法检测大鼠睫状体cGMP水平

结果显示：大鼠玻璃体腔注射病毒后4周，治疗组睫状体cGMP水平升高(1.33±0.29pmol/L)，高于对照组(0.76±0.15pmol/L)，差异有统计学意义(P＜0.05)(图7)(n＝6)。

实施例5重组CNP基因药物的制备

本发明药物的组成：

活性物质：包含pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-CNP基因的慢病毒

辅料：PBS溶液

制备成液体注射制剂，规格：10⁷Tu/ml，分别制备成10ml/支、20ml/支、50ml/支等合适的规格。

实施例6重组pCDF1-MCS2-EF1-copGFP/ratCNP降低小鼠眼压实验

1实验材料

1.1实验动物Wistar大鼠购于四川大学实验动物研究中心。

1.2主要试剂放射免疫试剂盒：购自上海中医药大学同位素室其他生化试剂均为进口或国产分析纯产品

1.3溶液配制

1.3.1中性福尔马林缓冲液：

将福尔马林稀释于PBS pH 7.2，终浓度为10％。

1.3.20.02M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2-7.6)

NaH₂PO₄·2H₂O 0.449g，Na₂HPO4·12H₂O，6.76g，NaCl 8.74g加ddH₂O定容至1L，高压灭菌。

1.3.3TBS：

Tris-HCl缓冲液(0.5M，pH7.6)100ml，NaCl 8.5g，定容至1000ml。

1.3.40.01M枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)

1)储存液：A液0.1M枸橼酸钠，29.41g枸橼酸钠溶于1L ddH₂O中；B液0.1M枸橼酸，20.01g枸橼酸溶于1L ddH₂O中。

2)工作液：取82ml A液和18ml B液，加900ml ddH₂O定容至1000ml，调整PH值为6.0。

1.3.5Mayer’s苏木精：

苏木精100mg，蒸馏水100ml，碘酸钠20mg，硫酸铝铵5g，柠檬酸100mg，水合氯醛5g，用蒸馏水溶解苏木精后，依次加入碘酸钠、硫酸铝铵、柠檬酸和水合氯醛，过滤后存于4℃冰箱备用。

1.3.6盐酸-乙醇分化液

浓盐酸1ml，75％乙醇99ml。

1.3.7DAB：

1)储备液(DAB 25mg/ml)：DAB 250mg+PBS 10ml，待完全溶解后分装成1ml，100μl，50μl，20μl等，-20℃，冻存；

2)工作液：DAB储备液20μl+PBS 1000μl+3％H₂O₂5μl。

1.4主要实验仪器与设备

1.4.1眼压计

1)Tonolab tonometer：购自美国Colonial Medical Supply，Franconia，NH

2)微管眼压测量系统：由四川大学物理研究所提供

1.4.2眼科手术显微镜

由六六视觉馈赠

2实验方法

按照IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)的操作饲养和处理实验动物。

2.1大鼠眼压测量评估

由于啮齿类动物体积小，精确地测量眼压非常困难；而大部分眼压计的设计是用于人或较大动物。因此，精确和方便地测量啮齿类动物眼压非常必要。最近，一种专门用于啮齿类动物的Tonolab眼压计问世。我们采用Tonolab眼压计测量Wistar大鼠眼压，实际眼压的测量采用微管导入前房的方法。所用的操作在上午10:00～11:00完成。

结果显示：大鼠眼压直线回归系数为0.99±0.04(n＝10)。Tonolab眼压计读数和真实眼压之间有很好的相关性，Tonolab眼压计可精确地，非侵袭性地检测大鼠眼压(图8)。

2.2大鼠基线眼压的测量

健康成年Wistar大鼠15只，雌雄不拘，体重150-200g。Tonolab眼压计分别于10:00～11:00、12:00～13:00、14:00～15:00、16:00～17:00、18:00～19:00、20:00～21:00六个时间段，测量大鼠基线眼压。

结果显示：在测量的6(1～6)个时段，大鼠眼压波动于12.67～14.20之间(表3.1)。各时间段双眼眼压比较，差异无统计学意义(P＝0.22～0.94)(表3.2，图9)。

表3.1大鼠右眼和左眼不同时段的眼压(单位mmHg)

表3.2双眼眼压在不同时间段的比较(单位mmHg)

2.3大鼠玻璃体腔病毒注射

上述测量基线眼压15只Wistar大鼠，麻醉散瞳后，分别用消毒后的10μl(33g)微量推进器吸取FIV-CNP、FIV-GFP各5μl(约5×10⁴个病毒)，选取右眼为治疗组，左眼为对照组，针尖斜面朝上，于大鼠眼球上方赤道部(距角巩膜缘后2mm)斜向后下方进针，从瞳孔直视下观察针尖避免损伤晶状体。治疗组玻璃体腔内注射FIV-CNP5μl，对照组玻璃体腔内注射FIV-GFP5μl。术后双眼涂红霉素眼膏。

