CN101693109A - 预防奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的酵母葡聚糖增效灭活苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预防奶牛细菌性乳房炎的油乳剂增效灭活菌苗，它是由牛源乳房炎致病菌油乳剂灭活苗和免疫增强剂组成；其中每毫升细菌灭活苗中含有5-40mg免疫增强剂(酵母葡聚糖)。使用本发明制备的细菌增效油乳剂灭活菌苗，能有效的提高奶牛机体细胞免疫及体液免疫水平，其免疫效果优于普通的细菌性油乳剂灭活苗，可降低奶牛细菌性乳房的发病率，无毒无害，对于预防奶牛细菌性乳房炎十分有效。

Description

预防奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的酵母葡聚糖增效灭活苗

技术领域

本发明属于畜禽疫病诊断和防治技术领域，涉及一种用于预防奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的酵母葡聚糖增效油乳剂灭活苗，更具体的说是一种通过在油乳剂灭活苗中添加免疫增强剂-酵母葡聚糖，来启动和调节奶牛非特异性和特异性免疫功能的增效灭活苗及其制备方法。

背景技术

奶牛乳房炎是影响世界奶牛业发展的三大疾病之一。其主要的临床表现为奶牛乳腺组织的炎症，可引起组织损伤、纤维化，降低奶牛产奶量，影响奶的品质、营养价值和奶制品的加工，严重制约奶牛的利用年限。奶牛乳房炎的致病菌约有150多种(Harmon R，1994)，目前在许多国家金黄色葡萄球菌是最常见和最重要的奶牛乳房炎致病菌，导致的经济损失最大(Waage S and Mark R A，1999)，而且当奶牛感染金黄色葡萄球菌后很难治愈，主要原因是耐药菌株的普遍存在，以及该病原侵入乳腺组织后被炎症组织包围，抗菌药不易到达(Hebert A et al，2000；Jeffery L and SarahA，1997)，所以使用预防或治疗性菌苗防治乳房炎就成为首选，然而由于金黄色葡萄球菌存在荚膜、其致病力又由许多不同毒力因子决定等原因，制备非常有效的菌苗变得很困难。因此，研制出有效的奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎菌苗已成为世界奶牛业迫切需要解决而又十分艰巨的任务。

奶牛乳房炎(Mastitis)是乳腺受到病原微生物、物理、化学刺激所发生的一系列炎性变化，其中病原微生物感染是最主要的致病因素。乳腺组织发生炎症病变时，可引起组织损伤、纤维化，降低奶产量、奶的品质和营养价值，影响奶制品的加工，并严重影响奶牛的利用年限。奶牛乳房炎的致病菌约有150多种(Harmon R，1994)，以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，约占整个奶牛乳房炎病例的90％以上。目前，在世界许多国家金黄色葡萄球菌是最常见和最重要的乳房炎致病菌，导致的经济损失最为严重(Waage S and Mark R A，1999)。在很多牛场，金黄色葡萄球菌乳房炎在泌乳牛和非泌乳牛中流行，并可感染其他泌乳牛。而且当奶牛感染金黄色葡萄球菌后很难治愈，主要原因是抗药菌株的存在以及该病原侵入乳腺组织后被炎症组织包围，抗菌药不易到达(Hebert A et al，2000；Jeffery L and Sarah A，1997)。因此，控制金黄色葡萄球菌乳房炎最有效的方法是对奶牛进行菌苗预防接种，菌苗能够增加奶牛自体免疫应答反应，提高奶牛对金黄色葡萄球菌的抵抗力，阻止、中和、杀灭金黄色葡萄球菌，从而消除由其带来的危害，减少经济损失。

纵观奶牛乳房炎疫苗发展的历史，国外20世纪30年代已经开始进行奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎菌苗的研制，迄今已有70多年的历史，但至今仍未能提出一个彻底解决的办法；我国对此研究起步较晚，始于20世纪80年代初，在20多年研究中取得了显著的成绩，但仍未能达到彻底解决的目标。近年来，随着分子生物学的兴起、研究手段的不断进步、新技术的不断应用，亚单位菌苗、基因工程菌苗、核酸菌苗等新概念菌苗相继进入人们的视野，但是由于缺乏广泛的有效性、生产成本以及某些情况下的不稳定性，而未能广泛应用。因此，研制高效和安全的抗奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎感染的菌苗就成为研究热点。

对奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌菌苗的试验性研究在国外已经进行了数十年，在我国也已经进行了多年的研究，虽说其中取得了一些成就，但效果好、可商品化的菌苗却很少见。由Boehringer Ingelheim Animal Health公司生产的金黄色葡萄球菌Lysigin菌苗在美国已经商品化，该菌苗是由四种噬菌体型金黄色葡萄球菌(I、II、III、IV)和多种血清型的金黄色葡萄球菌菌体抗原的裂解物构成的，是一种抗原性强的多价苗。虽然它能够提高奶牛乳房炎的治愈率，但不能抵抗新的感染(Nickerson S C et al，2000)。早期菌苗是由灭活的体外培养的微生物构成的，这种菌苗能够提高金黄色葡萄球菌乳腺内感染的治愈率，同时减轻细菌感染造成的严重程度，但并不能阻止新感染的发生(GreshamH D et al，2000；Foster T J，1991；Giraudo J A，1997)。应用活的或灭活的菌体、分离的肽糖、类毒素、粘附素等制作的传统菌苗，对防治金黄色葡萄球菌乳房炎的效果并不理想，该菌苗可以降低奶牛乳房炎的发病率，但不能提供有效地保护力。考虑到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎菌苗临床应用效果一直不理想，且为了治愈该病，养殖户往往盲目和滥用药物，造成葡萄球菌抗药性日益严重，从而难以有效地控制病情，带来资金浪费，牛奶品质下降，环境污染及对人类健康构成潜在威胁等不良后果。

