CN101695301B - 一种杀灭桃褐腐菌的微乳剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杀灭桃褐腐菌的微乳剂及其制备方法。本发明的杀灭桃褐腐菌的微乳剂，由有效成分、溶剂、乳化剂、防冻剂和水组成，所述有效成分为小檗碱和水杨酸。所述溶剂优选为体积百分比95％以上的乙醇。所述乳化剂优选为吐温80。所述防冻剂优选为5％g/mL的乙二醇水溶液。本发明的制备方法为：取小檗碱和水杨酸混合，加入溶剂中，加热溶解，得到有效成分溶液；将乳化剂加入溶液中，在超声条件下溶解，水浴加热并进行搅拌，得到有效成分乳剂；将乳剂加入防冻剂中，水浴加热并进行搅拌，得到杀灭桃褐腐菌的微乳剂。本发明的微乳剂能强烈抑制桃褐腐病菌并有广谱抗菌性，同时具有稳定、高效、成本低廉的优点。

Description

一种杀灭桃褐腐菌的微乳剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种杀菌剂及其制备方法，特别是涉及一种杀灭桃褐腐菌的微乳剂及其制备方法。

背景技术

长期以来，化学农药的广泛使用，在保障农作物高产和稳产方面发挥了巨大的作用。但传统化学农药的长期大量不合理使用所造成“3R”问题，即残留(residue)、抗性(resistance)、再猖獗(resurgence)日趋严重，引起了社会的普遍关注。寻求和开发对人类健康及生态环境安全的新型农药的需求越来越迫切。与化学农药相比，生物农药通常被认为具有无公害、无污染、无残留、不易产生抗性等明显优点。

桃褐腐病是由桃褐腐菌(Monilinia fructicola)引起的，主要危害桃树的花、叶、枝梢及果实，其中以果实受害最重，为果树种植领域亟待解决的难题之一。目前普遍采用化学杀菌剂及套袋方法在花期和结果期对病菌进行杀灭和防治；由于虫伤会增加病菌侵入机会，使用化学农药灭虫也成为防治环节之一；在果实采摘之后，还需要施用化学防腐剂以防止果实腐烂。整个过程中多次大量使用化学药剂，其带来的污染之大可想而知。因而急需寻找一种可以有效杀菌防腐的生物药剂。

微乳剂是近年来很受欢迎的农药新剂型。该剂型是指在表面活性剂的增溶作用下，使不溶于或微溶于水的有机化学农药有效成分高度分散在水介质中，自发地形成“胶束”(micelle)。胶束的表面有一层表面活性剂分子，使之形成稳定的、各向同性的、透明或半透明的均相液体分散体系。与其他剂型的农药相比，微乳剂具有很大的优势。

与乳油相比，微乳剂基本不用或少用有机溶剂。乳油因大量使用甲苯、二甲苯等有机溶剂对环境的污染而受到限制。微乳剂因基本不用或较少使用有机溶剂，贮运安全，无易燃易爆之虑，使用后也不存在环境污染。微乳剂的田间药效比乳油高5％～10％，刺激性、臭味减轻；贮运稳定性好；没有易沉淀、结块以及粘度增大、流动性差的缺点，对作物的安全性也较高。

与水剂、可溶性液剂相比，微乳剂适用于很多水溶性低的农药有效成分。水剂只适用于很少一些水溶性高的有效成分，而水溶性高的有效成分更合理的剂型是水溶性固体制剂。我国用于加工水剂的原药含量一般不高，很难加工成高浓度的水剂，因而包装费用和运输费较高。且国内生产的水剂及可溶性液剂一般不添加助剂，因而影响生物活性的发挥。微乳剂加工时则要靠助剂配制，不会发生因少加助剂而影响药效的问题。

与悬浮剂相比，微乳剂可以长期放置而不发生相分离。悬浮剂的一些产品在贮存期结块严重，影响使用效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效杀灭桃褐腐菌的生物药剂。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种杀灭桃褐腐菌的微乳剂，由有效成分、溶剂、乳化剂、防冻剂和水组成，所述有效成分为小檗碱和水杨酸的组合物。

