CN101711285A - 用于预测结肠直肠腺癌细胞的存在的方法和工具 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于在基因水平上可靠检测患者中的腺癌细胞的存在的方法和工具。本发明对与腺瘤进展至腺癌细胞相关的染色体异常区域精细作图，并且提供基于其的检测方法和工具。

Description

用于预测结肠直肠腺癌细胞的存在的方法和工具

发明领域

本发明涉及用于肿瘤诊断，更具体而言用于检测结肠直肠腺癌的存在的方法。本发明进一步提供了用于执行这些方法的引物和探针。

发明背景

胃肠道的结肠直肠部分的癌症是频繁发生的病症。在第一个阶段，良性肿瘤(腺瘤)发生，这可以变成恶性癌症(腺癌)。并非所有腺瘤都进展至癌。事实上这种进展至癌仅在小部分肿瘤中发生。基因组不稳定性的起始是关键步骤，并且在结肠直肠癌中以两种方式发生(Lengauer等人(1998)Nature，396，643-649)。导致微卫星不稳定性(缩写为MSI或MIN)的DNA错配修复缺陷已得到最广泛的研究(diPietro等人(2005)Gastroenterology，129，1047-1059)，但仅解释了约15％的腺瘤进展至癌。在结肠直肠腺瘤进展至癌的其他85％的病例中，基因组不稳定性在染色体水平(CIN)上发生，产生非整倍性。尽管长期以来这些染色体异常已视为继发于癌症发展的随机噪声，但目前已充分确定这些DNA拷贝数变化以特定模式发生，并且与不同临床行为相关(Hermsen等人(2002).Gastroenterology 123，1109-1119)。在结肠直肠癌中经常报告的染色体异常是7pq、8q、13q、20q获得和4pq、5q、8p、15q、17p、18q缺失。显示8q、13q和20q获得以及8p、15q、17p和18q缺失与结肠直肠腺瘤进展至癌相关(上文引用的Hermsen等人(2002)。染色体臂20q的获得是在结肠直肠癌中观察到的最常见的获得，在超过65％的病例中改变(Meijer等人(1998)J.Clin.Pathol.51，901-909)。在20q特别是区域20q12-q13上的获得在其他类型的实体肿瘤中也常常得到描述，并且已与胃和结肠直肠癌的不良结局相关。检测这些染色体异常的方法一般基于比较基因组杂交(CGH)。Rooney等人(2004 J.Pathol.204，282-288)描述了定性PCR的使用，以检测结肠癌中的基因ZNF217的基因复制。

在尽可能早的阶段中鉴定上述腺瘤至腺癌的进展具有最大限度的临床重要性，以允许癌的早期治疗，同时避免不需要的手术干预。理想地，可以在恶性细胞的存在通过活组织检查物或切除材料的原位光学分析或显微镜分析无法检测的阶段时鉴定腺癌。

发明概述

本发明涉及用于癌症诊断，更具体而言用于鉴定结肠和/或直肠中的腺癌的存在的方法和工具。更具体而言，本发明提供了具有增加的灵敏度和可靠性、允许差异检测癌的方法和工具。

腺瘤可能发展或不发展成腺癌。然而，本发明的优点是基于这些细胞的差异遗传构成，在非常早的阶段时检测例如腺瘤内的恶性结肠直肠腺癌细胞。这种筛选可以使用非常灵敏的技术来进行，从而使得可以检测仅少量癌细胞的存在。这允许在癌细胞可以通过回波描记术、射线照相术或MRI(磁共振成像)检测的阶段前鉴定癌细胞的存在，并且允许检测无需活组织检查或切除术就可以获自结肠的材料(例如粪便)中的腺癌细胞。

本发明基于结肠直肠腺瘤至腺癌的进展与腺瘤细胞染色体内至少一个染色体获得或缺失区域的出现相关的发现。因此，本发明的目的在于通过直接或间接分析方法通过检测这些获得或缺失而精确地检测癌细胞的存在。

在本发明的一个方面，提供了基于检测包含与从结肠直肠腺瘤进展到腺癌相关的染色体获得或缺失的遗传物质的存在，检测患者中的结肠直肠腺癌细胞的存在的方法。

更具体而言，提供了用于检测患者中的结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法，所述方法包括检测患者的测试样品的基因组DNA中一个或多个最小重叠区域(SRO)的获得或缺失的存在的步骤，其中包含一个或多个SRO的获得或缺失的遗传物质的存在指示患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。更具体而言，在本发明的方法中，一个或多个SRO选自：

-染色体8上的SRO_8p_1、SRO_8p_2、SRO_8p_3和SRO_8p_4，和/或

-染色体8上的SRO_8q_1、SRO_8q_2、SRO_8q_3、SRO_8q_4、SRO_8q_5和SRO_8q_6，和/或

-染色体13q上的SRO_13q_1、SRO_13q_2、SRO_13q_3、SRO_13q_4、SRO_13q_5和SRO_13q_6，和/或

-染色体15上的SRO_15q_1、SRO_15q_2和SRO_15q_3，和/或

-染色体17上的SRO_17p_1和SRO_17p_2，和/或

-染色体18上的SRO_18q_1和SRO_18q_2，和/或

-染色体20上的SRO_20q_1、SRO_20q_2和SRO_20q_3。

在具体实施方案中，本发明的方法包括与结肠直肠腺癌相关的每个染色体获得或缺失区域的至少一个SRO的获得或缺失的检测，更具体而言在8q、13q和20q处的染色体获得，以及在8p、15q、17p和18q处的染色体缺失。在进一步的实施方案中，本发明的方法包括至少一个染色体区域的所有所述SROs的获得或缺失的检测。在进一步的实施方案中，本发明的方法包括每个列出的染色体区域的所有所述SROs的获得或缺失的检测。

