具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的仪器、试剂等如下:
1.仪器
1.1AA-6800型原子吸收分光光度计,日本岛津。北京市计量局每年一次强检,厂家定期检修,每天使用前自检。
1.2Milli-Q净化水装置,密理博中国有限公司。用于实验室去离子水的制备。
1.3瑞士梅特勒十万分之一天平。用于标准物质、贮备液、血清溶液样品的准确称量;容量瓶等的内校。北京市计量局每年一次强检,每天使用前自检。
1.4Eppendorf reference移液器。每年送生产厂家校准1次,每月1次内校。
1.5小型磁力搅拌器90-1型,上海振荣科学仪器厂。
1.6血清过滤装置,滤膜孔径大小分别为0.8um,0.45um,0.2um。配有真空抽吸泵,美国HENGAO公司。
2.试剂
2.1超纯去离子水(≥18.2MΩ.cm),要有充足的水,用于试剂溶液配置和对所有玻璃器具的冲洗。
2.2血清电解质标准参考物质SRM956b水平I和II,购自美国NIST,用于室内质量控制与准确度验证。相对扩展不确定度为0.6%。
2.3葡萄糖酸镁标准物质,购自美国国家标准技术研究所(NIST),产品名称为SRM929a。用于配制镁标准溶液,使用前必须在含氧化磷的干燥器中干燥12小时,相对标准不确定度为0.027%/2。
2.4水中镁成分分析标准物质:产品名称为水中镁成分分析标准物质,购自国家标准物质中心,其在国家标准物质研究中心的编号为GBW(E)080126)(1000mg/L),相对扩展不确定度为0.5%。
2.5氧化镧,优级纯,上海化学试剂公司。
2.6氯化钠、氯化钾,分析纯,上海化学试剂公司。每千克中镁含量低于10mg。使用前在干燥器中200℃干燥4小时,并储存于含有硅胶并具有湿度指示的干燥器中冷却到室温。
2.7浓盐酸,优级纯,上海化学试剂公司。其镁含量低于10-6%。
3.试剂配制
3.1HCl,7.80mol/L,100ml:量取浓盐酸(12mol/L)65ml置于事先盛有少量去离子水的100ml容量瓶中,边加边摇动,尽量减少盐酸挥发,加入去离子水至校准刻度。
3.2HCl,1.00mol/L,100ml:量取浓盐酸(12mol/L)8.33ml,置于事先盛有少量去离子水的100ml容量瓶中,边加边摇动,尽量减少盐酸挥发,加入去离子水至校准刻度.
实施例1、血清镁标准物质I的制备及效果检测
一、血清的收集
血清标本收集自北京朝阳医院检验科,收集体检后的剩余血清,年龄20~70岁,所有血清均为无肝肾功能疾病、无溶血、无黄疸且非乳糜的血清。所有血清的收集均经过受采者的同意。血清采集方法:遵照ISO指南34(ISO Guide 34,Generalrequirements for the competence of reference material producers.)。收集血清于50ml聚乙烯密闭离心管中,75%酒精或碘酒消毒瓶体表面并密封,外观澄清透明,不加任何添加物或防腐剂。共收集5000个个体的血清,混匀,过滤,共得到混合血清约3000毫升,-80℃冰箱保存备用。
二、不同镁浓度的血清溶液样品的配制
本实验中测量混合血清中血清镁浓度是用全自动生化分析仪Synchron LX20进行的,配套原装试剂,美国贝克曼公司生产。其中血清镁检测试剂,生产批号M807634,质控血清为常规化学水平2和3,生产批号为M701602和M701603,定标液为Multi Calibrator,生产批号M603320。
将收集好的混合血清随机分为5批,每批约500ml。每天从-80℃冰箱取出一批血清,置于室温融化。然后将融化后的血清,充分混匀后,取出约0.5ml,用SynchronLX20全自动生化分析仪测定,确定混合血清的血清镁浓度(血清镁浓度值的单位名称为mmol/L)。根据测定值,通过镁添加或稀释,得到如下5种镁浓度的血清溶液样品:血清溶液样品1,镁浓度为0.60mmol/L;血清溶液样品2,镁浓度为0.90mmol/L;血清溶液样品3,镁浓度为1.20mmol/L;血清溶液样品4,镁浓度为1.50mmol/L;血清溶液样品5,镁浓度为1.80mmol/L。
镁添加的方法:结合混合血清中镁的浓度,计算确定所需混合血清的质量和所需镁添加剂的质量,再用天平称量得到所需量的混合血清和镁添加剂,将其混匀,即得到所需浓度的血清溶液样品;
稀释的方法:结合混合血清中镁的浓度,计算确定所需混合血清的质量和所需稀释剂的质量,再用天平称量得到所需量的混合血清和稀释剂,将其混匀,即得到所需浓度的血清溶液样品;
电解质溶液(即稀释剂)的组成:由终浓度为5.0mmol/L的KCl、终浓度为140.0mmol/L的NaCl和去离子水组成;所述终浓度为各物质在电解质溶液中的浓度。
电解质溶液的配制:取1个干净干燥的小烧杯,准确加入0.8120g氯化钠和0.0373g氯化钾。沿小烧杯壁缓慢加入去离子水溶解。取洁净干燥的100ml容量瓶1只,置于天平上调零,将小烧杯内的液体用玻璃棒小心转移进入容量瓶,再加入适量去离子水冲洗烧杯、玻璃棒,将冲洗烧杯和玻璃棒的去离子水转移至容量瓶,重复冲洗至少5遍,所有冲洗用的去离子水均收集于容量瓶内。注意液体不能洒到容量瓶之外。在天平上准确称量,加去离子水至100ml。颠倒6次混匀,静置5分钟,再颠倒6次。使用之前上述步骤重复2遍。配制溶液过程中室内温度控制在20℃~25℃,湿度20%~50%。
镁添加剂为水中镁成分分析标准物质。
三、血清溶液样品的过滤
将步骤二中得到的不同血清溶液样品分别放入锥形瓶中,用磁力搅拌器充分混匀1小时;混匀后的血清溶液样品依次使用孔径为0.8um滤膜、0.45um滤膜和0.2um滤膜过滤三次达到清除血清杂质和除菌的目的。将过滤好的无菌血清,将过滤好的无菌血清,取出60ml用于血清密度的测量,其余用加样枪分装到已经贴好标识的无菌聚乙烯分装管中,每管1.0ml,密封。所有的容器及过滤装置必须在120℃条件下高压灭菌;所有操作须在生物安全柜中行无菌操作。分装小管的标识包括血清镁浓度水平、小管编号、分装时间等项目。分装后的血清小管立刻放入-80℃冰箱中保存,每日监测冰箱温度情况。
四、血清溶液样品的密度测定:
1.1容量瓶体积的校正:控制室温为20℃~22℃,湿度20%-50%。根据JJG196-1990中华人民共和国国家计量检定规程校准容量瓶。将1只待校准的10ml容量瓶清洁、干燥至恒重,称重(M1);测量去离子水的温度(将去离子水置实验室1小时以上,实验室室温即为水的温度),将去离子水注入容量瓶标线处,液面凹陷底部与容量瓶刻线相平齐,称重(M2);根据去离子水的温度,查出该温度下水的密度(ρ水),计算该温度下该容量瓶实际体积为(M2-M1)/ρ水。重复上述步骤20次,计算该容量瓶实际体积均值(V)与相对标准不确定度。该容量瓶的实际体积为9.964ml,相对标准不确定度为0.034%。
1.2血清溶液样品的密度的计算:将经过体积校正的10ml容量瓶称重为M1;将血清溶液样品小心转移至容量瓶,液面凹陷底部与容量瓶刻线相平齐,称重为M3。血清溶液样品密度(ρ血清溶液样品)为:(M3-M1)/V。重复上述步骤20次,计算ρ血清溶液样品的均值与标准差。
测量血清溶液样品的密度的总不确定度是由如下不确定度构成的合成不确定度:容量瓶体积的相对标准不确定度(0.034%)、重复操作引起的不确定度、称量引起的不确定度;测量血清溶液样品的密度的相对合成标准不确定度为0.05%。
