CN101688836B - Fret检测方法及装置 - Google Patents

Abstract

一种FRET检测方法和检测装置，其中，在去除荧光检测信息的不确定因素并定量地测量出FRET效率时，获得预先被存储在存储装置的校准信息，所述校准信息至少包括：测量对象样品的荧光中，供体分子发出的供体荧光成分的漏泄率、受体分子发出的受体荧光成分的漏泄率、以及在不发生FRET的情况下的供体荧光成分的非FRET荧光寿命。另外，利用测量对象样品的荧光的荧光强度信息和相位信息、供体荧光成分的漏泄率和受体荧光成分的漏泄率，求出供体荧光成分的FRET荧光寿命，且求出FRET效率。

Description

FRET检测方法及装置

技术领域

本发明涉及FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer：萤光共振能量转移)的检测方法及装置，通过接收被激发的第二分子发出的荧光和第一分子发出的荧光，由此检测出第一分子的能量朝向第二分子转移的FRET。具体来讲，涉及在作为荧光分子的供体分子和作为荧光分子的受体分子的对中，通过两个荧光分子之间的相互作用来检测FRET的FRET检测技术。

背景技术

目前，作为医疗、制新药、食品产业中后基因的相关技术，蛋白质的功能分析变得越来越重要。特别是，为了分析细胞作用，需要研究活细胞中活体物质的蛋白质与其它蛋白质或低分子化合物之间的相互作用(结合、分离)。

对于与这种蛋白质的与其他蛋白质或低分子化合物之间的相互作用，最近进行着利用荧光共振能量转移(FRET)现象进行分析的方法。即，使用荧光对几纳米区域中的分子间的相互作用进行检测。这种利用了FRET现象的检测主要是利用显微镜系统来进行。

例如，下述专利文献1公开了一种利用了FRET的分子荧光分析。在该文献中公开了利用FRET现象并根据所接收到的荧光以进行荧光相关分析法或荧光强度分布分析的荧光分光分析方法。

专利文献1：日本特开2005-207823号公报

发明内容

然而，在该方法中，能够在短时间内进行FRET检测的细胞等样品数量最多限定在几十个左右，因此将很多细胞作为分析对象时难以在短时间内进行统计分析。另外，在以往的方法中，由于仅进行荧光强度的测量，因此该荧光强度因受到附着在细胞上的荧光蛋白标记量的影响而发生变化。因此，存在无法完全排除所测量出的荧光信息的不确定因素，且也难以定量检测出FRET的发生程度的问题。

因此，本发明为了解决上述问题，其目的在于：提供一种FRET检测方法及装置，对含有供体和受体分子的样品，能够去除因荧光蛋白标记量而产生的荧光检测信息的不确定因素，且能够去除因发自供体分子的荧光的荧光波长扩展和发自受体分子的荧光的荧光波长扩展等而引起的荧光检测信息的不确定因素，定量地测量FRET的发生程度。

为了达成上述目的，本发明提供一种FRET检测方法，将激光照射在用第一分子和第二分子进行标记的测量对象样品上，此时通过接收测量对象样品所发出的荧光，检测出第一分子的能量朝向第二分子转移的FRET，其特征在于，所述FRET检测方法包括下述步骤：

收集检测值的步骤，其中，朝向所述测量对象样品照射以规定的频率对强度进行了时间调制的激光，且使用与不同的多个接收波段相对应的多个检测传感器来接收所述测量对象样品在此时所发出的荧光，由此收集含有所述测量对象样品的荧光的荧光强度信息和相位信息的检测值，其中，所述接收波段包括以使所述第一分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第一波段和以使所述第二分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第二波段；

读取并得到预先存储在存储装置的校准信息的步骤，其中，所述校准信息至少包括下述信息：第一强度比，其表示的是所述测量对象样品的所述荧光中所述第一分子发出的第一分子荧光成分在所述第二波段的荧光强度与其在所述第一波段的荧光强度之比；相对于所述激光时间调制的所述第一分子荧光成分的相位信息；第二强度比，所述荧光中所述第二分子发出的第二分子荧光成分在所述第一波段的荧光强度与其在所述第二波段的荧光强度之比；相对于所述激光时间调制的所述第二分子荧光成分的相位信息；没有发生所述FRET的状态下的所述第一分子荧光成分的非FRET荧光寿命，其被定义为通过激光被激发的第一分子发出的荧光做出一次滞后系统的弛豫响应的时刻；

求出所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命的步骤，从各个检测传感器所收集的所述检测值中，求出在每个所述接收波段中所述测量对象样品的荧光的荧光强度信息和相位信息，并利用所求出的所述荧光强度信息和所述相位信息、所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的所述相位信息、所述第二强度比和所述第二分子荧光成分的所述相位信息，求出被定义为通过激光被激发的第一分子发出的荧光做出一次滞后系统的弛豫响应时的所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命；

求出FRET发生信息的步骤，其中，利用所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命与所述第一分子荧光分子的所述非FRET荧光寿命之比，求出FRET发生信息。

另外，在求出所述FRET发生信息的步骤中，将所述非FRET荧光寿命设定为τ_d、将所述FRET荧光寿命设定为τ_d ^*时，最好求出作为所述FRET发生信息的由1-(τ_d ^*/τ_d)表示的FRET效率Et。