在具体实施方案中，本发明的方法包括使用比较基因组杂交(CGH)，特别是阵列CGH检测染色体获得或缺失。

在进一步的具体实施方案中，本发明的方法包括使用诸如荧光原位杂交、DNA印迹或杂合性缺失分析的技术检测染色体获得或缺失。

在进一步的具体实施方案中，本发明的方法包括通过采用SRO特异性引物对的PCR反应检测染色体获得或缺失。在具体实施方案中，所使用的SRO特异性引物对定位接近于SRO的边界，并且允许如本发明所公开的检测SRO的缺失或获得。考虑了定量和定性PCR方法。更具体而言，用于检测染色体缺失区域的SRO的SRO特异性引物对包含位于所述SRO 5′的正向引物和位于所述SRO 3′的反向引物。在具体实施方案中，用于检测染色体获得区域内的SRO的SRO特异性引物对包含所述SRO的3′区域内的正向引物和SRO的5′区域内的反向引物。

在进一步的具体实施方案中，本发明的方法包括通过定量PCR检测位于一个或多个SROs内的序列而检测染色体获得或缺失。

在进一步的具体实施方案中，本发明的方法包括使用MPLA(多重连接(multiplex ligation)依赖性探针扩增)检测染色体获得或缺失。

在具体实施方案中，对患者的测试样品执行用于检测患者中的结肠直肠腺癌细胞的存在的本发明方法，所述测试样品是包含来自结肠直肠癌活组织检查或切除术的材料的样品。可替代地，测试样品包含来自粪便样品的材料。进一步可替代考虑的是对测试样品执行的方法，所述测试样品包含来自组织或液体的材料，所述液体选自血液、尿、唾液和结肠液。

本发明的方法特别适合于诊断结肠直肠腺瘤进展至腺癌。

本发明的另一个方面提供了用于检测染色体缺失或复制的试剂盒，对于表1中所示的每个染色体区域的一个或多个SROs，所述试剂盒包括在严格条件下与所述SRO内的序列或者与位于所述SRO边界3′或5′最多约1Mb的基因组序列内的序列特异性杂交的一种或多种寡核苷酸。在具体实施方案中，一种或多种寡核苷酸是SRO特异性PCR引物对。在进一步的实施方案中，一种或多种寡核苷酸是SRO特异性探针。在进一步的特别实施方案中，SRO特异性引物检测表2的一种或多种标记基因。

因此，本发明的进一步方面涉及本文提供的试剂盒用于体外测定患者样品中的结肠直肠腺瘤细胞的存在的用途。更具体而言，试剂盒在用于测定结肠直肠病变的细胞中的染色体异常的方法中使用。当已鉴定腺瘤细胞的存在时，本发明的方法和试剂盒可以用于体外测定结肠直肠腺瘤进展至腺癌。

根据下述详述，结合举例说明例如本发明原理的附图，本发明的上述和其他特性、特征和优点将是显而易见的。这个说明仅为了举例而给出，而不限制本发明的范围。下文引用的参考图指附图。

附图简述

图1示意性举例说明使用定性PCR反应检测多核苷酸序列中的染色体缺失(A)或获得(B)的原理。该图显示了在染色体异常前和后的部分基因组DNA。箭头代表PCR引物。PCR片段(如果产生)的长度显示在基因组DNA下。

实施方案的详述

本发明将根据具体实施方案且参考某些附图进行描述，但本发明并不限于此，而仅由权利要求限制。权利要求中的任何参考标记不应解释为限制范围。所描述的附图仅是示意性和非限制性的。在附图中，为了举例说明的用途，某些元件的尺寸可以是扩大且不是按比例描绘的。当术语“包含”在本说明书和权利要求中使用时，它不排除其他元件或步骤。当使用不限定或限定项目的情况下提及单数名词例如“一个”或“一种”、“该”时，这包括该名词的复数，除非具体阐述另外的意思。

此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二和第三等用于区分相似元件，并且不一定用于描述顺序或年代次序。应当理解如此使用的术语在合适的环境下可互换，并且本文描述的本发明的实施方案能够以除本文描述或举例说明外的其他序列操作。

下述术语或定义仅为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应解释为具有小于本领域普通技术人员理解的范围。

定义

如本文所使用的，“肿瘤”或“赘生物”指这样的异常组织，其通过比正常更快速的细胞增殖而生长，并且在起始新生长的刺激停止后继续生长。术语“病变”一般是指涉及由于任何疾病或任何损伤导致的任何组织或器官的异常，在本文中也用于指赘生物。肿瘤、赘生物或病变可以是良性或恶性的。

“癌症”是提及任何类型的恶性赘生物的通用术语。

如本文所使用的，“腺瘤”指良性上皮赘生物。腺瘤通常是良好分界的，它们可以是扁平或息肉样的，并且赘生细胞不浸润或侵入邻接组织。

如本文所使用的，“腺癌”指上皮细胞的恶性赘生物。最通常地，癌形成腺体或腺样模式。同义词是“腺癌(glandular cancers)”和“腺癌(glandular carcinomas)”。恶性细胞通常特征在于进行性和不受控制的生长。它们可以局部或通过血流和淋巴系统传播到身体的其他部分。结肠直肠腺瘤在年长群体中是常见的，但仅这些恶变前肿瘤的小部分(估计约5％)进展至恶性肿瘤(即结肠直肠腺癌)。

