CN101717764B - 一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶(13-HPL)的制备方法，属于利用盐析、色谱分离技术和膜分离技术纯化膜蛋白技术领域。本发明包括苋菜13-HPL冻干微粒体酶的制备、初步纯化、电泳纯纯化；制备苋菜13-HPL冻干微粒体采用新鲜苋菜为原料，经均浆、离心后取沉淀和保护剂蔗糖(1-30％)溶液共同冷冻干燥可得冻干微粒体酶。此冻干粉体积小、可在-20℃下长期保存；酶回收率、活力高，解决了原料季节性依赖。纯化工艺步骤主要包括微粒体酶的洗涤，溶解，硫酸铵沉淀，透析，微滤，羟基磷灰石柱层析，阴离子交换柱层析和超滤得到电泳纯氢过氧化物裂解酶。苋菜13-HPL在高附加值食品、日化用品生产方面越来越引起重视，这是首次从中国种植苋菜中分离纯化得到氢过氧化物裂解酶。
Description
技术领域
一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶的制备方法，具体以苋菜(Amaranthus mangostanus L.)为原料，通过该方法得到电泳纯的苋菜13-氢过氧化裂解酶。属于利用盐析、色谱分离技术和膜分离技术纯化膜蛋白技术领域。
背景技术
氢过氧化物裂解酶(HPL)是植物脂氧化途径中脂肪氧合酶(LOX)下游的酶，可将LOX作用下多不饱和脂肪酸形成的氢过氧化脂肪酸裂解形成含氧酸和挥发性醛类。根据底物过氧基位置的差异，HPL可分为两类：第一类可裂解13位氢过氧化物生成6C醛类和12C含氧酸，称为13-HPL；第二类可裂解9位氢过氧化物生成9C醛类和9C含氧酸，称为9-HPL。由13-LOX和13-HPL共同催化得到的6C醛类(包括己醛，己烯醛)具有清新芳香风味，在国外被称作“GreenNotes”。这些挥发性醛类被广泛应用于香精、香水制造业和食品工业，例如用于长期存储或杀菌后果蔬新鲜气味的重塑。
HPL广泛存在于绿色高等植物中，Tressl和Drawert首先于1973年报道了香蕉中HPL的存在，随后研究者们相继在西瓜秧苗、黄瓜秧苗、番茄和茶叶中发现HPL并进行了性质研究。最近据报道，已从青椒果实、番茄叶、紫花苜蓿、番石榴和向日葵中得到基本纯的HPL。而国内尚无有关此酶的报道。
HPL是一种膜蛋白，色谱行为差，且在植物组织中含量较低易受季节影响。此外，酶活性中心部位含有巯基，不稳定，易受外界条件影响氧化聚集失活。这都是HPL研究较少、进展缓慢的主要原因。建立一种克服季节影响，有效的氢过氧化物裂解酶分离纯化方法，是开发利用该酶的关键步骤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冻干苋菜13位氢过氧化物裂解微粒体酶和其纯化工艺。
本发明的技术方案：一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶，简称电泳纯苋菜13-HPL，的制备方法，步骤为：苋菜13-HPL冻干微粒体酶的制备、初步纯化、电泳纯纯化；
(1)制备苋菜13-HPL冻干微粒体酶：以苋菜为原料，清洗并除去其中的泥沙及其它杂物，摘除根部和茎，沥干水分，将苋菜叶切成小片，苋菜叶与在0～10℃预冷的0.5～5倍体积/苋菜叶重量(v/w)的缓冲液A混合、且在组织捣碎机中均浆10s-300s，经四层纱布过滤；
将纱布过滤液在0～4℃、5000～50000g离心10～60min，取沉淀溶于10～50倍体积/沉淀重量(v/w)的缓冲液B，分装，冷冻干燥36～108h得冻干苋菜13-HPL微粒体酶；
(2)初步纯化：冻干苋菜13-HPL微粒体酶经洗涤，溶解，硫酸铵沉淀，透析，微滤获得初步纯化苋菜13-HPL；步骤为：
取冻干苋菜13-HPL微粒体酶粉加入8-12倍酶粉量(v/w)的缓冲液C，洗涤去除酶粉中所含蔗糖和色素，于0～4℃、5000～50000g离心10～60min，取沉淀；沉淀溶于磷酸钠缓冲液D，于0～4℃，5000～50000g离心10～60min，取上清；
上清液加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度达10％～50％，于0～4℃，5000～50000g离心10～60min，取沉淀；