随着世界范围奶牛养殖业规模的扩大，国内外奶制品贸易跨区域交流日益频繁，大大增加了奶制品病原传播的机会。同时，由于现代奶牛养殖业的集约化、高密度生产方式及养殖环境的日益恶化，又常会引发养殖动物的应激反应，导致机体的免疫系统受到抑制。正是这些因素相互影响，出现了全球性的奶牛乳房炎发病频繁、流行程度日益广泛、经济损失极为巨大的局面。更为重要的是，随着生活水平的提高，消费者对于奶制品质量安全的需要日趋严格，奶制品的药残问题倍受公众关注。近年来，由于奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎菌苗效果一直不理想，养殖户多采用抗生素等药物来防治奶牛乳房炎，所以病原抗药性现象日趋严重。因此，奶牛的免疫学防治日益受到人们的重视，免疫增强剂的研究已成为当前奶牛业免疫学研究和新型药物开发的一个热点。

酵母葡聚糖是第一个被发现具有免疫活性的葡聚糖，它是啤酒酵母细胞壁多糖的提取物，主要成分是β-D-葡聚糖，它可以提高巨噬细胞的吞噬活性，促进肝脏和脾脏巨噬细。胞的增殖。随着科技的不断发展，酵母葡聚糖又被发现具有抗感染、抗肿瘤、抗辐射、促进伤口愈合和辅助生长等功能(龚炎杰，2005)，是一种重要的生物效应应答剂。免疫增强剂是指单独或同时与抗原使用均能增强机体免疫应答的物质，按其功能可以分为两大类：一类是增强动物的非特异性免疫功能；另一类是增强由菌苗诱导的特异性免疫机能(又称佐剂作用)。目前研究较多的免疫增强剂有酵母葡聚糖、左旋咪唑、黄芪多糖、海藻多糖、壳聚糖、细菌脂多糖、肽聚糖、植物活性物质和微生态制剂(益生菌)等等。

我国是酵母资源利用的大国，发酵工业特别是酿酒工业，每年都产生大量的废酵母泥，其中含有丰富的蛋白质和多糖成分。目前，多数是作为蛋白质资源而被运用到调味品和饲料工业，少数则作为废料直接排放掉，不仅其中的多糖成分未引起人们的足够重视，同时又会造成环境污染。所以，从酵母资源的综合利用方面来讲，开发利用酵母葡聚糖具有重要的经济价值和现实意义。目前，从酵母细胞壁中提取的酵母葡聚糖作为口服免疫增强剂已经商品化，其主要作为饲料添加剂应用于畜禽生产和水生动物养殖中，但是作为免疫增强剂添加到菌苗中作为注射剂，通过皮下或肌肉注射给动物尚未见报道。

本发明人开展了在奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎灭活苗中添加免疫增强剂-酵母葡聚糖的试验研究工作，旨在通过酵母葡聚糖免疫增强剂来启动和调节奶牛的非特异性免疫功能，并特异地增强金黄色葡萄球菌乳房炎灭活苗的免疫效力，最终通过奶牛自身免疫抵抗力的提高和灭活苗的免疫作用，来防止和减少奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的发生，这无疑已成为奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎防治研究的主要方向之一，具有十分重要的理论与实际意义。

发明内容

本发明的一个目的是公开了一种用于预防奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的酵母葡聚糖增效灭活菌苗。

本发明的另一个目的是公开用于预防奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的酵母葡聚糖增效灭活菌苗的制备方法。

本发明采用注射方式将含酵母葡聚糖的奶牛金黄色葡萄球菌灭活菌苗对新西兰青年兔和昆明白小鼠进行接种，通过检测菌苗免疫刺激反应，较系统的研究其对家兔细胞免疫和体液免疫的影响，以及对攻菌小鼠保护率的比较。目的旨在探索对奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎灭活菌苗免疫效果的影响，筛选出适合奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎菌苗的免疫增强剂，为日后将该菌苗应用于本体动物奶牛的研究奠定基础，并为研制出更为安全有效的奶牛金黄色葡萄球菌灭活苗提供科学的理论依据。为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：

一种用于预防奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎的油乳剂增效灭活苗，由牛源金黄色葡萄球菌灭活苗和免疫增强剂组成，其特征是：在常规牛源金黄色葡萄球菌灭活苗中每毫升添加5-40mg酵母葡聚糖免疫增强剂。

本发明提供的预防奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的酵母葡聚糖增效油乳剂灭活苗，明显提高了奶牛的非特异性免疫功能和常规奶牛金黄色葡萄球菌油乳剂灭活苗的免疫效力。

本发明所述的奶牛金黄色葡萄球菌油乳剂增效灭活苗，其中的免疫增强剂为酵母葡聚糖购自安琪酵母股份有限公司(酵母葡聚糖)；牛源金黄色葡萄球菌由天津畜牧兽医研究所兽医研究室分离于天津某奶牛场，并经本实验室细菌生物学特性鉴定为金黄色葡萄球菌。该菌株现保藏在天津畜牧兽医研究所兽医研究室。牛源金黄色葡萄球菌分离的方法属于常规分离技术，具体见实施例1的描述。

本发明所述的增效灭活苗剂型为油乳剂。

本发明进一步公开了预防奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的酵母葡聚糖油乳剂增效灭活苗制备方法，按如下的步骤进行制备：

