CN101711278B - 与基质结合的t4噬菌体 - Google Patents

Abstract

配体-受体结合剂系统也可用作T4-脂质体结合剂。

Description

与基质结合的T4噬菌体

相关申请的交叉参考 

本申请要求2007年3月1日申请的发明名称为“Liposome-Bacteriophage Complex As Vaccine Adjuvant”的美国临时专利申请号60/904,168的优先权，其全文并入本文作参考。 

政府权益声明 

美国政府根据Walter Reed Army Institute of Research和The CatholicUniversity of America之间的合作研究协议合同U01-AI056443-01对此发明具有权利。 

联合研究协议声明 

根据37 C.F.R.§1.71(g)(1)，本文公开的请求保护的发明是根据35U.S.C.103(c)(3)由或代表The Catholic University of America和Walter ReedArmy Institute of Research所订立的联合研究协议所完成的并且是在所述联合研究协议范围内进行活动的结果，该协议在所述请求保护的发明完成之时或之前生效。 

背景 

发明领域

本发明一般性涉及抗原载体。 

相关技术 

在开发疫苗配制品的最佳构建体的过程中，已经观测到疫苗配制品可以通过利用脂质体携带抗原或者佐剂或者这二者而改良，而不是通过仅使用水溶性组合物。然而，尽管其具有许多优势，但是脂质体仍难以生产且对于许多疫苗具有许多有限的商业潜力。 

发明概述 

一方面，本发明提供了组合物，其包含：基质；以及一或多种T4噬菌体成分，所述噬菌体成分通过葡糖缀合物(glucoconjugate)与基质结合。 

第二方面，本发明提供了包含如下步骤的方法：(a)提供一种基质，其具有与其结合的一或多种葡糖缀合物；以及(b)使一或多种T4噬菌体成分的每一种均与所述一或多种葡糖缀合物中各自相应的葡糖缀合物结合。 

第三方面，本发明提供了一种组合物，其包含：脂质体；以及通过T4-脂质体结合剂与所述脂质体结合的一或多种T4噬菌体成分。 

第四方面，本发明提供了一种方法，其包括如下步骤：(a)提供一种脂质体，其具有与其结合的一或多种T4-脂质体结合剂，和(b)使一或多种T4噬菌体成分的每一种与所述一或多种T4-脂质体结合剂中各自相应的T4-脂质体结合剂结合。 

第五方面，本发明提供了一种方法，其包括如下步骤：(a)提供一或多种T4噬菌体成分，每一种成分具有与其结合的一或多种配体，和(b)使一或多种T4噬菌体成分的每一种与脂质体结合，所述脂质体具有与其结合的受体，其中所述配体和受体包含配体-受体结合剂系统。 

附图简述 

结合附图描述本发明，其中： 

图1是示出生产大的多层脂质体的标准方案的流程图，所述脂质体可直接用于免疫或者可以掺入水包油型乳状液中。 

图2是T4噬菌体的示意图。 

图3是T4噬菌体衣壳在 

的冷冻EM重构。 

图4示出噬菌体T4与含有葡糖脑苷脂的脂质体的结合。 

图5是示出根据本发明的一个实施方案作为佐剂蛋白或者DNA疫苗的T4噬菌体-葡糖神经酰胺-脂质A-脂质体的一部分的示意图。 

图6是根据本发明的一个实施方案的含有葡糖神经酰胺和结合的T4噬菌体的脂质体的电子显微镜图片。 

图7是根据本发明的一个实施方案的大的多层脂质体的电子显微镜图片。 

图8是根据本发明的一个实施方案的具有噬菌体T4的大的多层脂质体的电子显微镜图片。 

图9是与野生型T4噬菌体保温的含有葡糖神经酰胺的脂质体样品的 电子显微镜图片。 

图10是与野生型T4噬菌体保温的没有葡糖神经酰胺的脂质体样品的电子显微镜图片。 

图11是T4噬菌体-脂质体-糖脂复合物的图示。 

图12是与单层脂质体结合的展示HIV-C-Trimer-Hoc融合蛋白的T4噬菌体的电子显微镜图片。 

图13是与单层脂质体结合的展示HIV-C-Trimer-Hoc融合蛋白的T4噬菌体的电子显微镜图片。 

发明详述 

在描述本发明之前定义一些术语是有益的。应意识到如下定义在本申请全文应用。 

定义 

在术语的定义与该术语的常用含义不一致时，除非特别指出，否则申请人意图是利用下文提供的定义。 

对于本发明，术语“佐剂性(adjuvancy)”是指一种制剂增强和/或促进动物对于特定抗原的免疫应答的能力。 

对于本发明，术语“佐剂”或者“疫苗佐剂”是指改善获得性免疫应答或者刺激先天免疫系统诱导希望的效应物或者介质的任何物质或策略。对于各种疫苗已经提议的新型疫苗佐剂的特征是油基乳状液；细菌产物如脂质A，热不稳定的大肠杆菌(Escherichia coli)肠毒素，或者CpG核苷酸；病毒产物如病毒样颗粒；植物产物如皂苷衍生物；可生物降解的颗粒如脂质体；分子佐剂；以及合成佐剂。佐剂也可以被认为是当与抗原和/或免疫原联合应用时增强和/或加强免疫应答的物质或者材料。佐剂也可以用于更迅速地激发免疫应答或者更强的应答，或者使用更少的抗原或者免疫原。佐剂如脂质A可加入已经形成的基质如脂质体中，或者加入佐剂如脂质A作为形成基质如脂质体的一部分。 

对于本发明，术语“抗原”是指由抗体特异性识别的和/或与抗体结合的物质或者材料。抗原的例子包括：病毒颗粒或生物体如HIV、炭疽、鼠疫、流感等，或者病毒颗粒或生物体的衍生物如HIV gp120、炭疽保护性 抗原等。 

对于本发明，术语“抗原呈递细胞(APC)”是指呈递抗原的细胞。这种细胞的例子包括树突细胞、巨噬细胞等。 

对于本发明，术语“噬菌体成分”是指噬菌体和噬菌体衍生物，包括具有与其附着的抗原、融合蛋白及其它类型分子的噬菌体和噬菌体衍生物。例如，术语“T4噬菌体成分”是指T4噬菌体和T4噬菌体衍生物。 

对于本发明，术语“噬菌体衍生物”是指包括噬菌体的蛋白质衣壳的至少一部分的任何结构。噬菌体衍生物的例子是外源DNA被包装进特定的噬菌体基因组中，例如Jiang，J.，Abu-Shilbayeh，L.and Rao，V.B.，“Display of aPorA Peptide form Neisseria meningitidis on the Bacteriophage T4 Capsidsurface”in Infection and Immunity65：4770-4777(1997)、Clark et al.，FEMSImmunology and Medical Microbiology，40，21-26(2004)以及March et al.，Vaccine，22，1666-1671(2004)所述，所述文献的全部内容及其揭示内容在此并入本文作参考。噬菌体衍生物的另一例子是噬菌体壳体。噬菌体衍生物的另一例子是噬菌体尾部。在本发明的一个实施方案中，外源DNA可以加载进空T4壳体中，使用如Kondabagil，K.R.，Zhang，Z.B.and Rao，V.B.，“The DNA translocating ATPase Of bacteriophage T4 packaging motor”in J.Mol.Biol.，363：786-799(2006)所述方法进行，所述文献的全部内容及其揭示内容在此并入本文作参考。 

对于本发明，术语“结合”是指任何类型的化学或者物理结合，包括共价结合、氢键结合等。 

对于本发明，术语“剂型”是指包括抗原在内的任何药物学活性化合物通过任何施用途径的药物输送，所述施用途径优选包括皮下、局部、肌内、皮内、乳腺内、腹膜内和眼内。在本发明的免疫原性或者疫苗方面所用术语“剂型”是指施用疫苗的任何药物形式，包括口服、皮下、肌内、眼内施用，施用和利用与佐剂及任选免疫调节剂如细胞因子一起施用的活的、减毒的或者合成的或者部分形式的疫苗。制备前述成分的组合以便使免疫原性剂型适合在动物包括人对象体内尽可能容易且有效地产生免疫应答。本发明的剂型也包括单位剂型，即以有效治疗或者激发免疫应答的剂量的单独单位施用的剂型。 

对于本发明，术语“表位”是指可以由免疫球蛋白的组合位点识别的抗原部分的最小部分。 

对于本发明，术语“扩展精加工(extended elaboration)”是指治疗剂在超过不存在稳定脂质体的条件下正常发生的时间内从脂质体包囊中的释放，通常在大约24小时内，在一些实施方案中为大约2-3周。 

对于本发明，术语“葡糖缀合物”是指包括可用于噬菌体结合基质的一或多个葡萄糖单位的糖缀合物。葡糖缀合物的例子是葡糖神经酰胺(GC)。适用于本发明多个实施方案中的葡糖缀合物的其他例子在下文描述。在本发明中，葡糖缀合物可用作结合剂以使得T4噬菌体与基质如脂质体结合。 

对于本发明，术语“糖缀合物”是指术语糖缀合物的惯用含义，即与一或多个化学特定物质(chemical specials)共价连接的碳水化合物。糖缀合物具有许多类型，包括糖蛋白、糖肽、肽聚糖、糖脂等。 

对于本发明，术语“免疫应答”是指动物的免疫系统对于抗原或者免疫原的特异性应答。免疫应答可包括抗体及细胞免疫性的产生。 

对于本发明，术语“免疫性”是指动物对象包括人对于感染生物体或者物质的抗性状态。可以理解感染生物体或者物质是广义的，包括寄生虫、毒性物质、癌细胞及其它细胞以及细菌和病毒。“治疗有效的免疫过程”(见下文定义)将产生免疫应答。 

对于本发明，术语“免疫条件”是指影响免疫应答的因素，包括输送给对象动物包括人的免疫原或者佐剂的量和种类、输送方法、接种次数、接种间隔时间、对象动物类型及其状况。“疫苗”是指能诱导免疫性的药物配制品。 

对于本发明，术语“免疫剂量”是指产生免疫应答所需的抗原或者免疫原的量。这个量随着不同佐剂的存在和效力而有所不同。这个量根据动物和抗原、免疫原和/或佐剂而有所不同，但是每次接种量通常在大约0.1μg/ml或更低至大约100μg之间。免疫剂量易于通过本领域技术人员熟知的方法确定，例如通过进行统计学有效的宿主动物免疫和攻击研究确定，例如Manual of Clinical Immunology，H.R.Rose and H.Friedman，AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.(1980)所述，所述文献的全部内 容及其揭示内容在此均并入本文作参考。在一些情况中，可以施用若干免疫剂量包括增强剂量以提供免疫性，对于本发明，这种治疗过程统称作“治疗有效的免疫过程”。 

对于本发明，术语“免疫原”是指单独或者与佐剂联合而能诱导免疫应答的物质或材料(包括抗原)。天然物质和合成物质均可以是免疫原。免疫原通常是蛋白质、肽、多糖、核蛋白、脂蛋白、合成的多肽，或者与蛋白质、肽、多糖、核蛋白、脂蛋白或者合成的多肽连接的半抗原，或者其它细菌、病毒或者原生动物级分。应理解“免疫原”包括除非与佐剂缔合，否则不产生免疫应答(或者仅产生治疗无效的免疫应答)的物质(例如小肽)。对于本发明，这种免疫原被称作“佐剂专性(adjuvant-obligatory)”免疫原。 

对于本发明，术语“免疫原量”是指感兴趣的感染性病原体抗原制备物的量或者激发动物体内临床可检测的保护性应答的生物毒素的量。 

对于本发明，术语“不稳定的肽样治疗剂”是指所述治疗剂在动物体内的被指定治疗反应之外的反应破坏或者变性的倾向。 

对于本发明，术语“脂质双层膜”是指双层近晶型中间相的类型，其中每个单层脂质的脂质平行阵列的极性基团朝向水相，每层的非极性基团(例如脂肪酰基团)相互朝向双层的中心。除了形成双层的脂质之外，高疏水性化合物如甘油三酯、固醇如胆固醇可以掺入所述双层中。脂质体通常含有脂质双层，如细胞的浆膜。 