沉淀用缓冲液D于0～4℃透析过夜，并在5000～50000g离心10～60min，取上清；上清液过0.22μm微孔滤膜，透过液即为初步纯化苋菜13-HPL；
(3)电泳纯纯化：将初步纯化13-HPL经羟基磷灰石柱，阴离子交换柱，超滤浓缩，得分子量约为55KD电泳纯的苋菜13-HPL；步骤为：
取初步纯化苋菜13-HPL上羟基磷灰石柱，用含0.01～0.4mol/L磷酸根的缓冲液D阶段洗脱收集活性组分；经超滤管浓缩脱盐后上DEAE-Toyopearl离子交换柱，后用含0～0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液E阶段洗脱，收集活性组分，经超滤管浓缩，得电泳纯苋菜13-HPL；
缓冲液A：含0.5％聚乙烯吡咯烷酮的0.1mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液。
缓冲液B：含10mmol/L DTT和10％蔗糖的0.02mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液。
缓冲液C：0.02mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液。
缓冲液D：含10mmol/L DTT和0.5％Tritron X-100的pH 6.8磷酸钠缓冲液。
缓冲液E：含10mmol/L DTT和0.5％Tritron X-100的0.02mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液。
所述电泳纯苋菜13-HPL的制备方法，所述超滤管为Millipore出产的15mL超滤管，截留分子量为100KD；所述羟基磷灰石柱为40μm I型羟基磷灰石柱，事先用缓冲液D平衡过夜；所述阴离子交换柱为DEAE-Toyopearl柱，事先用缓冲液E平衡过夜。
以苋菜为原料，分离纯化得到电泳纯的13-氢过氧化物裂解酶；该酶的最适pH为6.0，等电点为5.94±0.22，其SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)显示为一条分子量约为55KD的带。
采用两种方法对13-HPL的活力进行测定
1.分光光度法
xμL酶液(15-40μL)、15μL 10mM底物(13-亚油酸氢过氧化物或13-亚麻酸氢过氧化物)和pH 6.0的(2985-x)μL磷酸钠缓冲液混合，在25℃，以OD234nm下降速率计算酶活。空白由不含底物的上述溶液组成。1U酶活定义为每分钟每裂解1μmoL底物所需的酶量(ε＝25000M-1cm-1)。
2.气相色谱法
将xμL酶液(15-40μL)、30μL 10mM底物和pH 6.0的(2970-x)μL磷酸钠缓冲液混合在11mL顶空瓶中反应，在25℃下保温5分钟，加入6mol/L的HCl终止反应并加入KCl至饱和后做顶空气相色谱分析。顶空瓶在顶空进样仪70℃下加热30min后用气相色谱仪进行检测，工作参数如下：30.0m×0.32mm×0.50μm CP-WAX 52CB色谱柱。起始温度40℃，保温5min后以10℃/min升至180℃，以N2为载气，载气流量为30mL/min，分流比为1∶1。以Sigma公司购买的己醛和2-反式己烯醛为标样。空白为只有酶液而无底物的上述溶液。根据得到的峰面积，可计算其酶活。1U酶活定义为每分钟催化生成1μmol 6C醛类所需的酶量。
蛋白质含量测定采用BCA法，以牛血清白蛋白为标准。
依照Laemmli的方法进行各个纯化阶段样品的十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDSPAGE)。分离胶和浓缩胶的聚丙烯酰胺终浓度分别为12％(w/v)和4％(w/v)。用考马斯亮蓝染色。标准分子量蛋白为：兔磷酸化酶b(97400Da)，牛血清白蛋白(66200Da)，兔肌动蛋白(43000Da)，牛碳酸酐(31000Da)，胰蛋白酶抑制剂(20100Da)和鸡蛋清溶菌(14400Da)。
