CN101693670A

CN101693670A - 苯甲酸氮芥衍生物及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN101693670A
Application number: CN200910036290A
Authority: CN
Inventors: 朱海亮; 郑庆忠; 程魁; 焦庆才
Original assignee: NANJING UNIVERSITY CHINA MEDICINE TOWN R&D CENTER
Current assignee: NANJING UNIVERSITY CHINA MEDICINE TOWN R&D CENTER
Priority date: 2009-10-10
Filing date: 2009-10-10
Publication date: 2010-04-14

Abstract

一类苯甲酸氮芥衍生物，它有如下通式：

式中：R¹为：

4-CH₃-C₆H₅、4-CH₃O-C₆H₅、4-CH(CH₃)₂-C₆H₅、4-F-C₆H₅、4-Cl-C₆H₅、4-Br-C₆H₅、4-NO₂-C₆H₅、2-F-C₆H₅、2-Cl-C₆H₅、2-Br-C₆H₅、正丁基、叔丁基、正十二烷基，R²为：H；或者R¹为CH₃-，R²为C₆H₅-；或者R¹，R²都为正丙基、正丁基。本发明的苯甲酸氮芥衍生物对人体口腔上表皮癌细胞株(KB)和人白血病细胞株(K562)有明显的抑制作用，因此本发明的苯甲酸氮芥衍生物可以在制备抗肿瘤药物中应用。本发明公开了其制法。

Description

苯甲酸氮芥衍生物及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及苯甲酸氮芥衍生物及其制备方法与作为抗癌药物的应用。

背景技术

目前治疗恶性肿瘤的药物有多类化合物，如氮芥类、嘧啶类、铂类、卟啉类等。在各种抗肿瘤药物中，氮芥类化合物是使用较早而又重要的一类抗肿瘤药，在肿瘤的治疗中占有重要的地位。

氮芥类抗肿瘤药物是β-氯乙胺类化合物的总称，包括单β-氯乙胺类和双β-氯乙胺类等。氮芥类化合物作为重要的一类抗肿瘤药物，已有多种用临床。纵观其结构，氮芥类抗肿瘤化合物一般分为两部分：烷基化部分和载体部分。烷基化部分是抗肿瘤活性的功基，载体部分可以用以改善该类药物在体内的吸收、分布药动学性质，从而影响药物的毒性、选择性和抗肿瘤活性。因此选用不同载体的氮芥类药物设计具有重要的意义。

氮芥与苯环相连时称为芳香氮芥，芳香氮芥类药物广泛应用于临床，如苯丁酸氮芥、美法仑等。目前使用的芳香氮芥类抗肿瘤药物中，虽然有较高的烷化效率，但毒性较大。

苯甲酸氮芥毒性相对较小，是最早作为氮芥类的抗体导向酶前药疗法药物之一，而且近几年有报道苯甲酸氮芥衍生物如CMDA和CJS1050活性较好，其结构如下：

并且，一般认为酰胺的引入有望降低药物的毒性。将酰胺引入氮芥中制得酰胺氮芥，可望降低氮芥类药物毒性。本发明将苯甲酸氮芥分子中引入酰胺，制备的苯甲酸氮芥衍生物，对人白血病细胞(K562)和人体口腔上表皮癌细胞(KB)有明显的抑制作用，而且毒性较小，因此苯甲酸氮芥衍生物作为很有潜力的抗肿瘤药物的前景十分值得关注。随着对氮芥类药物研究的不断深入，在对氮芥抗肿瘤作用机制不断了解的基础上进行有效的结构改造与修饰和分子设计，将会有越来越多的高效、低毒的氮芥类抗肿瘤药物用于临床，造福人类。

发明内容

本发明的目的在于提供一类苯甲酸氮芥衍生物以及它们的制备方法与用途。

本发明的技术方案如下：

一类苯甲酸氮芥衍生物，其特征是它有如下通式：

式中：R¹为：

4-CH₃-C₆H₄-、4-CH₃O-C₆H₄-、4-CH(CH₃)₂-C₆H₄-、4-F-C₆H₄-、4-Cl-C₆H₄-、4-Br-C₆H₄-、4-NO₂-C₆H₄-、2-F-C₆H₄-、2-Cl-C₆H₄-、2-Br-C₆H₄-、正丁基、叔丁基或正十二烷基，