所述组合物中小檗碱和水杨酸的重量比优选为1∶2。

所述溶剂优选为体积百分比95％以上的乙醇。

所述体积百分比95％以上的乙醇的用量为每1.5g有效成分加入70-90mL。

所述溶剂为正丁醇。

所述正丁醇用量为每1.5g有效成分加入90-130mL。

所述乳化剂优选为吐温80。

所述吐温80用量为每1.5g有效成分加入15-35mL。

所述防冻剂优选为5％g/mL的乙二醇水溶液。

所述乙二醇水溶液的用量为每1.5g有效成分加入60-80mL。

所述防冻剂为5％g/mL的丙三醇水溶液。

所述丙三醇水溶液的用量为每1.5g有效成分加入80-100mL。

所述杀灭桃褐腐菌的微乳剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)取小檗碱和水杨酸混合，加入溶剂中，加热溶解，得到有效成分溶液；

(2)将乳化剂加入有效成分溶液中，在超声条件下溶解，水浴加热，同时进行搅拌，得到有效成分乳剂；

(3)将有效成分乳剂缓缓加入防冻剂中，水浴加热，同时进行搅拌，得到杀灭桃褐腐菌的微乳剂。

所述杀灭桃褐腐菌的微乳剂的组分及比例优选为：小檗碱0.5g，水杨酸1g，体积百分比95％的乙醇70-90mL，吐温80 15-35mL，5％g/mL的乙二醇水溶液60-80mL。

所述杀灭桃褐腐菌的微乳剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)取重量比为1；2的小檗碱和水杨酸混合，加入体积百分比95％的乙醇中，50-54℃加热，得到有效成分溶液；

(2)将吐温80加入得到的溶液中，在超声条件下溶解，50-54℃水浴加热，7100r/min搅拌，得到乳剂；

(3)将5g乙二醇溶于100mL水中，配制成5％g/mL乙二醇水溶液；

(4)将所述乳剂缓缓加入5％g/mL乙二醇水溶液中，50℃-54℃水浴加热，同时以7100r/min搅拌15-30min，即得到杀灭桃褐腐菌的微乳剂。

本发明的有益效果为：

1.发明人在大量筛选中药抗菌活性成分过程中，发现小檗碱(berberine)和水杨酸组合使用对桃褐腐病菌有很强的专一性抑制作用，能有效抑制孢子萌发和菌丝生长。微乳剂对桃褐腐菌的最小抑菌浓度MIC＝1/100C，即(0.5g小檗碱+1g水杨酸)/15000mL＝1mg原料药/10mL。微乳剂对桃褐腐菌的半数有效浓度EC₅₀＝1/1250C，即(0.5g小檗碱+1g水杨酸)/150*1250mL＝8μg原料药/mL。

小檗碱和水杨酸不仅能强烈抑制桃褐腐病菌(真菌)，而且具有广谱抗菌性，能广泛杀灭桃果实表面的G⁺和G^-细菌，极大降低了贮藏和运输期产品的带菌量。

2.由源自植物的小檗碱作为主要有效成分的本发明对环境无污染，具有食用安全性，可放心作为抗桃褐腐病天然农药使用。

3.微乳剂剂型具有稳定、高传递效率、安全、能够促进向动植物组织内部渗透等特点，在农药领域较之其他机型具有显着的优越性。

4.小檗碱和水杨酸价格低廉，均能适应大规模工业生产。

附图说明

图1为制备O/W型微乳剂的工艺流程图

具体实施方式

下面的具体方法可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1杀灭桃褐腐菌的微乳剂的制备

1.制备工艺的选择

本发明选用直接乳化法制备O/W型乳剂，具体工艺流程如图1所示：

把原药、助溶剂、乳化剂等混合成油相；水或部分乳化剂为水相。在微乳剂制备装置中，将水相加入油相中。特点：从开始至终点整个过程，虽然二相比例变化也是连续的，但开始时油相占主体，随着水相量的增加至50％时二相比例平衡，再继续加入水相时在体系中占主体并非是油相，而是水相。