“进展的腺瘤”是已具有癌症病灶的腺瘤并且也称为“恶性息肉”。

“结肠直肠”指结肠和/或直肠，即完整的大肠。

如本文所使用的，“染色体异常”指染色体缺失或获得，即在染色体中已缺失或复制的区域。

如本文所使用的，“标记基因”指其表达在腺瘤和腺癌细胞之间有差别(减少或增加)的基因。

“表达概况”指细胞或样品中的许多标记基因的表达水平。

关于结肠癌预防居第二位的事情是早期诊断。存在结肠癌的5个阶段(0-4)。这个分期系统反映癌症的浸润阶段。一般而言，阶段越早，癌症就越容易治疗。

本发明提供了用于区分恶性和恶变前的结肠直肠病变以及用于诊断受试者中的结肠直肠癌的存在的方法和工具。例如，本发明的诊断方法可以可靠地检测非常早期的结肠直肠癌。

虽然结肠镜检查和乙状结肠镜检查是用于早期检测结肠直肠癌的最常用检查，但它们不仅对于患者非常不舒适，而且它们仅允许检测可见病变。此外，它们的灵敏度由执行测试的医生的经验决定。当通过组织学分析鉴定息肉以证实息肉性质时，通常执行在结肠镜检查过程中切除物或活组织检查物的获取。最近，基于DNA微阵列的肿瘤基因表达概况已用于癌症诊断。然而，研究已局限于少数癌症类型，并且具有使不同数据库中的比较复杂化的扩展多重技术平台。在RNA或蛋白质水平上执行的表达分析具有许多缺点，首先与样品的来源相关，即侵入性结肠镜检查的需要。此外，RNA或蛋白质样品容易被结肠或直肠的内容物污染，这使后续分析复杂，或导致待分析的材料降解。此外，特别对于早期诊断，当与周围腺瘤组织的细胞群比较，样品可能仅包含少量腺癌细胞时，通过此种少量腺癌细胞的异常基因表达的贡献可能不会被注意到。因此，表达分析的灵敏度被限制。

本发明基于因为以下观察结果：超过85％的结肠直肠癌与染色体异常的存在相关的观察，应当可以在基因水平上检查这些癌症，避免蛋白质或RNA表达分析的缺点。在一个方面，本发明涉及体外方法，其中通过直接分析样品的遗传物质中染色体异常的存在或不存在，将基因组DNA用于检测患者中的结肠直肠腺癌细胞。已发现结肠直肠腺癌细胞显示在8q、13q和20q处的染色体获得，而染色体缺失在8p 15q、17p或18q处遇到。患者样品中包含一种或多种所述染色体异常的遗传物质的存在指示该患者中的结肠直肠腺癌细胞的存在。因为这些染色体异常的存在是腺癌细胞相对于非恶性腺瘤细胞的特征，所以本发明的方法因此允许检测良性结肠直肠腺瘤进展至恶性癌。

在本发明方法中使用的患者样品是包含基因组DNA，更具体而言潜在包含源于患者中存在的癌细胞的基因组DNA的样品。在一个实施方案中，样品包含患者的结肠直肠组织，更具体而言，样品是或包含来自结肠直肠病变的活组织检查物或切除物的遗传物质。然而，考虑到本发明方法的灵敏度，还可以使用包含极少量遗传物质的样品。在具体实施方案中，对来自机体的材料执行本发明方法的基因组分析，所述材料包含来自结肠直肠病变的完整细胞或裂解细胞，例如粪便样品。腺癌细胞可以侵袭其他组织。因此，本发明的方法也考虑了分析除来自结肠直肠活组织检查物或切除物和粪便样品外的测试样品。还考虑了可以包含腺癌细胞或这些细胞的至少部分基因组DNA的样品例如血液、尿、唾液的分析。

在某些实施方案中，本发明的方法包括比较获自患者的样品的基因组分析与对照。在本发明上下文中的合适对照包括不包含来自腺癌细胞的遗传物质的基因组DNA。一般地，合适的对照是来自未受影响的组织或来自不包含腺癌细胞的腺瘤组织的、来自相同患者的遗传物质。对照材料也可以是源于另一个患者或对照患者的集合(不包含来自腺癌细胞的遗传物质)的遗传物质。

由于包含8q、13q和20q处的染色体获得和/或8p、15q、17p或18q处的染色体缺失的DNA材料的存在，基因组DNA可以通过任何遗传分析技术进行分析。杂合性缺失(LOH)可以使用多态性标记来执行。可替代地，使用杂交方法例如CGH(比较基因组杂交)。

根据一个实施方案，使用CGH执行本发明方法中染色体缺失和插入的检测。在本文中测试样品的基因组DNA与代表人基因组的基因组克隆阵列进行杂交。CGH是确立的方法，这个操作的例子在本申请的实施例部分中详细描述。CGH基于样品DNA与矩阵上的DNA的杂交。基因组异常的存在基于与对照DNA相比杂交模式的差异进行检测。为了具有可靠结果，避免非特异性杂交。这例如通过使用升高的温度、高盐浓度和离液剂例如甲酰胺去除非特异性结合的DNA来执行。这些参数中每一个的值依赖序列相似性程度和杂交配偶体的长度。合适的值在CGH阵列制造商的说明书以及参考书中存在，例如Sambrook等人(2000)in Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，Cold SpringHarbor Press。例子是包含约50％甲酰胺、2x SSC，pH 7或0.1M磷酸钠、0.1％Nonidet P40，pH 8的溶液，其中SSC浓度为0.2-0.01xSSC。