R²为：H；

或者R¹为CH₃-，R²为C₆H₅-；

或者R¹和R²都为正丙基或正丁基。

一种制备上述的苯甲酸氮芥衍生物的方法，其特征是它由下列步骤组成：

步骤1.取1mmol苯甲酸氮芥溶于12mL二氯甲烷中，室温搅拌下加入1mmol N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)加完后搅拌10min。

步骤2.在步骤1得到的混合物中分别加入1mmol相应的脂肪胺或芳香胺或3-氨丙基吗啉和0.5mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)室温搅拌或回流反应20-24h。

步骤3.将步骤2得到的反应混合物过滤，用二氯甲烷洗涤滤饼，合并有机相，减压蒸除溶剂，以乙酸乙酯-石油醚(V∶V＝1∶3-1∶8)为洗脱液，硅胶柱色谱分离纯化得到本发明的苯甲酸氮芥衍生物。

本发明的苯甲酸氮芥衍生物对人白血病细胞(K562)和人体口腔上表皮癌细胞(KB)有明显的抑制作用，因此本发明的苯甲酸氮芥衍生物可以应用于制备抗肿瘤药物。

具体实施方式

通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

实施例一：N-丁基-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物1)的制备

取1mmol苯甲酸氮芥(参见Chemical Biology & Drug Design，2007，70(3)，216-226；化学试剂，2004，26(3)，183-184方法制备得到苯甲酸氮芥)溶于12mL二氯甲烷中，室温搅拌下加入1mmol N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)加完后搅拌10min，然后分别加入1mmol正丁胺和0.5mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)室温搅拌24h。过滤，二氯甲烷洗涤滤饼(10mL×3)，合并有机相，减压蒸除溶剂，乙酸乙酯-石油醚(V∶V＝1∶3-1∶8)为洗脱液，硅胶柱分离，减压蒸除溶剂，得目标化合物。白色粉末，产率为85％.M.p.：52-54℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：0.95(t，J＝7.3Hz，3H)；1.36-1.46(m，2H)；1.54-1.63(m，2H)；3.39-3.46(m，2H)；3.67(t，J＝6.6Hz，4H)；3.77(t，J＝6.6Hz，4H)；6.07(s，1H)；6.66(d，J＝8.8Hz，2H)；7.69(d，J＝8.8Hz，2H).MS(ESI)：318.3(C₁₅H₂₂Cl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₅H₂₂Cl₂N₂O：C，56.79；H，6.99；N，8.83％；Found：C，56.68；H，6.90；N，8.94％.

实施例二：N-叔丁基-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物2)的制备

制备方法同实施例一。以叔丁基胺代替正丁胺，得目标化合物。白色粉末，产率为80％.M.p.：141-143℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：1.28(s，9H)；3.63(t，J＝6.6Hz，4H)；3.76(t，J＝6.6Hz，4H)；5.83(s，1H)；6.68(d，J＝8.9Hz，2H)；7.70(d，J＝8.9Hz，2H)；MS(ESI)：318.3(C₁₅H₂₂Cl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd forC₁₅H₂₂Cl₂N₂O：C，56.79；H，6.99；N，8.83％；Found：C，56.88；H，6.72；N，8.70％.

实施例三：N-环戊基-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物3)的制备

制备方法同实施例二。以环戊基胺代替正丁胺，得目标化合物。白色粉末，产率为81％.M.p.：84-86℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：1.67-1.69(m，4H)；1.70-1.73(m，4H)；3.64(t，J＝6.8Hz，4H)；3.78(t，J＝6.8Hz，4H)；4.33-4.45(m，1H)；5.90(s，1H)；6.67(d，J＝8.9Hz，2H)；7.68(d，J＝8.9Hz，2H).MS(ESI)：330.3(C₁₆H₂₂Cl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₆H₂₂Cl₂N₂O：C，58.36；H，6.73；N，8.51％；Found：C，58.19；H，6.58；N，8.64％.