对于本发明，术语“配体-受体结合剂系统”是指包含两个分子的T4-脂质体结合剂：在噬菌体成分上展示的配体以及在脂质体上展示的受体。配体-受体结合剂系统的例子包括：T4-Hoc融合蛋白或者T4-Soc融合蛋白，其包括作为配体的HIV gp41的MPER区域以及作为受体的gp120；T4-Hoc融合蛋白或者T4-Soc融合蛋白，其包括作为配体的gp120以及作为受体的CD4；T4-Hoc融合蛋白或者T4-soc融合蛋白，其包括作为配体的炭疽保护性抗原以及作为受体的炭疽毒素等等。 

对于本发明，术语“脂质结构”是指所有有组织的脂质结构或者结构域，以及所有固相、介晶态、晶体、液晶以及液态脂质结构等。脂质结构包括所有脂质的多种有组织的物理状态(multiple organized physical states)，例如Small，D.M.，in″The physical states of lipids：solids，mesomorphic states， and liquids”in“The Physical Chemistry ot Lipids，From Alkanes toPhospholipids″Handbook of Lipid Research，Vol，4，Plenum，NY，1986，Chapter 3，pp.43-87教导，所述文献在此以其全部内容和揭示内容并入本文作参考。术语“脂质结构”和“脂质的物理状态”对于本发明具有相同概念。因此，术语“固相脂质结构”与“介晶状态”、“液态脂质”、“有组织的脂质结构”、“结构域”、“晶体脂质结构”、“液态晶体脂质结构”以及“液态脂质结构”可互换。 

对于本发明，术语“脂质”是指中等分子量(100-5000之间)的任何分子，其含有脂肪烃或者芳香烃的基本部分。脂质的例子包括脂肪酸、脂肪、油脂、蜡、烃、类固醇、固醇、脂溶性维生素(如维生素A、D、E和K)、甘油单酯、肥皂、去污剂等，以及更复杂的分子如三酰甘油、磷脂、神经节苷脂和脂多糖等。脂质进一步包括高疏水性化合物如甘油三酯、固醇如胆固醇。可用于本发明的特定脂质包括磷脂，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)、鞘磷脂(SPM)等，单独或者组合使用。所述磷脂可以是合成的或者衍生自天然来源如鸡蛋或者大豆。一些合成的磷脂是二肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)以及二肉豆蔻磷脂酰甘油(DMPG)。对可用于本发明中的脂质的进一步描述见Small，D.M.，″The PhysicalChemistry of Lipids，From Alkanes to Phospholipids″Handbook of LipidResearch，Vol，4，Plenum，NY，1986，p.1中关于“脂质”的定义，所述文献以其全部内容和揭示内容并入本文作参考。 

对于本发明，术语“脂质体”是指由双层膜组成的运载体，例如由磷脂和胆固醇双层组成的双层膜。脂质体也可以含有其它类固醇成分，如胆固醇的聚乙二醇衍生物(PEG-胆固醇)、粪醇、胆甾烷醇或者胆甾烷，以及PC与胆固醇的组合。脂质体也可以含有糖脂。脂质体可以由近晶型中间相(smectic mesophases)组成，以及可以由磷脂或者非磷脂近晶型中间相组成或者是磷脂或者非磷脂近晶型中间相。 

对于本发明，“天然状态构型”是指如部分如肽的组构，当其在原位即在天然状态存在时其构型与非天然状态构型(变性的)不同，其中所述部分由于生物活性或者免疫反应性而被改变。 

对于本发明，术语“颗粒”是指最小直径为0.01微米、最大直径不超过1000微米的任何物质。 

对于本发明，术语“肽样”是指短链肽以及蛋白质、脂蛋白和糖蛋白，但是也包括非蛋白质分子，例如含有氨基酸的分子。在一些实施方案中，肽样治疗剂除了其它制剂之外还可另外含有维生素、类固醇、叠氮胸苷以及游离伯氨喹。一种有用类别的肽是免疫调节剂，如白细胞介素、集落刺激因子和干扰素、另一有用类别的蛋白质是例如在疫苗中使用的抗原和免疫原。 

对于本发明，术语“引发(priming)”是指刺激动物对免疫原的初次应答(与二次应答或者继发应答相反)。初次应答特征在于动物的免疫原抗体的产生，理想的是在于--即使没有佐剂--应答二次或者继发免疫原性攻击的B-淋巴细胞群的产生，伴有快速且大量的抗体产生。基于这种应答，1、2、3或者更多剂的无佐剂的免疫原的加强剂量将产生对于免疫原的治疗有效的免疫应答。 

对于本发明，术语“自组装”是指噬菌体成分与基质的自发结合。在一些实施方案中，自组装需要溶剂或者悬浮液体如水的存在。例如，在包括于水性介质中的葡糖缀合物的脂质体表面上的噬菌体颗粒的自发结合或者通过向干燥噬菌体与包括葡糖缀合物的脂质体的混合物中加入水性介质导致的噬菌体与脂质体的结合均是自组装过程。 

对于本发明，术语“近晶型中间相”是指单层或双层的、层平面正常或者倾斜的以及具有冷冻或者解链的脂肪链的分子。当加热指定分子时，代替直接解链为各向同性液体，其可以是经过称作中间相或者液晶的中间状态，特征在于在一些方向上有残存有序性(residual order)但在另一些上没有顺序。通常，液晶分子的长比宽略长，沿着分子的长度具有极性或者芳香部分。分子形状和极性-极性或者芳香相互作用使得分子以部分有序的阵列排列。这些结构在一端具有极性基团的分子中特征性出现。在分子的长轴方向具有长程有序性的液晶被称作近晶的、分层的或者薄层液晶。在近晶状态，分子可以是单层或双层、层平面正常或者倾斜，以及具有冷冻或者解链的脂肪链。关于“近晶型中间相”的进一步描述见Small，D.M.，in″The Physical Chemistry of Lipids，From Alkanes to Phospholipids″Handbook of Lipid Research，Vol，4，Plenum，NY，1986，pp.49-50，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

对于本发明，术语“稳定的脂质”是指对于氧化分解代谢有抗性的脂质，所述氧化分解代谢是由于pH、温度、氧自由基(例如在炎症反应期间由侵润免疫细胞产生的那些)的改变或者生理环境的其它应激而引起。应理解稳定是具有连续性的性质，由此正常脂质刚性通过稳定方法如氢化而被修饰。因此，稳定的脂质是对于由于pH改变而引起的氧化分解代谢是抗性的及对于温度、氧自由基或者其它生理环境应激是抗性的脂质，并且在使用的体内环境中存在的一般生理pH范围内不被快速解构。当稳定的脂质组成脂质体时，特别是与其它脂质体相对比在经胃肠外施用后在生理环境中将保持延长时期的结构完整性。 

对于本发明，术语“脂质体的结构完整性”是指在扩展精加工期间包囊化物质的药物学活性基本保持。假定这个结构完整是归因于在扩展精加工期间包含脂质体的脂质材料的双层排列的持续以及伴随的捕获(entrapped)水相的基本维持。结构完整性可以通过从脂质组合中形成脂质体而赋予，所述脂质包含当被对象动物体内存在的生理学条件被攻击时足够稳定的脂质以维持需要的结构。 

对于本发明，术语“T4-脂质体结合剂”是指可用于使T4-噬菌体成分与脂质体结合的任何分子或者分子组合。在一些实施方案中，T4-脂质体结合剂可以结合脂质体，使得T4噬菌体成分通过T4-脂质体结合剂与脂质体结合。例如，T4-脂质体结合剂葡糖神经酰胺或者cholest-5-en-3B(二硫嘧啶)(PDS-胆固醇)可以结合脂质体，然后T4噬菌体可以通过结合剂结合脂质体。在其它实施方案中，T4-脂质体结合剂可以是配体-受体结合剂系统，且包含两个分子：一个分子结合噬菌体，一个分子结合脂质体。 

对于本发明，术语“疫苗”是指包含一或多种脂质体以及能激发动物体内免疫应答的抗原物质的配制品。 

描述 

脂质体运载体可以作为疫苗安全地施用给人体，例如Gluck，R.，Vaccine，17：1782-1787(1999)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。脂质体运载体作为疫苗的应用利用这样的事实，即颗粒材料易于被吞 噬细胞如树突细胞或者巨噬细胞摄取，然后这些细胞作为抗原呈递细胞(APC)引起对所述颗粒相关的抗原的特异性免疫应答，如Verma，J.N.，Rao，M.，Amselem，S.，Krzych，U.，Alving，C.R.，Green，S.J.，Wassef，N.M.，Infect.Immun.，60：2438-2444(1992)以及Peachman，K.K.，Rao，M.，Alving，C.R.，Palmer，D.R.，Sun，W.，Rothwell，S.W.，Immunobiology，210：321-333(2005)所述，这些文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。由于与免疫系统相互作用的这种机制，颗粒材料与可溶材料相比具有更高的诱导免疫应答的效力或能力，因为可溶材料不易于被APC摄取。 

然而，已知抗原呈递细胞(APC)对特定抗原的简单摄取不总是提供最强的可能免疫应答，因此通常需要佐剂以增强免疫应答或者以特定方向引导免疫应答，如Alving，C.R.，Vaccine，20：S56-S64(2002)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。脂质体相关的脂质A作为胞内和胞外佐剂的例子已经在Verma，J.N.，Rao，M.，Amselem，S.，Krzych，U.，Alving，C.R.，Green，S.J.，Wassef，N.M.，Infect.Immun.，60：2438-2444(1992)中描述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

脂质体运载体是非常多用途的，且可以作为纳米颗粒或者作为不同大小的混合物制备。抗原可以在液态双层脂质体中重建(reconstitute)，包囊在内部水空间内或者与外表面共价附着。例如，呈现良好免疫原性的脂质体或者含有附着的或者包囊化的抗原且还含有脂质A作为佐剂的脂质体已经在Alving，C.R.，Koulchin，V.，Glenn，G.M.，and Rao，M.，Immunol.Rev.，145：5-31(1995)中描述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

使用脂质体作为运载体输送抗原的有吸引力的特征之一是观测到脂质体被巨噬细胞和不成熟树突细胞快速摄取，如Su，D.，Van Rooijen，N.，Immunology，66：466-470(1989)，in Verma，J.N.，Wassef，N.M.，Wirtz，R.A.，Atkinson，C.T.，Aikawa，M.，Loomis，L.D.，Alving，C.R.，Biochim.Biophys.Acta.，1066：229-308(1991)以及Verma，J.N.，Rao，M.，Amselem，S.，Krzych，U.，Alving，C.R.，Green，S.J.，Wassef，N.M.，Infect.Immun.，60：2438-2444(1992)所述，这些文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

脂质体抗原具有额外的能同时获得进入常规I型和II型MHC途径的潜力。这个特性呈现出诱导抗体和细胞免疫应答二者的优势，如Alving，C.R.， Koulchin，V.，Glenn，G.M.，and Rao，M.，Immunol.Rev.，145：5-31(1995)以及Alving，C.R.，Wassef，N.M.，IDS Res.and Human Retrovir.，10；S91(1994)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。也已经证实由于其颗粒性质，脂质体是使得外源蛋白质抗原进入I型MHC途径的有效输送系统，如Alving，C.R.，Wassef，N.M.，IDS Res.and Human Retrovir.，10；S91(1994)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。所有这些性质使得应用脂质体作为佐剂的疫苗具有强力诱导希望的免疫应答的能力。 

