CN101690805A - 一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺，其可被人体内的抗原递呈细胞靶向摄取和加工，并同时可诱导抗原递呈细胞的成熟。本发明包括以下步骤：(1)从兔红细胞膜上提取α1，3Gal糖脂：将兔的浓缩红细胞裂解在水中，将细胞膜用氯仿和甲醇混合作用，用过滤掉其中的颗粒成分，加入双蒸水，产生油相和水相；收集水相并驱除掉甲醇和迹量的氯仿，获取α1，3Gal糖链-甘油三脂复合物，备用；(2)取一定量的α1，3Gal糖脂，加入三氯甲烷溶解后，加入到一定量的蛋黄卵磷脂、胆固醇和PEG2000-DSPE混合物中，振荡溶解，旋转薄膜蒸发使之形成脂质薄膜，加入含NY-ESO-1蛋白1mg/ml的PBS缓冲液，经超声乳化后得到本发明产物。
Description
一、技术领域：
本发明涉及一种医用或实验用疫苗的设计和制备工艺，尤其是涉及一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺。
二、背景技术：
肿瘤疫苗作为一种肿瘤免疫治疗手段备受关注，近年来取得较大的进展。目前已有多种瘤苗成功进入临床试验研究，并在某些免疫原性较强的肿瘤(如恶性黑色素瘤和肾癌等)中取得一定的疗效。但总体而言，目前肿瘤疫苗的疗效还远不能满足临床期望。机体免疫细胞对瘤苗中的抗原成分缺乏有效的加工与递呈是其中的问题之一，此外未成熟抗原递呈细胞(APCs)捕获抗原后，若缺乏有效的免疫信号刺激而不能成熟，则可能会出现诱导免疫耐受，也是瘤苗研究需要解决的问题之一。本发明主要是在现有纳米疫苗技术的基础上针对如何解决有效地增强APCs对瘤苗的捕获和如何同时有效地促进APCs成熟等问题提出一种新的纳米瘤苗设计策略，目前国内外尚无类似瘤苗设计策略的报道。
三、发明内容：
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺，所制备的纳米瘤苗可被人体内的APCs靶向摄取和加工，并同时可诱导APCs的成熟。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺，其特征在于：将α1，3Gal糖脂引入到纳米脂质体表面，制备一种能被树突状细胞靶向摄取的纳米疫苗递送系统；利用该疫苗递送系统荷载肿瘤抗原，制备具有树突状细胞靶向性的纳米瘤苗脂质体，以增强树突状细胞对肿瘤抗原的摄取和递呈，同时激活树突状细胞的Toll样受体信号通路并促进其成熟，进而诱导特异性的抗肿瘤细胞免疫反应。
将α1，3Gal糖脂引入到纳米脂质体表面的工艺包括以下步骤：
取10mgα1，3Gal糖脂1mL，加入等体积三氯甲烷1mL，充分混合作用20min，取含有α1，3Gal糖链-甘油三脂复合物的三氯甲烷的油相备用；于小试管中精密称取蛋黄卵磷脂38mg，胆固醇17.4mg，PEG2000-DSPE 14mg，然后加入0.5ml含有α1，3Gal糖链-甘油三脂复合物的三氯甲烷，振荡使其溶解，旋转薄膜蒸发使之形成脂质薄膜。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
(1)本发明针对目前肿瘤疫苗设计中存在的问题，提出了一种新的瘤苗设计策略，建立了一种新型能被DCs靶向摄取的纳米瘤苗递送系统；
(2)本发明不仅具有被DCs靶向摄取的特性，而且还具有促进DCs成熟的特性；
四、附图说明：
图1为本发明的结构示意图；
图2为α1，3Gal/NY-ESO-1NP被树突状细胞靶向摄取以及通过其表面α1，3Gal糖脂活化APCs的TLRs信号通路的示意图；
图3为透射电镜观察α1，3Gal/NY-ESO-1NP的形态结果图；
图4为α1，3Gal/NY-ESO-1 NP被DCs靶向摄取后细胞裂解液中NY-ESO-1的含量结果图；