本发明选择由无色、无味，经济环保的水占主体，其中油相由有效成分、乳化剂、溶剂组成，水相由防冻剂和水组成。

2.溶剂的选择

本发明微乳剂的主要有效成分小檗碱在常温下极难溶于水，在苯、甲苯、醚等有机溶剂中的溶解度也不高。将小檗碱与水杨酸按重量比1∶2混合(小檗碱：0.5g，水杨酸：1g)，选定95％乙醇(体积百分比)，无水乙醇，乙酸乙酯，丙三醇和正丁醇(均为分析纯)五种溶剂，在常温，加热，常温超声三种条件下溶解。所用溶剂在20mL～150mL范围内，以10mL/次增长进行实验。溶解结果参见表1：

表1有效成份在不同溶剂中的溶解情况和溶剂用量

在常温下，上述有机溶剂均不能很好的溶解有效成分。

在加热至50℃左右时，只有95％乙醇，正丁醇和无水乙醇可以溶解有效成分，而乙酸乙酯，被稀释的丙三醇均不能使有效成分溶解，而且还出现结块现象；95％乙醇，无水乙醇在70mL时全部溶解，正丁醇在90mL时全部溶解。

在常温超声的条件下，95％乙醇，正丁醇和无水乙醇可以溶解有效成分，而乙酸乙酯，被稀释的丙三醇均不能使有效成分溶解，而且在含有乙酸乙酯的样品瓶中出现了结块现象，在被稀释的丙三醇瓶中出现了气泡包裹溶质的现象。95％乙醇，无水乙醇在80mL处全部溶解，正丁醇在130mL处全部溶解。

因此，溶剂可选用95％乙醇，正丁醇和无水乙醇。由于无水乙醇的成本比乙醇高，而在相同条件下正丁醇的用量大于95％乙醇，且正丁醇有毒，故以95％乙醇作为溶剂为最佳。其最少用量为70mL溶解0.5克小檗碱及1克水杨酸。

3.乳化剂的选择

本发明微乳剂为O/W型，故选择的乳化剂的条件将以稳定且HLB(亲水疏水平衡值，Hydrophile-Lipophile Balance Number)在7～18为前提，依据所知剂型对乳化剂的要求，对环境、及市面上供求能力等方面的参考，选定了吐温80、十六醇为筛选对象。把吐温80、十六醇加入到有效成分与上述最佳溶剂的混合物中，在加热的条件下快速搅拌。

将上述选出的最佳溶剂95％乙醇与有效成分在超声条件下溶解，加入适量的乳化剂，在52℃左右的加热条件下快速搅拌后观察现象。结果见表2：

表2形成油相后现象

乳化剂	吐温80	十六醇
			用量(mL)	15mL，25mL，35mL	15mL，25mL，35mL
现象	均为澄清透明	起初溶液呈浑浊状，静置数分钟后溶液中有漂浮小颗粒

结果表明：将吐温80、十六醇加入到有效成分与上述最佳溶剂在超声条件下混合的溶液中，在加热的条件下(50℃左右)快速搅拌，吐温80的效果优于十六醇。吐温80为最佳乳化剂，其用量为15mL-35mL每0.5克小檗碱和1克水杨酸。

4.防冻剂的选择

微乳剂常用的防冻剂一般为甲醇、乙二醇和丙三醇三种，且防冻剂在微乳剂的制备中的浓度多为5％(g/mL)。由于毒性较大，本发明不采用甲醇作为防冻剂。本发明选用乙二醇与丙三醇作为实验对象，对制得微乳剂的稳定性进行下列检测和测定：

透明温度范围的测定方法：将待测微乳剂取出50mL放入250mL烧杯中，用搅拌器搅拌并在冰浴中渐渐降温。溶液出现浑浊时的温度T₁即为透明温度下限；再将试管至于水浴中，以2℃/min的速度慢慢提升，出现浑浊现象时的温度T₂即为透明温度上限。待测微乳剂的透明温度范围即为T₁～T₂。

低温稳定性的检测方法：微乳剂样品密封后置于0-5℃的冰箱中冷藏观察，7天后测定微乳剂的外观及有效成分分解率，要求样品外观澄清透明、无晶体产生，有效成分分解率＜5％则为合格。