测得5种血清溶液样品的密度分别为如下:血清溶液样品1:1.024±0.001g/ml;血清溶液样品2:1.025±0.001g/ml;血清溶液样品3:1.025±0.001g/ml;血清溶液样品4:1.025±0.001g/ml;血清溶液样品5:1.025±0.001g/ml。本发明将以此密度值对镁标准物质中血清镁浓度标准值及绝对合成扩展不确定度值进行浓度单位换算。
五、冰冻混合血清溶液样品均匀性检验
均匀性是标准物质的重要属性之一,ISO Guide 35中完全按照不均匀性的不确定度来判定标准物质的不均匀性。以往的许多文献中,均匀性检验存在一些问题,如测量方法的重复性与灵敏度不够,抽样方法不合理,没有注意测量顺序,用F检验直接判定标准物质的均匀性等。虽然一般认为血清溶液样品为均匀的物质,但均匀性检验不可或缺,血清均匀性检验的主要目的是检出没有预料到的问题,例如在分装过程中受到的差异性污染,或者添加的过程造成的不均匀等。冰冻混合血清溶液样品的均匀性包括瓶间均匀性和瓶内均匀性。冰冻混合血清溶液样品溶化后为液体,从物理(热力学)的角度来看具有高度的均匀性。可以通过搅拌,使瓶内血清物质均匀,故一般不需检测瓶内均匀性。瓶间均匀性检验主要是检测制备期间可能由于未被发现的问题所产生的杂质、干扰物或异常,在这种情况下预计从瓶间均匀性研究得到的不确定度贡献很小。本发明中采用ANOVA方式检验均匀性。ANOVA方式较常用,可以得到较多的数据。ANOVA方式是抽取有代表性的样本数,每瓶重复测量2-3次。(Medical Laboratories-Particular requirement of quality andcompetence[S].International Standard,ISO 15189,2003:1-4)(MedicalLaboratories-Particular requirement of quality and competence[S].International Standard,ISO 15189,2003:21-25)。(In Vitro diagnosticmedical devices-Measurement of quantities in samples of biologicalorigin-Motrological traceability of values assigned to calibrators andcontrol materials[S].ISO/DIS 17511,2003:1-2.)。
1)抽样方法:采用微软公司Excel程序中的RAND函数随机生成0~500内的随机数字,将血清溶液编号与之相对应的血清分装管抽出,用于均匀性性检验。2)抽样数量:抽样数要对整体有足够的代表性,通常取10~30个,最典型的是20个,不能少于10个。《一级标准物质技术规范》中要求,当总瓶数少于500个时,抽取瓶数不少于15个,当总体瓶数大于500个时,抽取瓶数为25个。当候选标准物质均匀性较好时,当总瓶数少于500个时,抽取瓶数不少于10个,当总体瓶数大于500个时,抽取瓶数不少于15个。考虑到血清的均匀性较好,用上述方法分别从5种血清溶液样品中随机抽取10个血清小管,共50个小管备检。3)测量方法:均匀性检验与测量方法的精密度(重复性)密切相关,所以在最佳重复条件下测量,由同一操作者在同一实验室用同一仪器在尽可能短的时间内完成测量。每天完成1种血清溶液样品的均匀性检验,每种血清溶液样品测量10管,每管测量3次。用下述实验七中所述火焰原子吸收光谱法检测血清溶液样品中镁浓度值。4)测量顺序:均匀性检验抽样数较多时,测量时间会比较长,测量结果可能受时间的影响,按随机顺序分析所选样本以区分测量的漂移和该批样本的趋势变化。在测量过程中间隔插入质控样品。每次重复测量都按随机顺序进行。在配制标准曲线与样品稀释的过程中,为了避免蒸发,每一个血清小管在使用前要密闭。5)测量结果的数据分析:均匀性检验的数据如果出现离群值也不剔除。按ISO Guide 35的要求,用单因素方差分析法,以不均匀性的不确定度(ubb)作为评价标准物质均匀性的指标。见如下公式(4):
式中,MSamong表示组间的均方,MSwithin表示组内的均方,n表示每瓶血清溶液样品重复测量次数(本发明中,n=4),sbb表示瓶间不均匀性的标准差。sbb等同于ubb。所有数据用SPSS 11.0统计软件进行处理。
瓶间均匀性结果的判定:若ubb相对于测量不确定度(即由重复测量、标准物质、称量等引起的不确定度)可以忽略(ubb显著低于测量不确定度,两者不在同一个数量级)(Jean Pauwels,Heinz Schimmel,Andree Lamberty.Cfiteria for thecertification of internationally acceptable reference materials.ClinicalBiochemistry,1998,31(6):437-439.),则认为该标准物质均匀;若ubb在测量不确定度中是一个显著因素,则重新制备或单个定值;更多情况下ubb与测量不确定度在同一个数量级,应将ubb计入总不确定度内(Jean Pauwels,Andree Lamberty,Heinz Schimmel.Homogeneity testing of reference materials.Accred QualAssur,1998,3:51-55.),可以认为样品的均匀度是可以接受的。
异常数据的处理:应注意离散值和异常值的区别。原则上讲,异常值经验证可以被剔除,而离散值应在数据组中予以保留,不应剔出,确保在大多数情况下不确定度不被低估。因为这些值可能预示着测量过程或所抽样品存在严重问题(AdriaanMH van der Veen.Trends in the certification of reference materials.AccredQual Assur,2004,9:232-236)。补充测量一般不可接受,因为获得数据的条件已经与取得所有结果时的条件不同了。
表1、冰冻血清溶液样品1的数据
瓶号 |
结果1 |
结果2 |
结果3 |
结果4 |
均值 |
1 |
0.64 |
0.64 |
0.64 |
0.64 |
0.64 |
2 |
0.66 |
0.64 |
0.65 |
0.64 |
0.65 |
3 |
0.65 |
0.64 |
0.64 |
0.66 |
0.65 |
4 |
0.64 |
0.65 |
0.65 |
0.67 |
0.64 |
5 |
0.65 |
0.63 |
0.65 |
0.65 |
0.65 |
6 |
0.64 |
0.65 |
0.65 |
0.65 |
0.65 |
7 |
0.63 |
0.64 |
0.65 |
0.64 |
0.64 |
8 |
0.64 |
0.63 |
0.65 |
0.64 |
0.64 |
9 |
0.64 |
0.64 |
0.64 |
0.65 |
0.64 |
10 |
0.65 |
0.66 |
0.64 |
0.64 |
0.65 |
表2、冰冻血清溶液样品2数据
瓶号 |
结果1 |
结果2 |
结果3 |
结果4 |
均值 |
1 |
0.95 |
0.96 |
0.93 |
0.94 |
0.95 |
2 |
0.97 |
0.94 |
0.96 |
0.96 |
0.96 |
3 |
0.95 |
0.98 |
0.98 |
0.94 |
0.96 |
4 |
0.97 |
0.98 |
0.98 |
0.97 |
0.98 |
5 |
0.99 |
0.94 |
0.96 |
0.95 |
0.96 |
6 |
0.95 |
0.95 |
0.99 |
0.96 |
0.96 |