另外，优选：在收集所述检测值的步骤中，将所述激光照射在多个所述测量对象样品上，并利用所述传感器来收集多个所述测量对象样品的每一个所述检测值；在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，根据各个检测值求出所述测量对象样品的各个荧光强度信息和相位信息，且从求出的多个荧光强度信息和相位信息中求出所述FRET荧光寿命。

另外，优选：在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，将从所述检测值中求出的所述荧光强度和相位信息用矢量表示在每个所述接收波段上，并将该矢量与所述第一强度比、所述第二强度比用于每个所述接收波段上，由此求出在产生FRET的状态下所述第一分子荧光成分的荧光强度信息和相位信息与所述第二分子荧光成分中因FRET的产生而发出荧光的FRET成分的荧光强度信息和相位信息，并利用所求出的信息求出所述FRET荧光寿命。

优选：在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，至少使用通过所述第一波段的所述检测传感器所收集的检测值来表示的第一波段中的所述矢量和所述第二强度比，求出在产生所述FRET的状态下所述第一分子荧光成分的荧光强度信息和相位信息；至少使用通过所述第二波段的所述检测传感器所收集的检测值来表示的第二波段中的所述矢量和所述第一强度比，求出所述FRET成分的荧光强度信息和相位信息。

优选：在所述存储装置中，所述第二分子荧光成分中第二分子通过所述激光而直接被激发，由此产生的直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息被预先存储在所述存储装置；在获得所述校准信息的步骤中，调出被存储在所述存储装置的所述直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息，并用矢量来表示直接激发荧光成分的信息；在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，至少利用所述直接激发荧光成分的所述矢量和所述第二波段中的所述矢量，从而求出产生所述FRET状态下的所述第二分子荧光成分的荧光强度信息和相位信息。

优选：在所述存储装置中，所述第二分子荧光成分中第二分子通过所述激光而直接被激发，由此产生的直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息被预先存储在所述存储装置；

在获得所述校准信息的步骤中，调出所述第二分子荧光成分中第二分子通过所述激光而直接被激发后发出的直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息，且用所述直接激发荧光成分的矢量来表示；在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，使用所述校准信息以求出所述第一分子荧光成分的FRET寿命，而且至少使用所述第二波段中的所述矢量和所述第一强度比，从而求出所述FRET成分的相位信息，然后利用所求出的所述FRET成分的相位信息和所述直接激发荧光成分的所述矢量，求出产生所述FRET的状态下的所述第二分子荧光成分的FRET荧光寿命和不产生FRET状态下的所述第二分子荧光成分的非FRET荧光寿命，进而使用所述第二分子荧光成分的FRET荧光寿命和所述第二荧光成分的所述非FRET荧光寿命，求出所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命。

优选：所述测量对象样品是用所述第一分子和所述第二分子在通过所述激光被激发而发出自发荧光的自发荧光样品上做了标记的样品；在所述存储装置中，预先存储有通过将激光照射在所述自发荧光样品的方式而使所述自发荧光样品发出的荧光的、每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息；

在获得所述校准信息的步骤中，调出被存储在所述存储装置的、所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段中的荧光强度信息和相位信息，并用矢量来表示所述自发荧光样品的荧光；

在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，从每个所述接收波段的所述测量对象样品的各个所述矢量中减去所述自发荧光样品的荧光的所述矢量，并利用进行减法计算后得到的矢量以求出所述FRET荧光寿命。

优选：在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过自发荧光校准而得到的信息的方式来获得信息；

在所述自发荧光校准中，将所述自发荧光样品作为测量对象物且照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集每个所述接收波段中含有荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且将所求出的信息存储在所述存储装置。

优选：在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过非FRET校准而得到的信息的方式来获得信息；

在所述非FRET校准中，样品上附着有所述第一分子和所述第二分子、且将进行了不产生FRET处理的非FRET样品作为测量对象物，朝向所述非FRET样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集每个所述接收波段中含有荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述非FRET样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，然后利用所求出的每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息、预先被存储在所述存储装置的所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的相位信息、预先被存储在所述存储装置的所述第二强度比和所述第二分子荧光成分的相位信息，求出通过激光照射直接被激发的第二分子所发出的直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息，且将所求出的信息存储在所述存储装置。

优选：所述非FRET样品是用所述第一分子和所述第二分子在通过所述激光被激发而发出自发荧光的自发荧光样品上做了标记的样品；在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过自发荧光校准而得到的信息的方式来获得信息；

所述自发荧光校准是在所述非FRET校准之前进行的校准，其中，将所述自发荧光样品作为测量对象物且朝向所述自发荧光样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集含有每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且将所求出的信息存储在所述存储装置；

在所述非FRET校准中，从用矢量表示所述非FRET样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的非FRET样品矢量中，减去用矢量表示的通过所述自发荧光校准而求出来的所述自发荧光信息的自发荧光矢量，然后利用通过该减法计算获得的矢量、预先存储在所述存储装置的所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的相位信息、预先存储在所述存储装置的所述第二强度比和所述第二分子荧光成分的相位信息，导出所述直接激发荧光成分矢量，并将导出的结果存储在所述存储装置。