(1)按常规方法制备油相：将注射用白油94份、司班-80 6份和硬脂酸铝2份充分混合后高压灭菌，冷却后待用。

(2)按一定比例将酵母葡聚糖准确添加至已经灭活完全的牛源金黄色葡萄球菌菌悬液中，并在菌悬液中加入3～5％的Tween-80，充分混合均匀，制成水相；

(3)按1∶3水油比例，将混有酵母葡聚糖的菌悬液缓缓加入到白油佐剂中，用胶体磨充分乳化2～3分钟，制成油乳剂灭活苗；

(4)最后进行物理性状、无菌检验以及安全性和效力检验，待检验合格后，得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎油乳剂增效灭活苗。

本发明进一步公开的预防奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的酵母葡聚糖增效油乳剂灭活苗的免疫学试验包括：增效灭活苗在增强细胞免疫和体液免疫方面的应用。特别是在提高家兔细胞免疫和体液免疫方面的应用。

同时本发明也公开了增效灭活苗在提高牛源金黄色葡萄球菌灭活苗对攻牛源金黄色葡萄球菌方面的应用。具体的试验方法及结果如下：

一、酵母葡聚糖应用于奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎油乳剂灭活苗的免疫效果试验

1试验设计

本研究首先将不同剂量的酵母葡聚糖添加到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎油乳剂灭活苗中，以健康新西兰青年兔作为试验动物，通过淋巴细胞转化试验和间接ELISA检测方法，对注射灭活苗后的新西兰青年兔细胞免疫和体液免疫水平进行检测评估，从而判断酵母葡聚糖在奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎灭活苗中的免疫增强作用。动物试验成功后，将奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎油乳剂增效灭活苗临床应用到本体动物奶牛身上，可提高常规奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎油乳剂灭活苗的免疫效力，使奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎发病率明显下降。

纵所周知，左旋咪唑是四咪唑的左旋体，1966年合成，1968年开始作为广谱驱虫药用于临床。至1971年Renoux发现左旋咪唑可增强小鼠接种布氏杆菌菌苗的免疫作用以来，人们对其免疫系统的调节作用进行了深入研究。大量试验表明：它是一种免疫调节剂，主要调节T细胞的功能，促进T细胞的前体细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞的增殖和转化成熟，使之成为功能性效应细胞。生产上许多研究者已经把它作为免疫佐剂，在注射疫苗的同时给动物口服左旋咪唑，用以增强疫苗的免疫效力，获得了很好的效果。因此，在本研究中还设置左旋咪唑灭活苗组作为对照，其目的是想通过酵母葡聚糖与左旋咪唑的在灭活苗中免疫效果的比较，来判断和评价酵母葡聚糖在灭活苗中的免疫增强作用。

本研究在家兔试验上共设置6个组别，其中根据酵母葡聚糖在灭活苗中添加量不同，设置了4个不同剂量的酵母葡聚糖灭活苗组；此外，还有普通灭活苗对照组、左旋咪唑灭活苗对照组和空白对照组。

2材料与方法

2.1材料

2.1.1试验动物  健康新西兰青年兔，天津医科大学实验动物中心提供。

2.1.2主要试剂  酵母葡聚糖(70％)(购自安琪酵母股份有限公司)

细胞培养液(RPMI1640)、Hanks液、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素、10％小牛血清、ConA、MTT、肝素钠针剂、淋巴细胞分离液、牛血清白蛋白(BSA)、3，3′，5′，5-四甲基联苯胺(均购自天津联星生物公司)；二甲基亚砜(DMSO)和酶标山羊抗兔IgG(购自sigma公司)；其他试剂均为试验室常规试剂，分析纯，按需要配制。

2.1.3主要仪器  CO₂培养箱和酶标检测仪等。

2.2方法

2.2.1试验动物分组

1、酵母葡聚糖灭活苗1组(6只)：含5mg/ml酵母葡聚糖的牛源金葡菌灭活苗；

2、酵母葡聚糖灭活苗2组(6只)：含10mg/ml酵母葡聚糖的牛源金葡菌灭活苗；

3、酵母葡聚糖灭活苗3组(6只)：含20mg/ml酵母葡聚糖的牛源金葡菌灭活苗；

4、酵母葡聚糖灭活苗4组(6只)：含40mg/ml酵母葡聚糖的牛源金葡菌灭活苗；

5、左旋咪唑灭活苗对照组(6只)：含5mg/ml左旋咪唑的牛源金葡菌灭活苗；

6、普通灭活苗对照组(6只)：牛源金葡菌灭活苗；

7、空白对照组(6只)：正常饲喂；

2.2.2试验用灭活苗制备

按照试验设计中不同组别灭活苗中酵母葡聚糖添加剂量的不同，将酵母葡聚糖准确添加至已经灭活完全的牛源金黄色葡萄球菌菌悬液中，混匀后，在菌悬液中加入3％的Tween-80，然后将菌悬液缓缓加入油佐剂中(水相∶油相＝1∶3)，进行充分乳化，待乳化检验合格后，方可使用。

2.2.3免疫程序

新西兰兔于试验前先饲喂、观察一周。动物表现一切正常后，开始正式试验，将新西兰兔随机分成7组，按照2.2.1设计对各组新西兰兔分别免疫接种不同组分的牛源金黄色葡萄球菌油乳剂灭活苗，免疫计量均为2ml，注射途径为颈背部皮下多点注射，各组别新西兰兔灭活苗含菌量均为10¹⁰cfu/ml。

2.2.4检测方法

分别于免疫接种后的第7天、14天、21天、28天、35天、42天对新西兰兔进行采血，每次采血每只新西兰兔均需要采血两份，一份为抗凝血，用于做淋巴细胞转化试验；另一份为非抗凝血，待血凝后吸取血清做间接ELISA检测。