通过在从腺瘤到癌的转变后缺失或复制的染色体区域的精细作图，已鉴定了先前与结肠直肠腺癌相关的染色体缺失和获得区域的最小区域。

因此，本发明的具体实施方案涉及用于检测患者样品中结肠直肠腺癌细胞的存在的方法，其包括检测至少一个最小重叠区域(SRO)的获得或缺失的存在。已对于与结肠直肠腺癌相关的每个染色体获得区域，更具体而言8q、13q和20q处的染色体获得区域，以及每个染色体缺失区域，更具体而言8p、15q、17p或18q处的染色体缺失区域鉴定了最小重叠区域(SRO)。事实上，某些变化存在于发现与结肠直肠腺癌相关的染色体异常的确切大小和位置。SROs对应于以下这些区域：当染色体获得或缺失在分别的染色体区域上存在时，其总是获得或缺失，并且因此代表其对应的染色体缺失或获得。对于每个染色体缺失或获得区域鉴定的SROs在表1中提供。

表1：在结肠直肠腺癌细胞中的染色体异常的最小重叠区域。

#：SRO区域在各自染色体上的定位，依照UCSC 2003年7月的HumanGolden Path的限定。

因此，本发明检测方法的具体实施方案包括用于与结肠直肠腺癌相关的一个或多个染色体缺失/获得区域的表1的一个或多个SROs的检测。

染色体异常区域缩小到SROs内，允许检测界限清楚的DNA区域。这种SRO特异性检测可以例如通过(定量或定性)PCR来进行。PCR的特异性和灵敏度使得可以检测仅包含微量细胞或DNA或者仅包含来自结肠直肠病变的微量基因组物质的样品中的SROs。例如，粪便样品可以包含从结肠直肠病变例如腺瘤性息肉中释放的仅微量的细胞材料。

根据一个具体实施方案，本发明的方法包括检测由MLPA描述的一个或多个SROs。在这种技术中，使用在样品DNA上彼此邻近杂交的2种探针。其后使探针连接，并且连接的探针代替样品通过PCR进行扩增。在具体实施方案中，选择探针，使得邻近探针的靶序列是在SRO内的序列。扩增产物的量反映靶序列的相对拷贝数。可替代地，可以选择探针，使得扩增子的大小或存在/不存在指示染色体异常。MLPA允许使用同时与染色体的不同部分杂交的不同探针对(每个产生特定长度的扩增子)。因此，可以同时检测不同SROs(Schouten等人2002，Nucl.Acids Res.30(12)，e57)。

可替代地，界限清楚的目的基因组区域的鉴定允许CGH技术的进一步改善，由此仅使用针对特定目的区域的探针。

因此，在一个实施方案中，通过测定8p上命名为SRO_8p_1、SRO_8p_2、SRO_8p_3和SRO_8p_4的一个或多个或所有区域的染色体缺失来测定样品中结肠直肠腺瘤细胞的存在。

另外或可替代地，通过测定8q上命名为SRO_8q_1、SRO_8q_2、SRO_8q_3、SRO_8q_4、SRO_8q_5和SRO_8q_6的一个或多个或所有区域的染色体获得来测定样品中结肠直肠腺瘤细胞的存在。

另外或可替代地，通过测定13q上命名为SRO_13q_1 SRO_13q_2、SRO_13q_3 SRO_13q_4、SRO_13q_5和SRO_13q_6的一个或多个或所有区域的染色体获得来测定样品中结肠直肠腺瘤细胞的存在。

另外或可替代地，通过测定15q上命名为SRO_15q_1、SRO_15q_2和SRO_15q_3的一个或多个或所有区域的染色体缺失来测定样品中结肠直肠腺瘤细胞的存在。

另外或可替代地，通过测定17p上命名为SRO_17p_1和SRO_17p_2的一个或两个区域的染色体缺失来测定样品中结肠直肠腺瘤细胞的存在。

另外或可替代地，通过测定18q上命名为SRO_18q_1和SRO_18q_2的一个或两个区域的染色体缺失来测定样品中结肠直肠腺瘤细胞的存在。

另外或可替代地，通过测定20q上命名为SRO_20q_1、SRO_20q_2和SRO_20q_3的一个或多个或所有3个区域的染色体获得来测定样品中结肠直肠腺瘤细胞的存在。

最特别地，本发明提供了基于检测与结肠直肠癌的发生相关的任何染色体缺失或获得区域是否可以在患者的基因组物质中检测到，由此可以容易地检测患者中的结肠直肠癌细胞的存在的方法。因此，本发明的一个具体实施方案是指用于检测腺癌细胞的方法，其包括测定表1中提及的染色体异常8p缺失、8q获得、13q获得、15q缺失、17p缺失、18q缺失和20q获得中每一种的至少一个SRO的染色体获得或缺失。在一个非常具体的实施方案中，通过测定表1中提及的染色体异常8p缺失、8q获得、13q获得、15q缺失、17p缺失、18q缺失和20q获得中每一种的所有SRO的染色体获得或缺失来执行这种检测。本发明的方法允许可靠检测患者中的结肠直肠腺瘤细胞进展至腺癌细胞。

根据一个实施方案，本发明的方法包括在PCR扩增技术中通过SRO特异性引物对检测上文描述的一个或多个SRO。SRO特异性引物对是这样的引物对，当用于扩增基因组物质时，其将依赖是否存在涉及SRO的染色体异常(获得/缺失)而产生不同的扩增子。当使用SRO特异性引物对时，无需使用定量PCR方法就可以鉴定一个或多个染色体获得和/或缺失。