优选：在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过第一分子校准而得到的信息的方式来获得信息；

在所述第一分子校准中，将仅以所述第一分子来进行标记的第一分子样品作为测量对象物且朝向所述第一分子样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集含有所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且求出所述第一分子样品在所述第二波段的荧光强度和其在所述第一波段的荧光强度之比并将其作为所述第一强度比，然后将所求出的所述第一强度比和所述相位信息存储在所述存储装置。

优选：所述第一分子样品是用所述第一分子在通过所述激光被激发而发出自发荧光的自发荧光样品上做了标记的样品；在所述获得校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过自发荧光校准而得到的信息的方式来获得信息；

所述自发荧光校准是在所述第一分子校准之前进行的校准，其中，将所述自发荧光样品作为测量对象物且朝向所述自发荧光样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集在每个所述接收波段上含有荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且将所求出的信息存储在存储装置；

在所述第一分子校准中，从用矢量表示所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的第一分子样品矢量中，减去用矢量来表示的通过所述自发荧光样品校准而求出来的所述自发荧光样品的荧光信息的自发荧光矢量，然后利用通过该减法计算而得到的矢量，求出所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且将所求出的信息存储在存储装置。

优选：在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过第二分子校准而得到的信息的方式来获得信息；

在所述第二分子校准中，将仅以所述第二分子来进行标记的第二分子样品作为测量对象物，且朝向所述第二分子样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集含有所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且求出所述第二分子样品在所述第一波段的荧光强度和其在所述第二波段的荧光强度之比并将其作为所述第二强度比，然后将所求出的所述第二强度比和所述相位信息存储在所述存储装置。

优选：所述第二分子样品是用所述第二分子在通过所述激光被激发而发出自发荧光的自发荧光样品上做了标记的样品；在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过自发荧光校准而得到的信息的方式来获得信息；

所述自发荧光校准是在所述第二分子校准之前进行的校准，其中，将所述自发荧光样品作为测量对象物且朝向所述自发荧光样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集在每个所述接收波段中含有荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且将所求出的信息存储在存储装置；

在所述第二分子校准中，从用矢量表示所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的第二分子样品矢量中，减去用矢量来表示的通过所述自发荧光样品校准而求出的所述自发荧光样品的荧光信息的自发荧光矢量，然后利用通过该减法计算而得到的矢量，求出所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，并将所求出的信息存储在存储装置。

本发明还提供一种FRET检测装置，将激光照射在用第一分子和第二分子进行了标记的测量对象样品上，此时通过接收测量对象样品所发出的荧光的方式，检测出第一分子的能量朝向第二分子转移的FRET，其特征在于：

所述FRET检测装置包括：

检测信息获得部，其中，朝向所述测量对象样品照射以规定的频率对激光强度进行了时间调制的激光，且使用与不同的多个接收波段相对应的多个检测传感器来接收所述测量对象样品在此时所发出的荧光，由此获得含有所述测量对象样品的荧光的荧光强度信息和相位信息的检测值，其中，所述接收波段包括以使所述第一分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第一波段和以使所述第二分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第二波段；

存储装置，其对至少包括下述信息的校准信息进行预先存储：第一强度比，其表示的是所述测量对象样品的所述荧光中所述第一分子发出的第一分子荧光成分在所述第二波段的荧光强度与其在所述第一波段的荧光强度之比；所述第一分子荧光成分的相位信息；第二强度比，所述第二分子发出的第二分子荧光成分在所述第一波段的荧光强度与其在所述第二波段的荧光强度之比；所述第二分子荧光成分的相位信息；没有发生所述FRET的状态下的所述第一分子荧光成分的非FRET荧光寿命，其被定义为通过激光被激发的第一分子发出的荧光在做出一次滞后系统的弛豫响应时的寿命；

FRET荧光寿命计算部，其从所述检测信息获得部所获得的所述检测值中，求出对于各个所述接收波段的所述测量对象样品的荧光的荧光强度信息和相位信息，并利用所求出的所述荧光强度信息和所述相位信息、从所述存储装置中读取的所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的所述相位信息、所述第二强度比和所述第二分子荧光成分的所述相位信息，求出被定义为通过激光被激发的第一分子发出的荧光在做出一次滞后系统的弛豫响应时的所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命；

FRET发生信息计算部，求出利用所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命和所述第一分子荧光成分的所述非FRET荧光寿命之比来表示的FRET发生信息。

另外，优选：在所述FRET荧光寿命计算部中，将从各个所述检测值中求出的所述荧光强度和相位信息用矢量来表示，并利用所述矢量、所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的所述相位信息、所述第二分子荧光成分的所述第二强度比、所述第二分子荧光成分的所述相位信息，求出在产生FRET的状态下的所述第一分子荧光成分的荧光强度信息和相位信息与所述第二分子荧光成分中因FRET的产生而发出FRET成分的荧光强度信息和相位信息，并利用所求出来的这些信息来求出所述FRET荧光寿命。

优选：所述传感器的各个接收波段是以使所述第一分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第一波段和以使所述第二分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第二波段；

在所述FRET荧光寿命计算部中，至少利用从通过所述第一波段的检测传感器而得到的所述检测值中所求出来的第一波段的所述矢量和所述第二强度比，求出在产生所述FRET的状态下的所述第一分子荧光成分的荧光强度信息和相位信息；另外，至少利用通过所述第二波段的所述检测传感器而得到的所述检测值来表示的第二波段的所述矢量和所述第一强度比，求出所述FRET成分的荧光强度信息和相位信息。