然而，尽管其具有许多优势，但是脂质体难以生产且作为疫苗的商业开发潜力有限。称作WRAIR脂质体的脂质体的自组装配制品已经由WalterReed Army Institute of Research(WRAIR)发明。WRAIR脂质体由二肉豆蔻磷脂酰胆碱、二肉豆蔻磷脂酰甘油、胆固醇和脂质A组成，如Wassef，N.M.，Alving，C.R.，Richards，R.L.Immuno.Methods.，4；217-222(1994)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。WRAIR脂质体与传统脂质体相比具有较高的生产重复性且可在GMP(良好操作规范)条件下生产。然而，对于疫苗最好的脂质体典型是大型多层运载体，甚至直径为50-100微米，可以易于被吞噬细胞摄取。由此，这种脂质体不能经受最后的过滤，且必须在无菌条件下生产。图1示出了典型的流程图，示出直接用于免疫或者可以掺入水包油乳状液中的大型多层脂质体的生产方案。 

在102方案中，脂质开始是干燥的膜或者是冻干的脂质。将脂质在步骤112中溶解于氯仿并且在步骤114中组合。然后在步骤116将组合的脂质进行旋转蒸发和在步骤118高真空蒸发，产生干燥的膜。将此干燥的膜在步骤122溶解于水中，在步骤124加入多个疫苗小瓶中。然后将溶解的脂质在步骤126冻干，形成溶解的冻干的脂质组合物。然后在步骤132向此脂质组合物中加入抗原。 

在步骤134组合所述脂质组合物与抗原并离心，并在步骤136置于疫苗小瓶中。所述疫苗小瓶中的产物可用于直接进行免疫接种，如步骤142所示。或者，可以将所述疫苗小瓶中的脂质体在步骤144抽取进连接三通开关的注射器中，可以将轻质液体石蜡在步骤146抽取进连接三通开关的其它注射器中，在步骤148通过将脂质体与轻质液体石蜡在注射器之间流动混合所述轻质液体石蜡与脂质体。所得组合物可用于进行免疫，如步骤 150所示。 

在另一方案中，步骤122、124和126可以如箭头162所示跳过，在步骤132抗原可以直接加入干燥的膜中。 

在另一方案中，如箭头164所示，步骤134的组合和离心步骤可省略。 

在图1的方案中，脂质开始是干燥的膜或者冻干的粉末。随后通过加入溶解于注射用水中的抗原，脂质体形成为大的囊泡(vesicle)的水悬浮液，这是自发的过程。在与抗原产生悬浮液之前，可以通过过滤或者其它方式简单地使脂质灭菌。然而，离心在最终水悬浮液中的大囊泡需要保持严格的无菌条件，这使得该方法难以用于商业方法中。尽管不同的方案可用于产生可以被灭菌过滤的小单层囊泡，但是由于例如脂质体的球形体积随着直径的立方而降低，从而降低包囊化抗原的有效负荷。此外，由于表面积仅随着直径的平方而降低，因此对于给定体积的包囊化抗原需要更多的脂质，从而抗原包囊化的材料成本将增加。 

考虑到这些生产难题，亟待解决的问题是产生脂质体疫苗配制品，其可以在密闭的无菌环境如注射小瓶中产生、且可以在外部加载抗原以自组装脂质体抗原配制品。因此，在一个实施方案中，本发明通过提供脂质体而解决了与脂质体疫苗配制品相关的许多上述问题，本发明的脂质体包括T4噬菌体的结合位点，其在噬菌体表面上展示一或多个抗原。 

如图2所示，T4噬菌体(或者噬菌体T4)是感染细菌大肠杆菌的无包膜裂解病毒。噬菌体T4的感染过程从特异性受体吸附于细菌细胞壁上开始。通过尾丝发生结合。尽管对于T4噬菌体结合存在一些大肠杆菌菌株特异性，但是所有结合的一个共有特征是依赖脂多糖(LPS)。LPS是由脂质核和分支糖组成的复合物分子。先前已经报道某些脂多糖上葡糖基缀合的或者糖基类似物缀合的分子可以作为部分受体或者作为噬菌体结合革兰氏阴性菌的位点，如Dawes，J.，Nature，256：127-128(1975)和Prehm，P.，Jann，B.，Jann，K.，Schmidt，G.，Strim，S.，B.J.Mol.Biol.，101：277-281(1976)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。研究表明LPS的葡萄糖残基可以部分取代另一个T4噬菌体结合分子OmpC，如Yu，F.，Mizushima，S.，J.Bacteriol.，151(2)：718-722(1982)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。LPS的葡萄糖部分是参与噬菌体T4尾丝与大肠杆菌开始附着 的功能性基团之一。T4结合含有Glucer的脂质体，但是不结合没有Glucer的脂质体或者含有Galcer的脂质体。T4与脂质体的Glucer依赖型附着看起来促进壳体-脂质体相互作用，进一步稳定所述复合物。 

T4噬菌体的壳体是伸长的(延长的)二十面体，可见图2以及Leiman PG，Kanamaru S，Mesyanzhinov VV，Arisaka F.Rossmann MG.，Cell.Mol.LifeSci.，60(11)：2356-2370(2003)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。T4含有一个主要壳体蛋白gp23的960个拷贝。此外，如图3所示，有两种非必需壳体蛋白：高抗原性外层壳体蛋白(Hoc)和小外层壳体蛋白(Soc)。每个壳体有Hoc的155个拷贝和Soc的870个拷贝。这些蛋白质在壳体装配完成之后添加在壳体上，不是为噬菌体生存力或者噬菌体感染性所必需的。由于这种性质，其可以由外来抗原置换，由此使得T4成为极多用途的纳米颗粒。先前已经提供了加载来自炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)和HIV抗原的T4噬菌体的免疫原性数据，示出T4可以有效地展示一或多个抗原，见Li，Q.，Shivachandra，S.B.，Zhang，Z.and Rao，V.B.，“Assembly of the Small Outer Capsid protein，Soc，on bacteriophage T4：anovel system for high density display of multiple large anthrax toxins andforeign proteins on phage capsid”in J.Mol.Biol.，370：1006-1019(2007)和Li，Q.，Shivachandra，S.，Leppla，S.H.and Rao，V.B.，“Bacteriophage T4 Capsid：Unique Platform for Efficient Surface Assembly of MacromolecularComplexes”in J.Mol.Biol.，363：577-578(2006)以及Shivachandra，S.，Rao，M.，Janosi，L.，Sathaliyawala，T.，Matyas，G.R.，Alving，C.R.，Leppla，S.H.，Rao，V.B.，“In vitro binding of anthrax protective antigen on bacteriophage T4 capsidsurface through Hoc-capsid interactions：a strategy for efficient display of largefull-length proteins”in Virology，Feb 5；345(1)：190-8.Epub 2005 Nov 28(2006)，Sathaliyawala，T.，Rao，M.，Maclean，D.M.，Birx，D.L.，Alving，C.R.and Rao，V.B.Assembly of Human Immunodeficiency Virus(HIV)antigens onBacteriophage T4：a Novel In vitro Approach To Construct MulticomponentHIV Vaccines.J.Virol.80：7688-7698(2006)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

这种T4保护性抗原/HIV抗原复合物在动物体内是高免疫原性的，见 Shivachandra，S.B.，M.Rao，L.Janosi，T.Sathaliyawala，G.R.Matyas，C.R.Alving，S.H.Leppla，and V.B.Rao.，Virology，345(1)：190-8(2006)和Shivachandra SB，Li Q，Peachman KK，Matyas GR，Leppla SH，Alving CR，Rao M，Rao VB.，Vaccine，25(7)：1225-35.Epub 2006 Oct 17(2007)，Sathaliyawala，T.，Rao，M.，Maclean，D.M.，Birx，D.L.，Alving，C.R.and Rao，V.B.Assembly of Human Immunodeficiency Virus(HIV)antigens onBacteriophage T4：a Novel In vitro Approach To Construct MulticomponentHIV Vaccines.J.Virol.80：7688-7698(2006)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。除了在体外展示HIV抗原之外，HIV蛋白的DNA表达序列也可以在没有T4噬菌体DNA的条件下被包装进T4的壳体中，因此提供增加免疫原性的另一途径。30Kb的外源DNA节段已经被成功地包装进T4的壳体中。在一些I期临床试验中，脂质体囊泡已经被安全地施用给人体，见Fries LF，Gordon DM，Richards RL，Egan JE，Hollingdale MR，Gross M，Silverman C，Alving CR，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，89：358-362(1992)和Gluck，R.，Vaccine，17：1782-1787(1999)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

已经发现T4噬菌体结合葡糖缀合物的暴露的葡萄糖单位。这使得T4噬菌体结合许多不同类型的基质。所述基质可以是任何形状或者任何大小。例如，所述基质可以是一片材料、一块材料、一层或者双层材料、膜、颗粒等。 

本发明的基质可以由葡糖缀合物可以结合的任何类型材料制成。例如，本发明的基质可以是天然或者合成的任何类型的生物材料例如脂质体、脂质双层、碳水化合物、蛋白质、微团和聚合物等。聚合物是由通过共价化学键连接的重复结构单位或者单体组成的大分子量分子组成的物质。虽然术语“聚合物”的一般用法是指“塑料”，但是聚合物包含具有不同性质和用途的许多类别的天然和合成材料。天然聚合材料如虫胶和琥珀已经使用几百年。生物聚合物如蛋白质(例如毛发、皮肤和部分骨结构)和核酸在生物学过程中起重要作用。还存在许多其它天然聚合物，如纤维素，其是木材和纸张的主要成分。另一例子是聚丙烯[聚(1-甲基乙烯)]。 

除了葡糖神经酰胺(GC)之外，还有可用于本发明不同实施方案中的各种各样的葡糖缀合物。葡糖缀合物是一种糖缀合物，由葡萄糖和具有基本的葡萄糖结构的分子如葡糖胺组成，其与其它类型的分子连接。糖蛋白、蛋白聚糖和葡萄糖连接的糖脂(包括葡糖神经酰胺)以及葡聚糖分子是在哺乳动物细胞和哺乳动物组织以及哺乳动物非细胞间隙(noncellular spaces)中发现的最多的葡糖缀合物。它们主要在外层细胞壁上和分泌的体液中被发现。糖缀合物和葡糖缀合物已经示出在细胞与细胞相互作用中起重要作用，因为细胞表面上除了糖缀合物和葡糖缀合物自身之外还存在各种葡聚糖和聚糖结合受体。 

术语“聚糖”是指多糖或者寡糖。聚糖也可以用于指糖缀合物如糖蛋白、糖脂或者蛋白聚糖的碳水化合物部分。聚糖通常仅由单糖(包括葡萄糖)的O-糖苷键组成。例如，纤维素是由β-1，4-连接的D-葡萄糖组成的聚糖(或者更特别地是葡聚糖)，壳多糖是由β-1，4-连接的N-乙酰-D-葡糖胺组成的聚糖。聚糖可以是单糖残基的同聚物或者异聚物，且可以是线性或者分支的。 

葡聚糖分子是通过糖苷键连接的D-葡萄糖单体的多糖。如下是可适合用作本发明各种实施方案的结合剂的葡聚糖的例子：纤维素、β-1，4-葡聚糖、凝乳聚糖，β-1，3-葡聚糖、酵母聚糖、β-1，3-葡聚糖、葡聚糖、α-1，6-葡聚糖、糖原、α-1，4-和α-1，6-葡聚糖、昆布多糖、β-1，3-和β-1，6-葡聚糖、蘑菇多糖、严格纯化的β-1，6：β-1，3-葡聚糖、地衣淀粉、支链淀粉、α-1，4-和α-1，6-葡聚糖、淀粉、α-1，4-和α-1，6-葡聚糖。 

可用于本发明各种实施方案中的葡糖缀合物的其它例子包括合成的缀合物，其中单糖、寡糖或者含有葡萄糖作为组成成分的多糖(以及具有基本葡萄糖结构的分子如葡糖胺)通过化学共价键或者非共价键附着于颗粒或者聚合物结构。 