2.4病毒注射后大鼠眼压的测定

于病毒注射后，每天观察大鼠角膜，前房及晶状体等。涂抗生素眼膏一周。一周后每天同一时间(10:00～11:00)采用Tonolab眼压计测量眼压，持续三周后处死大鼠。结果显示：1只大鼠发生严重眼内感染，另2只大鼠因注射损伤晶状体发生白内障，共12只大鼠纳入实验。纳入的12只大鼠未见明显的角膜、前房炎症反应及其它眼部异常。

病毒注射后眼压比较

治疗组和对照组的基线眼压(10:00～11:00)分别为12.83±0.42mmHg和12.67±0.26mmHg，差别无统计学意义(P＞0.05，n＝12)。病毒注射后第11天，治疗组眼压开始下降，与对照组相比，差别有统计学意义(P＜0.05)；第13天开始，治疗组眼压与基线眼压及对照组眼压相比，差别均有统计学意义(P＜0.05)；之后治疗组眼压持续下降，稳定在一个相对低水平，直至第28天处死。对照组眼压在病毒注射后第8天开始测量一直较基线眼压升高，差别有统计学意义(P＜0.05)，而在病毒注射后第25天开始，对照组眼压与基线眼压相比差别没有统计学意义(P＞0.05)，直至第28天处死(表3.3，图10)。

表3.3病毒注射后大鼠眼压的比较(单位mmHg)

0：基线眼压；^*P＜0.05：治疗组vs基线眼压；^Δ：P＜0.05：对照组vs基线眼压

综上，本发明的重组基因药物可通过在体内表达有活性的CNP，增加细胞cGMP的生成，可有效降低眼压，且不良反应少，为治疗青光眼提供了一种新的用药途径，疗效持续，病人依从度好，具有良好的制药应用前景。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学华西医院

<120>一种含利钠肽基因的药物及制备方法和应用

<130>CD520-08P105289

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1243

<212>DNA

<213>C型利钠肽

<400>1

cacgctgttt tgacctccat agaagattct agagcccggg cgcgccggat ccatcggcac 60

catgcacctc tcccagctga tcgcctgtgc cctgctgctc gcgctactct cactccggcc 120

ctccgaagcc aagcccggga caccaccgaa ggtcccgaga accccgccag gggaggagct 180

ggcagagccc caggcagctg gtggcaatca gaaaaagggt gacaagactc caggcggcgg 240

gggagccaat ctcaagggag accgatcgcg actgcttcgg gacctgcgtg tggacaccaa 300

gtcccgggct gcgtgggctc gccttctgca cgagcacccc aacgcgcgca aatacaaagg 360

cggcaacaag aagggcttgt ccaaaggctg ctttggcctc aagctggacc ggatcggctc 420

catgagcggt ctgggatgtt agtgcagcga attcgcggcc gcgaaggatc tgcgatcgct 480

ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 540

gggtcggcaa ttgaacgggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 600

tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 660

tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacagctg aagcttcgag 720

gggctcgcat ctctccttca cgcgcccgcc gccctacctg aggccgccat ccacgccggt 780

tgagtcgcgt tctgccgcct cccgcctgtg gtgcctcctg aactgcgtcc gccgtctagg 840

taagtttaaa gctcagtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag 900

actcagccgg ctctccacgc tttgctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg 960

tttctgtctg cgccgtacag atccaagctg tgacggcgct acgctagacg ccaccatgga 1020

gagcgacgag agcggctgcc gccatggaga tcgagtgccg catcaacggc acctgaacgg 1080

cgtggagttc cagctggtgg gcggcggaaa aggcaccccc ccagcagggc cgcctggacc 1140

cacaagattg agaaagctca gaggctggaa cgtcagccct acctggctgg gacacgtatg 1200

taacgttcta ccttcggagc gctcatctac acagcggtct gga 1243

Claims

1.一种重组质粒，其特征是：含有如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的质粒，其特征是：质粒载体为逆转录病毒或腺病毒。

3.根据权利要求2所述的质粒，其特征是：所述载体为逆转录病毒。

4.根据权利要求3所述的质粒，其特征是：所述载体为慢病毒。

5.根据权利要求4所述的质粒，其特征是：所述载体为pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-CNP慢病毒表达载体。

6.一种药物组合物，其特征是：含有权利要求1～5任一一项所述的重组质粒。

7.一种制备权利要求6所述药物组合物的方法，其特征是：克隆含有如SEQ ID NO.1的核苷酸序列，将其与表达载体链接，然后包装成病毒颗粒，再制备成药物制剂。

8.根据权利要求7所述的方法，所述表达载体为pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-CNP慢病毒表达载体。

9.权利要求6所述的组合物在制备治疗青光眼药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，所述药物为注射剂。