7 |
0.96 |
0.97 |
0.97 |
0.94 |
0.96 |
8 |
0.96 |
0.96 |
0.96 |
0.97 |
0.96 |
9 |
0.94 |
0.95 |
0.95 |
0.96 |
0.95 |
10 |
0.94 |
0.96 |
0.96 |
0.95 |
0.95 |
表3、冰冻血清溶液样品3
瓶号 |
结果1 |
结果2 |
结果3 |
结果4 |
均值 |
1 |
1.35 |
1.36 |
1.37 |
1.35 |
1.36 |
2 |
1.35 |
1.38 |
1.35 |
1.37 |
1.36 |
3 |
1.34 |
1.38 |
1.38 |
1.36 |
1.37 |
4 |
1.34 |
1.36 |
1.33 |
1.37 |
1.35 |
5 |
1.35 |
1.35 |
1.34 |
1.37 |
1.35 |
6 |
1.35 |
1.34 |
1.36 |
1.35 |
1.35 |
7 |
1.35 |
1.36 |
1.35 |
1.39 |
1.36 |
8 |
1.36 |
1.38 |
1.37 |
1.35 |
1.37 |
9 |
1.33 |
1.36 |
1.35 |
1.37 |
1.35 |
10 |
1.36 |
1.36 |
1.34 |
1.36 |
1.36 |
表4、冰冻血清溶液样品4
瓶号 |
结果1 |
结果2 |
结果3 |
结果4 |
均值 |
1 |
1.69 |
1.63 |
1.66 |
1.64 |
1.66 |
2 |
1.62 |
1.70 |
1.64 |
1.65 |
1.65 |
3 |
1.63 |
1.67 |
1.62 |
1.66 |
1.65 |
4 |
1.66 |
1.67 |
1.67 |
1.70 |
1.68 |
5 |
1.67 |
1.66 |
1.70 |
1.68 |
1.68 |
6 |
1.67 |
1.67 |
1.66 |
1.66 |
1.67 |
7 |
1.68 |
1.68 |
1.66 |
1.69 |
1.68 |
8 |
1.68 |
1.68 |
1.63 |
1.68 |
1.67 |
9 |
1.66 |
1.69 |
1.68 |
1.71 |
1.69 |
10 |
1.71 |
1.66 |
1.67 |
1.65 |
1.67 |
表5、冰冻血清溶液样品5的数据
瓶号 |
结果1 |
结果2 |
结果3 |
结果4 |
均值 |
1 |
1.96 |
1.94 |
1.90 |
1.95 |
1.94 |
2 |
1.94 |
1.92 |
1.93 |
1.94 |
1.93 |
3 |
1.96 |
1.93 |
1.95 |
1.91 |
1.94 |
4 |
1.95 |
1.93 |
1.95 |
2.01 |
1.96 |
5 |
1.94 |
1.96 |
1.96 |
1.97 |
1.96 |
6 |
1.96 |
1.94 |
1.97 |
1.93 |
1.95 |
7 |
1.97 |
1.94 |
1.96 |
1.97 |
1.96 |
8 |
1.94 |
1.94 |
1.92 |
1.91 |
1.93 |
9 |
1.94 |
1.94 |
1.95 |
1.94 |
1.94 |
10 |
1.95 |
1.95 |
1.95 |
1.95 |
1.95 |
表6、冰冻血清溶液样品1方差分析表
变异源 |
SS |
自由度 |
MS |
瓶间 |
0.001 |
9 |
7.222×10-5 |
瓶内 |
0.002 |
30 |
13.889×10-5 |
总和 |
0.003 |
39 |
|
表7、冰冻血清溶液样品2
变异源 |
SS |
自由度 |
MS |
瓶间 |
0.002 |
9 |
0.000 |
瓶内 |
0.006 |
30 |
0.000 |
总和 |
0.008 |
39 |
|
表8、冰冻血清溶液样品3
变异源 |
SS |
自由度 |
MS |
瓶间 |
0.001 |
9 |
0.000 |
瓶内 |
0.007 |
30 |
0.001 |
总和 |
0.008 |
39 |
|
表9、冰冻血清溶液样品4
变异源 |
SS |
自由度 |
MS |
瓶间 |
0.006 |
9 |
0.001 |
瓶内 |
0.015 |
30 |
0.001 |
总和 |
0.021 |
39 |
|
表10、冰冻血清溶液样品5
变异源 |
SS |
自由度 |
MS |
瓶间 |
0.005 |
9 |
0.001 |
瓶内 |
0.010 |
30 |
0.000 |
总和 |
0.015 |
39 |
|
瓶间均匀性检验结果见表1~5。血清镁浓度的单位为mmol/L。根据表1~5分别对应得出表6~10。
由表6~10的数据,根据公式(4),计算得到:冰冻血清溶液样品1瓶间不均匀性的绝对标准不确定度Sbb=((7.222×10-5-6.667×10-5)/4)1/2=1.1779×10-3mol/L;冰冻血清溶液样品2瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为0mmol/L;冰冻血清溶液样品3瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为0mmol/L;冰冻血清溶液样品4瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为0mmol/L;冰冻血清溶液样品5瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为1.581×10-2mmol/L。
上述5种冰冻血清溶液样品的相对标准不确定度如表16所示。
六、冰冻混合血清溶液样品-80℃贮存条件下稳定性检验
只有证明充分均匀之后才能进行稳定性检验。而任何样品(只要不小于均匀性检验所用的取样量)都可以认为具有代表性。对所需样品的数目没有限制,也不要求随机取样。然而,由于测量技术的重复性和精密度的影响,结果会有变化,因此应当进行重复测试。
本发明中检测在-80℃冰冻条件下保存不同时间的血清溶液样品的稳定性。
检测方法:使用下述步骤七中所述的检测方法,检测血清溶液样品中镁浓度;在同一个实验室检测冰冻混合血清溶液样品的稳定性。
检测当天将每种冰冻血清溶液样品从-80℃冰箱中各取2管,在室温下融化后(室温控制在25℃左右)充分混匀,立即检测,每管测定3次,取均值。
将步骤二中得到的未经冷冻的血清溶液样品,按照实验七中所述方法测得的镁浓度值作为稳定性检验的初始值(相当于表30中第0天);也是每种检测2管,每管测定3次。然后分别于第30天、90天、180天(冰冻当天记作第1天)分别从-80℃冰箱中取出已经经过均匀性检验的同一批冰冻混合血清溶液样品进行检测,每次检测包括SRM956b标准物质三个水平之一作为质控血清。
采用双因素方差分析(Two Way ANOVA),用SPSS11.5统计软件进行数据分析。
五种血清溶液样品在-80℃冰箱贮存0天、30天、90天、180天的血清镁浓度检测结果如表11所示。结果P=0.257>0.05,血清溶液样品中血清镁的浓度在不同的时间点上没有显著性差异,血清镁浓度在180天内是稳定的。
表11、冰冻混合血清溶液样品中血清镁稳定性检验数据(μg/g)
时间 |
血清溶液样品1 |
血清溶液样品2 |
血清溶液样品3 |
血清溶液样品4 |
血清溶液样品5 |
0天 |
14.09 |
21.20 |