当所述基质是脂质体且用作结合剂的葡糖缀合物是葡糖神经酰胺时，葡糖神经酰胺可以插入脂质体脂质双层中。然后所述葡糖神经酰胺作为噬菌体T4的结合位点以将抗原积聚在脂质体表面。预期葡糖神经酰胺在脂质双层中具有自由侧向流动性(free lateral mobility)，因此可以自联合(self-associate)以用于噬菌体尾部上葡萄糖结合位点的多价结合，并因此产生高于单价结合可溶葡萄糖部分的预期的低亲和性结合的高亲和性结合。由于噬菌体远小于脂质体，因此脂质体的表面可以用展示一或多个抗原的 噬菌体覆盖。 

通过上述方法形成的T4-脂质体-GC缀合物可以作为抗原的载体，通过在T4壳体表面上展示抗原(例如作为Hoc-或者Soc-融合蛋白)或者通过表达插入T4壳体中的给定抗原的DNA而作为抗原载体。 

由于所述结合包括在水介质中脂质体表面上噬菌体颗粒的自组装，这样消除了在生产过程期间向脂质体中加入抗原的必要性。例如噬菌体颗粒和脂质可以自发形成脂质体且可以作为无菌粉末在注射小瓶中混合在一起，然后通过在所述注射小瓶中加入水而可以简便地形成含有展示抗原的结合的噬菌体颗粒的脂质体。 

在一个实施方案中，本发明提供了自组装纳米疫苗，其组合了高水平特异性及高免疫刺激能力，包括独特的中和抗体的诱导。 

当T4噬菌体靶向细菌时，挑战是通过在生物可降解颗粒上产生天然靶而模拟自然。已经证实脂质体具有强免疫刺激能力，但是在生产和稳定性方面存在问题：挑战是要求脂质体配制品可以易于生产且较廉价，但是需要保持强免疫刺激特性。 

对于疫苗可以使用具有高影响力的许多佐剂。疫苗研发的一个关键问题是需要适当的佐剂化。本发明通过激活众多免疫学活性包括中和抗体而提出并产生了纳米疫苗佐剂。 

本文描述的关于脂质体的所有性质导致脂质体诱导强免疫应答的能力。Walter Reed Army Institute of Research实验室发明了称作WRAIR脂质体的脂质体自组装配制品。WRAIR脂质体由二肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻磷脂酰甘油(DMPG)、胆固醇和脂质A组成(Alving，C.R.，Shichijo，S.，Mattsby-Baltzer，I.，Richards，R.L.，Wassef，N.M.1993.Preparations anduse of liposomes in immunological studies.In Lipsosome Technology：G.Gregoriadis，ed.，CRC Press Inc.，Boca Raton，FL，Vol.3，p.317-343；Wassef，N.M.，Alving，C.R.，Richards，R.L.1994.Liposomes as carriers for vaccines.Immuno Methods.4，217-222)。它们比传统脂质体具有更高的生产重复能力且可以在GMP条件下生产。WRAIR脂质体与传统脂质体相比还具有延长的保存期，使其在治疗和疫苗制品方面更具吸引力。使用表面等离子体共振的初步数据表明噬菌体T4结合含有葡糖脑苷脂的WRAIR脂质体与结合 没有葡糖脑苷脂、脂质A或者含有半乳糖脑苷脂的WRAIR脂质体相比好6倍，见图4和图8所示。 

HIV是一种包膜病毒，其从宿主细胞获得其膜。病毒蛋白的结构和方向很可能受其埋入其中的脂质双层的影响。脂质体配制品可以仿效病毒包膜表面且在HIV包膜蛋白的正确呈递中是有益的。除了在T4上呈递的抗原之外，我们还将HIV包膜蛋白掺入脂质体配制品中。 

具有高水平特异性和高水平免疫刺激能力包括诱导HIV中和抗体的展示抗原(HIV蛋白和/或DNA)的自组装纳米颗粒可以通过利用T4受体结合含有糖脂和佐剂脂质A的工程化的脂质体的性质而产生。 

本发明的总体目的是产生自组装纳米疫苗，其组合了高水平特异性及高水平免疫刺激能力，特别是诱导中和抗体的能力。 

在本发明的一个实施方案中，提供了含有抗原的T4噬菌体，该抗原附着于T4壳体或者包含于其中。事实上，任何抗原均可以用于与T4噬菌体相连，在一些实施方案中，所述抗原是HIV包膜抗原。在可选的实施方案中，可以改变T4噬菌体以包含编码一或多个HIV抗原、特别是HIV蛋白的DNA序列。在这些实施方案中，HIV抗原编码序列在存在或者不存在T4噬菌体DNA的条件下被包装进T4的壳体中，由此提供了增加免疫原性的另一途径。外源DNA的包装可以在感染的大肠杆菌细胞中在感染期间完成，或者在试管中使用由纯化成分如空壳体、包装蛋白、外源DNA和ATP组成的指定包装系统完成，见Jiang，J.，Abu-Shilbayeh，L.and Rao，V.B.“Display of a PorA Peptide form Neisseria meningitidis on the Bacteriophage T4Capsid surface”in Infection and Immunity 65：4770-4777(1997)、Ren，Z.J.，Lewis，G.K.，Wingfield，P.T.，Locke，E.G.，Steven，A.C.，Black，L.W.，“Phagedisplay of intact domains at high copy number：a system based on SOC，the smallouter capsid protein of bacteriophage T4”in Protein Science 5：1833-43(1996)、Kondabagil，K.R.，Zhang，Z.B.and Rao，V.B.The DNA translocating ATPaseOf bacteriophage T4 packaging motor.J.Mol.Biol.，363：786-799(2006)和Black，L.W.and Peng，G.“Mechanistic coupling of bacteriophage T4 DNApackaging to components of the replication-dependent late transcriptionmachinery”in J.Biol.Chem.，281：25635-43(2006)所述，所述文献的全部内容 和揭示在此并入本文作参考。 

在本发明的一个实施方案中，提供了生产多层脂质体的方法。在一些实施方案中，这些脂质体可直接用于免疫，或者可以掺入水包油乳状液中。本发明的配制品和生产方法提供了一些优势，其中包括提供含有噬菌体T4结合位点的脂质体的优势，在所述噬菌体T4壳体表面上展示抗原。 

根据本发明的另一方面，本文描述的脂质体也可以用于鉴定结合包埋于脂质双层中的糖脂的T4噬菌体受体。 

所述脂质体和脂质体配制品用途极为广泛且可以作为纳米颗粒或者作为不同大小的混合物制备。此外，在一些实施方案中，本发明的脂质体可以用不同磷脂组合物以及不同比率的这些磷脂工程化。抗原可以在脂质体脂质双层内重建、在内部水空间中包囊化、或者与外表面共价附着。 

用于本发明实施方案中的合适佐剂包括：脂质A，以及凝胶型佐剂包括：铝盐或者“铝佐剂”如氢氧化铝和磷酸铝，钙盐如磷酸钙等；微生物佐剂，包括胞壁酰二肽(MDP)衍生物如莫拉丁酯(murabutide)和苏氨酰-MDP，细菌内毒素如单磷酰脂质A，细菌DNA如CpG和细菌外毒素如霍乱毒素(CT)，大肠杆菌热不稳定内毒素(LT)等；颗粒佐剂包括生物可降解聚合物微球，免疫刺激复合物(ISCOM)，脂质体如病毒颗粒等；油乳状液和表面活性剂包括Freund’s不完全佐剂，montanide ISA 720等，显微流态化乳状液(microfluidized emulsion)包括MF59、AS02A等，皂苷包括QS-21等；合成佐剂包括非离子嵌段共聚物，聚磷嗪(PCPP)，合成的多核苷酸如Poly A:U，Poly A:C等；细胞因子如白细胞介素(IL)-2，IL-12，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；γ干扰素(IFN-γ)等，遗传佐剂包括细胞因子基因或者编码作为质粒DNA输送的共刺激分子如IL-12、IL-2、IFN-γ的基因等以及在Alving，C.R.Vaccine adjuvants.in Vaccines for Biodefenseand Emerging and Neglected Diseases，Barrett，A.，and Stanberry，L.，eds.，Elsevier，NY(2008)(正在出版中的文章)中描述的其它佐剂。 

作为本发明一个实施方案的佐剂化蛋白的T4噬菌体-葡糖神经酰胺-脂质A-脂质体复合物502的举例实施方案在图5中示出。复合物502包含T4-噬菌体512、脂质A分子514、葡糖神经酰胺分子516和脂质体518。噬菌体512包含壳体522和尾部524。在图5中可以看出，每个脂质A分子514 的烃尾部532和每个葡糖神经酰胺分子516的烃尾部534包埋于脂质体518的脂质双层536中。每个脂质A分子514还包含两个葡糖胺单位542，每个葡糖神经酰胺分子516包含葡萄糖单位544。噬菌体512的尾部524在与葡糖神经酰胺分子516结合的过程中。 

为了在图5中清晰地举例说明，仅示出了脂质体的一部分且仅示出了结合脂质体的众多噬菌体中的一个T4噬菌体。同样，为了清晰地举例说明，复合物的成分未按比例示出。根据本发明的实施方案，所述噬菌体在壳体表面上可具有抗原或者在壳体中包囊化的噬菌体DNA可以用另一类型的DNA置换。 

当用作疫苗时，这种复合物可以由作为抗原呈递细胞(APC)的吞噬细胞摄取。APC可以由复合物中的脂质A激活，提供佐剂作用。壳体抗原的表达提供了抗原的表达。通过佐剂作用增强的抗原的表达提供了免疫应答。 

在另一实施方案中，图5的复合物可用作DNA疫苗。当用作DNA疫苗时，T4中的DNA在所述复合物被吞噬细胞摄取后被释放。 

在本发明的一个实施方案中，噬菌体T4也可以与脂质体共价结合，通过掺入极少量的巯基反应性脂质cholest-5-en-3B(二硫嘧啶)(PDS-胆固醇)以与噬菌体T4表面上任何地方可利用的游离SH基团共价偶联。也可以使用相似的试剂如可商购自Avanti polar Lipids的伯胺基团特异性1，2Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-phosphoehtnaolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide(MPB)，这种试剂见Kung，V.T.，and Redemann，C.T.，“Synthesisof carboxyacyl derivatives of phosphotidylethanolamine and use as an efficientmethod for conjugation of protein to liposomes”in Biochim.Biophys.Acta.862：435-439(1986)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

配体-受体结合剂系统也可以用作T4-脂质体结合剂。例如，在T4上展示的蛋白质或者肽的T4-壳体-暴露的疏水性末端理想地适于与脂质体单独或者含有合适受体的脂质体形成有效相互作用。一个例子是HIV gp41包膜蛋白的MPER(近膜端外部区(membrane proximal external region))单独与脂质体可以通过非特异性疏水性相互作用而相互作用或者可以与掺入脂质体中的gp120受体形成特异性配体-受体结合剂相互作用。生物化学研究已经证实MPER肽与脂质体或者磷脂微团通过C-末端疏水性序列相互作用，见 Sanchez-Martinez，S et al.，“Specific phospholipid recognition by humanimmunodeficiency virus type-1 neutralizing anti-gp41 antibody”in FEBSLetters，580：2395-2399(2006)和Shnaper，S et al.，“The C-and N-terminalregions of gp41 ectodomain fuse membranes enriched and not enriched withcnolesterol，respectively”in J.Biol.Chem.279：18526-18534(2004)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。因此，T4-Soc或Hoc-MPER颗粒与合成的脂质体通过尾丝和壳体可以有有效的自发相互作用。 

配体-受体系统的其它例子包括：T4-Hoc融合蛋白或者T4-Soc融合蛋白，包括gp120作为配体以及CD4作为受体；T4-Hoc融合蛋白或者T4-Soc融合蛋白，包括炭疽保护性抗原作为配体以及炭疽毒素受体(ATR)作为受体等。 