高温稳定性的检测方法：微乳剂的高温稳定性包含物理稳定和化学稳定两种含义。按照国家标准中关于乳油的热贮稳定性试验条件，将微乳剂样品在54±2℃的条件下贮存14天，检测制剂的外观及有效成分分解率。要求外观保持均相透明，有效成分的分解率应不大于5％。

分解率的测定方法：利用高效液相色谱测定刚制成的微乳剂与低温放置7天后的微乳剂中的有效药物含量；分解率％＝低温放置后药物小檗碱的含量/刚制得药物中小檗碱的含量*100％。

分解率测定条件为：

流动相：0.05mol/L乙腈-磷酸二氢钾混合溶液，其中乙腈∶磷酸二氢钾＝35∶65(重量比)，用磷酸调节pH到3.0；

流速：1.0mol/min；

柱温：30℃，采用C₁₈色谱柱；

检测波长：345nm；

进样量：10μl。

1)乙二醇作为防冻剂

取两份由有效成分小檗碱和水杨酸按重量比1∶2混合的原药分别放入两个三口瓶中(或圆底烧瓶中)，并编号为1和2。分别向内加入95％乙醇，对1号瓶和2号瓶分别使用超声和水浴加热的方法使原药溶解，再向其中加入乳化剂适量(最小量，15mL每0.5克小檗碱及1克水杨酸)，放入52±2℃的水浴中用搅拌器快速搅拌，待充分混合后，将其缓缓倒入已配置好的水相中，水相由乙二醇和水组成。将其放入52±2℃的水浴中用搅拌器快速搅拌(7100r/min)充分混合，即得微乳剂。

两种制备方法的配方及结果如下：

表3利用常温下超声溶解有效成分的微乳剂配方

1号实验现象及结果：常温下澄清透明，上无浮油下无沉淀。静置24h，无任何变化。

低温稳定性试验(0-5℃)：7天后，制剂外观无任何变化，分解率＜5％。

高温稳定性试验(52±2℃)：14天后，制剂外观无任何变化，分解率＜5％。

透明温度范围：-7～105℃。

表4利用加热溶解有效成分的微乳剂配方

2号实验现象及结果：常温下澄清透明，上无浮油下无沉淀。静置24h，无任何变化。

低温稳定性试验(0-5℃)：7天后，析出白色结晶。

高温稳定性试验(52±2℃)：14天后，溶液仍为澄清透明液体，分解率＜5％。

透明温度范围：-7～105℃。

若2号实验中将溶剂的量增加10mL/次，在加到80mL后低温稳定性试验才能合格，这样2号实验与1号实验的实验用量一样，但2号实验从溶解，搅拌，形成温度、所需要的时间要比1号实验所用的长，从经济观点考虑1号实验略优于2号。但两种试验方法均可形成微乳剂。

2)丙三醇作为防冻剂

取两份由小檗碱和水杨酸按重量比1∶2混合的原药分别放入两个三口瓶中(或圆底烧瓶中)，并编号为3和4。分别向内加入95％乙醇，对3号瓶和4号瓶分别使用超声和水浴加热的方法使原药溶解，再向其中加入乳化剂适量(最小量，15mL每0.5克小檗碱及1克水杨酸)，放入52±2℃的水浴中用搅拌器快速搅拌，待充分混合后，将其缓缓倒入已配置好的水相中，水相由丙三醇和水组成。将其放入52±2℃的水浴中用搅拌器快速搅拌充分混合，即得微乳剂。