29.47 |
37.69 |
43.59 |
30天 |
14.30 |
21.15 |
29.30 |
37.21 |
43.37 |
90天 |
14.19 |
21.17 |
29.38 |
37.51 |
43.48 |
180天 |
14.19 |
21.18 |
29.36 |
37.48 |
43.36 |
七、血清溶液样品中镁浓度的定值
(一)定值中使用的试剂及其配制方法如下:
1、空白工作液的组成及配制
1)空白贮备液的配制:
取1个干净干燥的小烧杯,准确加入0.8120g氯化钠和0.0373g氯化钾,沿小烧杯壁缓慢加入去离子水溶解。取洁净干燥的100ml容量瓶1只,置于天平上调零,将小烧杯内的液体用玻璃棒小心转移进入容量瓶,再加入适量去离子水冲洗烧杯、玻璃棒,将冲洗烧杯和玻璃棒的去离子水转移至容量瓶,重复冲洗至少5遍,所有冲洗用的去离子水均收集于容量瓶内。注意液体不能洒到容量瓶之外。在天平上准确称量,加去离子水至100.0000g。颠倒6次混匀,静置5分钟,再颠倒6次。使用之前上述步骤重复2遍。配制溶液过程中室内温度控制在20℃~25℃,湿度20%~50%。
空白贮备液的组成:由终浓度为0.0373g/100.0000g的KCl、终浓度为0.8120g/100.0000g的NaCl和去离子水组成;所述终浓度为各物质在空白贮备液中的浓度。
2)空白贮备液的稀释:准确称取1.0000g上述空白贮备液,精确加入稀释液至100.0000g,颠倒混匀30次,得到空白工作液。
空白工作液的组成:由终浓度为0.373mg/100.0000g的KCl、终浓度为8.12mg/100.0000g的NaCl、终浓度为0.2429g/100.0000g的氯化镧和去离子水组成;所述终浓度为各物质在空白工作液中的浓度。
2、稀释液:准确称取三氧化二镧1.630g,加入到干净的烧杯中,先沿壁缓慢加入20ml去离子水,再用移液管缓慢滴入7.80mol/L盐酸10ml,缓慢摇动小烧杯,使之溶解。将烧杯内液体转移到1000ml容量瓶中,以去离子水冲洗烧杯内壁至少5次,每次冲洗用的去离子水均收集于容量瓶中。当溶液温度达到环境温度,用去离子水定容到校准的体积,颠倒混匀30次。稀释液的组成:由终浓度为10mmol/L的氯化镧、终浓度为50mmol/L的盐酸和去离子水组成。
3、镁标准工作液的组成及配制
所述镁标准工作液在配制过程中,是通过称量质量对溶质和溶剂进行定量的,然后将所述溶质和溶剂混合,得到镁浓度单位名称为质量/质量的镁标准工作液;
所述镁标准工作液的配制方法中使用葡萄糖酸镁标准物质,所述葡萄糖酸镁标准物质购自美国国家标准技术研究所,产品名称为SRM929a。
所述镁标准工作溶液由氯化镁、氯化钠、氯化钾、氯化镧和去离子水组成;
所述氯化镁是通过加入SRM929a和盐酸反应得到的;所述氯化镧是通过加入三氧化二镧和盐酸反应得到的;
所述镁标准工作液在配制过程中,所述溶质为SRM929a、氯化钠、氯化钾和三氧化二镧;所述溶剂为去离子水。
(1)镁标准工作液1的组成及配制
镁标准工作液1的组成:由终浓度为12ug/100.0000g的镁离子、终浓度为8.12mg/100.0000g的氯化钠、终浓度为0.373mg/100.0000g的氯化钾、终浓度为0.2429g/100.0000g的氯化镧和去离子水组成;所述终浓度为各物质在镁标准工作液1中的浓度。
镁标准工作液1的配制过程:配制溶液过程中室内温度控制在20℃~25℃,湿度20%~50%。1)镁标准贮备液1的配制:向小烧杯中准确称量加入SRM929a 22.38mg。沿小烧杯壁缓慢加入1ml去离子水,再用移液器轻轻滴入浓盐酸0.1ml。待葡萄糖酸镁完全溶解后分别加入0.8120g氯化钠和0.0373g氯化钾,再加去离子水溶解,转移至100ml洁净干燥的容量瓶中,转移方法同空白贮备液的配制。加去离子水稀释至100.0000g,颠倒容量瓶30次以混匀。将容量瓶做好标记。镁标准贮备液1的组成:由终浓度为1.20mg/100.0000g的镁离子、终浓度为0.812g/100.0000g的氯化钠、终浓度为0.0373g/100.0000g的氯化钾和去离子水组成;所述终浓度为各物质在镁标准贮备液1中的浓度。2)镁标准贮备液1的稀释:准确称取1.0000g上述镁标准贮备液1,精确加入稀释液至100.0000g,颠倒混匀30次,得到镁标准工作液1。
(2)镁标准工作液2的组成及配制:
镁标准工作液2的组成及配制与镁标准工作液1完全相同。
(3)镁标准工作液3的组成及配制
镁标准工作液3的组成:由终浓度为30ug/100.0000g的镁离子、终浓度为8.12mg/100.0000g的氯化钠、终浓度为0.373mg/100.0000g的氯化钾、终浓度为0.2429g/100.0000g的氯化镧和去离子水组成;所述终浓度为各物质在镁标准工作液3中的浓度。
镁标准工作液3的配制过程:1)镁标准贮备液3的配制:方法与镁标准贮备液1的配制方法相同;不同的是加入55.95mg SRM929;镁标准贮备液3的组成:由终浓度为3.00mg/100.0000g的镁离子、终浓度为0.812g/100.0000g的氯化钠、终浓度为0.0373g/100.0000g的氯化钾和去离子水组成;所述终浓度为各物质在镁标准贮备液3中的浓度。2)镁标准贮备液3的稀释:与上述镁标准贮备液1的稀释方法相同,得到镁标准工作液3。
(4)镁标准工作液4的组成及配制
镁标准工作液4的组成:由终浓度为48ug/100.0000g的镁离子、终浓度为8.12mg/100.0000g的氯化钠、终浓度为0.373mg/100.0000g的氯化钾、终浓度为0.2429g/100.0000g的氯化镧和去离子水组成;所述终浓度为各物质在镁标准工作液4中的浓度。
镁标准工作液4的配制过程:1)镁标准贮备液4的配制:方法与镁标准贮备液1的配制方法相同;不同的是加入89.52mg SRM929;镁标准贮备液4的组成:由终浓度为4.80mg/100.0000g的镁离子、终浓度为0.812g/100.0000g的氯化钠、终浓度为0.0373g/100.0000g的氯化钾和去离子水组成;所述终浓度为各物质在镁标准贮备液4中的浓度。2)镁标准贮备液4的稀释:与上述镁标准贮备液1的稀释方法相同,得到镁标准工作液4。
(5)镁标准工作液5的组成及配制
镁标准工作液5的组成及配制与镁标准工作液4完全相同。
4、标准参考物质SRM956b-I和II的稀释:取2只洁净干燥100ml容量瓶,分别准确称取SRM956b-I和II各1.000g于容量瓶中,加稀释液至100.000g。颠倒混匀30次,标记为SRM956b-I稀释和SRM956b-II稀释。
5、血清溶液样品的稀释:准确称取血清溶液样品1.000g与容量瓶中,加稀释液至100.000g,颠倒混匀30次,得到血清溶液样品分析溶液,直接用于定值测量。另外配制平行样品溶液各一份。颠倒混匀30次。
(二)实验设计如下:
2.1定值实验室的选择:除了本发明的发明人所在实验室对所制备的标准物质进行定值,还选择能力相当的实验室协助定值。所选实验室应事先通过能力评估,证明合作者在标准物质/标准样品方面具有足够的经验和经历,参加有关的能力验证计划,能够给出符合质量要求的结果。然后将5个血清溶液样品的待定值血清溶液样品各3瓶发放给所选实验室,同时发放标准参考物质SRM956b水平I和II各1瓶。血清溶液样品及标准品在运输过程中应置于冰盒中,迅速送达该实验室,实验室接收标本后应检查血清溶液样品外观,确定没有融化,立即置于-80℃冰箱中保存待检。选定岛津国际贸易(上海)有限公司北京分析中心实验室。2.2选定实验室的定值要求:要求实验室在2天内完成定值。每天融化各待定值标准品1瓶,平行定值3次。测量待定值标准品之中穿插测SRM956b 3次。记录实验结果。并以罗氏公司的“c.fas”定值校准品作为室内质控之一。记录实验结果。2.3在试验完成后两天内收集数据。对每个实验数据,用格拉布斯法剔除可疑值。2.4汇总全部数据后,验证数据分布的正态性,在数据服从正态分布的情况下,所有数据构成一组新的测量数据。继续用格拉布斯法剔除可疑值。2.5计算出总平均值和标准差。该均值作为标准品的中间值。2.6根据单位换算公式求得5个浓度水平的血清溶液样品中血清镁浓度(mmol/L)。
(三)镁浓度标准值的定值
仪器参数设置:AA-6800型原子吸收分光光度计,空心阴极灯电流大小为8mA;单色器狭缝宽度为0.5nm;乙炔-空气火焰,乙炔流量1.9L/min,为轻度富燃火焰;燃烧器高度为7mm;采用氘灯除背景,采用手动进样。采用仪器默认延迟时间和手动连续进样模式,进样量在3~6mL/min,测定波长为285.2nm。
实验室条件:环境温度20~25℃,变化不大于3℃/h,湿度20%~50%,交流电压波动小于5%,乙炔气体纯度大于99%,排风通畅等。
(1)吸入去离子水将仪器调零。
(2)保证仪器稳定:将上述5种镁标准工作液和空白工作液用仪器重复测量,使仪器满足如下条件:1)对同一种工作液而言,每日内重复4次测量,每次测量得到的镁吸光度读数值的变异系数小于等于1.25%;2)对同一种工作液而言,不同日间测量得到的镁吸光度读数值的变异系数小于等于2%;3)空白工作液的吸光度读数小于镁浓度最低的镁标准工作液的吸光度读数的3%。期间空白和镁标准工作液以及镁标准工作液之间吸入去离子水观察读数是否为0,必要时重新调零。
(3)开始测定前,镁空心阴极灯预热30分钟,然后点火,使用空气-乙炔火焰,吸入去离子水10分钟至火焰稳定。(4)用去离子水将仪器重新调到吸光度为零。
(5)绘制工作曲线:1)吸入空白工作液、镁标准工作液1、镁标准工作液2、镁标准工作液3、镁标准工作液4和镁标准工作液5,并读取吸光度。在每个工作液之间喷一次去离子水,并保证每次喷去离子水的吸光度读数为0。2)重复步骤1);仪器根据镁标准工作液的浓度及吸光度读数,自动生成工作曲线,所述工作曲线为一元线性回归曲线,其自变量为所述镁标准工作液中镁的浓度值(ug/g),因变量为所述镁标准工作液中镁的吸光度值;
此过程中仪器应满足如下条件:1)对同一种工作液而言,每次测量得到的镁标准工作液中镁吸光度读数值的变异系数小于等于1.25%;2)对同一种工作液而言,重复测量得到的镁吸光度读数值的平均值与每次测量的实际测量值之间的偏差小于等于1.5%;3)空白工作液的吸光度读数小于镁标准工作液1(即镁浓度最低的镁标准工作液)的吸光度读数的3%;4)仪器生成的工作曲线中,R2>0.9995。
空白工作液中除了没有镁离子外,其它成分与镁标准工作液完全相同,可以排除其他成分对测定结果的影响。R值称为相关系数,在-1~1之间,表示相关的程度,绝对值越接近于1说明相关性越好。正值为正相关,负值为负相关。R值的平方R2称为确定系数,表示X变量的变化有百分之多少是由Y变量引起的。
(6)分别吸入SRM956b-I、SRM956b-II、5种血清溶液样品分析溶液(U1、U2、U3、U4、U5),检测其吸光度值,血清溶液样品分析溶液之间同样吸入去离子水观察读数是否为0,必要时重新调零。分别得到5种所述血清溶液样品分析溶液中镁的吸光度读数值。(7)重复第(5)、(6)步骤三次,共得到四组数据。(8)取每种溶液的四次测量吸光度数据的和,5种镁标准工作溶液、5种血清溶液样品分析溶液的4次吸光度数据之和分别记作∑W1、∑W2、∑W3、∑W4、∑W5、∑U1、∑U2、∑U3、∑U4、∑U5;
按下列公式计算血清溶液样品中血清镁浓度值:
其中,n为将血清溶液样品稀释为血清溶液样品分析溶液的稀释倍数,本实验中,n=100;r为测量次数,本实验中,r=4。
同样的计算方法可以得到U2、U3、U4、U5。血清溶液样品中镁浓度定值结果见表12、13。
根据表12、13,依据格拉布斯准则,分别剔除可疑数据,计算得到定值结果,如表14。测定SRM956b二个浓度水平及罗氏c.f.a.s的结果如表15,相对偏差均小于1.5%,因此认为本发明方法的赋值结果可靠。
表12、本发明的发明人所在实验室的定值结果(μg/g)
表13、岛津公司实验室定结果(μg/g)
|
测定1 |
测定2 |
均值 |
血清溶液样品1 |
14.09 |
14.42 |
14.26 |
血清溶液样品2 |
21.24 |
20.96 |
21.10 |
血清溶液样品3 |
29.09 |
29.35 |
29.22 |
血清溶液样品4 |
37.26 |
36.97 |
37.11 |
血清溶液样品5 |
43.20 |
43.31 |
43.26 |
罗氏c.fas |
27.93 |
27.73 |
27.83 |
表14、血清镁标准物质中镁浓度定值结果(μg/g)
血清 |
均值(标准值) |
标准差 |
CV(%) |
血清溶液样品1 |
14.09 |
0.23 |
1.65 |
血清溶液样品2 |
21.20 |
0.28 |
1.32 |
血清溶液样品3 |
29.47 |
0.36 |
1.23 |
血清溶液样品4 |
37.69 |
0.64 |
1.71 |
血清溶液样品5 |
43.59 |
0.37 |
0.86 |
表15、SRM956b 2个浓度水平和罗氏c.fas测定结果
血清镁 |
认定值μg/g |
均值μg/g |
标准差μg/g |
CV(%) |
相对偏差(%) |
SRM956b-I |
36.12 |
36.15 |
0.49 |
1.35 |
0.06 |
SRM956b-II |
23.58 |
23.83 |
0.15 |
0.61 |
1.05 |
罗氏c.fas |
27.90 |
27.83 |
0.07 |
0.26 |
-0.26 |
(四)镁浓度标准值的不确定度的评定
不确定度是指与测量结果相关的参数,表征可合理地赋予被测量的值的分散性。标准差或变异系数只能反映所使用的测量程序在规定的条件下的随机不确定性,还有一些因素如血清的均匀性好坏、天平的称量误差、容量器具的校准误差等都会最终影响测定结果。而这些因素造成的不确定性,是重复测量结果的标准差或变异系数所无法反映的。本研究在制备血清镁标准物质时,从血清溶液样品的收集、处理、检测到定值等进行全面质量控制,并对过程中产生的不确定度进行全面评定,使最终的血清定值能够更合理的表征被赋予值的分散程度。确定生产的标准物质/标准样品的特性值时最重要的一个方面是评定测量的不确定度。而每个测量都伴随有相应的不确定度。
4.1测量不确定度
(1)重复测量引起的不确定度。
对同一浓度血清溶液样品在不同时间按相同的条件进行多次测定即重复测定,包括批内和批间重复测定。测量值在一定范围内会出现上下波动,这与仪器自身的性能及测定的浓度水平有关,由此引入重复测定引起的不确定度。因此为了保证分析的准确性,测定前必须检查实验条件,根据所选测量方法和仪器的实际情况,设立重复测量的可接受标准;另外还需要对仪器进行维护,使仪器处于最佳状态,将由重复测量引起的不确定度降低到最小。本发明中分析5个血清溶液样品,每个血清溶液样品测定2批,每批测定3次。计算重复测量产生的不确定度。
重复测量产生的不确定度的检测方法:将每个血清溶液样品测得的6个值分别计算平均值X、标准差SD,则重复测量产生的相对不确定度为(SD/X)×100%。