优选：所述FRET检测装置还具有自发荧光校准部；

在所述自发荧光校准部中，将通过所述激光照射被激发而发出自发荧光的自发荧光作为测量对象物，且朝向所述自发荧光照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个所述检测传感器中收集含有所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的检测值，求出所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段上的荧光强度信息和相位信息，并将其存储在所述存储装置；

在所述FRET荧光寿命计算部中，用矢量来表示每个所述接收波段的所述测量对象样品的荧光信息，且从所述矢量中减去表示所述自发荧光样品的所述荧光强度信息和所述相位信息的矢量，并利用进行减法计算后得到的矢量求出所述FRET荧光寿命。

所述FRET装置还具有非FRET校准部；

在所述非FRET校准部中，在将样品上附着有所述第一分子和所述第二分子、且进行了不发生FRET处理的非FRET样品作为测量对象物，且朝向所述非FRET样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集含有每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的检测值时，求出所述非FRET样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，然后利用所求出的荧光强度信息和相位信息、所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的相位信息、所述第二强度比和所述第二分子荧光成分的所述相位信息，求出因第二分子通过所述激光照射直接被激发而产生的直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息，且导出用矢量表示这些信息的直接激发荧光成分矢量，并将该导出结果存储在所述存储装置；

所述FRET荧光寿命计算部中，利用所述直接激发荧光成分矢量来求出所述FRET荧光寿命。

优选：所述FRET检测装置还具有第一分子校准部；

在所述第一分子校准部中，在将仅以所述第一分子来进行标记的第一分子样品作为测量对象物，且朝向所述第一分子样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集含有所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的检测值时，求出所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且求出所述第一分子样品在所述第二波段的荧光强度和其在所述第一波段的荧光强度之比并将其作为所述第一强度比，并将所求出的所述第一强度比和所述第一分子样品的荧光的所述相位信息存储在所述存储装置。

优选，所述FRET检测装置还具有第二分子校准部；

在所述第二分子校准部中，将仅以所述第二分子来进行标记的第二分子样品作为测量对象物，且朝向第二分子样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集含有所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的检测值时，求出所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且求出所述第二分子样品在所述第一波段的荧光强度和其在所述第二波段的荧光强度之比并将其作为所述第二强度比，并将所求出的所述第二强度比和所述第二分子样品的荧光的所述相位信息存储在所述存储装置。

根据本发明的FRET检测方法和装置，例如，对于在细胞上附着有作为荧光蛋白的供体分子和受体分子的测量对象样品，能够去除由荧光蛋白的标记量所引起的荧光检测信息的不确定因素，且能够去除因来自供体分子的荧光接收波段与来自受体分子的荧光接收波段重叠而引起的荧光检测信息的不确定因素，从而定量地测量出FRET的发生程度(例如FRET效率)。