Rao于2005年10月3日申请的发明名称为“Methods and compositionscomprising bacteriophage nanoparticles”的美国专利申请No.2005/0226892描述了产生可用于本发明的方法和组合物中的定制T4噬菌体的方式，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。在Rao的定制T4噬菌体中，Hoc和/或Soc融合蛋白与T4噬菌体的壳体结合，每个壳体上一或多种Hoc融合蛋白的拷贝数和/或比率被控制和/或每个壳体上一或多种Soc融合蛋白的拷贝数和/或比率被控制。如Rao的美国专利申请No.2005/0226892所述，一些定制噬菌体可具有一或多种类型的Hoc融合蛋白，一些定制噬菌体可具有一或多种类型的Soc融合蛋白，以及一些定制噬菌体可具有Hoc和Soc融合蛋白的混合物。尽管为简便起见，在下文使用术语“T4噬菌体”，应理解下文描述的实施方案也可使用T4噬菌体衍生物，如T4空壳体和具有DNA的壳体。 

在一个实施方案中，本发明的定制T4噬菌体可以在体外装配系统中形成，所述装配系统利用hoc^-和/或soc^-T4噬菌体和与另一分子融合的Hoc和/或Soc蛋白或者其片段。这个分子可包含具有化学和/或生物学活性的任何分子，包括但不限于蛋白质、蛋白质片段、氨基酸、抗原、脂质、抗体、碳水化合物、酶、细胞因子或者趋化因子或者其它炎症介质。可以通过本领域技术人员已知的任何方法使所述分子与Hoc和/或Soc融合。当这个分子与Hoc和/或Soc蛋白或者其片段融合时，所得产物包含Hoc和/或Soc 融合分子。在本发明的一个实施方案中，与Hoc和/或Soc融合的分子是蛋白质如外源蛋白质，由此产生Hoc和/或Soc融合蛋白。形成的Hoc和/或Soc融合蛋白可以包含外源抗原和Hoc和/或Soc蛋白。在纯化后，将这些Hoc和/或Soc融合蛋白与纯化的hoc^-和/或soc^-T4噬菌体颗粒组合。所得定制T4噬菌体展示例如与Hoc融合的外源抗原。 

为了产生本发明一个实施方案中的Hoc和/或Soc融合蛋白，使Hoc和/或Soc蛋白或者其片段的N-或者C-末端与外源分子或者实体如蛋白质融合。在本发明的某些实施方案中，在融合蛋白的N-末端加入六组氨酸标记序列以使得可以通过Ni-琼脂糖柱层析一步纯化蛋白质-Hoc和/或Soc重组蛋白。本领域技术人员意识到代替六组氨酸标记，可以使用本领域已知的纯化重组蛋白的许多其它标记，包括但不限于谷胱甘肽转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、FLAG、血凝素(HA)和绿色荧光蛋白(GFP)。本发明进一步包含在外源蛋白与Hoc或Soc蛋白之间的通用接头序列。在某些实施方案中，所述接头是无结构接头。尽管不希望受到如下理论的约束，但是认为所述接头序列使得外源蛋白结构域对于壳体表面Hoc或Soc折叠或者装配的影响最小化，反之亦然。在某些实施方案中，所述无结构接头优选包含聚甘氨酸接头(pro-gly-gly)，但是本领域已知的有结构和无结构的、以及长度和序列不同的许多接头与本发明的一或多个实施方案是相容的。 

本发明实施方案中的Hoc和/或Soc融合蛋白可以通过许多方法构建。本领域技术人员意识到可利用多种遗传和蛋白质工程方法构建Hoc和/或Soc融合蛋白。例如，可以使用PCR-定向重叠延伸剪接(SOE)策略工程化编码希望的融合蛋白的基因构建体，见Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.& Pease，L.R.，“Engineering hybrid genes without the use ofrestriction enzymes：gene splicing by overlap extension”in Gene，77，61-68(1989)和Kuebler，D.and Rao，V.B.，“Functional Analysis of the DNAPackaging/Terminase Protein Gp17 from Bacteriophage T4”in J.Mol.Biol.，281：803-814(1998)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。这种策略需要四个寡核苷酸(引物1-4)和三个连续的PCR，这是工程化重组构建体的一种快速且有效的策略。使用这种策略，可以在一天内工程化相当复杂的基因构建和多个基因融合。根据本发明的某些实施方案，为了包 含六组氨酸标记序列，可以将基因构建体符合读框地插入T7表达载体的六组氨酸标记。 

所述载体可以是典型的大肠杆菌表达载体，如pET载体，见Studier，W.，Rosenberg，A.H.& Dunn，J.J.，“Use of T7 RNA polymerase to directexpression of cloned genes”in Methods Enzymol.，185，61-89(1990)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考；或者是大量的可商购的昆虫、哺乳动物以及穿梭表达表达载体之一。通过变性和复性方法从可溶性无细胞裂解物或者从不溶包涵体中纯化过表达的抗原。纯化方法包括柱层析法，如Histrap亲和性层析、MonoQ离子交换法以及Superdex凝胶过滤法等，例如Shivachandra S.B.，Rao M.，Janosi L.，Sathaliyawala T.，Matyas G.R.，Alving C.R.，Leppla S.H.，Rao V.B.，“In vitro binding of anthraxprotective antigen on bacteriophage T4 capsid surface through Hoc-capsidinteractions：a strategy for efficient display of large full-length proteins”inVirology，345：190-198(2006)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

在本发明的一个实施方案中，包含这样的T4噬菌体颗粒，其包含指定的伸长的(即延长的)二十面体，直径为大约86nm，长度为大约120nm。为了使得Hoc和/或Soc结合T4噬菌体颗粒的壳体，本发明利用不能表达Hoc和/或Soc蛋白的hoc^-和/或soc^-T4噬菌体突变体，因此这个突变体在其壳体表面不含有Hoc和/或Soc蛋白，如Shivachandra S.B.，Rao M.，Janosi L.，Sathaliyawala T.，Matyas G.R.，Alving C.R.，Leppla S.H.，Rao V.B.，“In vitrobinding of anthrax protective antigen on bacteriophage T4 capsid surfacethrough Hoc-capsid interactions：a strategy for efficient display of largefull-length proteins”in Virology，345：190-198(2006)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。产生hoc^-和/或soc^-T4噬菌体突变体的方法可以通过本领域已知的各种方法进行，见Karam，J.D.(ed.)，MolecularBiology of Bacteriophage T4.1994 ASM Press，Washington，D.C.附录，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。为了用于本发明的体外系统中，需要分离所述hoc^-和/或soc^-T4噬菌体颗粒，其应该是基本上纯的。技术人员可以通过本领域已知的任何方式分离这些T4噬菌体颗粒，但是可以例如 通过蔗糖梯度纯化实现充分的分离和纯化，如Mooney，D.T.，et al.J.Virol.61，2828-2834(1987)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

根据本发明的某些实施方案，在Hoc和/或Soc融合蛋白纯化和hoc^-和/或soc^-T4噬菌体分离之后，纯化的Hoc和/或Soc融合蛋白通过体外装配系统被装配或者“加载”于纯化的hoc^-和/或soc^-T4噬菌体上，产生T4噬菌体。加载包括将Hoc和/或Soc融合蛋白置于与hoc^-和/或soc^-T4噬菌体紧邻，由此Hoc和/或Soc蛋白结合T4噬菌体壳体表面。为了便于Hoc和/或Soc融合蛋白加载于hoc^-和/或soc^-T4噬菌体上，将纯化的成分在反应缓冲液中保温大约1-120分钟，优选大约20-90分钟，更优选大约40-70分钟，甚至更优选大约30-60分钟。在此保温期间，反应缓冲液温度可以不同，但优选在大约25-45℃，更优选大约32-42℃，甚至更优选大约37℃。对于反应缓冲液，本领域已知的许多缓冲液均与本发明相容。例如，合适的反应缓冲液可包含Tris缓冲盐水，pH在7-8之间，或者优选pH在7.2-7.8之间，更优选pH在7.3-7.5之间，甚至更优选pH为大约7.4。其它合适的反应缓冲液可包括本领域技术人员已知的不同盐浓度和/或存在许多缓冲成分如甘油、蔗糖、离子和非离子去污剂的那些缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、hepes缓冲液等。 

在Hoc和/或Soc融合蛋白与hoc^-和/或soc^-T4噬菌体在反应缓冲液中保温之后，通过本领域技术人员已知的方法从反应缓冲液中取出Hoc和/或Soc融合蛋白-hoc^-和/或soc^-T4噬菌体。例如，可以将反应混合物(其包括纯化的Hoc和/或Soc融合蛋白、纯化的hoc^-和/或soc^-T4噬菌体、反应缓冲液和新形成的T4噬菌体)在5,000-40,000rpm离心20-100分钟，优选在大约10,000-20,000rpm离心40-80分钟，更优选在13,000-16,000rpm离心55-65分钟。也可以通过柱层析法或者梯度离心技术回收颗粒。在离心或者回收步骤之后，弃去含有未结合的Hoc和/或Soc融合蛋白的上清，并将含有新形成的T4噬菌体的沉淀用反应缓冲液或者其它合适缓冲液洗涤以除去任何未结合的融合蛋白。 

在一个实施方案中，本发明的定制T4噬菌体具有指定拷贝数的Hoc和Soc结合位点的优势(每个颗粒共大约1025个拷贝)。具有这样大量的指 定结合位点，所述T4噬菌体提供了独特的纳米平台(nanoplatform)，基于此平台可以定制特定分子或者多个分子的展示。通过在上述保温之前或者保温期间操纵体外装配反应中成分的比率(即操纵Hoc和/或Soc融合蛋白与T4噬菌体颗粒的比率)，可以控制结合T4噬菌体的融合蛋白的拷贝数。相似地，通过在体外装配系统中使用两或多种Hoc和/或Soc融合蛋白以及通过调整不同融合蛋白与T4噬菌体的摩尔比率，可以控制结合T4噬菌体的融合蛋白的比例以产生指定的T4噬菌体。例如，指定的T4噬菌体可以展示HIV抗原tat和nef以及其它融合蛋白的组合。通过在保温之前或者在保温期间改变tat-Hoc和nef-Hoc融合蛋白与噬菌体颗粒的比率，在噬菌体上展示的蛋白质的拷贝数将成比例地改变。所述融合蛋白独立地结合所述结合位点并且观测到不同蛋白质结合之间无干扰或协同性。控制拷贝数的方法在Li，Q.，Shivachandra，S.B.，Zhang，Z.and Rao，V.B.Assembly of theSmall Outer Capsid protein，Soc，on bacteriophage T4：a novel system for highdensity display of multiple large anthrax toxins and foreign proteins on phagecapsid.J.Mol.Biol.，370：1006-1019(2007)以及Shivachandra，S.B.，Li，Q.，Peachman，K.K.，Matyas，G.R.，Leppla S.H.，Alving C.R.，Rao，M.，Rao V.B.Multicomponent anthrax toxin display and delivery using bacteriophage T4.Vaccine，25：1225-35(2007)中描述。 

