CN101723872B

CN101723872B - 一种对称的多胺与吡咯聚酰胺缀合物及其制备方法

Info

Publication number: CN101723872B
Application number: CN2009101941406A
Authority: CN
Inventors: 周春琼; 周中振
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2009-11-26
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2029-11-26
Also published as: CN101723872A

Abstract

本发明提供了一种对称的多胺与吡咯聚酰胺缀合物，缀合物的分子结构如式I所示。本发明所述的缀合物是先由1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸甲酯水解得到1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸，再通过N，N’-二环己基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑活化1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸中的羧基，加入三乙基四胺进行反应，洗脱分离得到。本发明所述的缀合物可与Co²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺等金属离子形成配合物，所制得的配合物可作为核酸切割试剂。

Description

一种对称的多胺与吡咯聚酰胺缀合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及含多个氮杂环的杂环化合物及其制备方法，尤其涉及多胺与吡咯聚酰胺缀合物及其制备方法。

背景技术

核酸断裂与基因重组技术是分子生物学和基因工程的核心技术，其中DNA和RNA的定位断裂又是该技术的关键。化学核酸酶因其制备简便、价格便宜、不受酶的天然专一性限制而被广泛应用于定向设计抗肿瘤、艾滋病等疾病的化学药物及其基因治疗中。化学核酸酶从结构上大致分DNA识别和切割两部分，其中，人工合成的含N-甲基吡咯(Py)和N-甲基咪唑(Im)的多聚酰胺多用于识别DNA序列，它能够在小沟中与DNA的特定序列进行识别，并具有穿透细胞膜、调控基因表达的功能，吡咯-咪唑多聚酰胺与DNA的碱基对的配对规则如下：Py/Py配对识别A·T或T·A碱基对，Py/Im和Im/Py配对分别识别C·G和G·C碱基对；而多胺类化合物则多用于定点切割DNA，它不仅能在体外与DNA特异性结合，还能穿透细胞膜、穿过核膜，进入细胞核内抑制基因表达。

公开号为CN1475483的专利申请中公开了一系列单咪唑-多胺酰胺类化合物及其制备方法，公开号为CN1560112、CN1560053和CN101353345专利申请中又分别公开了具非对称结构的大环多胺与吡咯类聚酰胺缀合物及其制备方法，上述专利申请中都指出该类化合物可用于化学核酸切割试剂中。然而，上述缀合物因其结构本身存在缺陷而造成其DNA的切割效果不理想。为解决这一问题，Cheng-Yong Zhou等人于2006年在“Synthesis，characterization andstudies on DNA-binding of a new Cu(II)complex with N¹，N⁸-bis(1-methyl-4-nitropyrrole-2-carbonyl)triethylenetetramine”一文中公开了如式a所示具有对称结构的直链多胺与酰胺缀合物，该化合物解决了单咪唑类和大环多胺类聚酰胺缀合物结构上的缺陷，增强了与DNA的结合能力，但式a化合物识别DNA的能力并没有增强，使其在抗肿瘤等医学领域中的应用受到阻碍。同年，周成勇等人在式a化合物的基础上合成了如式b所示的多胺与聚酰胺的缀合物，式b化合物的两端增加了吡咯环的个数，理论上增强了该化合物识别DNA的能力；尽管作者至今都没有公开用该化合物合成的核酸切割试剂与DNA的作用情况，但是，实验室结果表明用该化合物制备的核酸切割试剂的切割和识别DNA的效果并不理想。另一方面，该文献报道的式b化合物的合成方法的多个步骤需要对吡咯环上的氨基进行保护，该操作需在无水无氧的条件下进行，该制备方法操作难度大、成本高，在常规实验条件下难以实现。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提高多胺与吡咯聚酰胺缀合物切割和识别DNA的活性。

本发明所要解决的技术问题还在于提供所述的多胺与吡咯聚酰胺缀合物的制备方法。

本发明的技术方案是这样的：

一种对称的多胺与吡咯聚酰胺缀合物，其名称为N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰胺基]三乙基四胺，其结构如下式I所示：

本发明所述的缀合物常温下为橙黄色固体，分子式为C₃₀H₃₈N₁₂O₈，易溶于二甲亚砜和N，N-二甲基甲酰胺，微溶于氯仿、甲醇和乙醇，难溶于水，熔点为252～253℃，核磁共振氢谱为¹H NMR(DMSO-d₆，400MHZ)δ：2.02(s，2H)，2.83(m，4H)，3.81(q，6H)，3.94(m，6H)，4.01(d，4H)，6.91(s，2H)，7.21(s，2H)，7.58(s，2H)，7.68(t，1H)，7.71(t，1H)，8.17(s，2H)，10.27(s，2H)，质谱为FAB-MS：695.3(M+H)⁺。