两种制备方法的配方及结果如下：

表5利用常温下超声溶解有效成分的微乳剂配方

3号实验现象及结果：常温下呈半透明状态。静置24h，呈半透明状态。

低温稳定性试验(0-5℃)：5天后，析出白色结晶。

高温稳定性试验(52±2℃)：14天后，溶液仍为澄清透明液体，分解率＜5％。

透明温度范围：-7～105℃。

表6利用加热溶解有效成分的微乳剂配方

4号实验现象及结果：常温下呈半透明状态。静置24h，无任何变化。

低温稳定性试验(0-5℃)：7天后，析出白色结晶。

高温稳定性试验(52±2℃)：14天后，溶液仍为澄清透明液体，分解率＜5％。

透明温度范围：-7～105℃。

若4号实验中将溶剂的量增加10mL/次，在加到100mL后低温稳定性试验才能合格。

结果表明：1、2和4号实验都可制成微乳剂，但1号实验用量少，制备工艺简单，成本低廉，在这三者中尤为突出，故冷冻剂将选用乙二醇水溶液为最佳，最少用量为60mL。

实施例2微乳剂的质量检测

选取以下参数制备成待测微乳剂供后述质量检测实验测试：

溶剂：95％乙醇，用量为75mL；

溶解加热温度为50℃；

乳化剂：吐温80，用量为15mL；

乳化搅拌加热温度为50℃，搅拌时间为25min；

防冻剂：5％(g/mL)乙二醇水溶液，用量60mL。

1.透明温度范围的测定

检测方法如前所述，检测结果为：待测微乳剂的透明温度范围为-7～105℃。

2.乳液稳定性检测

参考农药乳油的国家标准规定的乳液稳定性的测试方法进行。按上述待测微乳剂配方配出样品，按照342mg/L加水稀释，于30℃下静置30min，保持透明状态，无油状物悬浮或固体物沉淀，并能与水以任何比例混合，视为乳液稳定。不符合要求的组分予以淘汰。

1)外观检测

检测方法：将待测微乳剂放进合适容器中，在室温下观察并记录现象，静置数天后再次观察现象并记录结果。

检测结果：

(1)即时结果：微乳剂在常温下为透明黄色、有良好流动性的液体，无任何沉淀或漂浮物。

(2)两个月后：仍为澄清透明黄色液体，无任何漂浮物或析出物。

2)乳化稳定性能检测

检测方法：待微乳成型后马上从容器中用注射器取出0.1mL的微乳剂，放入三角烧瓶中，加入蒸馏水，使微乳剂稀释1000倍，常温放置，观察现象并记录结果，带常温放置24h后，再次观察现象并记录结果。

检测结果：即时结果和静置24小时后观察结果相同，微乳剂为澄清透明黄色液体，无任何漂浮物或析出物。

3)低温稳定性检测

检测方法如前所述。

检测结果：微乳剂无任何变化，7天后依然澄清透明，且分解率＜5％，符合微乳剂质量要求。

4)高温稳定性检测

检测方法如前所述。

检测结果：微乳剂在14天后仍然澄清透明，无任何漂浮物或析出物，分解率＜5％。

3.微乳剂抑菌试验

通过微乳剂对桃褐腐菌的最小抑菌浓度(MIC)测定及微乳剂对桃褐腐菌的半数有效浓度(EC₅₀)测定验证植物源农药微乳剂的实用性。

1)微乳剂对桃褐腐菌的最小抑菌浓度(MIC)测定

测定方法：

PDA培养基的制备：将去皮马铃薯切成小块，称取100g，加水煮沸30min，过滤取滤汁，然后加入10g葡萄糖，加水至500mL，再加入10g琼脂粉煮沸使其完全溶解，自然pH值。

不同浓度微乳液的配制：设微乳剂原始浓度为C，即(0.5g小檗碱+1g水杨酸)/150mL＝10mg原料药/mL。量取10mL浓度为C的微乳液，通过0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，采用十倍稀释法，用移液枪吸取1mL的该浓度微乳液，加入9mL的无菌水中，得1/10C浓度的溶液，依次十倍稀释分别得到1/100C、1/1000C、1/10000C的溶液。

将已配制的PDA培养基分装在6个100mL的三角瓶中，每瓶装54mL，121℃高温灭菌。

在无菌条件下取不同浓度的微乳液6mL，分别与已灭菌的54mL培养基混合，分别得到60mL带药终浓度为1/10C、1/100C、1/1000C、1/10000C、1/100000C的培养基，以加6mL无菌水为空白对照。每个浓度重复6次。培养基凝固后待用。

采用生长速率法，在无菌条件下，用孔径为6mm的打孔器取已培养好的桃褐腐菌的菌落边缘生长旺盛的菌块，倒置放在培养基平板中央，27℃恒温培养。采用十字交叉法，用游标卡尺测量菌落直径。