使用所述体外装配系统，可以构建大量不同的定制T4噬菌体，以用于不同应用中。例如，本发明的某些实施方案能产生体液和细胞介导的这两种免疫应答，并因此可用作单一或者多成分疫苗配制品。在这些不同的疫苗配制品中，Hoc和/或Soc融合蛋白的外源蛋白可以包含在T4噬菌体颗粒的表面上展示的抗原性蛋白。各种不同的抗原包括但不限于白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)，脂质A，磷脂酶A2，内毒素，葡萄球菌肠毒素B及其它毒素，I型干扰素，II型干扰素，肿瘤坏死因子(TNF-α或β)，转化生长因子-β(TGF-β)，淋巴毒素，移动抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(CSF)，单核细胞-巨噬细胞CSF，粒细胞CSF，血管内皮生 长因子(VEGF)，血管生成素，转化生长因子(TGF-β)，热休克蛋白，血液碳水化合物部分(carbohydrate moieties of blood groups)，Rh因子，成纤维细胞生长因子，及其它炎症和免疫调节蛋白、核苷酸、DNA、RNA、mRNA，有义，反义，癌细胞特异性抗原，如MART、MAGE、BAGE及热休克蛋白(HSP)；突变体p53；酪氨酸酶；粘蛋白(mucine)，如Muc-1，PSA，TSH，自身免疫抗原；免疫治疗药物，如AZT；以及血管发生和抗血管发生药物，如制管张素、内皮抑制素、和碱性成纤维细胞生长因子以及血管内皮生长因子(VEGF)，前列腺特异性抗原和甲状腺刺激激素，或者其片段。如上所述，通过在保温之前或者在保温期间调节Hoc和/或Soc-抗原融合蛋白与hoc^-和/或soc^-T4噬菌体颗粒的比率可以调整T4噬菌体以适合在T4噬菌体颗粒的壳体上展示单个抗原、多个抗原和/或指定比例的抗原。 

在本发明的某些实施方案中，可以使用所述体外装配系统产生定制T4噬菌体，其同时展示相应于一或多种感染性疾病的多个抗原。更特别地，通过利用本文描述的体外装配系统，可以在同一壳体表面上展示例如HIV和炭疽抗原二者，使得可以配制既对抗HIV也对抗炭疽的疫苗。在另一个实施方案中，可以定制同时或者相近时间出现的疾病和病症的纳米颗粒。例如，许多AIDS患者患有多种其它疾病，如结核。定制纳米颗粒可含有人免疫缺陷病毒以及分枝杆菌的一或多个抗原(或者抗原的不同表位)。在另一实施方案中，可以使用所述体外装配系统产生T4噬菌体，其在同一壳体上同时展示一或多个抗原的多个表位。 

在另一个实施方案中，可以在构建Hoc和/或Soc基因融合构建体期间对靶向的序列进行位点定向组合突变，如Rao，V.B.and Mitchell，M.，“TheN-terminal ATPase Site in the Large Terminase Protein Gp17 is CriticallyRequired for DNA Packaging in Bacteriophage T4”in J.Mol.Biol.，314：411-421(2001)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。使用这个策略，在所述T4噬菌体上或者在多个T4噬菌体上的一组抗原突变体的表达及其组合展示使得可以构建多变体疫苗，该疫苗有效地对抗感染物质的一些株系，或者产生抗宿主选择压力的突变体的感染物质(例如HIV)。 

在再一个实施方案中，可以构建在表面上展示相互作用的分子的定制 T4噬菌体。例如，使用本领域技术人员已知的方法可以构建第一种Hoc和/或Soc融合蛋白，其包含与第一种外源蛋白融合的Hoc和/或Soc。相似地，可以构建第二种Hoc和/或Soc融合蛋白，其包含与第二种外源蛋白融合的Hoc和/或Soc。通过应用本发明揭示的体外装配系统，可以将第一种和第二种Hoc和/或Soc融合蛋白加载于T4噬菌体的表面上。在某些实施方案中，所述第一种和第二种融合蛋白可独立地呈递不同的免疫学表位。此外，所述第一种和第二种外源蛋白可以直接或者通过可以加入装配反应混合物中的另一蛋白质或者分子成分而间接地彼此相互作用。这个实施方案的T4噬菌体可例如赋予本发明的不同T4噬菌体组合物额外的免疫原性。不希望受到如下理论的约束，第一种和第二种外源蛋白之间的相互作用可例如暴露额外的表位且因此增强免疫原性应答。在相关的实施方案中，第一种外源蛋白质可具有酶活性，而第二种外源蛋白可作为第一种外源蛋白的底物或者配体。在这个实施方案中，第二种蛋白质的裂解可导致许多生物学作用，包括但不限于在T4噬菌体表面上展示额外的表位。同样，在这个实施方案中裂解的蛋白质可以例如是细胞因子或者趋化因子，其可进一步调节免疫应答。尽管上述实施方案涉及第一种和第二种外源蛋白，但是本发明还包含依赖于多种不同外源蛋白的相似实施方案。例如，第三种外源蛋白和第四种外源蛋白也可以单独和/或当在T4噬菌体颗粒表面上相互作用时展示额外的表位。本领域技术人员已知的蛋白质工程技术可以操纵这些实施方案展示的分子成分之间的结构和距离以用于多种特定应用中。这些是特别重要的，因为预想所述复合物模拟天然复合物或者与天然复合物相同，所述天然复合物是在体内通过在特异性相互作用之后发生的构象转变而形成的。这种复合物可能产生可干扰感染物质与宿主细胞之间相互作用的免疫应答(例如靶宿主细胞的HIV感染)，多成分毒素分子产生致死毒性(例如炭疽致死毒素和水肿毒素的形成)。 

在本发明的另一实施方案中，本发明的定制T4噬菌体可包括在第一层展示的蛋白质之上展示的第二层分子。在这个实施方案中，Hoc和/或Soc融合蛋白可包含第一层，且Hoc和/或Soc融合蛋白的外源蛋白作为融合膜(nexus)以装配第二层分子成分。如此，展示的第一层蛋白质可用作结合位点以展示与这些第一层结合位点相互作用的第二层蛋白质。例如，T4噬菌 体结合的炭疽PA63可用于捕获炭疽致死毒素和水肿毒素(未与Hoc或Soc融合)，或者捕获与LF或EF的N-末端PA63结合结构域融合的外源蛋白质。 

在再一个实施方案中，可以设计靶向特定细胞或者组织类型的定制T4噬菌体。特别地，通过展示Hoc和/或Soc-配体融合分子(其中所述配体特异于细胞或组织类型)，可以使本发明的T4噬菌体靶向某些细胞或者组织以激发各种选择性细胞或者组织应答。可以通过本发明技术人员已知的任何方法开发这种Hoc和/或Soc-配体融合分子。一旦开发出来，所述Hoc和/或Soc-配体融合分子可以使用本发明揭示的体外装配系统加载于hoc^-和/或soc^-T4噬菌体颗粒上以产生展示所述配体的T4噬菌体。各种配体包括但不限于结合CD4、趋化因子受体、GM-1受体、Toll-样/病原体识别受体、DC-sign受体、细胞因子受体、Fc受体、或者补体受体或者其片段的那些配体。 

在本发明的另一实施方案中，可以使用重组DNA技术和T4遗传学将外源DNA包装进定制T4噬菌体基因组中，例如Jiang，J.，Abu-Shilbayeh，L.and Rao，V.B.“Display of a PorA Peptide form Neisseria meningitidis on theBacteriophage T4 Capsid surface”in Infection and Immunity 65：4770-4777(1997)、Ren，Z.J.，Lewis，G.K.，Wingfield，P.T.，Locke，E.G.，Steven，A.C.，Black，L.W.，“Phage display of intact domains at high copy number：a systembased on SOC，the small outer capsid protein of bacteriophage T4”in ProteinScience 5：1833-43(1996)、Kondabagil，K.R.，Zhang，Z.B.，Rao，V.B.，“TheDNA translocating ATPase Of bacteriophage T4 packaging motor”in J.Mol.Biol.，363：786-799(2006)、Clark et al.，FEMS Immunology and MedicalMicrobiology，40，21-26(2004)以及March et al.，Vaccine，22，1666-1671(2004)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。因此，除了在T4噬菌体表面上展示Hoc和/或Soc融合蛋白之外，编码抗原或者Hoc和/或Soc融合蛋白的外源DNA构建体也存在于T4噬菌体内。在某些实施方案中，这种独特的T4噬菌体平台技术可用作免疫-加强(prime-boost)输送系统。通常，通过质粒DNA接种获得的免疫应答不佳且不稳定，因此需要多次注射和大量的DNA和蛋白质以增强免疫应答。相反，本发明这个实施方案的T4噬菌体可以同时输送蛋白质和DNA成分至相同抗原呈递细 胞，因此潜在地诱导更强的免疫应答。例如，使用本领域已知的噬菌体遗传学和分子生物学技术，可以将DNA构建体插入T4噬菌体的基因组中，在强哺乳动物启动子如CMV(巨细胞病毒)启动子的控制下，其可以表达包含例如HIV抗原nef的融合蛋白(即DNA构建体表达nef-Hoc融合蛋白)。或者，通过使用特定的T4包装系统，如Leffers，G.and Rao，V.B.，“Adiscontinuous headful packaging model for packaging less than headful lengthDNA molecules by bacteriophage T4”in J.Mol.Biol.，258：839-850(1996)以及Kondabagil，K.R.，Zhang，Z.B.and Rao，V.B.，“The DNA translocatingATPase Of bacteriophage T4 packaging motor”in J.Mol.Biol.，363：786-799(2006)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。同样，完整的噬菌体T4基因组可以用多联体(concatemeric)外源DNA构建体的多个拷贝置换。通过将这些遗传修饰的T4噬菌体与例如包含与HIV抗原nef融合的Hoc/Soc的融合蛋白在本发明体外装配系统中保温可以产生新的T4噬菌体，其包含编码内部特定抗原以及在壳体表面外部展示的相应抗原的DNA。正如本领域技术人员所意识到的那样，可以设想这个实施方案的多种组合，包括内部克隆和外部表达的多个基因。 

在再一个实施方案中，可以使用本发明的T4噬菌体进一步调节免疫应答。例如，可以在T4噬菌体平台上掺入各种炎症介质，扩大免疫应答。这种炎症介质包括但不限于各种细胞因子，如白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子和干扰素，以及其它炎症介质如趋化因子。利用本发明的体外装配系统，可以在T4噬菌体表面上展示这些炎症介质的全长或者功能基序和结构域，或者在其它实施方案中，可以将编码炎症介质的DNA构建体掺入T4噬菌体的基因组中。 

本发明的另一实施方案包含没有包装DNA的定制T4噬菌体。例如，通过本领域技术人员已知的方法操纵T4遗传学(例如基因16和17中的包装缺陷型突变)，可以产生没有包装的DNA的hoc^-和/或soc^-T4噬菌体突变体，如Rao，V.B.，and Black，L.W.，“DNA packaging of bacteriophage T4proheads in vitro：.Evidence that prohead expansion is not coupled to DNApackaging”in J.Mol.Biol.，185：565-578(1985)所述。 

使用本发明的体外加载系统，可以将Hoc和/或Soc融合蛋白加载于 hoc^-和/或soc^-T4噬菌体突变体上以产生没有DNA的T4噬菌体。当DNA的存在关系到生物安全性时，可以使用这个实施方案的T4噬菌体替代含有DNA的T4噬菌体。由于这个实施方案不影响T4噬菌体壳体表面的分子组成，因此可以组合使用这个策略与本发明揭示的许多实施方案。 

在本发明另一个实施方案中，结合基质的定制T4噬菌体可包含不同T4噬菌体的混合物。在这个实施方案中，可以将本文所述任何实施方案的T4噬菌体与本发明的其它不同T4噬菌体混合。例如，既对抗炭疽也对抗HIV的疫苗组合物可包含在一组T4噬菌体上单独展示的HIV-抗原以及在另一组T4噬菌体上单独展示的炭疽抗原，每组纳米颗粒使用本发明的体外装配系统产生。使用这种方法，可以例如产生对抗多种不同的感染性疾病的多成分疫苗配制品。 