如反应式II所示，本发明所述的对称的多胺与吡咯聚酰胺缀合物的制备方法由以下步骤组成：

先将1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中；接着，以溶解于N，N-二甲基甲酰胺中1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸的按摩尔数为基准，依次加入等摩尔数的N，N’-二环己基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑，室温下搅拌反应36小时后加入0.5～1摩尔倍的三乙基四胺，室温搅拌反应24小时，再加入相当于反应后溶液体积8倍的水，搅拌过滤，滤渣以V_CHCl3∶V_CH3OH＝8∶1的CHCl₃-CH₃OH溶液作为洗脱剂，用硅胶柱进行洗脱分离，收集并浓缩R_f为0.21的洗脱液，得化合物N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺；

所述的1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸由1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸甲酯水解得到。

本发明所述的缀合物的制备方法，其中所述的1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸可由1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸甲酯在酸性或碱性条件中水解得到，本发明人推荐的工艺方法如下所述：先按摩尔比取1份1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸甲酯溶于10L体积浓度为50％的甲醇水溶液中，再往溶液中加入10～20份氢氧化钠，50～70℃下搅拌反应2小时，过滤出未溶物，旋转蒸馏除去甲醇后往溶液中滴加1mol/L的盐酸至pH为3.0，得化合物1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸。

本发明所述的缀合物的制备方法，其中所述的1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸甲酯可参照肖军华等人发表的《DNA识别分子-寡聚酰胺的中间体合成研究》(化学通报，2000年第6期，35-37)一文中所记载的DCC/HOBT偶合法制备得到，也可按反应式III所示的方法制备。如反应式III所示的方法由以下步骤组成：

a、按摩尔比取1份三氯乙酸和1份二氯亚砜，80℃加热回流2小时，0.08Mpa下减压蒸馏，收集44～45℃下的馏分，得到化合物三氯乙酰氯；

b、按摩尔比取1份N-甲基吡咯和1～1.4份步骤a所得化合物，室温搅拌下酰化反应6小时，得化合物N-甲基-2-三氯乙酰基吡咯；

c、按摩尔比取1份步骤b所得化合物和1.5～2.0份HNO₃，-40℃下硝化反应4小时，得化合物4-硝基-2-三氯乙酰基-N-甲基吡咯；

d、按摩尔比取1份步骤c所得化合物并使其完全溶解于甲醇中，加入1.0～1.5份甲醇钠，室温下搅拌反应2小时，得到化合物4-硝基-N-甲基吡咯-2-甲酸甲酯；

e、按摩尔比取1份步骤d所得化合物，以每摩尔步骤d所得化合物5～10g的比例加入钯的质量百分数为10％的钯碳作为催化剂，通入H₂，室温反应19小时，得化合物4-胺基-N-甲基吡咯-2-甲酸甲酯；

f、按摩尔比取1份步骤c所得化合物和0.8～1.0份步骤e所得化合物，室温下搅拌反应24小时，得化合物1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸甲酯。

本发明所述缀合物的制备方法与现有方法相比，具有以下优点：

1、实验操作简单。现有的合成直链多胺与吡咯聚酰胺缀合物的方法需要对氨基进行保护，而氨基的保护大多通过无水无氧的反应环境来实现，一般的实验室无法满足这么苛刻的反应条件，不利于该类化合物的生产和研究；而本发明提供了一种全新的直链多胺与吡咯聚酰胺缀合物的合成方法，该方法的整个过程不需要额外的氨基保护，在常温常压下即可发生反应，不需要无水无氧操作，大大简化了实验操作的难度。

2、生产成本低。本发明方法所使用的合成原料价格低廉，同时由于不需要额外的氨基的保护，大大的降低了生产成本。

3、合成的产率高。使用本发明方法合成直链多胺与吡咯聚酰胺缀合物，其产率可高达85％。

本发明所述的对称的多胺与吡咯聚酰胺缀合物可用于制备核酸切割试剂，该试剂是所述缀合物与Co²⁺、Zn²⁺或Cu²⁺的配合物，其制备方法由以下步骤组成：

将N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中制得浓度为0.1mol/L的溶液A；再将钴、锌或铜的可溶性盐溶于N，N-二甲基甲酰胺中制得浓度为0.25mol/L的溶液B；然后按溶液A比溶液B等于5∶2～5∶4的体积比将溶液B滴加到溶液A中，室温搅拌24小时，减压蒸馏除去溶剂后用甲醇溶解，滤去不溶物，滤液低温冷却，待析出固体后过滤，滤渣用水洗涤后干燥，得到N1，N4-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺与Co²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺等金属离子的配合物。