因此，在一个进一步的方面，本发明提供了这样的引物对，其检测与结肠直肠腺癌相关的染色体获得和缺失区域的一个或多个SROs的复制或缺失。更具体而言，本发明提供了表1中所示的SROs的SRO特异性引物对。此外，本发明提供了适合于检测根据本发明的SROs组合，更具体而言用于检测与结肠直肠腺癌相关的每个染色体缺失或获得区域的一个SRO的引物对的集合。进一步的实施方案涉及包含用于检测本发明的每一SROs的引物的引物对的集合。

缺失可以定性地检测，例如通过位于染色体缺失区域的SRO 5′的正向引物和位于染色体缺失区域的SRO 3′的反向引物。当该SRO的缺失(或染色体缺失)发生时，引物之间的基因组DNA的一部分不存在，并且导致比野生型(无染色体缺失)中小得多的PCR产物的产生。由具有缺失的区域扩增的PCR片段小于完整染色体的片段。此种更小的片段将优先扩增，允许非常灵敏的检测。此外或可替代地，可以缩短PCR反应中的延伸时间，以阻止更长PCR产物的扩增。

复制或染色体获得的发生可以例如通过如表1中命名的SRO的3′区域中的正向引物和5′区域中的反向引物进行检测。因为这些引物彼此“远离(point away)”，所以在没有复制的情况下，染色体上将不存在PCR产物。检测缺失或复制的概念在图1中举例说明。

通过计算长度、GC组成和引物和模板之间的序列同一性程度来测定关于与PCR引物一起使用的严格条件。基于预测的引物解链温度，修改PCR扩增的条件。PCR反应中的严格性参数在很大程度上通过选择PCR循环中的退火温度来决定。不同软件程序可用于在给定DNA序列中选择具有所需解链温度的PCR引物对，其是特异的且不彼此杂交，或形成发夹。任选地，通过执行所谓的嵌套式PCR增加PCR反应的特异性。用于扩增基因组DNA的试剂盒可从例如Roche或Stratagene获得。

根据另一个实施方案，本发明的方法包括通过定量PCR检测上文描述的一个或多个SRO。使用与位于目的SRO内的序列退火的引物，样品中这种序列的定量表达可以与对照(对照样品中的相同区域或其他区域)进行比较。类似地，使用MLPA，可以使用靶向染色体缺失或获得区域内的序列的引物对(MLPA)，导致反映靶序列的相对拷贝数的相对量的扩增子的产生。

在本发明的上下文中鉴定的位于SROs内的特异性靶序列，更具体而言，表1中鉴定的SROs，可以由技术人员容易地测定。尽管基本上基因组DNA的任何部分都适合于作为用于扩增的靶，但在具体实施方案中，基因的一部分，更具体而言至少一个外显子的至少一部分用作用于扩增的靶。

因此，本发明方法的具体实施方案涉及检测样品中的结肠直肠腺癌细胞的存在，所述方法包括定量检测位于与结肠直肠腺癌相关的SRO内的DNA序列，更具体而言位于表1的SRO内的序列的存在。

根据另一个实施方案，本发明的方法包括使用对于SRO内的序列特异的探针(SRO特异性探针)，通过基因组筛选而检测上文描述的一个或多个SRO。类似于CGH技术，与对照基因组物质比较，包含染色体异常的基因组物质与对于SRO内的序列特异的探针集合的杂交将产生不同信号。在本发明上下文中鉴定的位于SROs，更具体而言，表1中鉴定的SROs内的基因可以由技术人员容易地测定。

因此，在一个进一步的方面，本发明提供了允许在包含基因组DNA的样品内检测基因组物质的存在的探针，所述基因组物质包含与结肠直肠腺癌相关的染色体获得和缺失区域的一个或多个SROs的复制或缺失。更具体而言，本发明提供了用于表1中所示的SROs的SRO特异性探针。此外，本发明提供了包含适合于检测根据本发明的SROs组合，更具体而言适合于检测与结肠直肠腺癌相关的每个染色体缺失或获得区域，即在8q、13q和20q处的染色体获得区域和在8p、15q、17p或18q处的染色体缺失区域的一个SRO的探针。进一步的实施方案涉及包含用于检测每一个本发明的SROs的探针。

因此，一般地，本发明提供了包含一种或多种寡核苷酸的试剂盒，所述寡核苷酸在严格条件下与SRO内的序列或与位于所述SRO边界的3′或5′最多约1Mb的基因组序列内的序列特异性杂交，其允许特异性检测SRO。

本发明的一个进一步方面提供了针对与结肠直肠腺癌相关的染色体获得和缺失而鉴定的SROs的标记基因。本发明的标记基因是位于与结肠直肠癌相关的染色体获得和缺失区域内的SRO内的基因。更具体而言，本发明的标记基因是位于表1中公开的SROs内，并且已显示在腺瘤细胞和腺癌细胞之间具有差异表达的基因。本发明的标记基因列表在下表2中提供。这些基因是特别感兴趣的，因为它们允许基因组筛选和平行表达分析。

因此，本发明的一个进一步实施方案涉及用于检测患者中的结肠直肠腺癌细胞的方法，其包括检测表2中所示的一种或多种基因之一的基因组DNA的缺失或获得。表2中的登记号指Genbank中的mRNA条目。基因的标识符在描述后的括号中指出。基因名或cDNA的条目得到具有不同外显子指示的基因组序列。