重复测量的相对标准不确定度结果:血清溶液样品1:1.65%、血清溶液样品2:1.32%、血清溶液样品3:1.23%、血清溶液样品4:1.71%、血清溶液样品5:0.86%(表16)。
(2)标准溶液引起的不确定度。
镁标准工作溶液的配制采用重量法由NIST SRM929a葡萄糖酸镁标准物质配制而成,由此引入标准物质SRM929a产生的不确定度。SRM929a Mg含量为5.362%±0.027%,其相对标准不确定度为0.027%/2。
(3)称量质量引起的不确定度。
镁标准工作液的配制及血清溶液样品的稀释过程都是用称量质量的方法进行的,都要使用到天平,由此引入称量质量引起的不确定度。万分之一天平精度为0.1mg,按均匀分布计算,取 其称量不确定度为 其相对标准不确定度约为0.006%。
(4)血清溶液样品密度测量引起的不确定度,其相对标准不确定度为0.05%。
(5)血清溶液样品测量的相对合成标准不确定度(Uc(y)),见公式(3)
Uc 2(y)=(u1)2+(u2)2+(u3)2+(u4)2 (3)
其中,u1为重复测量引起的不确定度,u2为标准物质引起的不确定度,u3为称量质量引起的不确定度,u4为血清溶液样品密度测量引起的不确定度。
5种血清溶液样品镁浓度定值的相对合成标准不确定度为1.65%、1.32%、1.23%、1.71%、0.86%。
“绝对合成标准不确定度”,见公式(5)
绝对合成标准不确定度=c×Uc(y)(ug/g),(5)
式中c为血清溶液样品中镁浓度定值。
(6)血清溶液样品测量的相对扩展合成标准不确定度
按照“化学分析中不确定度的评估指南”:在大多数情况下,推荐k=2(95%置信区间),即扩展因子kp=2。
血清溶液样品测量的相对扩展合成标准不确定度=2×Uc(y);血清溶液样品测量的绝对扩展合成标准不确定度为:U95%=2×c×Uc(y)
5种血清溶液样品的绝对扩展合成标准不确定度分别为0.467、0.559、0.723、1.287、1.031μg/g。
4.2不均匀性引起的不确定度分析。
将实验五中得到的5种血清溶液样品的不均匀性的不确定度分别与实验4.1中步骤(5)所述的血清溶液样品测量的相对合成标准不确定度(简称测量不确定度)比较,结果表明:冰冻混合血清溶液样品1和5的sbb与测量不确定度在同一数量级,则将sbb计入定值的总不确定度内。冰冻混合血清溶液样品2、3、4相对于测量不确定度可以忽略,均匀性的不确定度不计入定值不确定度。基于上述结果,冰冻混合血清镁5种血清溶液样品的标准物质均匀性是可以接受的。
4.3血清溶液样品中镁浓度定值的合成标准不确定度:
(1)血清溶液样品中镁浓度定值的相对合成标准不确定度
式中,Uc为血清溶液样品中镁浓度定值的相对合成标准不确定度,Ubb=不均匀性引起的相对标准不确定度,Uchar为实验4.1中步骤(5)所述的血清溶液样品测量的相对合成标准不确定度。
确定镁浓度标准值(即定值)及其相对合成标准不确定度后的血清溶液样品即为血清镁标准物质。
血清镁标准物质中镁浓度标准值的相对合成标准不确定度结果见表16。
表16、血清镁标准物质定值相对不确定度结果(%)
(2)血清溶液样品中镁浓度标准值的绝对扩展合成标准不确定度
推荐k=2(95%置信区间),即扩展因子kp=2。
血清溶液样品中镁浓度标准值的绝对扩展合成标准不确定度=2×c×Uc(y),其中,c为血清溶液样品中镁浓度的标准值,Uc(y)为血清溶液样品中镁浓度标准值的相对合成标准不确定度。
各血清溶液样品中镁浓度标准值的绝对扩展合成标准不确定度如下:血清溶液样品1:1.655%×2×14.091=0.467(μg/g);血清溶液样品2:1.319%×2×21.200=0.559(μg/g);血清溶液样品3:1.226%×2×29.472=0.723(μg/g);血清溶液样品4:1.707%×2×37.685=1.287(μg/g);血清溶液样品5:1.182%×2×43.591=1.031(μg/g)。
八、将单位名称为ug/g的镁浓度值换算为单位名称为mmol/L的镁浓度值
根据上文测量的血清溶液样品密度,将血清镁浓度由ug/g单位换算为法定计量单位mmol/L,按照公式(2)换算。
C血清=(C/24.305)/(1/ρ)(mmol/L)(2)
C血清:血清溶液样品中镁浓度,用mmol/L表示。C:血清溶液样品中镁浓度,用ug/g表示。24.305:镁元素的原子量。ρ:血清溶液样品密度。
血清溶液样品1:镁浓度标准值为0.594mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.020mmol/L;相对扩展合成标准不确定度为3.31%,其相对合成标准不确定度为1.66%。
血清溶液样品2:镁浓度标准值为0.894mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.024mmol/L;相对扩展合成标准不确定度为2.64%,其相对合成标准不确定度为1.32%。
血清溶液样品3:镁浓度标准值为1.243mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.030mmol/L;相对扩展合成标准不确定度为2.45%,其相对合成标准不确定度为1.23%。
血清溶液样品4:镁浓度标准值为1.589mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.054mmol/L;相对扩展合成标准不确定度为3.41%,其相对合成标准不确定度为1.71%。
血清溶液样品5:镁浓度标准值为1.838mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.043mmol/L;相对扩展合成标准不确定度为2.36%,其相对合成标准不确定度为1.18%。
九、血清镁标准物质互通性研究
检测常规方法评价及其与本实施例中步骤七中方法之间相关性。用本实施例中步骤七中方法和常规方法同时测定血清样本(10例以上,分布范围较宽),对测定结果作线性回归及相关分析,如果相关系数r≥0.995,表明两种方法间有良好的相关性。挑选临床实验室常用的HITACHI、DADE、BACKMAN、OLYMPUS等生化分析系统作为常规方法,分别测量10份血清,每份血清测量三次,取均值为横坐标。本实施例中步骤七中方法同时测定该10份血清,均值为纵坐标分别描记直线。分别用常规方法和本实施例中步骤七中方法测定待认定标准品。结果表明,测量结果描记的点,分别落在上述的直线上,说明待认定标准品在常规方法与本实施例中步骤七中方法之间互通性良好。
十、溯源性
关于标准物质的溯源性(traceability),是指通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。为了能在时空上具有可比性,测量需要溯源到适当和规定的测量标准。溯源链的理想终点(即定义中的“参考标准”)是国际单位制(SI)单位的定义,但目前只有少部分检验项目可以溯源至SI单位,而多数项目只能溯源至国际约定校准物质或国际约定参考测量程序,甚至是厂家校准物和(或)测量程序。本研究基于DGKL火焰原子吸收血清镁测定参考方法的基础上进行重要改进,所研制的候选血清镁标准物质经两个权威实验室采用国际公认的参考方法的原理进行定值,由NIST SRM929a血清电解质标准物质进行血清镁量值的传递,溯源关系明确。
实施例2、血清镁标准物质II的组成及制备
一、血清的收集
方法与实施例1中所述相同。
二、不同镁浓度血清溶液样品的配制