在另一个实施方案中，本发明的T4噬菌体系统也可以作为独特的分子诊断系统而开发，通过利用展示的分子通过特异性相互作用检测病原体/成分。 

在另一个实施方案中，在定制噬菌体上展示的抗原可产生额外的(协同)应答，如抗毒素作用加上免疫应答。例如，展示的抗原可作为抗毒素，同时作为有效的疫苗。在炭疽孢子攻击的情况中，抗生素治疗以及施用疫苗是必需的。直接使用抗生素将抑制(消除)正在进行的炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)细菌感染的进程。但是，所述孢子级分可在体内保留数周(或数月)并且导致继发感染。因此，接种也是必需的以中和继发感染。用展示抗毒素例如LF和/或EF的PA63-结合N末端结构域的噬菌体T4进行免疫，通过干扰致死毒素和水肿毒素的形成而可以立即中和初始感染的毒性作用。所述结构域的高密度展示(在Soc-LF结构域融合情况中每个壳体810个拷贝)将作为多价毒素抑制剂，因此极大地增强结合PA63的亲和性以及中和毒素形成，如Nourez，M.，Kane，R.S.，Mogridge，J.，Metallo，S.，Deschatelets，P.，Sellman，B.R.，Whitesides，G.M.and Collier，R.J.，“Designing a polyvalent inhibitor of anthrax toxin”in Nature Biotechnology，19，958-961(2001)所述。所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。单独施用相同的T4颗粒或者组合其它T4噬菌体(例如PA-Hoc-T4)同时施用将作为产生中和免疫应答的疫苗并且消除延迟的孢子萌生导致的继发感 染。 

关于可以在T4噬菌体成分上展示的抗原的大小没有明显的大小限制。迄今为止，直至93kDa的极大抗原或者直至700kDa的大杂寡聚复合物可以在噬菌体T4上展示，如Li，Q.，Shivachandra，S.B.，Zhang，Z.and Rao，V.B.，“Assembly of the Small，Outer Capsid protein，Soc，on bacteriophage T4：anovel system for high density display of multiple large anthrax toxins andforeign proteins on phage capsid”in J.Mol.Biol，370：1006-1019(2007)以及Fokine，A.，Bowman，V.D.，Battisti，A.J.，Li，Q.，Chipman，P.R.，Rao，V.B.and Rossmann，M.G.，“Cryo-electron microscopy study of bacteriophage T4displaying anthrax toxin proteins”in Virology，367：422-427(2007)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

实施例

通过下文各个实施例进一步描述本发明。 

实施例1 

根据本发明的一个实施方案制备含有葡糖神经酰胺和结合的T4噬菌体的脂质体。图6是脂质体的电子显微镜照片。 

实施例2 

根据本发明的一个实施方案制备大的多层脂质体。图7是这些脂质体之一的电子显微镜照片。 

实施例3 

T4噬菌体与实施例2的大的多层脂质体结合形成复合物。图8是该复合物的电子显微镜照片。 

实施例4 

制备含有葡糖脑苷脂的脂质体的一些不同配制品以捕获展示HIV抗原及加载DNA的纳米颗粒T4噬菌体。此外，将HIV包膜抗原掺入结合所述纳米颗粒的脂质体中。所述脂质体-T4配制品应激发强免疫应答，如图11所示。 

实施例5 

荧光标记的T4用荧光染料标记T4噬菌体。先前使用Alexa 

染料标记登革病毒、减毒的黄热病毒以及照射的依波拉病毒的方法用于标记T4(见下文)。标记的T4感染性的保持通过体外噬斑测定法证实。将荧光标记的T4与用不同浓度糖脂(葡糖脑苷脂、半乳糖脑苷脂和乳糖脑苷脂)工程化的多层或者显微流态化的单层脂质体置于结合测定中。 

预期糖脂作为噬菌体T4附着受体，因此提供结合特异性。所述脂质体还含有强力佐剂脂质A。将不同浓度的标记的T4与每种脂质体配制品一起保温。通过低速离心除去未结合的噬菌体。沉淀含有结合脂质体的T4。使用流式细胞计量术、ELISA和Biacore分析获得含有糖脂的脂质体与T4结合的定量数据。含有糖脂的脂质体与T4之间的直接相互作用在用磷钨酸负染色之后通过电子显微镜观测。 

实施例6 

HIV包膜蛋白和脂质体配制品使用共焦荧光显微镜检验抗原呈递细胞(原代细胞以及细胞系)中抗原-T4-糖脂-脂质体复合物的细胞内交通。在小鼠和兔中评估该复合物的免疫原性。展示的抗原包括HIV包膜蛋白。 

中和抗体通过在HIV-1领域广泛使用的两种测定法评估。第一种测定法是PBMC测定，见Brown B.K.，Darden，J.M.，Tovanabutra，S.，Oblander，T.，Frost，J.，Sanders-Buell，E.，deSouza，M.S.，Birx，D.L.，McCutchan，F.E.，andPolonis，V.R.，“Biologic and genetic characterization f a panel of 60 humanimmunodeficiency virus type 1 isolate，representing clades A，B，C，D，CRF01_AE，and CRF02_AG，for the development and assessment of candidatevaccines”，in Journal of Virology，79：6089-6101(2005)，Brown，B.K.，Karasavvas，N.，Beck，Z.，Matyas，G.R.，Birx，D.L.，Polonis，V.R.，and Alving，C.R.，“Monoclonal antibodies to phosphatidylinositol phosphate neutralizehuman immunodeficiency virus type 1：role of phosphate-binding subsites”inJournal of Virology，81：2087-2091(2007)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。简而言之，在这个测定中，将血清或者血浆样品与预定的HIV病毒稀释液保温，然后加入得自HIV-1阴性供体的植物凝集素刺激的PBMC。在保温过夜后，加入细胞并再培养4-6天。通过p24捕获ELISA确定培养上清中存在的p24的量。第二种测定是TZM-bl假病毒测定，见Binley，J.M.et al.，“Comprehensive cross-clade neutralization analysis of a panel of anti-human immunodeficiency virus type 1 monoclonal antibodies”in Journal of Virology，78：13232-13252(2004)、Brown，B.K.，Karasavvas，N.，Beck，Z.，Matyas，G.R.，Birx，D.L.，Polonis，V.R.，and Alving，C.R.，“Monoclonal antibodies to phosphatidylinositol phosphate neutralize humanimmunodeficiency virus type 1：role of phosphate-binding subsites”in Journalof Virology，81：2087-2091(2007)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。TZM-b1(也称作JC-53BL)是一种HeLa细胞系。在这个测定中，将克隆的HIV-1包膜基因与缺陷的HIV-1基因组主链(SG3)共转染，产生在靶细胞内能单循环感染的病毒颗粒，荧光素酶在这个测定中是读出数值(readout)。评估总抗体、细胞和粘膜免疫应答包括抗原特异性-ELISA、ELISPOT、细胞内细胞因子染色、淋巴细胞增殖及细胞毒性T-细胞测定以确定对抗这些纳米颗粒复合物的免疫应答的范围。 

实施例7 

结合T4的抗原使HIV蛋白与T4噬菌体壳体结合，使用与Rao在2005年10月3日申请的发明名称为“Methods and compositions comprisingbacteriophage nanoparticles”的美国专利申请No.2005/0226892中所述相似的方法进行，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

实施例8 

脂质体的制备通过标准方法制备含有不同浓度(0-150μg/μmole磷脂)糖脂(葡糖脑苷脂，半乳糖脑苷脂和乳糖脑苷脂)的多层WRAIR脂质体(DMPC：DMPG：胆固醇与脂质A)，所述标准方法在Wassef，N.M.，Alving，C.R.，Richards，R.L.，“Liposomes as carriers for vaccines”in Immuno.Methods，4，217-222(1994)中描述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。一旦确定最佳配制品，向所述脂质体中加入荧光脂质作为标记。使用显微流化仪(microfluidizer)制备单层脂质体。 

实施例9 

噬菌体T4的荧光标记本领域已经实现了用 

Fluor染料成功标记登革病毒、减毒的黄热病毒和照射的依波拉病毒，并且示出标记的登革病毒保留其反应性，见Palmer，D.R.，Fernandez，S.，Bisbing，J.，Peachman，K.K.，Rao，M.，Darvir，D.Gunther，V.，Burgess，T.，Kono，Y.，Padmanabhan，R.， and Sun，W.，“Restricted replication and lysosomal trafficking of Yellow Fever17D vaccine virus in human dendritic cells”in J.Gen.Virol.Jan；88(Pt1)：148-56(2007)和Peachman，K.K.，Rao，M.，Alving，C.R.，Palmer，D.R.，Sun，W.and Rothwell，S.W.，“Human Dendritic Cells and Macrophages ExhibitDifferent Intracellular Processing Pathways for Soluble andLiposome-Encapsulated Antigens”in Immunobiology，210：321-333(2005)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。使用相似方法用 

Fluor 488或594(Molecular Probes，Eugene，OR)标记噬菌体T4(1x10¹⁰pfu)。为了证实T4噬菌体标记的病毒的反应性，对标记的噬菌体进行噬斑测定。 

实施例10 

噬菌体T4结合脂质体的确定将不同浓度的标记的T4噬菌体与每种脂质体配制品一起保温，总体积100μl。在室温或者在37℃保温1小时。通过低速离心除去未结合的噬菌体。与脂质体结合的T4将沉淀，上清含有未结合的病毒和极小的脂质体。使用流式细胞计量术获得关于含有糖脂的荧光脂质体与荧光噬菌体T4结合的定量数据。 

此外，利用表面等离子共振技术，使用Biacore 2000检测T4-脂质体相互作用以确定结合亲和性，包括K_a和K_d值。两种不同的Biacore芯片L1和CM5用于共价附着含糖脂的脂质体或者展示HIV-1抗原的噬菌体T4。噬菌体T4与单层脂质体的结合通过表面等离子共振技术确定。 

实施例11 

电子显微术通过电子显微镜观测含有糖脂的脂质体与噬菌体T4之间的直接相互作用。在用磷钨酸负染色之后观测该制备物。 

实施例12 

脂质体-T4-抗原复合物的免疫原性评估.首先在小鼠、随后在兔中评估脂质体-T4-抗原(HIV蛋白和/或DNA)复合物的免疫原性。在第0、3和6周对雌性BALB/c小鼠或兔进行免疫接种。每两周取动物血样，通过ELISA分析各个血清样品的Env-特异性及T4 Hoc-特异性IgG抗体。粘膜免疫应答通过测量血清和阴道冲洗液中IgA水平而评定。仅评估兔的体液免疫。在最后一次加强后一周，对小鼠行安乐死，分离未经实验的小鼠和经免疫 的小鼠的脾和淋巴结。制备单细胞悬浮液并检测Env特异性细胞免疫应答。使用流式细胞计量仪通过CFSE标记测量脾和淋巴结细胞中的T细胞增殖。通过ELISPOT测定法测量抗原特异性细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4)产生细胞，所述测定法在Rao M，Bray M，Alving CR，Jahrling P，Matyas GR，“Induction of immune responses in mice and monkeys to Ebola virus afterimmunization with liposome-encapsulated irradiated Ebola virus：protection inmice requires CD4(+)T cells：in J.Virol.Sep；76(18)：9176-85(2002)中描述。通过流式细胞计量术测量细胞内细胞因子染色(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12)。通过标准铬释放测定法测量细胞毒性T细胞的产生，所述方法如Rao，M.，Matyas，G.M.，Vancott，T.C.，Birx，D.L.and Alving，C.R.，Immunology and Cell Biology 82：523-530(2004)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