附图说明

图1为使用本发明的FRET检测装置的流式细胞仪的概略构成图；

图2为表示供体分子能量吸收光谱与荧光光谱、受体分子的吸收光谱与荧光光谱的例子的示意图；

图3为说明FRET发生的示意图；

图4为表示图1所示的流式细胞仪的受光部的一例的概略构成图；

图5为对图1所示的流式细胞仪中的、发自FRET样品的荧光成分和朝向光电转换器入射的各种荧光成分进行说明的说明图；

图6为表示图1所示的流式细胞仪的控制和处理部的一例的概略构成图；

图7为表示图1所示的流式细胞仪的分析装置的一例的概略构成图；

图8为表示FRET发生时的荧光发光动力学的模式图。

图9为对图1所示的流式细胞仪中的、发自无标记样品的荧光成分和各荧光成分朝向光电转换器入射的情况进行说明的说明图；

图10为对图1所示的流式细胞仪中的、发自供体标记样品的荧光成分和各荧光成分朝向光电转换器入射的情况进行说明的说明图；

图11为对图1所示的流式细胞仪中的、发出自受体标记样品的荧光成分和各荧光成分朝向光电转换器入射的情况进行说明的说明图；

图12为对图1所示的流式细胞仪中的、发出自非FRET标记样品的荧光成分和各荧光成分朝向光电转换器入射的情况进行说明的说明图；

图13为在图1所示的流式细胞仪中所进行的FRET检测方法的流程图；

图14为在图1所示的流式细胞仪中所进行的第一校准流程图；

图15为在图1所示的流式细胞仪中所进行的第二校准流程图；

图16为在图1所示的流式细胞仪中所进行的第三校准流程图；

图17为在图1所示的流式细胞仪中所进行的第四校准流程图；

符号说明

10 流式细胞仪

12 FRET样品

20 信号处理装置

22 激光光源部

24、26 受光部

26a 透镜系统

26c₁、26c₂ 带通滤波器

27a、27b 光电转换器

28 控制和处理部

30 管道

32 回收容器

40 信号生成部

42 信号处理部

44 控制部

46 振荡器

48 功率分配器

50、52、54a、54b 放大器

56 相位差检测器

60 系统控制器

62 低通滤波器

66 A/D转换器

80 分析装置

82 CPU

84 存储器

86 输入输出端口

88 第一校准单元

90 第二校准单元

92 第三校准单元

94 第四校准单元

96 荧光弛豫时间常数计算单元

98 FRET效率计算单元

具体实施方式

下面，根据流式细胞仪对本发明的FRET检测方法和装置进行详细说明。

图1是使用了本发明的FRET检测装置的流式细胞仪10的概略构成图。

流式细胞仪10主要包括信号处理装置20和分析装置(计算机)80。

在信号处理装置20中，将激光照射在供体分子(第一分子)和受体分子(第二分子)通过化学键或物理键附着在特定细胞等的受体样品(下述称为细胞)上而被标记了的FRET检测对象样品12(下述成为FRET样品12)上，检测出发出自该FRET样品12的荧光的荧光信号并进行信号处理。在分析装置80中，根据从信号处理装置20所获得的处理结果进行对FRET样品12的分析。样品被激光照射后能够自发荧光。这样的自发荧光会成为测量噪波的成分，因此一般情况下不发生为好。但是，在对细胞等照射激光等时，一定程度上发生上述情况。

本发明的一个实施例的流式细胞仪10是下述一种装置，准备测量溶液中处于浑浊状态的多个FRET样品，并对每一个FRET样品，检测出朝向该FRET样品照射激光时所发出的荧光的荧光成分(后述的供体波段的荧光成分和受体波段的荧光成分)的各个荧光寿命(荧光弛豫时间常数)，且计算出表示FRET样品中FRET发生程度的FRET效率。

信号处理装置20具有激光光源部22、受光部24、26、控制和处理部28和管道30。控制和处理部28包括：控制部，对来自激光光源部22的激光以规定频率进行强度调制；处理部，对来自FRET样品12的荧光信号进行处理。在管道30中，使形成高速流的鞘液与样品12一起流动，以形成流动池。

在管道30的出口处设置有回收容器32。在流式细胞仪10的构成中也可以配置细胞分类器，以便通过激光照射在短时间内分离出FRET样品12中的特定细胞等的活体物质，以将活体物质分离于各自的回收容器。

激光光源部22是为了激发供体分子而发射出激光的光源。例如，当作为供体分子使用CFP(Cyan Fluorescent Protein)、作为受体分子使用YFP(YellowFluorescent Protein)时，波长405～440nm的激光作为具有主要激发供体分子的波长的激光而被使用。激光光源部22对具有这样的波长的、用于激发供体分子的激光以规定频率进行强度调制而将其发射的部分。

在此，对FRET的发生进行简单地说明。图2是表示供体分子能量吸收光谱与荧光光谱、受体分子的吸收光谱与荧光光谱的例子的示意图。图3是用来容易理解发生FRET的说明图。

图2表示当供体分子为CFP、受体分子为YFP时的能量吸收、荧光发射的特性。在图2中，曲线A₁表示CFP的能量吸收光谱、曲线A₂表示CFP的荧光发射光谱、曲线B₁表示YFP的能量吸收光谱、曲线B₂表示YFP的荧光发射光谱。在图2中，斜线的部分表示发生FRET的波段。

一般来说FRET，供体分子通过激光被激发，该供体分子的一部分发射出荧光，一部分能量通过库伦相互作用朝向受体分子流动。该能量转移是在2nm以下的极其相近的距离下产生，且该能量转移表示分子之间的相互作用(结合)。因此，通过发生能量转移，受体分子被激发而从受体分子发射出荧光。此时，如图2所示，供体分子的荧光发射波段和受体分子的能量吸收波段部分重叠，这对FRET的发生是必需的。

一般来说同一分子中，只要荧光发射能量不是很大，能量吸收的峰值波长和荧光发射的峰值波长就会接近。如图2所示，对于作为供体分子的CFP(CyanFluorescent Protein)、作为受体分子的YFP(Yellow Fluorescent Protein)也是这样的。为了FRET的发生，供体分子的荧光发射波段和受体分子的能量吸收波段必须部分重叠，因此图2所示的曲线A₁、A₂、B₁、B₂的各个峰值波长均集中在狭小的波段上，且波长谱的一部分相互重叠。因此，当激光光源部22发射出用于激发供体分子的激光(例如，以频率f进行调制的激光)时，通过该激光不光是供体分子连受体分子也直接被激发而发出荧光(参照图3)。

在流式细胞仪10中，通过从激光光源部22照射激光，从FRET样品12发射出下述荧光：要进行测量的FRET样品12中的细胞的自发荧光(在图3中未表示)、FRET样品12中供体分子被激发而发出的荧光、受体分子被激发而发出的荧光，以及受体分子发出的FRET荧光。

受光部24按照夹着管道30与激光光源部22相对而置的方式进行配置，且具有光电转换器，光电转换器通过在测量点上通过的FRET样品12使激光发生前向散射，由此输出FRET样品12通过测量点的检测信号。由该受光部24所输出的信号被提供至控制和处理部28，在控制和处理部28中，上述信号可作为通知FRET样品12通过管道30中测量点的时间的触发信号来使用。

另一方面，受光部26按照相对于发射自激光光源部22的激光发射方向呈正交方向、且相对于管道30中的FRET样品12的移动方向呈正交方向的方式进行配置。受光部26具有光电倍增管或雪崩光电二极管等的光电转换器，接收FRET样品12在测量点被照射后所发出的荧光。