方法与实施例1中所述相同,不同的是稀释或镁添加得到的血清溶液样品中镁的浓度不同,所用的电解质溶液的浓度不同,得到如下5种镁浓度水平不同的血清溶液样品:
血清溶液样品1:镁浓度为0.50mmol/L;血清溶液样品2:镁浓度为0.80mmol/L;血清溶液样品3:镁浓度为1.10mmol/L;血清溶液样品4:镁浓度为1.40mmol/L;血清溶液样品5:镁浓度为1.70mmol/L。
电解质溶液的组成:由终浓度为4.5mmol/L的KCl、终浓度为135.0mmol/L的NaCl和去离子水组成;所述终浓度为各物质在电解质溶液中的浓度。
三、血清溶液样品的过滤
方法与实施例1中所述相同。
四、血清溶液样品的密度测定:方法与实施例1中所述相同。
测得5个血清溶液样品的密度分别为如下:血清溶液样品1:1.023±0.001g/ml;血清溶液样品2:1.024±0.001g/ml;血清溶液样品3:1.024±0.001g/ml;血清溶液样品4:1.024±0.001g/ml;血清溶液样品5:1.024±0.001g/ml。
五、冰冻血清溶液样品均匀性检验:方法与实施例1中所述相同。
冰冻混合血清溶液样品1瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为1.216×10-3mmol/L;冰冻混合血清溶液样品2瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为1.271×10-3mmol/L;冰冻混合血清溶液样品3瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为1.527×10-3mmol/L;冰冻混合血清溶液样品4瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为1.623×10-3mmol/L;冰冻混合血清溶液样品5瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为2.114×10-3mmol/L。
换算为相对标准不确定度分别为0.24%、0.16%、0.14%、0.12%、0.13%。
将此不均匀性的不确定度分别与下述实验七中得到的测量不确定度比较,结果表明:血清溶液样品1、2、3、4、5的Sbb与测量不确定度相比,不在同一个数量级,相对于测量不确定度可以忽略。因此,认为5种血清溶液样品的均匀性良好。
六、冰冻混合血清溶液样品-80℃贮存条件下稳定性检验
检测方法:与实施例1中所述相同。结果表明,P=0.326>0.05,血清镁的浓度在不同的时间点上没有显著性差异。因此在180天内其水平是稳定的。
七、血清中镁浓度的定值
(一)定值中使用的试剂及其配制方法与实施例1中所述相同。
(二)实验设计与实施例1中所述相同。
(三)镁浓度标准值的定值:方法与实施例1中所述相同;
结果5种血清溶液样品中镁浓度的定值如表17所示:
表17、血清镁标准物质中镁浓度标准值的最终定值结果(μg/g)
血清 |
均值 |
标准差 |
CV(%) |
血清溶液样品1 |
12.13 |
0.17 |
1.40 |
血清溶液样品2 |
19.16 |
0.28 |
1.45 |
血清溶液样品3 |
26.44 |
0.27 |
1.02 |
血清溶液样品4 |
33.76 |
0.37 |
1.11 |
血清溶液样品5 |
40.97 |
0.35 |
0.85 |
(四)定值不确定度
4.1测量不确定度
(1)重复测量引起的不确定度:方法与实施例1中所述相同。
重复测量产生的每种血清溶液样品的相对标准不确定度结果:血清溶液样品1:1.40%、血清溶液样品2:1.45%、血清溶液样品3:1.02%、血清溶液样品4:1.11%、血清溶液样品5:0.85%。
(2)标准物质引起的不确定度:与实施例1中所述相同,其相对标准不确定度为0.027%/2。
(3)称量质量引起的不确定度:与实施例1中所述相同,其相对标准不确定度约为0.006%。
(4)血清溶液样品密度测量引起的不确定度:与实施例1中所述相同,其相对合成标准不确定度为0.05%。
(5)血清溶液样品测量的相对合成标准不确定度:计算方法与实施例1中所述相同;结果:血清溶液样品1:1.40%、血清溶液样品2:1.45%、血清溶液样品3:1.02%、血清溶液样品4:1.11%、血清溶液样品5:0.85%。
血清溶液样品测量的绝对合成标准不确定度:计算方法与实施例1中所述相同。
(6)血清溶液样品测量的相对扩展合成标准不确定度:计算方法与实施例1中所述相同。
血清溶液样品测量的绝对扩展合成标准不确定度为:计算方法与实施例1中所述相同。
5种血清溶液样品的绝对扩展合成标准不确定度分别为0.34、0.56、0.54、0.75、0.70μg/g。
4.2不均匀性引起的不确定度分析。
5种血清溶液样品的瓶间不均匀性的不确定度如本实施例中实验五中所述。血清溶液样品1、2、3、4、5的ubb不计入血清溶液样品中镁浓度标准值的总不确定度。
4.3血清溶液样品中镁浓度标准值的合成标准不确定度:
(1)血清溶液样品中镁浓度标准值的相对合成标准不确定度:计算方法与实施例1中所述相同。
结果,5种血清溶液样品中镁浓度标准值的相对合成标准不确定度分别为1.40%、1.45%、1.02%、1.11%、0.85%。
(2)血清溶液样品中镁浓度标准值的绝对扩展合成标准不确定度:计算方法与实施例1中所述相同。
结果,5个不同水平的血清溶液样品的绝对扩展合成标准不确定度分别为0.34、0.56、0.54、0.75、0.70μg/g。
八、将单位名称为ug/g的镁浓度值换算为单位名称为mmol/L的镁浓度值
方法与实施例1中所述相同。
血清溶液样品1:镁浓度标准值为0.499mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.018mmol/L;其相对合成标准不确定度为1.400%;相对扩展合成标准不确定度为2.802%。
血清溶液样品2:镁浓度标准值为0.788mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.023mmol/L;其相对合成标准不确定度为1.45%;相对扩展合成标准不确定度为2.90%。
血清溶液样品3:镁浓度标准值为1.088mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.025mmol/L;其相对合成标准不确定度为1.02%;相对扩展合成标准不确定度为2.04%。
血清溶液样品4:镁浓度标准值为1.389mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.040mmol/L;其相对合成标准不确定度为1.11%;相对扩展合成标准不确定度为2.22%。
血清溶液样品5:镁浓度标准值为1.686mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.031mmol/L;其相对合成标准不确定度为0.85%;相对扩展合成标准不确定度为1.70%。
九、血清镁候选标准物质互通性研究
血清镁标准物质没有添加血清基质中不存在的物质,如稳定剂、防腐剂、防冻液等成分,也没有对其进行特殊的处理如冻干等,血清外观、性状、透明度等均没有改变,互通性好。
十、溯源性
由NIST SRM929a血清电解质标准物质进行血清镁量值的传递,溯源关系明确。
实施例3、血清镁标准物质III的组成及制备
一、血清的收集
方法与实施例1中所述相同。
二、不同镁浓度血清溶液样品的配制