实施例四：N，N-二正丙基-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物4)的制备

制备方法同实施例二。以二正丙胺代替正丁胺，得目标化合物。白色粉末，产率为78％.M.p.：88-90℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：0.92(t，J＝7.3Hz，6H)；1.36-1.46(m，4H)；3.56(t，J＝6.6Hz，4H)；3.68(t，J＝6.6Hz，4H)；3.78(t，J＝6.6Hz，4H)；6.65(d，J＝8.9Hz，2H)；7.68(d，J＝8.9Hz，2H).MS(ESI)：346.3(C₁₇H₂₆Cl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₇H₂₆Cl₂N₂O：C，59.13；H，7.59；N，8.11％；Found：C，59.02；H，7.40；N，8.32％.

实施例五：N，N-二正丁基-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物5)的制备

制备方法同实施例一。以二正丁胺代替正丁胺，得目标化合物。白色粉末，产率为76％.M.p.：91-93℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：0.95(t，J＝7.3Hz，6H)；1.33-1.49(m，8H)；3.56(t，J＝6.6Hz，4H)；3.68(t，J＝6.6Hz，4H)；3.78(t，J＝6.6Hz，4H)；6.66(d，J＝9.0Hz，2H)；7.67(d，J＝9.0Hz，2H).MS(ESI)：374.4(C₁₉H₃₀Cl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₉H₃₀Cl₂N₂O：C，61.12；H，8.10；N，7.50％；Found：C，61.31；H，7.97；N，7.32％.

实施例六：N-正十二烷基-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物6)的制备

制备方法同实施例一。以正十二胺代替正丁胺，得目标化合物。白色粉末，产率为75％.M.p.：60-62℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：0.90(t，J＝7.2Hz，3H)；1.19-1.31(m，18H)；1.41-1.48(m，2H)；3.12-3.16(m，2H)；3.67(t，J＝6.6Hz，4H)；3.81(t，J＝6.7Hz，4H)；5.96(s，1H)；6.70(d，J＝8.9Hz，2H)；7.71(d，J＝8.8Hz，2H).MS(ESI)：430.5(C₂₃H₃₈Cl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₂₃H₃₈Cl₂N₂O：C，64.32；H，8.92；N，6.52％；Found：C，64.51；H，8.73；N，6.34％.

实施例七：N-(3-吗啉基丙基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物7)的制备

制备方法同实施例一。以氨丙基吗啉代替正丁胺，以回流反应24h代替常温搅拌24h，得到目标化合物。白色粉末，产率为61％.M.p.：93-95℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：1.68-1.71(m，2H)；2.33-2.36(t，J＝6.6Hz，4H)；2.44-2.46(m，2H)；3.36-3.39(m，2H)；3.62-3.69(m，12H)；6.26(s，1H)；6.67(d，J＝8.8Hz，2H)；7.37(d，J＝8.8Hz，2H).MS(ESI)：389.3(C₁₈H₂₇Cl₂N₃O₂，[M+H]⁺).Anal.Calcd forC₁₈H₂₇Cl₂N₃O₂：C，55.67；H，7.01；N，10.82％；Found：C，55.79；H，7.21；N，10.63％.

实施例八：N-(4-甲基苯基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物8)的制备

制备方法同实施例一。以对甲基苯胺代替正丁胺，得目标化合物。白色粉末，产率为86％.M.p.：130-132℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：2.32(s，3H)；3.66(t，J＝7.0Hz，4H)；3.80(t，J＝7.1Hz，4H)；6.70(d，J＝8.9Hz，2H)；7.15(d，J＝8.9Hz，2H)；7.50(d，J＝8.4Hz，2H)；7.71(s，1H)；7.79(d，J＝8.9Hz，2H).MS(ESI)：352.3(C₁₈H₂₀Cl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₈H₂₀Cl₂N₂O：C，61.55；H，5.74；N，7.97％；Found：C，61.70；H，5.60；N，7.81％.

实施例九：N-(4-甲氧基苯基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物9)的制备

制备方法同实施例一。以对甲氧基苯胺代替正丁胺，得目标化合物。白色粉末，产率为88％.M.p.：140-141℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：3.67(t，J＝6.4Hz，4H)；3.79-3.83(m，7H)；6.72(d，J＝7.2Hz，2H)；6.90(d，J＝7.2Hz，2H)；7.52(d，J＝9.0Hz，2H)；7.59(s，1H)；7.79(d，J＝9.0Hz，2H).MS(ESI)：368.3(C₁₈H₂₀Cl₂N₂O₂，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₈H₂₀Cl₂N₂O₂：C，58.86；H，5.49；N，7.63％；Found：C，58.67；H，5.68；N，7.81％.