图4是表示受光部26的一例的概略构成的概略构成图。图4所示的受光部包括：透镜系统26a、分色镜26b₁、26b₂、带通滤波器26c₁、26c₂、光电转换器27a、27b。透镜系统26a对来自FRET样品12的荧光的荧光信号进行聚焦。光电转换器27a、27b中使用的是光电倍增管或雪崩光电二极管等。透镜系统26a按照将入射到受光部26的荧光聚焦在光电转换器27a、27b的受光面的方式构成。

分色镜26b₁、26b₂是对规定范围的波段的荧光进行反射而对其它荧光进行透射的分色镜。分色镜26b₁、26b₂的反射波段和透射波段按照用带通滤波器26c₁、26c₂进行过滤、且利用光电转换器27a、27b来捕获具有规定波段的荧光的方式来进行设定。

带通滤波器26c₁、26c₂被设置在各光电转换器27a、27b的受光面的前面，仅使具有规定波段的荧光透射。透射的荧光波段被设定在与荧光波段相对应的波段，因此具有互相不同的波段。

当作为供体分子使用CFP、作为受体分子使用YFP时，设定有可对用图2的曲线A₂来表示作为供体分子荧光的荧光和用图2的曲线B₂来表示作为受体分子荧光的荧光分别进行测量的波段。例如，作为用于主要透射来自供体分子的荧光(供体荧光)的波段(供体波段)设定在图2中箭头A所示的波段，作为用于主要透射来自受体分子的荧光(受体荧光)的波段(受体波段)设定在图2中箭头B所示的波段。

在此，如上所述，实际上供体荧光的波段和受体荧光的波段重叠，因此透射的供体波段的光(荧光)中还包括漏泄的受体荧光成分。同样地，在受体波段中也包括漏泄的供体荧光成分。可以说这样的漏泄随着FRET的发生条件(供体分子的荧光发射波段与受体分子的能量吸收波段部分重叠的现象)会必然发生。以往，这样的漏泄成分会成为测量和评价FRET发生的不确定因素，从而降低了测量和评价的精度。在本申请中，在测量结果中还考虑这种泄漏成分的影响，由此对FRET进行高精度地测量和评价，这是本申请的特征之一。

光电转换器27a、27b为包括如具有光电倍增管的传感器，且为在光电面将受光后的光转换为电信号的传感器。受光部26是按照光电转换器27a接收供体波段的光，光电转换器27b接收受体波段的光的方式来构成。

图5是通过照射来自激光光源部22的激光，对通过管道30的FRET样品12发出的荧光成分和各荧光成分入射到光电转换器27a和27b的受光面的情况进行说明的概略图。FRET样品12是作为供体分子的CFP、作为受体分子的YFP附着在发出自发荧光的细胞上的样品。如果激光光源部22发射出激光，则流过管道30的FRET样品12分别发出下述荧光：荧光f_d，FRET样品12中的供体分子被激光直接激发而发出；荧光f_a，FRET样品12中的受体分子被激光直接激发而发出；FRET样品12中的细胞自身所发出的自发荧光f_s；还有FRET荧光f_f，由受体分子发出。各个荧光通过反光镜或过滤器被分离为供体波段成分和受体波段成分，分别入射到光电转换器27a和27b。在此，可假设FRET荧光f_f比被激光直接激发而发出的其它荧光小、且相对于朝向供体波段漏泄的漏泄成分非常小。

光电转换器27a接收的光包括图5所示的R₁～R₃途径的荧光，光电转换器27b接收的光包括图5所示的R₄～R₇途径的荧光。流式细胞仪10的下述说明的各部分的处理分别是对用光电转换器27a来受光的光(供体波段的荧光)和用光电转换器27b来受光的光(受体波段的光)进行的处理。

在光电转换器27a和光电转换器27b中，以作为具有信号信息的光信号来进行受光，因此输出自光电转换器27a和光电转换器27b的电信号成为具有相位差的信号信息的荧光信号。该荧光信号被提供至控制和处理部28并通过放大器进行放大，然后传输至分析装置80。

如图6所示，控制和处理部28的构成包括信号生成部40、信号处理部42和控制部44。

信号生成部40是为了以规定频率对激光强度进行调制(振幅调制)而生成调制信号。

具体来说，信号生成部40包括振荡器46、功率分配器48和放大器50、52，信号生成部将所生成的调制信号提供给激光光源部22的同时也提供给信号处理部42。将调制信号提供给信号处理部42，这是因为如后所述，其可作为对输出自光电转换器27a、27b的荧光信号进行相位差检测的参照信号来使用。然而，调制信号作为具有规定频率的正弦波信号被设定在10～100MHz范围的频率。

在信号处理部42中，利用光电转换器27a、27b所输出的荧光信号，提取与FRET样品12受到激光照射后而发出的荧光的相位滞后(相位差)相关的信息。信号处理部42的构成包括：放大器54a和54b；具有功率分配器(未图示)和IQ混频器(未图示)的相位差检测器56。放大器54a和54b对光电转换器27a和27b所输出的荧光信号进行放大。未图示的功率分配器对被放大了的各个荧光信号分别分配提供自信号生成部40的作为正弦波信号的调制信号。未图示的IQ混频器在上述调制信号上合成被放大的荧光信号。