2.2.5淋巴细胞悬液的制备

无菌兔耳采血5ml，肝素抗凝，缓缓加入到2倍体积的淋巴细胞分离液液面上，2000rpm离心15min；吸取中间层淋巴细胞至另一无菌试管中，加入4～5倍体积的Hanks液，2000rpm离心5min；倒掉Hanks液，加入5ml Tris-NH₄Cl液，2000rpm离心5min；倒掉Tris-NH₄Cl液，再次加入Hanks液，2000rpm离心5min；加入不完全RPMI1640培养液，吹散细胞，进行计数，调整细胞浓度为10⁵个/ml。

2.2.6MTT法测淋巴细胞转化率

取96孔细胞板，在不同孔中分别加入100ul ConA(RPMI1640配制，浓度为1μg/ml)，同时设不加刺激物孔，而以加入与刺激剂等体积的RPMI1640作为组内对照，每样本均设3个重复孔，然后向每孔中加入淋巴细胞悬液100μl，使每孔中培养液总体积为200μl，细胞数为10⁵个，加好后混匀，将培养板置于5％CO₂培养箱中，37℃培养淋巴细胞48h后，每孔加入10μl MTT(PBS配制，浓度为5mg/ml)，再培养3～4h后，每孔加入150μl二甲基亚砜，室温避光放置15～20min。用酶标仪测定490nm的吸光值。

2.1.2.7数据处理

试验数据以平均值±标准差(X±S)表示，经SAS软件进行统计分析，组间比较采用方差分析(ANOVA)。

3结果

3.1酵母葡聚糖灭活苗的安全性

注射灭活苗后，若新西兰兔饮水、吃料均正常，表明无全身反应；若注射部位无肿胀、破溃和硬结等异常变化，说明灭活苗未能引起局部炎症反应，副作用小，安全性能好。为了更好的了解灭活苗性状及对新西兰兔全身和局部是否会造成副反应，本试验对注射灭活苗后的新西兰兔进行了仔细的临床观察，具体试验结果(见表1)。

表1  新西兰兔注射灭活苗后饮食欲及全身、局部临床症状观察

从表1临床症状观察，各组别新西兰兔在注射灭活苗后的1～2天内均有饮食欲减退症状，但随后均恢复正常。酵母葡聚糖灭活苗1组、酵母葡聚糖灭活苗2组、普通灭活苗对照组和左旋咪唑灭活苗对照组的新西兰兔在试验过程中均没有任何异常状况。在试验进行到第三周时，酵母葡聚糖3和4组新西兰兔背部均出现不明隆起，未破溃，经细心观察发现：不明隆起并不影响新西兰兔饮食欲及一切生活习惯。随着试验周期的延长，酵母葡聚糖3组新西兰兔背部隆起逐渐变小，最后有两只消失，但酵母葡聚糖4组新西兰兔背部隆起变化不大。直到试验结束，两组新西兰兔背部隆起均未有破溃现象。在试验进程中，酵母葡聚糖四个组别新西兰兔较其他组别食欲旺盛、个体大、被毛光亮、精神状态好，尤其表现在试验后期，因为本试验需要对新西兰兔进行定期采血，所以在整个试验过程中需要严格保证新西兰兔的体况，试验初期各组别新西兰兔应用耳静脉采血都比较容易，但在试验后期就比较困难，而酵母葡聚糖组的情况比较好，在试验进程中采血均比较容易，由此可知，酵母葡聚糖确实有辅助生长的作用。

3.2淋巴细胞转化试验结果

根据试验设计，分别于试验第7d、14d、21d、28d、35d、42d对新西兰兔耳静脉采血，根据兔外周血淋巴细胞转化率判断注射灭活苗前后，新西兰兔细胞免疫水平，具体试验结果(见表2)。

表2  新西兰兔注射灭活苗前后外周血淋巴细胞转化率

3.2.1在免疫接种后第7天，四个酵母葡聚糖灭活苗组外周血淋巴细胞转化率值均高于空白对照组和普通灭活苗对照组，差异显著；但四个酵母葡聚糖灭活苗组之间差异不明显；左旋咪唑灭活苗对照组外周血淋巴细胞转化率值也都高于空白对照组和普通灭活苗对照组，差异也显著；且左旋咪唑灭活苗对照组转化率值高于其他六组。

3.2.2在免疫接种后第14天，四个酵母葡聚糖灭活苗组转化率值仍高于空白对照组和普通灭活苗对照组，差异均显著；酵母葡聚糖灭活苗1组和2组之间差异不显著，3组和4组之间差异也不显著；但是，酵母葡聚糖灭活苗3、4组转化率值高于酵母葡聚糖灭活苗1、2组，其差异显著；在此期间内，左旋咪唑灭活苗对照组转化率值仍高于其他六组。

3.2.3免疫接种后第21天结果基本同第14天，七个组之间比较均有差异。四组酵母葡聚糖灭活苗随着酵母葡聚糖剂量的增加，其外周血淋巴细胞转化率值也升高，且1、2、3、4四组之间差异显著；左旋咪唑灭活苗对照组转化率值还高于其他六组。

3.2.4免疫接种后第28天，除空白对照组外，六个灭活苗组的新西兰兔外周血淋巴细胞转化率均达到最高值。四个酵母葡聚糖灭活苗组同空白对照组、普通灭活苗对照组比较，差异十分显著，其中酵母葡聚糖灭活苗3、4组外周血淋巴细胞转化率值最高，明显高于酵母葡聚糖灭活苗1、2组，也明显高于左旋咪唑灭活苗对照组，酵母葡聚糖灭活苗1组和2组差异不显著，3组和4组差异也不显著；在此期间，左旋咪唑灭活苗对照组开始低于酵母葡聚糖灭活苗3、4组，但仍高于酵母葡聚糖灭活苗1、2组，也明显高于空白对照组和普通灭活苗对照组。