本发明所述的缀合物与Co²⁺、Zn²⁺或Cu²⁺的配合物可作为核酸切割试剂，该试剂的使用方法为：先将所述的缀合物与Co²⁺、Zn²⁺或Cu²⁺的配合物加水溶解再与Tris-HCl缓冲溶液混合，然后往所制得的缓冲溶液中加入DNA混匀，37℃恒温水浴中进行反应，反应完成后加入EDTA和溴酚蓝终止反应即可。

用本发明所述的缀合物制备的核酸切割试剂具有核酸切割系统和识别系统，其中，切割系统由直链多胺构成，识别系统由直链多胺两端的双N-甲基吡咯环连接而成的聚酰胺组成。本发明所述的核酸切割试剂之所以具有特定的酶切位点和较好的DNA识别、切割活性，其一是由于本发明所述的缀合物中Py/Py个数的连续增加提高了核酸切割试剂对DNA序列中TA碱基对的识别能力，同时Py/Py个数不是太多，保证了配合物与DNA有较好的亲合力；其二是本发明所述的缀合物中的多胺结构能与金属离子形成更加稳定的配位结构，其特定的对称结构使得所形成的配合物能与DNA稳定结合并对DNA进行定点切割。实验证明，即使在浓度较低的情况下，也能高效地将DNA完全切割为缺刻DNA和线性DNA。本发明为合成具DNA定点识别和定位切割的化学核酸酶提供了有效的途径，并为进一步开发出通过与DNA结合来抑制肿瘤细胞增殖的新型抗癌药物奠定了基础，在医学领域中具有非常重要的意义。

附图说明

图1为本发明所述的对称的多胺与吡咯聚酰胺缀合物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明所述的对称的多胺与吡咯聚酰胺缀合物的另一个琼脂糖凝胶电泳图。

图3为式a所示已知化合物的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为式b所示已知化合物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1、合成1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸甲酯

(1)取1.8mol三氯乙酸(购自广东光华化学厂有限公司)，加入10mlN，N-二甲基甲酰胺(购自广东光华化学厂有限公司)和1.85mol二氯亚砜(购自广东光华化学厂有限公司)，混合均匀后于80℃加热回流2小时，再于0.08Mpa下减压蒸馏，收集44～45℃下的馏分液，得到无色透明液体三氯乙酰氯322g，产率96％；

(2)取0.18mol三氯乙酰氯加入到30ml乙醚(购自广东光华化学厂有限公司)中，得溶液A；另取0.135mol N-甲基吡咯(购自上海晶纯试剂有限公司)溶于30ml无水乙醚中，得溶液B，将溶液B缓慢滴加到溶液A中，室温搅拌反应3小时；往反应液的上部滴加质量浓度为2.6％的碳酸钾水溶液，静置萃取，保留油层，抽真空除去乙醚，得到黄色固体物质N-甲基-2-三氯乙酰基吡咯20.8g，产率为68％；

(3)取0.088molN-甲基-2-三氯乙酰基吡咯溶于100ml乙酸酐(购自广州化学试剂厂)中，冷却到-40℃，搅拌下于1小时内滴加0.17mol的发烟硝酸，搅拌使反应液降至室温后再搅拌4小时，冷却到-30℃，加入50ml异丙醇(购自广东光华化学厂有限公司)，升温至-20℃，搅拌0.5小时，析出白色沉淀，静置15分钟，过滤，得到白色化合物4-硝基-2-三氯乙酰基-N-甲基吡咯10.8g，产率45％；

(4)取0.029molN-甲基-4-硝基-2-三氯乙酰基吡咯溶于20ml甲醇(购自广东光华化学厂有限公司)中，加入5ml浓度为6.4mol/L的甲醇钠甲醇溶液，室温搅拌2小时，加入0.25ml浓硫酸淬灭反应，反应液被加热回流，自然冷却至室温后析出白色晶体，过滤，真空干燥，得到4-硝基-N-甲基吡咯-2-甲酸甲酯3.3g，产率58％；