本发明的有益效果：
1.缓解原料供应压力。要将13-HPL分离纯化工业化必然需要大量的新鲜果蔬原料，而大部分13-HPL的提取原料都有季节性。例如高质量的新鲜苋菜在中国一年只有八个月可获得。而按本发明制备的冻干苋菜13-HPL微粒体酶粉在-20℃下保存可保持全部酶活数月之久，一定程度上缓解了原料供应的压力。
2.步骤相对简单。在纯化过程中，经过硫酸铵沉淀(盐析)、羟基磷灰石柱层析和阴离子交换柱层析步骤，得到电泳纯的13-HPL。只需两次柱层析，比一些已报道的氢过氧化物裂解酶的纯化工艺简单。这主要因为羟基磷灰石柱层析和阴离子柱层析时收集的酶活性峰酶活高而蛋白含量(OD220nm)低，除去了大量杂蛋白，有很好的分离纯化效果。
3.成本低。使用少量化学试剂，纯化使用的柱填料可再生重复使用。
4.环境友好。对环境无污染，是一种绿色提取工艺。
5.有良好的应用前景。C6醛类清香型风味成分有着广阔的产品市场，国外估计蔬菜、水果、香水及日用高端化工产品对C6醛类清香型风味成分的需求量大约为每年10-30吨，价格约3000美元/千克。目前主要通过化学合成取得，但随着人们对绿色健康的要求，天然香料越来越受到人们的青睐。而事实上，在天然植物中己醛、己烯醛等化合物的含量极低，获取这些成分的成本很高。而模拟植物体内的代谢途径，采用LOX/HPL酶法催化不饱和脂肪酸氧化降解制备己醛、己烯醛等C6醛类就有很强的吸引力。其绿色健康、附加值高，工艺路线无三废、经济可行。所以此项发明具有良好的推广前景。
附图说明
图1羟基磷灰石层析谱图。
图2阴离子交换柱层析谱图。
图3氢过氧化物裂解酶SDSPAGE电泳图。泳道1为标准分子量蛋白，泳道2为微粒体酶(32μg)，泳道3为粗酶液(33μg)，泳道4为硫酸铵沉淀组分(10μg)，泳道5为羟基磷灰石组分(7μg)，泳道6为DEAE柱组分(6μg)。
具体实施方式
缓冲液A：含0.5％聚乙烯吡咯烷酮的0.1mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液。
缓冲液B：含10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)和10％蔗糖的0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液。
缓冲液C：0.02mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液。
缓冲液D：含10mmol/L DTT和0.5％Tritron X-100的pH 6.8磷酸钠缓冲液。
缓冲液E：含10mmol/L DTT和0.5％Tritron X-100的0.02mol/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液。
实施例1
取湿重100克苋菜叶，切成小块，加入300mL缓冲液A均浆6次，每次10s，间隔30s。均浆液纱布过滤，滤液于4℃，18000g离心30min，取沉淀溶于50mL缓冲液B，分装，冷冻干燥80h，即得冻干苋菜13-HPL微粒体酶。冻干苋菜13-HPL微粒体酶复溶性好，酶活基本可完全回收。在-20℃保存50天后复测酶活基本无变化，可为分离纯化和工业生产C6醛提供稳定的酶源。
取10g冻干苋菜13-HPL微粒体酶粉溶于100mL缓冲液C。悬浊液于4℃，30000g离心30min，取沉淀溶于缓冲液D。将溶液在相同条件下再离心30min，上清液即为粗酶液。粗酶液加固体硫酸铵至饱和度35％，相同条件下离心30min。收集沉淀用0.01M磷酸钠缓冲液D透析过夜。透析液于4℃，30000g离心30min，取上清过0.22μm微孔滤膜。透过液即为初步纯化苋菜13-HPL。取透过液上羟基磷灰石柱分离，4℃下用含磷酸根浓度分别为0.01M，0.25M和0.4M的缓冲液D阶段洗脱，收集活性组分。超滤管浓缩后上DEAE-Toyopearl柱，4℃下用含0，0.15M，0.25M和1M NaCl的缓冲液E阶段洗脱。收集活性组分，超滤管浓缩，得到的产物经检测为电泳纯氢过氧化物裂解酶。纯化过程数据见表1，电泳结果见图3。