被设置在相位差检测器56的未图示的IQ混频器另设于光电转换器27a、27b之外，以便对提供自光电转换器27a、27b的荧光信号以提供自信号生成部40的调制信号作为参照信号来合成。具体来讲在各个IQ混频器中，将参照信号与荧光信号(RF信号)相乘，计算出含有荧光信号cos成分(实数部)和高频成分的处理信号，同时将参照信号的相位位移90度后的信号与荧光信号相乘，计算出含有荧光信号sin成分(虚数部)和高频成分的处理信号。含有cos成分的处理信号和含有sin成分的处理信号均被提供至控制部44。

具体来说，控制部44按照在信号生成部40生成具有规定频率的正弦波信号的方式进行控制，且从信号处理部42求得的含有荧光信号cos成分和sin成分的处理信号中去除高频成分，从而求出荧光信号的cos成分和sin成分。

具体来讲，控制部44包括系统控制器60、低通滤波器62、放大器64和A/D转换器66。系统控制器60给出控制各部分动作的指令，且对流式细胞仪10的整个动作进行控制管理。低通滤波器62从信号处理部42算出的、cos成分、sin成分上加有高频成分的处理信号中去除高频成分。放大器64对去除了高频成分的cos成分、sin成分的处理信号进行放大。A/D转换器66对被放大的处理信号进行取样。在A/D转换器66中，去除了高频信号的cos成分、sin成分的处理信号被取样后提供至分析装置80。

分析装置80是下述一种装置：从荧光信号的cos成分(实数部)、sin成分(虚数部)的处理信号值(检测值)中计算出各个荧光成分的荧光强度信息和相位信息、荧光寿命(荧光弛豫时间常数)、FRET效率等。例如，通过光电转换器27a得到的检测值中求出供体波段的荧光强度p_d和相位θ_d(测量值)，通过光电转换器27b得到的检测值中求出受体波段的荧光强度p_a和相位θ_a(测量值)。分析装置80与本发明的FRET检测装置相对应，实施后述的FRET检测方法。

图7是分析装置80的概略构成图。

分析装置80是在计算机上使规定程序启动的装置，其除了CPU82、存储器84、输入输出端口86之外，还包括通过启动软件来形成的第一校准单元88、第二校准单元90、第三校准单元92、第四校准单元94、荧光弛豫时间常数计算单元96和FRET效率计算单元98。另外，分析装置80连接有显示器94。

CPU82是设置在计算机上的计算处理器，其切实地执行第一校准单元88、第二校准单元90、第三校准单元92、第四校准单元94、荧光弛豫时间常数计算单元96和FRET效率计算单元98的各种计算。第一校准单元88进行自发荧光的校准，第二校准单元90进行第一分子校准，第三校准单元92进行第二分子校准，第四校准单元94进行非FRET校准。

存储器84包括：ROM，存储有通过在计算机上进行执行来形成第一校准单元88～第四校准单元94、荧光弛豫时间常数计算单元96和FRET效率计算单元98的程序；RAM，存储通过这些单元来计算的处理结果和提供自输入输出端口86的数据。

输入输出端口86用于接收提供自控制部44的荧光信号的cos成分(实数部)、sin成分(虚数部)的检测值的输入，且将通过各个单元来产生的处理结果的值或分布图等信息输出到显示器94上。显示器94显示各个单元求出的荧光振幅信息和相位差信息、荧光弛豫时间常数和FRET效率等的处理结果的值或分布图等的图表。

荧光弛豫时间常数计算单元96从提供自控制部44的cos成分和sin成分的检测值中求出由光电转换器27a和27b分别接收的荧光的荧光强度信息和相位信息(相位差的信息)。然后利用该荧光强度信息和相位信息、预先存储在存储器84的后述的校准信息，求出供体分子荧光成分的FRET荧光寿命、受体分子荧光成分的FRET荧光寿命和受体分子荧光成分的非FRET荧光寿命。供体分子荧光成分的FRET荧光寿命是指，产生FRET的情况下供体分子通过激光被激发而发出的荧光成分的荧光寿命。受体分子荧光成分的FRET荧光寿命是指，产生FRET的情况下受体分子通过激光被激发而发出的荧光成分的荧光寿命。另外，受体分子荧光成分的非FRET荧光寿命是指，不产生FRET的情况下受体分子通过激光被激发而发出的荧光成分的荧光寿命。各个荧光寿命由照射激光的FRET样品12的荧光成分均为一次滞后系统的弛豫响应时的荧光弛豫时间常数来表示。对于荧光弛豫时间常数计算单元96的详细情况会在后述。

在FRET效率计算单元98中，求出通过用荧光弛豫时间常数计算单元96所求出的供体分子荧光成分的FRET荧光寿命和供体分子荧光成分的非FRET荧光寿命之比来表示的FRET效率。供体分子荧光成分的非FRET荧光寿命被包括在校准信息中。供体分子荧光成分的非FRET荧光寿命是指，不产生FRET的情况下供体分子通过激光被激发而发出的荧光成分的荧光寿命。

FRET效率计算单元98中，也可以通过用荧光弛豫时间常数计算单元96所求出的受体分子荧光成分的FRET荧光寿命和受体分子荧光成分的非FRET荧光寿命等而计算出与上述FRET效率不同的值。对于FRET效率计算单元98的详细情况会在后述。