(5)取0.01mol4-硝基-N-甲基吡咯-2-甲酸甲酯加入到30ml乙酸乙酯(购自天津市化学试剂一厂)中，加入0.1g的10％钯碳(购自上海晶纯试剂有限公司)，搅拌下通氢气19小时，过滤除去钯碳，浓缩滤液，得到化合物4-胺基-N-甲基吡咯-2-甲酸甲酯的浓缩液；

(6)取0.01molN-甲基-4-硝基-2-三氯乙酰基吡咯溶于30mlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，再将该溶液加入到步骤(5)所得的浓缩液中，室温搅拌24小时，加入10ml乙醇(购自天津市富宇精细化工有限公司)加热回流，冷却过滤，用乙醇洗涤，得到黄色固体1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸甲酯2.2g，产率72％。

2、合成N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺

(1)取1.70mmol1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸甲酯溶于100ml体积浓度为50％的甲醇水溶液中，向溶液中加入30.6mmol氢氧化钠(购自广东光华化学厂有限公司)，60℃下搅拌反应2小时，过滤除去固体物质，滤液旋转蒸馏除甲醇，向溶液中滴加1mol/L的盐酸溶液至pH为3.0，得到黄色固体化合物1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸0.47g，产率98％；

(2)取1.42mmol的1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸溶于10mlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入1.42mmol的N，N’-二环己基碳化二亚胺(购自上海润捷化学试剂有限公司)和1.42mmol的1-羟基苯并三唑(购自上海源聚生物科技有限公司)，室温搅拌反应36小时，过滤取滤液，向滤液中加入2ml浓度为0.57mol/L的三乙基四胺(购自广东光华化学厂有限公司)的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应24小时，向溶液中加入100ml水，过滤，滤渣以V_CHCl3∶V_CH3OH＝8∶1的CHCl₃-CH₃OH溶液作为洗脱剂用硅胶柱进行洗脱分离，收集并浓缩R_f为0.21的洗脱液，得到橙黄色固体化合物N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺0.42g，产率85％。

3、化合物的表征

(1)按常规方法对1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸进行了质谱、核磁共振氢谱和元素分析。结果如下：

质谱ESI-MS(m/z)：291.1(M-H)^-

核磁共振氢谱¹H NMR(DMSO-d₆，400MHZ)δ：3.81(s，3H)，3.93(s，3H)，6.85(s，1H)，7.41(s，1H)，7.61(s，1H)，8.15(s，1H)，10.35(s，1H)

元素分析(理论值)：C 49.20(49.31)，H 4.01(4.11)，N 19.05(19.18)。

(2)按常规方法对N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺进行了质谱、核磁共振氢谱和元素分析。结果如下：

质谱ESI-MS(m/z)：695.3(M+H)⁺

核磁共振氢谱[¹H NMR(DMSO-d₆，400MHZ)δ]：2.02(s，2H)，2.83(m，4H)，3.81(q，6H)，3.94(m，6H)，4.01(d，4H)，6.91(s，2H)，7.21(s，2H)，7.58(s，2H)，7.68(t，1H)，7.71(t，1H)，8.17(s，2H)，10.27(s，2H)

元素分析(理论值)：C 51.70(51.82)，H 5.34(5.47)，N 24.07(24.18)。

4、制备核酸切割试剂及其性能研究

(1)Co²⁺配合物的制备

将N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.1mol/L的溶液A，将氯化钴溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.25mol/L的溶液B，取5ml溶液A，缓慢滴加2ml溶液B，室温搅拌24小时，减压蒸馏除去溶剂后加入甲醇将其重新溶解，滤去不溶物，滤液置于冰箱中冷却至红褐色固体完全析出，过滤，滤渣水洗干燥，得到N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺与Co²⁺的配合物。