表2：人标记基因及其在特定SRO内的定位。

在具体实施方案中，对基因的一部分执行检测(包含基因的至少部分内含子或外显子的检测)。在进一步具体的实施方案中，基因是癌基因。癌基因是在由于这种获得而超量表达的获得区域内的，并且其功能暗示在癌症中的作用的基因(例如转录因子、细胞周期基因等)。位于染色体20q中的此种基因的例子是C20orf24、AURKA、RNPC1、TH1L、ADRM1、C20orf20和TCFL5。

因此，在一个进一步的方面，本发明提供了用于特异性检测本发明的标记基因，更具体而言表2的标记基因的引物对或探针。本发明进一步提供了包含用于特异性检测一种或多种标记基因的引物或探针组合的引物或探针的集合，它们例如针对包含与结肠直肠腺癌相关的每个染色体异常的一种基因的标记基因的集合。进一步的实施方案涉及位于表1中鉴定的每个SRO内的标记基因的引物或探针组合。进一步的具体实施方案涉及用于检测一种或多种标记基因的引物/探针或引物/探针集合，与腺瘤细胞比较，所述标记基因在腺癌细胞中超量表达。进一步的具体实施方案涉及用于检测选自表2的一种或多种癌基因的引物/探针或引物/探针的集合。根据一个实施方案，根据本发明的这个方面的引物特别适合于定量PCR。根据一个进一步的实施方案，本发明的特异性探针特别适合于筛选阵列中的基因组物质。

本发明的具体和优选方面在所附的独立和从属权利要求中阐述。适当地并且并非仅仅如权利要求中明确阐述的，来自从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征组合，并且与其他从属权利要求的特征组合。

体现本发明的系统和方法的其他安排对于本领域技术人员将是显而易见的。

应当理解尽管优选实施方案、特定构建体和构型以及材料已在本文中针对本发明的装置进行讨论，但无需背离本发明的范围和精神即可进行形式和细节的各种变化或修饰。

实施例

实施例1：20q的染色体获得区域内的最小重叠区域的测定

肿瘤样品的选择和制备

在荷兰阿姆斯特丹的VU-大学医学中心(VUmc)前瞻性收集41个福尔马林固定且石蜡包埋的进展腺瘤(其中已存在癌的病灶，也称为恶性息肉)和73个快速冷冻的结肠直肠肿瘤(37个未进展的腺瘤和36个癌症)。所有样品顺应机构的伦理条例使用。

41个恶性息肉(档案材料)对应于38个患者(19个女性和19个男性)，因为3个患者呈现超过一个恶性息肉。患者的平均年龄是67岁(范围45-86岁)。从这些息肉，分开分析腺瘤和癌组分，加入总共分析的82个档案样品(41x2)。

73个冷冻样品对应于65个患者(31个女性和34个男性)。其中，6个患者具有多发性肿瘤：4个患者，多发性腺瘤和2个患者，接近于癌的1个或多个腺瘤。患者的平均年龄是69岁(范围47-89岁)。

在两组样品中执行阵列-CGH，并且仅对冷冻组进行表达微阵列。

DNA的分离

来自档案样品的DNA如先前详细描述而获得(Hermsen等人(2002)Gastroenterology，123，1109-1119)。根据供应商的说明书用TRIzol试剂(Invitrogen，Breda，NL)分离来自快速冷冻组织的DNA。在Nanodrop ND-1000分光光度计(Isogen，IJsselstein，NL)中测量DNA浓度和纯度，并且在1％琼脂糖凝胶中评估完整性，用溴化乙锭染色。

阵列CGH

a)用于比较基因组杂交(CGH)的阵列的产生

使用包含约5000个DNA克隆的内部印刷的全基因组BAC阵列。阵列包含具有沿1.0Mb的完整基因组的平均分辨率的Sanger 1Mb克隆集合、包含对应于200种癌症相关基因的约600个克隆的OncoBac集合(Caltech)，以及选择的获自Children’s Hospital Oakland ResearchInstitute(CHORI)和/或获自Sanger的tilepath克隆集合的目的克隆，以填充染色体6上大于1Mb的任何缺口，并且具有在染色体8q22-q23、11q23、13q21-q31和20q12-q13上的完全覆盖的重叠群区域。根据Snijders等人(Snijders等人(2001)Nat Genet，29，263-264，通过连接介导的聚合酶链反应(PCR)来完成BAC克隆DNA的扩增。所有克隆在Codelink^TM载玻片(Amersham BioSciences，Roosendaal，NL)上以150mM磷酸钠，pH 8.5中1μg/μl的浓度上一式三份地印刷，该印刷使用配备SMP3针(TeleChem International，Sunnyvale，CA，USA)的OmniGrid

100微阵列仪(Genomic Solutions，Ann Arbor，MI，USA)。印刷后，载玻片根据制造商的方案(Codelink^TM载玻片；Amersham BioSciences，Roosendaal，NL)进行加工。

b)标记和杂交

300ng肿瘤和参照(从来自10个健康女性或男性个体的外周血中分离的DNA合并物)DNAs通过随机引物法(Bioprime DNA LabelingSystem，Invitrogen，Breda，NL)进行标记。用sephadex柱(ProbeQuant G-50 Micro Columns-Amersham BioSciences，Roosendaal，NL)完成未掺入的核苷酸的去除。Cy3标记的测试基因组DNA和Cy5标记的参照DNA进行组合，并且通过添加0.1体积的3M乙酸钠(pH 5.2)和2.5体积冰冷的100％乙醇与100μg人Cot-1DNA(Invitrogen，Breda，NL)一起共沉淀。通过在4℃下在14,000rpm下离心30分钟来收集沉淀物。风干后，将团块溶解于13ml酵母tRNA(100mg/ml，Invitrogen)和26ml 20％SDS中，小心防止形成泡沫。