3.2.5免疫接种后第35天，除空白对照组外，六个灭活苗组的新西兰兔外周血淋巴细胞转化率值较第28天时均下降，其中四个酵母葡聚糖灭活苗组的淋巴细胞转化率下降得比较慢，左旋咪唑灭活苗对照组和普通灭活苗对照组淋巴细胞转化率下降比较快。除酵母葡聚糖灭活苗1、2组之间差异不显著外，其他组别之间比较差异均显著。酵母葡聚糖灭活苗3、4组淋巴细胞转化率值同第28天一样，仍高于左旋咪唑灭活苗对照组，酵母葡聚糖灭活苗1、2组转化率值略低于左旋咪唑灭活苗对照组。

3.2.6免疫接种后第42天，四个酵母葡聚糖灭活苗组淋巴细胞转化率值显著高于各自对应的免疫接种后第7天时的试验值，其四组之间比较差异显著。四个酵母葡聚糖灭活苗组同空白对照组和普通灭活苗对照组比较差异均显著。其2、3、4组淋巴细胞转化率值均高于左旋咪唑灭活苗对照组，而1组与左旋咪唑灭活苗对照组比较差异不显著。左旋咪唑对照组和普通菌苗对照组淋巴细胞转化率值下降明显，均接近于免疫接种后第7天的淋巴细胞转化率值。

3.3间接ELISA检测结果

根据试验设计，分别于试验第7d、14d、21d、28d、35d、42d对新西兰兔耳静脉采血，根据已经建立的间接ELISA方法检测各组新西兰兔血清抗体水平，具体试验结果见表3(经检测未注射菌苗前所有新西兰兔均为血清抗体阴性)。

从表3可以清楚的看到不同组别新西兰兔血清抗体效价在不同时间的分布情况

3.3.1在免疫接种后第7天，各组别新西兰兔血清抗体效价都比较低，各组别之间差异不显著。

3.3.2免疫接种后第14天，各组别新西兰兔血清抗体效价均有所提高，尤其酵母葡聚糖灭活苗2组和4组比较明显，其他组别差异不显著。

3.3.3随着试验继续进行，在免疫接种后第21天，各组别新西兰兔血清抗体效价仍在不断提高，左旋咪唑灭活苗组上升最快，且左旋咪唑灭活苗组、酵母葡聚糖灭活苗3组和4组差异不显著。

表3  新西兰兔注射灭活苗后血清抗体效价变化

3.3.4免疫接种后第28天，各组别新西兰兔血清抗体效价值均达到最高，酵母葡聚糖灭活苗4组高于其他组别，左旋咪唑灭活苗组、酵母葡聚糖灭活苗2组和酵母葡聚糖灭活苗3组差异不显著，酵母葡聚糖灭活苗1组血清抗体效价值较低，普通灭活苗组最低。

3.3.5免疫接种后第35天，各组别新西兰兔血清抗体效价值均有所下降，左旋咪唑灭活苗组、酵母葡聚糖灭活苗3组和酵母葡聚糖灭活苗4组差异不显著，酵母葡聚糖灭活苗1组和酵母葡聚糖灭活苗2组差异不显著。

3.3.6试验进行到免疫接种后第42天时，除普通灭活苗组新西兰兔血清抗体效价值比较低以外，其他五组新西兰兔血清抗体效价值差异均不显著。

4讨论和小结

4.1酵母葡聚糖灭活苗的安全性

酵母葡聚糖灭活苗3组和4组新西兰兔后背注射部位出现隆起，起初以为是注射部位发炎引起的化脓，后用注射器吸取其内容物，但并未吸出任何东西。在试验结束致死家兔后，才发现隆起内是未被吸收的酵母葡聚糖且很粘稠，之所以酵母葡聚糖灭活苗1组和2组新西兰兔背部没有出现隆起，应该是酵母葡聚糖添加量比较少，已被吸收；从临床现象观察，添加酵母葡聚糖组别新西兰兔，其精神状态好，被毛光亮，饮食欲增强，个体大；从这种情况看，酵母葡聚糖确实对灭活苗有促进动物生长、免疫增强作用，但是作为免疫佐剂添加到灭活苗中却要考虑到其合理用量和酵母葡聚糖的纯度。

4.2酵母葡聚糖对细胞免疫的增强作用

机体淋巴细胞转化率高低，是细胞免疫功能强弱的指标之一。本研究通过测定动物体外淋巴细胞转化率，以确定酵母葡聚糖促进细胞免疫的能力。从新西兰兔外周血淋巴细胞转化率试验结果看，酵母葡聚糖和左旋咪唑均可以提高新西兰兔外周血淋巴细胞转化率，但其作用特点有一定差异，左旋咪唑免疫增强作用出现时间比较早，约在注射菌苗1周后便表现出来，而酵母葡聚糖免疫增强作用出现时间较左旋咪唑晚1～2周，两个小剂量组(酵母葡聚糖灭活苗1组和2组)约在第21天表现出来，两个大剂量组(酵母葡聚糖灭活苗3组和4组)免疫增强作用约出现在试验第14天。但是，从试验数据来看，左旋咪唑的免疫增强作用持续时间比较短，约在注射灭活苗一个月后便迅速下降，而酵母葡聚糖则相对较长，虽然它的免疫增强作用出现在时间晚，但在维持灭活苗免疫效力、使外周血淋巴细胞转化率长时间处于较高水平方面却好于左旋咪唑，尤其在试验中后期表现明显。简而言之，通过本试验研究表明：左旋咪唑能在短时间内提高灭活苗免疫效果，促使机体尽快进入最佳免疫状态；酵母葡聚糖虽促进灭活苗免疫效果出现的时间迟一些，但维持灭活苗免疫效力的时间较长