图5为DCs经与α1，3Gal/NY-ESO-1 NP共孵育后，细胞表面CD40、CD83、CD86及HLA-DR的表达水平明显增高结果图；
图6为用western blot法检测α1，3Gal/NY-ESO-1NP与DCs共孵育后细胞中TLR4和NF-κb的表达，用real time PCR检测细胞中MYD88和TNF-αmRNA的表达结果图。
五、具体实施方式：
本发明将兔红细胞表面的α1，3Gal糖脂通过薄膜分散+超声乳化法引入到纳米脂质体表面，制备一种能被DCs靶向摄取的纳米疫苗递送系统；并通过薄膜分散+超声乳化法利用该疫苗递送系统荷载肿瘤特异性抗原NY-ESO-1蛋白，制备能被树突状细胞靶向摄取的纳米瘤苗脂质体，同时该疫苗递送系统可通过α1，3Gal糖脂激活Toll样受体(TLRs)信号通路以促进DCs成熟；从而实现本发明所提出的既具有被树突状细胞靶向摄取又能促进树突状细胞成熟之双重特性的新型纳米疫苗的设计策略。
实施例：
1、通过氯仿/甲醇萃取法从兔红细胞膜上提取α1，3Gal糖脂
将1L兔的浓缩红细胞通过低张性休克法裂解在水中，将细胞膜用600ml氯仿和800ml甲醇混合作用20小时，用Whatman纸过滤掉其中的颗粒成分，逐渐加入400ml双蒸水。产生500ml底部的油相和1500ml上部的水相；水相内含有绝大部分的α1，3Gal糖脂。收集水相并利用旋转蒸发器驱除掉甲醇和迹量的氯仿，结果α1，3Gal糖链-甘油三脂复合物以乳糜微粒的形式存在于水中，浓度可达10mg/ml，纯度大于95％，备用。
2、利用薄膜分散+超声乳化法制备成纳米脂质体
取一定量的α1，3Gal糖脂1ml，加入1ml三氯甲烷，充分混合作用20min，取油相(含有α1，3Gal糖链-甘油三脂复合物的三氯甲烷)备用。于小试管中精密称取蛋黄卵磷脂38mg，胆固醇17.4mg，PEG2000-DSPE 14mg，然后加入0.5ml含有α1，3Gal糖链-甘油三脂复合物的三氯甲烷，振荡使其溶解，旋转薄膜蒸发使之形成脂质薄膜，40℃水浴中N2气流挥干有机溶媒，加入含NY-ESO-1蛋白1mg/ml的PBS缓冲液(pH7.4)，经水合制得乳白色水性混悬液，20kW超声乳化5min共3次，高速剪切机100,000r/min剪切30min，分别经过2张重叠的200nm、100nm polycarbonate filters压滤3次，用0.22μm的滤膜过滤除菌后，得到α1，3Gal糖脂/NY-ESO-1树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗，于4℃保存。
参见图1，α1，3Gal糖脂分子是一种两性分子，即该分子具有亲水的糖链部分和疏水的脂质部分，当α1，3Gal糖脂可被引到纳米脂质体(脂质分子构成的纳米微粒)表面，脂质部分可嵌合到脂质体的双层脂分子中，糖链部分暴露在脂质体外的水相中。NY-ESO-1蛋白则因具有亲水性可通过薄膜分散+超声乳化法被荷载到纳米脂质体内。
参见图2，机体天然存在着大量的血清抗α1，3Gal抗体，当机体接种α1，3Gal/NY-ESO-1纳米脂质体后，这种纳米脂质体随即可被这种天然抗体识别，形成抗原/抗体复合物，这样机体的抗原递呈细胞，如DCs便可通过Fc段受体捕获抗原/抗体复合物并摄取其中的NY-ESO-1肿瘤抗原。此外，纳米脂质体表面的α1，3Gal糖脂可激活人树突状细胞的TLR4信号转导通路，从而激活树突状细胞来打破人体免疫系统对肿瘤相关抗原的免疫耐受。
参见图3，透射电镜观察脂质体粒子的形态：
取所制备的纳米脂质体2ul，PBS稀释40倍，取一滴滴于铜质筛网上，室温下放置2min，3％的磷酸钨染色，烤干后置于100000×透射电镜下观察拍照，所得到的纳米脂质体为直径约80nm的颗粒，结果如图3所示；
参见图4，评价DCs对α1，3Gal/NY-ESO-1 NP的摄取能力；