测定结果：

经84h恒温培养后，部分培养皿内有菌体生长，部分无菌体生长，不同浓度的微乳液对桃褐腐菌的抑制作用不同。具体结果如表7所示，“-”为培养基上未见菌生长；“+”为可见菌生长。

表7不同浓度的微乳液对桃褐腐菌的MIC测定

由表7可知，微乳剂对桃褐腐菌的MIC＝1/100C，即(0.5g小檗碱+1g水杨酸)/15000mL＝1mg原料药/10mL。

2)微乳剂对桃褐腐菌的半数有效浓度(EC₅₀)测定

测定方法：

(1)PDA培养基的制备，具体步骤如最小抑菌浓度(MIC)测定实验中所述。

(2)不同浓度微乳液的配制：分别配浓度为1/10C、1/100C、1/150C、1/200C、1/250C、1/400C的微乳液。

将已配制的PDA培养基分装6个100mL的三角瓶中，每瓶装54mL，121℃高温灭菌。

在无菌条件下，分别将6mL不同浓度的微乳液加入54mL PDA培养基中，充分混匀，分别得到60mL带药终浓度为1/100C、1/1000C、1/1500C、1/2000C、1/2500C、1/4000C的培养基，以加6mL无菌水为空白对照。每个浓度重复6次，培养基凝固后待用。

采用生长速率法培养桃褐腐菌，具体步骤如最小抑菌浓度(MIC)测定实验中所述。

测定结果：

经过84h的恒温培养后，不同浓度微乳液内的菌块生长情况不一，可见不同浓度的微乳液对桃褐腐菌的抑制作用不同，而且随着浓度的升高抑制作用增强。具体结果如表8所示：

表8微乳剂对桃褐腐菌的抑制作用

对表8数据进行回归分析，得出微乳剂对桃褐腐菌菌丝生长的毒力，以半数有效浓度(EC₅₀)表示，如表9所示：

表9微乳剂抑制桃褐腐菌菌丝生长的毒力

如表9所示，本发明微乳剂对桃褐腐菌的半数有效浓度EC₅₀＝8μg/mL。

Claims (4)

1.一种杀灭桃褐腐菌的微乳剂，由有效成分、溶剂、乳化剂、防冻剂和水组成，其特征在于：所述有效成分为小檗碱和水杨酸的组合物，小檗碱和水杨酸的重量比为1∶2；

所述溶剂为体积百分比95％以上的乙醇，用量为每1.5g有效成分加入70-90mL；

所述乳化剂为吐温80，用量为每1.5g有效成分加入15-35mL；

所述防冻剂为5％g/mL的乙二醇水溶液，用量为每1.5g有效成分加入60-80mL。

2.一种杀灭桃褐腐菌的微乳剂，其特征在于，所述杀灭桃褐腐菌的微乳剂的组分及比例为：小檗碱0.5g，水杨酸1g，体积百分比95％的乙醇70-90mL，吐温8015-35mL，5％g/mL的乙二醇水溶液60-80mL。

3.权利要求1或2所述杀灭桃褐腐菌的微乳剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取小檗碱和水杨酸混合，加入溶剂中，加热溶解，得到有效成分溶液；

(2)将乳化剂加入有效成分溶液中，在超声条件下溶解，水浴加热，同时进行搅拌，得到有效成分乳剂；

(3)将有效成分乳剂缓缓加入防冻剂中，水浴加热，同时进行搅拌，得到杀灭桃褐腐菌的微乳剂。

4.权利要求2所述杀灭桃褐腐菌的微乳剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取重量比为1∶2的小檗碱和水杨酸混合，加入体积百分比95％的乙醇中，50-54℃加热，得到有效成分溶液；

(2)将吐温80加入得到的溶液中，在超声条件下溶解，50-54℃水浴加热，7100r/min搅拌，得到乳剂；

(3)将5g乙二醇溶于100mL水中，配制成5％g/mL乙二醇水溶液；

(4)将所述乳剂缓缓加入5％g/mL乙二醇水溶液中，50℃-54℃水浴加热，同时以7100r/min搅拌15-30min，即得到杀灭桃褐腐菌的微乳剂。

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