方法与实施例1中所述相同,不同的是稀释或镁添加得到的血清溶液样品中镁的浓度不同,所用的电解质溶液的浓度不同,得到如下5种镁浓度水平不同的血清溶液样品:
血清溶液样品1:镁浓度为0.80mmol/L;血清溶液样品2:镁浓度为1.10mmol/L;血清溶液样品3:镁浓度为1.40mmol/L;血清溶液样品4:镁浓度为1.70mmol/L;血清溶液样品5:镁浓度为2.00mmol/L。
电解质溶液的组成:由终浓度为5.5mmol/L的KCl、终浓度为145.0mmol/L的NaCl和去离子水组成;所述终浓度为各物质在电解质溶液中的浓度。
三、血清溶液样品的过滤
方法与实施例1中所述相同。
四、血清溶液样品的密度测定:方法与实施例1中所述相同。
测得5个血清溶液样品的密度分别为如下:血清溶液样品1:1.023±0.001g/ml;血清溶液样品2:1.024±0.001g/ml;血清溶液样品3:1.024±0.001g/ml;血清溶液样品4:1.024±0.001g/ml;血清溶液样品5:1.024±0.001g/ml。
五、冰冻混合血清均匀性检验:方法与实施例1中所述相同。
冰冻混合血清溶液样品1瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为1.277×10-3mmol/L;冰冻混合血清溶液样品2瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为1.443×10-3mmol/L;冰冻混合血清溶液样品3瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为1.979×10-3mmol/L;冰冻混合血清溶液样品4瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为2.314×10-3mmol/L;冰冻混合血清溶液样品5瓶间不均匀性的绝对标准不确定度sbb为2.923×10-3mmol/L。
将此不均匀性的不确定度分别与下述实验七中得到的测量不确定度比较,结果表明:血清溶液样品1、2、3、4和5的Sbb与测量不确定度相比,不在同一个数量级,相对于测量不确定度可以忽略,因此,认为5种血清溶液样品的均匀性良好。
六、冰冻混合血清-80℃贮存条件下稳定性检验
检测方法:与实施例1中所述相同。结果表明,P=0.326>0.05,血清镁的浓度在不同的时间点上没有显著性差异。因此在180天内其水平是稳定的。
七、血清中镁浓度的定值
(一)定值中使用的试剂及其配制方法与实施例1中所述相同。
(二)实验设计与实施例1中所述相同。
(三)镁浓度标准值的定值:方法与实施例1中所述相同;
结果5种血清溶液样品中镁浓度的标准值如表18所示:
表18、血清镁标准物质中镁浓度标准值的最终定值结果(μg/g)
血清 |
均值 |
标准差 |
CV(%) |
血清溶液样品1 |
19.47 |
0.235 |
1.21 |
血清溶液样品2 |
26.94 |
0.213 |
0.80 |
血清溶液样品3 |
34.23 |
0.285 |
0.84 |
血清溶液样品4 |
41.51 |
0.324 |
0.78 |
血清溶液样品5 |
48.58 |
0.416 |
0.86 |
(四)定值不确定度
4.1测量不确定度
(1)重复测量引起的不确定度:方法与实施例1中所述相同。
重复测量产生的每种水平血清溶液样品的相对标准不确定度结果:血清溶液样品1:1.21%、血清溶液样品2:0.80%、血清溶液样品3:0.84%、血清溶液样品4:0.78%、血清溶液样品5:0.86%。
(2)标准物质引起的不确定度:与实施例1中所述相同,其相对标准不确定度为0.027%/2。
(3)称量质量引起的不确定度:与实施例1中所述相同,其相对标准不确定度约为0.006%。
(4)血清溶液样品密度测量引起的不确定度:与实施例1中所述相同,其相对合成标准不确定度为0.05%。
(5)血清溶液样品测量的相对合成标准不确定度:计算方法与实施例1中所述相同;结果:血清溶液样品1:1.21%、血清溶液样品2:0.80%、血清溶液样品3:0.84%、血清溶液样品4:0.78%、血清溶液样品5:0.86%
血清溶液样品测量的绝对合成标准不确定度:计算方法与实施例1中所述相同。
(6)血清溶液样品测量的相对扩展合成标准不确定度:计算方法与实施例1中所述相同。
血清溶液样品测量的绝对扩展合成标准不确定度为:计算方法与实施例1中所述相同。
5种血清溶液样品的绝对扩展合成标准不确定度分别为0.47、0.43、0.57、0.65、0.83μg/g。
4.2不均匀性引起的不确定度分析。
5种血清溶液样品的瓶间不均匀性的不确定度(ubb)如本实施例中实验五中所述。血清溶液样品1、2、3、4和5的Sbb与测量不确定度相比,不在同一个数量级,相对于测量不确定度可以忽略,不计入定值不确定度。
4.3血清溶液样品中镁浓度标准值的合成标准不确定度:
(1)血清溶液样品中镁浓度标准值的相对合成标准不确定度:计算方法与实施例1中所述相同。
结果,5种血清溶液样品的定值的相对合成标准不确定度分别为1.21%、0.80%、0.84%、0.78%、0.86%。
(2)血清溶液样品中镁浓度标准值的绝对扩展合成标准不确定度:计算方法与实施例1中所述相同。
结果,5种血清溶液样品中镁浓度标准值的绝对扩展合成标准不确定度分别为血清溶液样品1:0.47μg/g;血清溶液样品2:0.43μg/g;血清溶液样品3:0.67μg/g;血清溶液样品4:0.65μg/g;血清溶液样品5:0.83μg/g。
八、将单位名称为ug/g的镁浓度值换算为单位名称为mmol/L的镁浓度值
方法与实施例1中所述相同。
将所述单位名称为质量/质量(μg/g)的镁浓度值及不确定度换算为单位名称为物质的量/体积(mmol/L)的镁浓度值及不确定度。
血清溶液样品1:镁浓度标准值为0.801mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.012mmol/L;其相对合成标准不确定度为1.21%;相对扩展合成标准不确定度为2.42%。
血清溶液样品2:镁浓度标准值为1.108mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.024mmol/L;其相对合成标准不确定度为0.80%;相对扩展合成标准不确定度为1.60%。
血清溶液样品3:镁浓度标准值为1.408mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.040mmol/L;其相对合成标准不确定度为0.84%;相对扩展合成标准不确定度为1.68%。
血清溶液样品4:镁浓度标准值为1.707mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.058mmol/L;其相对合成标准不确定度为0.78%;相对扩展合成标准不确定度为1.56%。
血清溶液样品5:镁浓度标准值为1.999mmol/L,其绝对扩展合成标准不确定度为0.080mmol/L;其相对合成标准不确定度为0.86%;相对扩展合成标准不确定度为1.72%。
九、血清镁候选标准物质互通性研究
血清镁标准物质没有添加血清基质中不存在的物质,如稳定剂、防腐剂、防冻液等成分,也没有对其进行特殊的处理如冻干等,血清外观、性状、透明度等均没有改变,互通性好。
十、溯源性
由NIST SRM929a血清电解质标准物质进行血清镁量值的传递,溯源关系明确。