4.3酵母葡聚糖对体液免疫的增强作用

血清抗体水平高低可说明机体体液免疫功能的强弱。从新西兰兔不同时间血清抗体效价值结果看，酵母葡聚糖和左旋咪唑均可以提高新西兰血清抗体效价，但是二者差异并不显著。在试验的前两周，灭活苗各组别新西兰兔血清抗体效价值没有差异，左旋咪唑灭活苗组也没有体现出使血清抗体水平显著上升的效果。在试验的后两周，左旋咪唑灭活苗组与酵母葡聚糖灭活苗组也几乎没有差别，但是均高于普通灭活苗组。

2.3.4小结

本试验结果表明：酵母葡聚糖和左旋咪唑对新西兰兔细胞免疫影响大，两者作用差别明显，但在体液免疫水平方面两者差别不大；同时说明：试验一中建立的牛源金黄色葡萄球菌兔血清抗体间接ELISA检测方法可以有效的检测出不同时间段由金黄色葡萄球菌感染的新西兰兔血清抗体效价值。

二、酵母葡聚糖牛源金黄色葡萄球菌乳房炎灭活苗小鼠保护性试验

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物  健康昆明系小白鼠，天津医科大学实验动物中心提供

1.1.2主要试剂  细菌培养所需的培养基和试剂，根据需要按常规配制

1.2方法

1.2.1试验动物分组

酵母葡聚糖灭活苗1组(8只)：含5mg/ml酵母葡聚糖的牛源金葡菌灭活菌苗

酵母葡聚糖灭活苗2组(8只)：含10mg/ml酵母葡聚糖的牛源金葡菌灭活菌苗

左旋咪唑灭活苗组(8只)：含5mg/ml左旋咪唑的牛源金葡菌灭活菌苗

普通灭活苗对照组(8只)：牛源金黄色葡萄球菌灭活菌苗

空白对照组(8只)：正常饲喂

1.2.2试验用菌苗制备  试验用菌苗制备同上试验

1.2.3免疫程序  体重25±5g的健康昆明系小白鼠于试验前先饲喂、观察一周。动物表现一切正常，开始正式试验，第1天对昆明系小白鼠按照各自的组别免疫牛源金黄色葡萄球菌油乳剂灭活苗，免疫计量均为0.3ml，注射途径为颈背部皮下注射，各组别昆明系白小鼠灭活苗含菌量均为10¹⁰cfu/ml。

1.24攻菌量、攻菌方法和攻菌时间

通过试验确定牛源金黄色葡萄球菌对昆明系小白鼠的最小致死量为3×10⁹/只。

攻菌方法为腹腔注射。

攻菌时间为免疫后第28天。

2结果

2.1酵母葡聚糖灭活苗的安全性

为了更好的了解灭活苗性状及对昆明系小白鼠全身和局部是否会造成副反应，本试验对注射灭活苗后的昆明系小白鼠进行了全程的临床观察，具体试验结果见表1。

表1昆明小白鼠注射菌苗后饮食欲及全身、局部临床症状观察

从表1临床症状观察，各组别昆明系小白鼠在注射灭活苗后的1～2天内均有饮食欲减退症状，但随后逐渐恢复正常。普通灭活苗组和酵母葡聚糖灭活苗1组昆明系小白鼠在试验过程中没有任何异常状况；酵母葡聚糖灭活苗2组昆明系小白鼠在注射灭活苗1周内，注射部位出现了炎症反应，破溃并化脓，其中2只相继在注射灭活苗后第4天和第5天死亡；左旋咪唑灭活苗组昆明系小白鼠在注射灭活苗后精神不振，其中1只在免疫当天死亡，剩余昆明系小白鼠精神逐渐好转、直至恢复正常。直到攻毒前，再没有小鼠出现异常状况。

2.2攻毒保护试验结果

按照已经摸索出来的牛源金黄色葡萄球菌培养条件以及使空白对照组昆明系小白鼠死亡的攻菌量，在免疫接种第28天时，对所有组别昆明系小白鼠统一进行攻菌，攻菌量为30亿/只，攻菌方法为腹腔注射，具体试验结果见表1。

表1  昆明小白鼠攻菌结果

从表1可见，在攻菌后24h内，空白对照组昆明系小白鼠全部死亡，普通灭活苗组昆明系小白鼠死亡3只，左旋咪唑灭活苗组死亡1只，两个酵母葡聚糖灭活苗组没有小白鼠死亡现象；25-48h内，普通灭活苗组昆明系小白鼠死亡1只，左旋咪唑灭活苗组死亡1只，酵母葡聚糖灭活苗1组死亡2只，酵母葡聚糖灭活苗2组死亡1只；在49-72h，酵母葡聚糖灭活苗2组昆明系小白鼠死亡1只，其他组别昆明系小白鼠没有死亡个体；72h后，各组别昆明系小白鼠均没有死亡个体。在保护率方面酵母葡聚糖灭活苗1组最高，为75％，其次为左旋咪唑灭活苗组和酵母葡聚糖灭活苗2组，分别为71％和67％，均高于普通灭活苗组。