实施例十：N-(4-异丙基苯基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物10)的制备

制备方法同实施例一。以4-异丙基苯胺代替正丁胺，得目标化合物。白色粉末，产率为84％.M.p.：130-131℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：1.22(d，J＝6.9Hz，6H)；2.84-2.89(m，1H)；3.67(t，J＝6.6Hz，4H)；3.81(t，J＝6.6Hz，4H)；6.73(d，J＝9.0Hz，2H)；7.22(d，J＝9.0Hz，2H)；7.53(d，J＝9.0Hz，2H)；7.63(s，1H)；7.80(d，J＝9.1Hz，2H).MS(ESI)：380.3(C₂₀H₂₄Cl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd forC₂₀H₂₄Cl₂N₂O：C，63.33；H，6.38；N，7.39％；Found：C，63.42；H，6.49；N，7.21％.

实施例十一：N-(2-氟苯基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物11)的制备

制备方法同实施例七。以2-氟苯胺代替氨丙基吗啉，得目标化合物。白色粉末，产率为65％.M.p.：80-82℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：3.68(t，J＝6.8Hz，4H)；3.83(t，J＝6.8Hz，4H)；6.75(d，J＝9.0Hz，2H)；7.04-7.19(m，3H)；7.83(d，J＝8.9Hz，2H)；7.96(s，1H)；8.45-8.51(m，1H).MS(ESI)：356.2(C₁₇H₁₇Cl₂FN₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₇H₁₇Cl₂FN₂O：C，57.48；H，4.82；N，7.89％；Found：C，57.63；H，4.70；N，7.71％.

实施例十二：N-(2-氯苯基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物12)的制备

制备方法同实施例七。以2-氯苯胺代替氨丙基吗啉，得目标化合物。白色粉末，产率为60％.M.p.：111-113℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：3.66(t，J＝6.8Hz，4H)；3.81(t，J＝6.8Hz，4H)；6.73(d，J＝9.0Hz，2H)；7.06-7.17(m，3H)；7.84(d，J＝8.9Hz，2H)；7.88(s，1H)；8.47-8.53(m，1H).MS(ESI)：372.7(C₁₇H₁₇Cl₃N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₇H₁₇Cl₃N₂O：C，54.93；H，4.61；N，7.54％；Found：C，54.81；H，4.75；N，7.68％.

实施例十三：N-(2-溴苯基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物13)的制备

制备方法同实施例七。以2-溴苯胺代替氨丙基吗啉，得目标化合物。白色粉末，产率为58％.M.p.：104-106℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：3.68(t，J＝6.6Hz，4H)；3.82(t，J＝6.6Hz，4H)；6.74(d，J＝9.0Hz，2H)；7.07-7.20(m，3H)；7.85(d，J＝8.9Hz，2H)；7.91(s，1H)；8.46-8.53(m，1H).MS(ESI)：417.1(C₁₇H₁₇BrCl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₇H₁₇BrCl₂N₂O：C，49.07；H，4.12；N，6.73％；Found：C，49.26；H，4.32；N，6.54％.

实施例十四：N-(4-氟苯基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物14)的制备

制备方法同实施例七。以4-氟苯胺代替氨丙基吗啉，得目标化合物。白色粉末，产率为63％.M.p.：125-127℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：3.66(t，J＝6.6Hz，4H)；3.82(t，J＝6.6Hz，4H)；6.65(d，J＝8.9Hz，2H)；6.73(d，J＝8.9Hz，1H)；7.06(t，J＝8.7Hz，1H)；7.51-7.58(m，3H)；7.67(s，1H)；7.80(d，J＝9.0Hz，1H).MS(ESI)：356.2(C₁₇H₁₇Cl₂FN₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₇H₁₇Cl₂FN₂O：C，57.48；H，4.82；N，7.89％；Found：C，57.69；H，5.01；N，7.68％.