在室温下温育15分钟后，加入91μl主混合物[14.3％(w/v)硫酸葡聚糖(USB)、50％(v/v)甲酰胺(Invitrogen)、2.9x SSC pH7.0(Sigma)-]，并且轻轻混合。在73℃下使DNA样品变性10分钟，随后在37℃下温育60分钟，以允许Cot-1DNA阻断重复序列。在杂交站(HybArray12^TM-Perkin Elmer Life Sciences，Zaventem，BE)中，使阵列在37℃下与变性且阻断的杂交混合物温育38小时。杂交后，在45℃在包含50％甲酰胺、2xSSC，pH 7的溶液中将载玻片洗涤3分钟，随后为在室温下用PN缓冲液(PN：0.1M磷酸钠、0.1％nonidetP40，pH 8)、0.2xSSC、0.1xSSC和0.01xSSC的1分钟洗涤步骤。通过在室温下在1000rpm下离心3分钟使载玻片干燥。

c)检测

阵列的图像通过扫描(Agilent DNA Microarray扫描仪G2505B-Agilent technologies，Palo Alto，USA)而获得，并且Imagene 5.6软件(Biodiscovery Ltd，Marina del Rey，California)用于自动特征提取(2个通道Cy3和Cy5的每个点的点分段以及信号和背景强度的定量)。使用不良质量点的减弱的缺省设置。Microsoft Excel图表用于从测试和参照DNA的信号中值强度中扣除局部背景。对于每个BAC克隆计算一式三份点的中值，并且通过扣除染色体1-22上的BAC克隆的模式值来标准化2log比值(肿瘤/正常参考信号)。如果3个点的强度的标准差大于0.2，那么克隆从进一步的分析中排除。此外，在所有肿瘤中具有超过20％漏失值的克隆也从进一步的分析中排除。

考虑来自UCSC 2003年7月的Human Golden Path的限定的克隆位置，完成所有后续分析。

d)数据分析

拷贝数分段

为了对DNA拷贝数变化(获得和/或缺失)分段，应用平滑算法“aCGH-Smooth”(Jong等人(2004)Bioinformatics，20，3636-3637)。平滑的2log比值-0.15和0.15用作阈值，基于对于15个正常与正常杂交获得的99％置信区间(99％CIs)。仅包括覆盖至少3个邻接BAC克隆的获得和缺失。当2log比值超过1.0时，调用扩增。

在修饰版本的ArrayCGHbase(Menten等人(2005)BMCBioinformatics，6，124)中对DNA拷贝数数据评分。测定每个病例的中值绝对偏差(MAD)，作为评估阵列CGH质量的参数。简言之，计算来自所有常染色体的所有log2比值的中值，然后对于每个比值计算与中值的距离，并且最后所有距离的中值得到MAD值(de Wiel，未公开的数据)。进一步分析仅具有MAD＜0.2的病例。阵列-CGH概况在ArraCGHbase中得到显现，并且输出不同输出文件用于下游应用。

统计分析

使用TIGR多实验观察器(TMev)完成非监督聚类分析，其中应用完全连锁且使用Euclidian距离作为量度。对于监督分析，使用CGHMultiArray(van de Wiel等人(2005)Bioinformatics，21，3193-3194)比较两个组。对于相同肿瘤(腺瘤和来自相同进展的腺瘤内的癌组分)内的病变之间的配对分析，并且基于对于平局进行校正的Wilcoxon符号秩检验使用修改版本的CGHMultiArray。

为了测定染色体20上的获得的最频繁最小重叠区域(SRO)，在所有病例中，使用STAC-异常拷贝数的显著性检验(Diskin等人(2006).Genome Res.16，1149-1158.)。

结果

如本发明中公开的SROs的测定在本文中针对在20q处的染色体获得区域详细举例说明。先前通过CGH分析的(上文引用的Hermsen等人(2002)前41个进展的腺瘤(恶性息肉)通过阵列-CGH进行分析，以便使20q上的获得区域变窄。如其中所述，我们分开分析恶性息肉的腺瘤和癌组分的DNA拷贝数变化。在＞20％的病例中观察到1p、4、8p、14q、15q、17p和18的缺失以及1q、6p、7、8q、13q、17q、19p、20q和22q的获得，其中8p和18缺失以及13q和20q获得是最频繁的，在超过35％的病例中发生。单独的染色体20获得在超过60％的病例中发生。在基因组范围，拷贝数变化模式在进展的腺瘤中的腺瘤和癌组分之间并无不同，即在癌组分中发现的异常已存在于腺瘤组分上，尽管具有较低频率或幅度。

接下来，分析37个非进展的腺瘤和36个癌症的拷贝数变化。在73个肿瘤中，67个(34个腺瘤和33个癌症)显示高质量基因组概况(对应于8％的中途退出)，由此显示结果。在腺瘤中，异常的频率明显极低。相比之下，癌显示频繁的(＞20％的病例)1p、4、8p、14q、15q、17p和18缺失以及1q、6p、7、8q、13q、17q、19p、20q和22q获得，其中8p和18缺失以及13q和20q获得在超过35％的病例中存在(如在进展的腺瘤中)。染色体20获得在小于15％的腺瘤但超过60％的癌中发生，主要影响整个染色体或长臂，如在进展的腺瘤中。