取HLA-A2阳性人群的外周血10ml，分离外周血单个核细胞(PBMCs)，无血清Xvivo15培养液重悬细胞，置于24孔聚苯乙烯培养板，贴壁法移去悬浮细胞，贴壁细胞加入rhGMCSF(终浓度100μg/L)，rhIL4(终浓度10μg/L)，于37℃，50mL/L CO2条件下培养4天(所得细胞为未成熟DCs)，补加上述细胞因子，收获DCs；
然后分别加入一定量的α1，3Gal NP(用作对照，不含NY-ESO-1蛋白)、NY-ESO-1 NP(用作对照，不含α1，3Gal糖脂)和α1，3Gal/NY-ESO-1 NP，同时加入健康成人血清，使瘤苗和不成熟的DCs孵育2小时；
收集部分经孵育后的DCs，PBS洗涤3次后将细胞裂解，然后用Western blot法检测细胞裂解液中NY-ESO-1的含量。发现不成熟的DCs经与α1，3Gal/NY-ESO-1 NP共孵育后，细胞内NY-ESO-1的含量明显增加，结果如图4所示。
参见图5和图6，观察到纳米脂质体能促进DCs的成熟：
参见图5，将不成熟的DCs经与α1，3Gal/NY-ESO-1 NP共孵育后，行流式细胞术对表型进行鉴定(CD40、CD83、CD86及HLA-DR)；细胞表面CD40、CD83、CD86及HLA-DR的表达水平明显增高，结果如图5所示，说明DCs处于活化的成熟状态。
参见图6，将不成熟的DCs经与α1，3Gal/NY-ESO-1NP共孵育后，用westernblot法检测细胞内TLR4和NF-κb的表达，利用real time PCR检测MYD88和TNF-αmRNA的表达；说明α1，3Gal/NY-ESO-1NP可激活DCs的TLRs信号通路，结果如图6所示。
Claims (2)
1.一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺，其特征在于：将α1，3Gal糖脂引入到纳米脂质体表面，制备一种能被树突状细胞靶向摄取的纳米疫苗递送系统；利用该疫苗递送系统荷载肿瘤抗原，制备具有树突状细胞靶向性的纳米瘤苗脂质体，以增强树突状细胞对肿瘤抗原的摄取和递呈，同时激活树突状细胞的Toll样受体信号通路并促进其成熟，进而诱导特异性的抗肿瘤细胞免疫反应。
2.根据权利要求1所述的一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺，其特征在于：将α1，3Gal糖脂引入到纳米脂质体表面的工艺包括以下步骤：
取10mg α1，3Gal糖脂1mL，加入等体积三氯甲烷1mL，充分混合作用20min，取含有α1，3Gal糖链-甘油三脂复合物的三氯甲烷的油相备用；于小试管中精密称取蛋黄卵磷脂38mg，胆固醇17.4mg，PEG2000-DSPE 14mg，然后加入0.5ml含有α1，3Gal糖链-甘油三脂复合物的三氯甲烷，振荡使其溶解，旋转薄膜蒸发使之形成脂质薄膜。
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|---|---|---|---|---|
| CN101816631A (zh) * | 2010-04-27 | 2010-09-01 | 上海交通大学 | 用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂及其制备方法 |
| EP3145538A4 (en) * | 2014-05-21 | 2017-12-06 | Hryz Biotech Co. | Method for preparing dendritic cell loaded with antigen |
| CN110151702A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-08-23 | 昆明医科大学 | 聚乙二醇修饰流感疫苗脂质体及其制备方法 |
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