用同样的方法分别制备现有式a化合物(即背景技术中式a所示化合物)与Co²⁺的配合物和现有式b化合物(即背景技术中式b所示化合物)与Co²⁺的配合物。

(2)切割pBR322 DNA

将上述制备的切割试剂配制成1mmol/L的水溶液，再加入5mmol/L的Tris-HCl(pH 7.50，5mmol/L NaCl)缓冲溶液，分别配制成切割试剂浓度为50、100、150、180、200μM的缓冲溶液，然后取每一浓度的缓冲溶液19.5μL，分别加入0.5μL浓度为0.5μg/μL的pBR322 DNA，混匀后37℃恒温水浴反应2小时，反应完成后，通过加入EDTA和溴酚蓝终止反应。其琼脂糖凝胶电泳结果如图1和图2所示。图1中，泳道1为不含切割试剂的空白对照，泳道2～5分别表示切割试剂浓度为50，100，150，200μM的缓冲液的切割效果；图2中，泳道1为不含切割试剂的空白对照，泳道2～5分别表示切割试剂浓度为50，100，150，180μM的Tris-HCl缓冲液的切割效果。从图1和图2可以观察到随着配合物浓度的逐渐增大，超螺旋DNA(ccc带)逐渐向缺刻型DNA(oc带)转变，同时出现线性DNA(linear带)；图1中还能看到，超螺旋DNA在配合物浓度高至200μM时被完全切散；实验表明N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺与Co²⁺配合物对质粒pBR322 DNA不仅具优越的切割效果，而且具有独特的酶切位点。

按上述方法同样制备出含现有式a化合物与Co²⁺的配合物并进行切割pBR322 DNA的实验，其琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。其中，泳道1为不含切割试剂的空白对照，泳道2～5分别表示切割试剂浓度为50，100，150，180μM的Tris-HCl缓冲液的切割效果。从图3可以观察到随着配合物浓度的增大，只有少量的超螺旋DNA(ccc带)转化为缺刻型DNA(oc带)，并无线性产物出现，实验表明式a化合物与Co²⁺的配合物在该浓度范围内DNA切割和识别效果均不佳。

再按上述方法同样制备出含现有式b化合物与Co²⁺的配合物并进行切割pBR322 DNA的实验，其琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示。其中，泳道1为不含切割试剂的空白对照，泳道2～5分别表示切割试剂浓度为50，100，150，200μM的Tris-HCl缓冲液的切割效果。从图4可以观察到随着配合物浓度的增大，超螺旋DNA(ccc带)逐渐向缺刻型DNA(oc带)转变，直至超螺旋DNA被完全切散也没有出现线性产物，实验表明式b化合物与Co²⁺的配合物具较好的DNA切割效果，但其识别效果不佳。

综合图1、图2、图3和图4的实验结果可以看出：1、在同等的实验条件下，本发明所述缀合物的Co²⁺配合物对DNA的识别和切割效果都优于式a和式b化合物；2、式a和式b化合物的Co²⁺配合物只能将超螺旋DNA切割成缺刻型DNA，而本发明所述缀合物的Co²⁺配合物能将超螺旋DNA切割成缺刻型DNA和线性DNA，具有更佳的切割效果。

实施例2

根据实施例1的方法合成1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸甲酯，并水解得到1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸。

取2mmol的1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸溶于10mlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入2mmol的N，N’-二环己基碳化二亚胺和2mmol的1-羟基苯并三唑，室温搅拌反应36小时，过滤取滤液，向滤液中加入2ml浓度为0.5mol/L的三乙基四胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应24小时，向溶液中加入120ml水，过滤，滤渣以V_CHCl3∶V_CH3OH＝8∶1的CHCl₃-CH₃OH溶液作为洗脱剂用硅胶柱进行洗脱分离，收集并浓缩R_f为0.21的洗脱液，得到橙黄色固体化合物N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺0.56g，纯度为99％，产率为80.7％。

将N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.1mol/L的溶液A，将氯化铜溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.25mol/L的溶液B，取10ml溶液A，滴加4ml溶液B，室温搅拌24小时，减压蒸馏除去溶剂后加入甲醇将其重新溶解，滤去不溶物，滤液置于冰箱中冷却至蓝色固体完全析出，过滤，滤渣水洗干燥，得到N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺与Cu²⁺的配合物。

实施例3

取2.5mmol的1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸溶于10mlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入2.5mmol的N，N’-二环己基碳化二亚胺和2.5mmol的1-羟基苯并三唑，室温搅拌反应36小时，过滤取滤液，向滤液中加入5ml浓度为0.5mol/L的三乙基四胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应24小时，向溶液中加入200ml水，过滤，取沉淀物，以V_CHCl3∶V_CH3OH＝8∶1的CHCl₃-CH₃OH溶液作为洗脱剂用硅胶柱进行洗脱分离，收集并浓缩R_f为0.21的洗脱液，得到橙黄色固体化合物N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺0.67g，纯度为98.5％，产率为77％。

将N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.1mol/L的溶液A，将氯化锌溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.25mol/L的溶液B，取5ml溶液A，滴加3ml溶液B，室温搅拌24小时，减压蒸馏除去溶剂后加入甲醇将其重新溶解，滤去不溶物，滤液置于冰箱中冷却至白色固体完全析出，过滤，滤渣水洗干燥，得到N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺与Zn²⁺的配合物。