3讨论和小结

3.1酵母葡聚糖灭活苗的安全性

在免疫灭活苗后，酵母葡聚糖灭活苗1组和普通灭活苗组昆明系小鼠一切正常；酵母葡聚糖灭活苗2组昆明系小白鼠在注射灭活苗一周内，注射部位出现了炎症反应，其中有2只化脓非常严重，相继于注射灭活苗第4天和第5天死亡；左旋咪唑灭活苗组昆明系小白鼠在注射灭活苗后精神不振，并有1只当天死亡，从死亡的昆明系小白鼠外观和剖检情况看，酵母葡聚糖灭活苗2组昆明系小白鼠是由于注射部位严重感染而死亡；而左旋咪唑灭活苗组昆明系小白鼠死亡的原因则像是中毒反应，因为在小白鼠死亡前出现了摇头、肌肉震颤、运动失调、不安和应激性增高等不正常表现。综上所述，我个人认为酵母葡聚糖的添加量和纯度对灭活苗在昆明系小白鼠体内的吸收影响很大，因为酵母葡聚糖添加量过大和杂蛋白过多都会影响灭活苗在昆明系小白鼠体内的吸收，而若是不被吸收，会导致灭活苗长时间停留在注射部位皮下，从而加速注射部位的炎症反应，反应轻微者会出现局部红肿，反应严重者就会在注射部位出现破溃化脓，甚至由于感染而死亡。

3.2攻毒保护试验

攻菌保护试验结果表明：酵母葡聚糖确实可以提高牛源金黄色葡萄球菌灭活苗对昆明系小白鼠的保护率，且作用明显。从死亡时间看，酵母葡聚糖灭活苗2组昆明系小白鼠死亡时间最晚，其次是酵母葡聚糖灭活苗1组和左旋咪唑灭活苗组，空白对照组和普通灭活苗组昆明系小白鼠死亡时间早；从保护率看，酵母葡聚糖灭活苗1组保护率最高，为75％，其次为左旋咪唑灭活苗组和酵母葡聚糖灭活苗2组，分别为71％和60％，均高于普通灭活苗组；但是从灭活苗的安全性考虑，酵母葡聚糖灭活苗1组最好，没有对动物机体造成不良反应。综上所述，可以得出：酵母葡聚糖可以提高牛源金黄色葡萄球菌灭活苗对昆明系小白鼠的保护率，却作用明显，但是从灭活苗的安全性和保护率两方面考虑，需要对酵母葡聚糖的添加量进行深入的研究。

3.3小结

试验结果表明：酵母葡聚糖和左旋咪唑可以提高牛源金黄色葡萄球菌灭活苗对攻牛源金黄色葡萄球菌昆明系小白鼠的保护率，且与普通灭活苗组比较，作用显著。但从试验结果来看，左旋咪唑的用量不好控制，容易引起动物中毒死亡，而酵母葡聚糖的安全性比左旋咪唑好；酵母葡聚糖灭活苗2组昆明系小白鼠的炎症反应并不是中毒，其原因可能是酵母葡聚糖不纯，杂蛋白含量过高。

三、结论

1.细胞免疫和体液免疫监测结果表明：酵母葡聚糖能够增强牛源金黄色葡萄球菌乳房炎灭活苗的免疫作用；

2攻毒保护试验结果表明：酵母葡聚糖可以提高牛源金黄色葡萄球菌灭活苗对攻牛源金黄色葡萄球菌昆明系小白鼠的保护率。

本发明提供的防治奶牛乳房炎的酵母葡聚糖增效菌苗(油乳剂)所具有的积极效果在于：

(1)使用本发明的增效灭活苗，能提高动物机体非特异性细胞免疫水平。

(2)使用本发明的增效灭活苗，能提高金黄色葡萄球菌抗体滴度，即动物机体体液免疫水平。

(3)使用本发明的增效菌苗，可降低奶牛金黄色葡萄球菌乳房的发病率，无毒无害，对于防治奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎效果十分明显。

附图说明：

图1为新西兰兔注射灭活苗前后外周血腋淋巴细胞转化率折线比较图。

具体实施方式：

为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合检测实例对本发明做进一步的说明。

其中酵母葡聚糖(购自安琪酵母股份有限公司)；细胞培养液(RPMI1640)、Hanks液、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素、10％小牛血清、ConA、MTT、肝素钠针剂、淋巴细胞分离液、牛血清白蛋白(BSA)、3，3′，5′，5-四甲基联苯胺(均购自天津联星生物公司)；二甲基亚砜(DMSO)和酶标山羊抗兔IgG(购自sigma公司)是涉及生物制品的要提供发票)；白油、司班和硬脂酸铝均有市售。

牛源金黄色葡萄球菌由天津畜牧兽医研究所兽医研究室分离于天津某奶牛场，同时由天津畜牧兽医研究所兽医研究室保管(见保藏存活20年的证明)。

实施1  牛源金黄色葡萄球菌分离培养及鉴定步骤：

(1)细菌的分离培养  用接种环无菌钩取奶样2～3环，接种于普通琼脂平板上置温箱37℃培养24小时，观察菌落形态。

(2)细菌的纯化培养  挑取可疑菌落涂片，革兰氏染色镜检。同时划线接种鲜血琼脂平板，置温箱37℃进行纯化培养，培养24小时后，观察培养特性。

(3)接触酶试验  用接种环挑取新鲜待检菌的单个菌落置于洁净载玻片上，滴加3％过氧化氢溶液1滴，观察结果。

(4)血浆凝固酶试验  将1∶4的兔血浆0.5mL置于洁净的小试管中，再加入待检细菌悬浊液0.5mL，摇匀。另外，做标准阳性菌株的阳性对照和生理盐水的阴性对照。

(5)API STAPH生化特性鉴定  挑取单个菌落，按照说明书进行APISTAPH(购自杭州微生物公司)糖发酵及其它生化试验。(此API STAPH生化特性鉴定可以市场买到试剂盒，按照步骤就可以完成)。

实施2  增效油乳剂灭活苗的制备方法(一)

按如下的步骤进行：

(1)按常规方法制备油相：将注射用白油94份、司班-80 6份和硬脂酸铝2份充分混合后高压灭菌，冷却后待用。

(2)将酵母葡聚糖准确添加到已经灭活完全的牛源金黄色葡萄球菌菌悬液中(添加剂量为每毫升灭活苗含5mg酵母葡聚糖)，并在菌悬液中加入3％的Tween-80，充分混合均匀，制成水相；