实施例13 

实现高水平T4噬菌体结合的含有糖脂的脂质体配制品实现高水平T4噬菌体结合的含有糖脂的脂质体配制品通过如下方法制备。将溶解于9∶1氯仿∶甲醇混合物中的葡糖神经酰胺150μg/μmol磷脂与单独溶解于氯仿中的二肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻磷脂酰甘油(DMPG)、胆固醇(Avanti Polar lipids，Alabaster，AL)以1.8∶0∶2∶1.5摩尔比率组合。将溶剂溶解的脂质混合在一起，并且通过旋转蒸发除去该溶剂。干燥的脂质置于高度真空下以除去剩余溶剂。然后在冻干之前将干燥的脂质分散于水中。在与T4噬菌体组合之前，将冻干的脂质分散于磷酸盐缓冲盐水或者Tris缓冲盐水中。制备具有不同浓度葡糖神经酰胺(0、50、100和150μg/μmol磷脂)的脂质体，确定与T4噬菌体的结合。实现与T4噬菌体最大结合的葡糖神经酰胺的最佳浓度是150μg/μmol磷脂。在上述描述中，以半乳糖脑苷脂代替葡糖神经酰胺，获得不佳的T4噬菌体结合-脂质体配制品。相反，在上述描述中，以10μg/ml的脂质A(非糖脂)(List Biological Laboratories，Inc.，Campbell，CA)代替糖基神经酰胺也组成高水平T4噬菌体结合脂质体配制品。本实施例使用如下研究工作中的信息：Alving，C.R.，Shichijo，S.，Mattsby-Baltzer，I.，Richards，R.L.，Wassef，N.M.，“Preparations and use ofliposomes in immunological studies”In Liposome Technology：G.Gregoriadis， ed.，CRC Press Inc.，Boca Raton，FL，Vol.3，p.317-343(1993)和Wassef，N.M.，Alving，C.R.，Richards，R.L.，“Liposomes as carriers for vaccines”in Immuno.Methods 4，217-222(1994)，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。 

实施例14 

鉴定T4噬菌体-脂质体-糖脂结合性质T4噬菌体-脂质体-糖脂结合性质通过两种方法鉴定：(i)在电子显微镜下通过负染色直接观测T4噬菌体-脂质体复合物，(ii)通过表面等离子共振技术实时测量噬菌体T4与脂质体的结合。 

通过如下方法进行电子显微术。将野生型T4噬菌体颗粒(1×10¹⁰)与50μL的有或无葡糖神经酰胺(150μg/μmol磷脂)的含有50mM磷脂的脂质体在室温混合1小时，然后通过在7.5mL盐水中在4℃以7000rpm离心10分钟洗涤以除去未结合的噬菌体。将噬菌体T4-脂质体复合物沉淀用2％磷钨酸负染色10分钟或者用1％乙酸双氧铀负染色30秒。轻轻洗涤该沉淀，然后在Zeis 912AB电子显微镜下检验。电子显微镜学家以盲试方式评价样品。含有具有糖脂葡糖神经酰胺的脂质体的样品含有最多的T4噬菌体-脂质体-糖脂复合物(图9)，而没有葡糖神经酰胺的样品几乎没有所述复合物(图10)。对于图9中的样品，噬菌体T4与含有葡糖神经酰胺(150μg/μmol磷脂)的脂质体一起保温。对于图10，同量的噬菌体T4与没有葡糖神经酰胺的脂质体一起保温。样品用1％乙酸双氧铀负染色。 

利用Biacore 2000设备，通过表面等离子共振技术测量T4噬菌体-脂质体-糖脂结合。如上述实施例13制备脂质体。脂质体中没有或者含有脂质A或者150μg半乳糖脑苷脂(GalCer)或者150μg葡糖脑苷脂(GluCer)。所述脂质体制备物含有多层囊泡，大小为0.1微米至100微米。为了获得具有一样大小的统一脂质体制备物以及为了防止Biocore机器的孔堵塞，使用逐渐减小的滤膜将所述多层脂质体经过多次挤压循环而制备单层脂质体，直至通过颗粒分选机证实所述脂质体群统一为0.1至0.15微米。将每种单层脂质体制备物作为500mM磷脂悬浮液注射，直至在Biacore L1传感器芯片的各个流动池上捕获4000应答单位(RU，任意单位)。用Hanks Balance SaltSolution(HBS)洗涤液态表面以除去未结合的脂质体。将浓度在3.52×10¹⁰ 病毒体/ml至4.5×10¹²病毒体/ml范围的野生型噬菌体T4(90μl)或者磷酸盐缓冲盐水(阴性对照)以30μl/分钟流速注射至捕获的脂质体表面。使结合进行180秒，观测480秒解离。在注射后30秒收集数据点。从T4结合数据中减去用阴性对照获得的应答单位。图4的条形图表示三个实验的平均应答单位±S.D.。 

在图11中示出BALB/c小鼠的gp41-特异性IgG终点效价的血清水平。空心方形表示用含有葡糖神经酰胺和脂质A的脂质体与在T4噬菌体上展示的HIV抗原细胞质结构域-Hoc融合蛋白免疫的小鼠的gp41-特异性IgG终点效价。实心方形表示在不存在任何脂质体条件下用在T4噬菌体上展示的细胞质结构域-Hoc融合蛋白免疫的小鼠。分别在第4、6、7和8周分析每种情况中的各个血清样品，数值以几何平均数表示。 

尽管噬菌体T4结合含有脂质A的脂质体，但是与含有葡糖神经酰胺的脂质体的结合高3倍。观测到随着噬菌体颗粒数目增加，所述结合以剂量依赖性增加。 

实施例15 

当T4噬菌体-脂质体-糖脂复合物用于如下疫苗配制品中时是高免疫原性的，所述配制品包括与Hoc融合的以及在T4噬菌体上展示的HIV-1包膜蛋白gp41的细胞质外部结构域(COD)(2μg蛋白质每1.44×10¹²噬菌体)，存在或者不存在含有葡糖神经酰胺(150μg/μmol磷脂)和脂质A(10μg)的脂质体。在第0、3和6周用这些配制品通过肌内途径肌内免疫BALB/c小鼠，产生gp41-特异性血清IgG抗体应答，这个结果是使用酶联免疫吸附测定(ELISA)在第4、6、7和8周测量，如先前Rao，M.，Matyas，G.M.，Vancott，T.C.，Birx，D.L.and Alving，C.R，“Immunostimulatory CpG motifs induce cytotoxicT lymphocyte responses to human immunodeficiency virus type I oligomericgp140 envelope protein”in Immunology and Cell Biology，82：523-530(2004)所述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考，且使用全长gp4在ELISA测定中作为包被抗原。用含有脂质A和葡糖神经酰胺的COD-T4噬菌体-脂质体-糖脂复合物免疫的小鼠与在不存在含有葡糖神经酰胺和脂质A的脂质体的条件下用COD-T4免疫的小鼠相比诱导更高的抗原特异性IgG抗体效价(至少高一个log)。这个结果在所有时间点检测均一致，见图 11所示。 

图11示出BALB/c小鼠中gp41-特异性IgG终点效价的血清水平。空心方形表示用含有葡糖神经酰胺和脂质A的脂质体和在T4噬菌体上展示的HIV抗原细胞质结构域-Hoc融合蛋白免疫的小鼠的gp41-特异性IgG终点效价。实心方形表示在不存在任何脂质体的条件下用在T4噬菌体上展示的细胞质结构域-Hoc融合蛋白免疫的小鼠。分别在第4、6、7和8周分析每种情况中的各个血清样品，数值以几何平均数表示。 

实施例16 

初步的数据提示与单层脂质体的结合高于与多层脂质体的结合。多层脂质体如实施例13所述制备。单层脂质体如实施例14所述制备。如实施例13和14所述，将展示C-三聚体-Hoc蛋白(HIV包膜蛋白的三聚体序列)的T4噬菌体与多层脂质体或者与单层脂质体在室温保温1小时。所述三聚体重组体的构建在Sathaliyawala，T.，Rao，M.，Maclean，D.M.，Birx，D.L.，Alving，C.R.and Rao，V.B.，“Assembly of Human Immunodeficiency Virus(HIV)antigens on Bacteriophage T4：a Novel In vitro Approach To ConstructMulticomponent HIV Vaccines.J.Virology，80：7688-7698(2006)中描述，所述文献的全部内容和揭示在此并入本文作参考。洗涤复合物以除去未结合的噬菌体T4，在如上述负染色之后，在电子显微镜下检测这两种制备物。结果示出用单层脂质体检测在每个视野下有更多的噬菌体-脂质体复合物。 

图12和13示出展示HIV-C-三聚体-Hoc融合蛋白的T4噬菌体结合含有葡糖神经酰胺的单层脂质体。 

实施例17 

检验含有HIV包膜蛋白的脂质体与T4的结合特性如实施例13所述制备实现高水平T4噬菌体结合的含有糖脂的脂质体配制品。野生型T4噬菌体和展示C-三聚体HIV-1包膜蛋白的T4噬菌体的结合特性在Biacore2000上通过表面等离子共振技术测定。有或无葡糖神经酰胺的单层脂质体固定在L1芯片上。展示或者不展示C-三聚体gp41 HIV抗原的5×10¹²T4噬菌体颗粒经过捕获的脂质体。在Biacore 2000上以应答单位测量结合情况。当T4噬菌体C-三聚体gp41 HIV-抗原与含有葡糖神经酰胺的脂质体复合时，获得最高水平的结合(1250 RU)。缺乏C-三聚体抗原的野生型T4也 结合含有葡糖神经酰胺的脂质体(500 RU)。野生型T4噬菌体和展示HIV C-三聚体包膜蛋白的T4噬菌体与缺乏葡糖神经酰胺的脂质体的结合不佳(100RU)。 

本申请中引用的所有文献、专利、杂志文章及其它材料均并入本文作参考。 

尽管结合本发明的一些实施方案及参考附图对本发明进行了充分描述，但是应理解本领域技术人员可以对本发明进行各种改变和修改。除非偏离，则这种改变和修改包含在所附权利要求书限定的本发明范围内。 

Claims (15)

1.一种组合物，其包含：

基质，其中所述基质包含脂质体和葡糖缀合物；

一或多种T4噬菌体，每一种均通过葡糖缀合物与所述脂质体结合；及

与每种T4噬菌体结合的一或多种类型的抗原，

其中所述葡糖缀合物包括用于所述噬菌体结合所述脂质体的一或多个葡萄糖单位。

2.权利要求1的组合物，其中所述基质是颗粒。

3.权利要求1的组合物，其中所述基质包含佐剂。

4.权利要求1的组合物，其中存在与每种T4噬菌体结合的两或多种不同类型的抗原。

5.权利要求1的组合物，其中存在与每种噬菌体结合的Hoc和/或Soc融合蛋白。

6.权利要求5的组合物，其中每种融合蛋白均包含与Hoc或者Soc蛋白融合的外源蛋白。

7.权利要求6的组合物，其中每种外源蛋白均是抗原性的。

8.权利要求6的组合物，其中所述外源蛋白选自：白细胞介素、磷脂酶A2、内毒素、葡萄球菌肠毒素B及其它毒素、I型干扰素、II型干扰素、肿瘤坏死因子、淋巴毒素、移动抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、单核细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、血管内皮生长因子、血管生成素、转化生长因子、热休克蛋白、成纤维细胞生长因子，及其它炎症和免疫调节蛋白、癌细胞特异性抗原，以及热休克蛋白、突变体p53、酪氨酸酶、粘蛋白、自身免疫抗原，和碱性成纤维细胞生长因子，以及血管内皮生长因子和前列腺特异性抗原。

9.权利要求1的组合物，其中所述葡糖缀合物是葡糖神经酰胺。

10.权利要求1的组合物，其中所述一或多种T4噬菌体每一种均通过葡糖缀合物结合所述脂质体的外表面。

11.权利要求1的组合物，其中所述脂质体包含脂质A。

12.权利要求1的组合物，其中所述脂质体包含佐剂。

13.权利要求1的组合物，其中所述脂质体是WRAIR脂质体。

14.权利要求1的组合物，其中存在与每种T4噬菌体结合的一或多种类型的外源抗原。

15.一种制备方法，其包括如下步骤：

(a)提供一种基质，其包含脂质体并具有与所述脂质体结合的一或多种葡糖缀合物；及

(b)使一或多种T4噬菌体的每一种与所述一或多种葡糖缀合物中各自相应的葡糖缀合物结合；

其中存在与每种T4噬菌体结合的一或多种类型的抗原，以及所述葡糖缀合物包括用于所述噬菌体结合所述脂质体的一或多个葡萄糖单位。

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