实施例4

取2mmol的1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸溶于10mlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入2mmol的N，N’-二环己基碳化二亚胺和2mmol的1-羟基苯并三唑，室温搅拌反应36小时，过滤取滤液，向滤液中加入2ml浓度为0.8mol/L的三乙基四胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应24小时，向溶液中加入150ml水，过滤，取沉淀物，以V_CHCl3∶V_CH3OH＝8∶1的CHCl₃-CH₃OH溶液作为洗脱剂用硅胶柱进行洗脱分离，收集并浓缩R_f为0.21的洗脱液，得到橙黄色固体化合物N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺0.56g，纯度为98.8％，产率为81％。

将N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.1mol/L的溶液A，将氯化钴溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.25mol/L的溶液B，取5ml溶液A，滴加4ml溶液B，室温搅拌24小时，减压蒸馏除去溶剂后加入甲醇将其重新溶解，滤去不溶物，滤液置于冰箱中冷却至红褐色固体完全析出，过滤，滤渣水洗干燥，得到N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺与Co²⁺的配合物。

实施例5

取1.5mmol的1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸溶于10mlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入1.5mmol的N，N’-二环己基碳化二亚胺和1.5mmol的1-羟基苯并三唑，室温搅拌反应36小时，过滤取滤液，向滤液中加入3ml浓度为0.4mol/L的三乙基四胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应24小时，向溶液中加130ml水，过滤，取沉淀物，以V_CHCl3∶V_CH3OH＝8∶1的CHCl₃-CH₃OH溶液作为洗脱剂用硅胶柱进行洗脱分离，收集并浓缩R_f为0.21的洗脱液，得到橙黄色固体化合物N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺0.39g，纯度为99.2％，产率为75％。

将N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.1mol/L的溶液A，将氯化钴溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.25mol/L的溶液B，取10ml溶液A，滴加5ml溶液B，室温搅拌24小时，减压蒸馏除去溶剂后加入甲醇将其重新溶解，滤去不溶物，滤液置于冰箱中冷却至红褐色固体完全析出，过滤，滤渣水洗干燥，得到N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺与Co²⁺的配合物。

实施例6

取2mmol的1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸溶于10mlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入2mmol的N，N’-二环己基碳化二亚胺和2mmol的1-羟基苯并三唑，室温搅拌反应36小时，过滤取滤液，向滤液中加入2ml浓度为0.6mol/L的三乙基四胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应24小时，向溶液中加入160ml水，过滤，取沉淀物，以V_CHCl3∶V_CH3OH＝8∶1的CHCl₃-CH₃OH溶液作为洗脱剂用硅胶柱进行洗脱分离，收集并浓缩R_f为0.21的洗脱液，得到橙黄色固体化合物N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺0.57g，纯度为97.4％，产率为82％。

将N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.1mol/L的溶液A，将氯化钴溶于N，N-二甲基甲酰胺中得浓度为0.25mol/L的溶液B，取10ml溶液A，滴加7ml溶液B，室温搅拌24小时，减压蒸馏除去溶剂后加入甲醇将其重新溶解，滤去不溶物，滤液置于冰箱中冷却至红褐色固体完全析出，过滤，滤渣水洗干燥，得到N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺与Co²⁺的配合物。

Claims

1.一种对称的多胺与吡咯聚酰胺缀合物，其分子结构如式I所示：

2.权利要求1所述的一种对称的多胺与吡咯聚酰胺缀合物的制备方法，该方法由以下步骤组成：

先将1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中；接着，以溶解于N，N-二甲基甲酰胺中1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-甲酸的摩尔数为基准，依次加入等摩尔数的N，N’-二环己基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑，室温下搅拌反应36小时后加入0.5～1摩尔倍的三乙基四胺，室温搅拌反应24小时，再加入相当于反应后溶液体积8倍的水，搅拌过滤，滤渣以V_CHCl3：V_CH3OH＝8∶1的CHCl₃-CH₃OH溶液作为洗脱剂，用硅胶柱进行洗脱分离，收集并浓缩R_f为0.21的洗脱液，得化合物N¹，N⁴-二[1-甲基-4-(1-甲基-4-硝基吡咯-2-酰胺基)吡咯-2-酰基]三乙基四胺；

3.权利要求1所述的一种对称的多胺与吡咯聚酰胺缀合物在制备核酸切割试剂中的应用。