实施例十五：N-(4-氯苯基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物15)的制备

制备方法同实施例七。以4-氯苯胺代替氨丙基吗啉，得目标化合物。白色粉末，产率为54％.M.p.：116-118℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：3.66(t，J＝6.8Hz，4H)；3.80(t，J＝6.8Hz，4H)；6.68(d，J＝8.9Hz，2H)；6.73(d，J＝8.9Hz，1H)；7.02(t，J＝8.9Hz，1H)；7.49-7.56(m，3H)；7.64(s，1H)；7.73(d，J＝8.9Hz，1H).MS(ESI)：372.7(C₁₇H₁₇Cl₃N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₇H₁₇Cl₃N₂O：C，54.93；H，4.61；N，7.54％；Found：C，54.72；H，4.73；N，7.41％.

实施例十六：N-(4-溴苯基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物16)的制备

制备方法同实施例七。以4-溴苯胺代替氨丙基吗啉，得目标化合物。白色粉末，产率为51％.M.p.：120-122℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：3.65(t，J＝6.6Hz，4H)；3.80(t，J＝6.6Hz，4H)；6.69(d，J＝8.9Hz，2H)；6.77(d，J＝8.9Hz，1H)；7.10(t，J＝8.8Hz，1H)；7.55-7.62(m，3H)；7.66(s，1H)；7.83(d，J＝9.0Hz，1H).MS(ESI)：417.1(C₁₇H₁₇BrCl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₇H₁₇BrCl₂N₂O：C，49.07；H，4.12；N，6.73％；Found：C，49.25；H，4.31；N，6.56％.

实施例十七：N-(4-硝基苯基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物17)的制备

制备方法同实施例七。以4-硝基苯胺代替氨丙基吗啉，得目标化合物。白色粉末，产率为49％.M.p.：127-129℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：3.66(t，J＝6.6Hz，4H)；3.82(t，J＝6.6Hz，4H)；6.73(d，J＝9.0Hz，2H)；7.22(d，J＝9.0Hz，2H)；7.68(s，1H)；7.72(d，J＝9.0Hz，2H)；8.08(d，J＝9.0Hz，2H).MS(ESI)：383.2(C₁₇H₁₇Cl₂N₃O₃，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₇H₁₇Cl₂N₃O₃：C，53.42；H，4.48；N，10.99％；Found：C，53.25；H，4.27；N，11.19％.

实施例十八：N-苄基-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物18)的制备

制备方法同实施例七。以苄胺代替氨丙基吗啉，得目标化合物。白色粉末，产率为81％.M.p.：105-107℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：3.64(t，J＝6.6Hz，4H)；3.78(t，J＝6.6Hz，4H)；4.64(d，J＝5.7Hz，2H)；6.26(s，1H)；6.67(d，J＝9.0Hz，2H)；7.30-7.36(m，5H)；7.72(d，J＝9.0Hz，2H).MS(ESI)：352.3(C₁₈H₂₀Cl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₈H₂₀Cl₂N₂O：C，61.55；H，5.74；N，7.97％；Found：C，61.36；H，5.91；N，7.80％.

实施例十九：N-甲基-N-苯基-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物19)的制备

制备方法同实施例七。以N-甲基苯胺代替氨丙基吗啉，得目标化合物。白色粉末，产率为72％.M.p.：107-109℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：3.16(s，3H)；3.66(t，J＝7.0Hz，4H)；3.82(t，J＝7.0Hz，4H)；6.73(d，J＝8.8Hz，2H)；7.12(t，J＝7.7Hz，1H)；7.36(t，J＝8.3Hz，2H)；7.62(d，J＝8.3Hz，2H)；7.80(d，J＝8.8Hz，2H).MS(ESI)：352.3(C₁₈H₂₀Cl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₁₈H₂₀Cl₂N₂O：C，61.55；H，5.74；N，7.97％；Found：C，61.38；H，5.90；N，7.83％.