表1苋菜氢过氧化物裂解酶的分离纯化
| 步骤 | 总活力(U) | 总蛋白(mg) | 比活力(U/mg) |
| 13-HPL微粒体酶 | 319.1 | 911.75 | 0.35 |
| 粗酶液 | 344.7 | 272.75 | 1.26 |
| (NH4)2SO4沉淀后 | 264.0 | 54.03 | 4.89 |
| 羟基磷灰石柱层析后 | 140.1 | 13.12 | 10.67 |
| DEAE-Toyopearl层析后 | 74.0 | 2.67 | 27.71 |
Claims (2)
1.一种电泳纯苋菜13位氢过氧化物裂解酶，简称电泳纯苋菜13-HPL，的制备方法，其特征在于步骤为：苋菜13-HPL冻干微粒体酶的制备、初步纯化、电泳纯纯化；
(1)制备苋菜13-HPL冻干微粒体酶：以苋菜为原料，清洗并除去其中的泥沙及其它杂物，摘除根部和茎，沥干水分，将苋菜叶切成小片，苋菜叶与在0～10℃预冷的0.5～5倍体积/苋菜叶重量(v/w)的缓冲液A混合、且在组织捣碎机中均浆10s-300s，经四层纱布过滤；
将纱布过滤液在0～4℃、5000～50000g离心10～60min，取沉淀溶于10～50倍体积/沉淀重量(v/w)的缓冲液B，分装，冷冻干燥36～108h得冻干苋菜13-HPL微粒体酶；
(2)初步纯化：冻干苋菜13-HPL微粒体酶经洗涤，溶解，硫酸铵沉淀，透析，微滤获得初步纯化苋菜13-HPL；步骤为：
取冻干苋菜13-HPL微粒体酶粉加入8-12倍酶粉量(v/w)的缓冲液C，洗涤去除酶粉中所含蔗糖和色素，于0～4℃、5000～50000g离心10～60min，取沉淀；沉淀溶于磷酸钠缓冲液D，于0～4℃，5000～50000g离心10～60min，取上清；
上清液加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度达10％～50％，于0～4℃，5000～50000g离心10～60min，取沉淀；
沉淀用缓冲液D于0～4℃透析过夜，并在5000～50000g离心10～60min，取上清；上清液过0.22μm微孔滤膜，透过液即为初步纯化苋菜13-HPL；
(3)电泳纯纯化：将初步纯化13-HPL经羟基磷灰石柱，阴离子交换柱，超滤浓缩，得分子量为55KD电泳纯的苋菜13-HPL；步骤为：
取初步纯化苋菜13-HPL上羟基磷灰石柱，用含0.01～0.4mol/L磷酸根的缓冲液D阶段洗脱收集活性组分；经超滤管浓缩脱盐后上DEAE-Toyopearl离子交换柱，后用含0～0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液E阶段洗脱，收集活性组分，经超滤管浓缩，得电泳纯苋菜13-HPL；
缓冲液A：含0.5％聚乙烯吡咯烷酮的0.1mol/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液；
缓冲液B：含10mmol/L DTT和10％蔗糖的0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液；
缓冲液C：0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液；
缓冲液D：含10mmol/L DTT和0.5％Tritron X-100的pH6.8磷酸钠缓冲液；
缓冲液E：含10mmol/L DTT和0.5％Tritron X-100的0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液。
2.根据权利要求1所述电泳纯苋菜13-HPL的制备方法，其特征在于所述超滤管为Millipore出产的15mL超滤管，截留分子量为100KD；所述羟基磷灰石柱为40μm I型羟基磷灰石柱，事先用缓冲液D平衡过夜；所述阴离子交换柱为DEAE-Toyopearl柱，事先用缓冲液E平衡过夜。
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