(3)将混有酵母葡聚糖的菌悬液按1∶3水油比缓缓加入到白油佐剂中，用胶体磨充分乳化2～3分钟，制成油乳剂灭活苗；

(4)最后进行物理性状、无菌检验以及安全性和效力检验，待检验合格后，得到金黄色葡萄球菌油乳剂增效灭活苗。

实施3  增效油乳剂灭活苗的制备方法(二)

按如下的步骤进行：

(1)按常规方法制备油相：将注射用白油94份、司班-80 6份和硬脂酸铝2份充分混合后高压灭菌，冷却后待用。

(2)将酵母葡聚糖准确添加到已经灭活完全的牛源金黄色葡萄球菌菌悬液中(添加剂量为每毫升灭活苗含10mg酵母葡聚糖)，并在菌悬液中加入5％的Tween-80，充分混合均匀，制成水相；

(3)将混有酵母葡聚糖的菌悬液按1∶3水油比缓缓加入到白油佐剂中，用胶体磨充分乳化2～3分钟，制成油乳剂灭活苗；

(4)最后进行物理性状、无菌检验以及安全性和效力检验，待检验合格后，得到金黄色葡萄球菌油乳剂增效灭活苗。

实施4  增效油乳剂灭活苗的制备方法(三)

按如下的步骤进行：

(1)按常规方法制备油相：将注射用白油94份、司班-80 6份和硬脂酸铝2份充分混合后高压灭菌，冷却后待用。

(2)将酵母葡聚糖准确添加到已经灭活完全的牛源金黄色葡萄球菌菌悬液中(添加剂量为每毫升灭活苗含20mg酵母葡聚糖)，并在菌悬液中加入5％的Tween-80，充分混合均匀，制成水相；

(3)将混有酵母葡聚糖的菌悬液按1∶3水油比缓缓加入到白油佐剂中，用胶体磨充分乳化2～3分钟，制成油乳剂灭活苗；

(4)最后进行物理性状、无菌检验以及安全性和效力检验，待检验合格后，得到金黄色葡萄球菌油乳剂增效灭活苗。

实施5  增效油乳剂灭活苗的制备方法(四)

按如下的步骤进行：

(1)按常规方法制备油相：将注射用白油94份、司班-80 6份和硬脂酸铝2份充分混合后高压灭菌，冷却后待用。

(2)将酵母葡聚糖准确添加到已经灭活完全的牛源金黄色葡萄球菌菌悬液中(添加剂量为每毫升灭活苗含40mg酵母葡聚糖)，并在菌悬液中加入5％的Tween-80，充分混合均匀，制成水相；

(3)将混有酵母葡聚糖的菌悬液按1∶3水油比缓缓加入到白油佐剂中，用胶体磨充分乳化2～3分钟，制成油乳剂灭活苗；

(4)最后进行物理性状、无菌检验以及安全性和效力检验，待检验合格后，得到金黄色葡萄球菌油乳剂增效灭活苗。

实施6  实际应用效果观察

(1)在天津某奶牛场，随机选15头干奶期奶牛，用酵母葡聚糖增效油乳剂灭活苗，经后海穴免疫注射10头奶牛，于免疫后第60天再免疫一次，每毫升牛源金葡菌灭活苗中含有10-20mg免疫增强剂(酵母葡聚糖)。预防结果：10个病例，奶牛金黄色葡萄球菌乳腺炎发病率控制在2～10％。

(2)在山东某奶牛场，随机选15头干奶期奶牛，用酵母葡聚糖增效油乳剂灭活苗，经后海穴免疫注射10头奶牛，于免疫后第60天再免疫一次，每毫升牛源金葡菌灭活苗中含有30-40mg免疫增强剂(酵母葡聚糖)。预防结果：10个病例，奶牛金黄色葡萄球菌乳腺炎发病率控制在2～10％。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。

Claims (7)

1.一种用于预防奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎的油乳剂增效灭活苗，由牛源金黄色葡萄球菌灭活苗和免疫增强剂组成，其特征是：在牛源金黄色葡萄球菌灭活苗中每毫升添加5-40mg酵母葡聚糖免疫增强剂。

2.如权利要求1所述的增效菌苗，其中的免疫增强剂是酵母葡聚糖。

3.如权利要求1所述的增效菌苗，其中的增效灭活苗剂型为油乳剂。

4.一种制备权利要求1～3任一项所述的增效灭活苗的方法，按如下的步骤进行：

(1)按常规方法制备油相：将注射用白油94份、司班-806份和硬脂酸铝2份充分混合后高压灭菌，冷却后待用；

(2)按一定比例将酵母葡聚糖准确添加至已经灭活完全的牛源金黄色葡萄球菌菌悬液中，并在菌悬液中加入3～5％的Tween-80，充分混合均匀，制成水相；

(3)然后将混有酵母葡聚糖的菌悬液按1∶3水油比缓缓加入到白油佐剂中，用胶体磨充分乳化2～3分钟，制成油乳剂灭活苗；

(4)最后进行物理性状、无菌检验以及安全性和效力检验，待检验合格后，得到金黄色葡萄球菌油乳剂增效灭活苗。

5.权利要求1所述增效灭活苗在增强细胞免疫和体液免疫方面的应用。

6.权利要求1所述增效灭活苗在提高家兔细胞免疫和体液免疫方面的应用。

7.权利要求1所述增效灭活苗在提高牛源金黄色葡萄球菌灭活苗对攻牛源金黄色葡萄球菌方面的应用。

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