这67个肿瘤(非进展的腺瘤和癌)在DNA拷贝数概况上的等级聚类显示癌和腺瘤明显分成2个不同聚类，分别为聚类1和2，其中χ²检验p＜0.001。在搜索非进展的腺瘤和癌之间显著不同(p＜0.05)的那些DNA拷贝数变化中，观察到4q、8p、8q、13q、15q、18和20是相关区域，其中在20q上的基因座最显著不同(p＜0.00001)。

为了测定具有在结肠直肠癌进展中具有作用的假定癌基因的20q内的最相关区域，将STAC应用于石蜡包埋的恶性息肉(n＝41)和冷冻癌(n＝33)的组合集合。这些样品的分析揭示在20q上的异常拷贝获得的3个相关区域，1个跨4Mb(32-36Mb)，1个跨3Mb(56-59Mb)，并且第3个跨2Mb(61-64Mb)。这3个区域(最小重叠区域-SRO′s)仍分别包含80、35和94种基因。这对应于表1中对于20q列出的SROs。对于与腺癌相关的其他染色体异常区域执行类似分析，并且对于这些区域中的每一个所鉴定的SROs也在表1中提供。

实施例2：微阵列表达分析

为了研究染色体不稳定性对结肠直肠腺瘤至癌进展中基因表达的影响，对一系列68个结肠直肠肿瘤(37个非进展的腺瘤和31个癌)，通过阵列-CGH，分析整个基因组拷贝数变化，并且通过微阵列分析，分析表达水平。对于最频繁发生类型的染色体异常即20q获得，鉴定了在结肠直肠癌的进展中发挥作用的假定癌基因。

在表2中，提供了位于表1的SROs内的基因的概述，当比较结肠直肠腺瘤和腺癌组织时，如通过来自活组织检查物或切除物样品的mRNA的微阵列分析测定的，发现其具有显著不同的表达(FDR＜0，1(假测定率))。

Claims (20)

1.用于检测患者中结肠直肠腺癌细胞的存在的体外方法，所述方法包括下述步骤：

检测所述患者的测试样品的基因组DNA中至少一个最小重叠区域(SRO)的获得或缺失的存在，其中所述SRO选自：

-染色体8p上的SRO_8p_1、SRO_8p_2、SRO_8p_3和SRO_8p_4，和/或

-染色体8q上的SRO_8q_1、SRO_8q_2、SRO_8q_3、SRO_8q_4、SRO_8q_5和SRO_8q_6，和/或

-染色体13q上的SRO_13q_1、SRO_13q_2、SRO_13q_3、SRO_13q_4、SRO_13q_5和SRO_13q_6，和/或

-染色体15q上的SRO_15q_1、SRO_15q_2和SRO_15q_3，和/或

-染色体17p上的SRO_17p_1和SRO_17p_2，和/或

-染色体18上的SRO_18q_1和SRO_18q_2，和/或

-染色体20q上的SRO_20q_1、SRO_20q_2和SRO_20q_3，

其中一个或多个所述SROs的获得或缺失的存在指示所述患者中结肠直肠腺癌细胞的存在。

2.根据权利要求1的方法，其中所述检测包括每个染色体缺失或获得区域的至少一个SRO的获得或缺失，即在8q、13q和20q处的染色体获得以及在8p、15q、17p和18q处的染色体缺失的检测。

3.根据权利要求1的方法，其中所述检测包括至少一个染色体区域的所有所述SROs的获得或缺失的检测。

4.根据权利要求1的方法，其中所述检测包括每个列出的染色体区域的所有所述SROs的获得或缺失的检测。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述染色体获得或缺失的检测使用比较基因组杂交来执行。

6.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述染色体获得或缺失的检测通过位于所述一个或多个SROs中的至少部分基因的定量PCR检测来执行。

7.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述SRO的染色体缺失的检测通过PCR反应来执行，所述PCR反应使用包含位于所述SRO 5′的正向引物和位于所述SRO 3′的反向引物的SRO特异性引物对。

8.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述SRO的染色体获得的检测通过PCR反应来执行，所述PCR反应使用所述SRO的3′区域中的正向引物和所述SRO的5′区域中的反向引物。

9.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述SRO的染色体获得或缺失的检测使用多重连接依赖性探针扩增(MPLA)来执行。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述测试样品是结肠直肠肿瘤切除物或活组织检查物。

11.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述测试样品是粪便样品。

12.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述测试样品是组织或液体的样品，所述液体选自血液、尿、唾液和结肠液。

13.根据权利要求1-12中任一项的方法用于诊断结肠直肠腺瘤进展至腺癌的用途。

14.用于检测染色体缺失或复制的试剂盒，对于表1中所示的每个染色体区域的一个或多个SROs，所述试剂盒包含在严格条件下与所述SRO内的序列或者与位于所述SRO边界3′或5′最多约1Mb的基因组序列内的序列特异性杂交的一种或多种寡核苷酸。

15.根据权利要求14的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸是SRO特异性PCR引物对。

16.根据权利要求14的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸是一种或多种SRO特异性探针。

17.根据权利要求14的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸是特异性扩增SRO内的核苷酸序列的引物对。

18.根据权利要求17的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸是各自特异性扩增表2的标记基因序列的引物对。

19.根据权利要求14-18中任一项的试剂盒用于体外测定结肠直肠病变的遗传物质中的染色体异常的用途。

20.根据权利要求14-18中任一项的试剂盒用于体外测定结肠直肠腺瘤进展至腺癌的用途。

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