实施例二十：N-(1-萘基)-4-(二-(2-氯乙基)氨基)苯甲酰胺(化合物20)的制备

制备方法同实施例七。以1-萘胺代替氨丙基吗啉，得目标化合物。白色粉末，产率为72％.M.p.：107-109℃.¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：3.66(t，J＝6.6Hz，4H)；3.83(t，J＝6.6Hz，4H)；6.74(d，J＝8.8Hz，2H)；7.35(d，J＝8.8Hz，2H)；7.56-7.61(m，3H)；7.86(s，1H)；7.90-7.94(d，J＝8.0Hz，2H)；8.04(d，J＝8.0Hz，2H).MS(ESI)：388.3(C₂₁H₂₀Cl₂N₂O，[M+H]⁺).Anal.Calcd for C₂₁H₂₀Cl₂N₂O：C，65.12；H，5.20；N，7.23％；Found：C，65.29；H，5.35；N，7.12％.

实施例二十一：苯甲酸氮芥衍生物体外抗肿瘤活性研究

采用MTT[3-(4，5)-双甲基-2-噻唑-(2，5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定苯甲酸氮芥衍生物对人体口腔上表皮癌细胞株(KB)和人白血病细胞株(K562)的抑制率，计算IC₅₀值(μM)。

(1)培养液(每升)的配制：①悬浮细胞：RPMI-1640培养粉一袋(10.4g)，新生牛血清100ml，青霉素溶液(20万U/ml)0.5ml，链霉素溶液(20万U/ml)0.5ml，加三蒸水溶解后，用5.6％的NaHCO₃溶液调pH值至7.2-7.4，最后定容至1000ml。过滤灭菌。②贴壁细胞：同上，再加入NaHCO₃2.00g，HEPES 2.38g。

(2)D-Hanks缓冲液(每升)的配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.06g，KH₂PO₄0.06g，NaHCO₃0.35g。高压灭菌。

(3)胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0.5％胰蛋白酶液。过滤除菌。

(4)实验药液的配制：将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液，一般按实验最高浓度的10倍配制储备液。根据化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量DMSO助溶，再加三蒸水溶解。DMSO在培养液中的浓度不宜过大，加药后的每孔细胞悬液中DMSO的终浓度一般不超过0.05％-0.1％。储备液保存于-20℃冰箱中备用。

(5)人白血病细胞K562的培养：为悬浮生长细胞，常规培养于RPMI-1640培养液内(含10％小牛血清、100U/ml链霉素)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3-4天传代一次。传代时将原瓶中培养液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去原培养液，加入等量新鲜培养液，吹打均匀，移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。

(6)人体口腔上表皮癌细胞KB的培养：为贴壁生长细胞，常规培养于RPMI-1640培养液内(含10％小牛血清、100U/ml链霉素)，置37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3-4天传代一次。传代时先弃去原培养液，再用D-Hanks缓冲液洗涤；然后用0.5％胰蛋白酶消化30秒左右，加入少量新鲜培养液终止消化；吹打，使贴壁细胞从培养瓶壁上脱落下来；移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。

(7)细胞孵育：取对数生长期的2种肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为1-1.5×10⁵个ml^-1。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μl，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。培养24h后，分别按设计加入药液。

(8)加药：将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。阳性对照药物的活性按照测试样品的方法测定。

(9)存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加MTT 40μl(用D-Hanks缓冲液配成4mg/ml)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加150μl DMSO，振荡5min，使formazan结晶溶解。最后，利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度(OD值)。

抑制率的计算：细胞生长的抑制率按照下列公式计算：

生长抑制率＝(1-存活率)×100％＝[1-(OD_实验-OD_空白)/(OD_对照-OD_空 _白)]×100％(OD_实验表示测试药物组的平均光密度，OD_对照表示对照组的平均光密度，OD_空白表示对照组的平均光密度)。

半数抑制浓度(IC₅₀)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。

测得的IC₅₀见表1所示

表1本发明所列苯甲酸氮芥衍生物的对肿瘤细胞的抑制IC₅₀值(μM)

Claims

1.一类苯甲酸氮芥衍生物，其特征是它有如下通式：

式中：R¹为：

R²为：H；

或者R¹为CH₃-，R²为C₆H₅-；

或者R¹和R²都为正丙基或正丁基。

2.一种制备权利要求1所述的苯甲酸氮芥衍生物的方法，其特征是它由下列步骤组成：

3.权利要求1所述的苯甲酸氮芥衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。