在此，对本发明的FRET检测方法的原理进行说明。如上所述，通过朝向具有供体分子和受体分子的FRET样品上照射主要用于激发供体分子的激光而发生FRET时，标记样品发射出图5所示的各个荧光(f_d、f_f、f_a、f_s)。

首先考虑：当用脉宽为0的理想的脉冲光源来激发FRET样品时含无辐射过程的荧光发光模式。脉冲响应(发射自单位体积的光子数量(荧光强度))由下述式(1)来表示。荧光分子吸收光之后该电子跃迁到激发态仅需10^-15秒，然后，从分子内弛豫过程开始计算经过10^-13～10^-11秒后，从第一激发态回落下来。如下述式(1)所示的模式，可以忽视这些吸收、分子内弛豫过程的动力学，仅将从第一激发态到发光跃迁过程作为对象。

【数式1】

$F\left(t\right)=k_{f}N\left(t\right)=k_f{N}_0{e}^{-(k_f+k_{\mathrm{nr}})t}=\frac{N_0}{{\mathrm{\τ}}_0}{e}^{-t/\mathrm{\τ}}---\left(1\right)$

其中，

N(t)：激发态下的单位体积中的荧光分子数(激发态密度函数)

N₀：在0时刻的激发态下单位体积中的荧光分子数

K_f：发光跃迁的速度常数(相对于单位时间内发生发光跃迁的分子数的比例)

K_nf：无辐射跃迁的速度常数(相对于单位时间内发生无辐射跃迁的分子数的比例)

τ₀≡1/k_f：假设为没有无辐射过程时的激发态寿命(自然寿命)

τ≡1/(k_f+k_nf)：荧光弛豫时间常数(荧光弛豫时间常数)

在此，N₀为依赖荧光分子的摩尔吸光系数和摩尔浓度的量，若荧光分子的标记量(相对于细胞的、供体分子和受体分子的附着量或状态)发生改变的话，N₀也发生变化。另外，k_f、k_nf与荧光分子的量子产额

以下述式(2)来表示。

【数式2】

$\frac{k_f}{k_f+k_{\mathrm{nr}}}=\mathrm{\φ}---\left(2\right)$

在脉冲响应被表示为式(1)的系统的微分方程式中，若将激光的入射功率设定为u(t)，则可由下述式来表示。

【数式3】

$\frac{\mathrm{dN}\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=-(k_f+k_{\mathrm{nr}})N\left(t\right)+N_{0}u\left(t\right)---\left(3\right)$

根据发出自这样的荧光分子的荧光发光的脉冲模式，考虑图5所示的对应于发生FRET时所产生的各个荧光成分的、荧光发光过程的动力学模式。当具有供体分子和受体分子的FRET样品中发生FRET时，供体分子中争相进行着发光跃迁、无辐射跃迁、激发能量转移。供体分子的供体波段上的荧光成分(对应于图5中的途径R₁)的模式可由下述式(4)和下述式(5)来表示。

【数式4】

$\frac{d{N}_d\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=-(k_d+k_t)N_d\left(t\right)+N_{d0}u\left(t\right)---\left(4\right)$

F_d(t)＝k_dfN_d(t)                    (5)

另一方面，受体分子中通过激发能量转移而被激发的荧光分子再被激发。在受体分子的受体波段上的荧光成分(对应于图5中的途径R₄和途径R₇)的模式可由下述式(6)和下述式(7)来表示。

【数式5】

$\frac{d{N}_a\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=k_t{N}_d\left(t\right)-k_a{N}_a\left(t\right)+N_{a0}u\left(t\right)---\left(6\right)$

F_a(t)＝k_afN_a(t)                    (7)

在此，N_d(t)为供体分子激发态下的单位体积中的荧光分子数；N _a (t)为受体分子激发态下的单位体积中的荧光分子数；K_d是供体分子的发光跃迁速度常数和无辐射跃迁速度常数之和；K_a是受体分子的发光跃迁速度常数和无辐射跃迁速度常数之和；K_df是供体分子的发光跃迁速度常数；K_af是受体分子的发光跃迁速度常数；N_d0是供体分子在0时刻激发态下的单位体积中的荧光分子数；N_a0是受体分子在0时刻激发态下的单位体积中的荧光分子数；K_t为从供体分子朝向受体分子的能量转移速度常数。其中，式(6)中的k_tN_d(t)项作为供体分子通过FRET而发射的荧光成分，对应于图5中的途径R₇的荧光成分。

另外，在供体分子的受体波段上的荧光成分(对应于图5中的途径R₅)模式可由下述式(8)和下述式(9)来表示。另外，在受体分子的供体波段上的荧光成分(对应于图5中的途径R₂)模式可由下述式(10)和下述式(11)来表示。然而，一般来说对于供体分子、受体分子的荧光动力学，即使在波段发生变化的情况下荧光动力学也不会发生变化，但此时假定上述荧光动力学是与一般的动力学不同的动力学。

【数式6】

$\frac{d{N}_{\mathrm{da}}\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=-k_{\mathrm{da}}{N}_{\mathrm{da}}\left(t\right)+N_{\mathrm{da}0}u\left(t\right)---\left(8\right)$

F_da(t)＝k_dafN_da(t)                    (9)

$\frac{d{N}_{\mathrm{ad}}\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=-k_{\mathrm{ad}}{N}_{\mathrm{ad}}\left(t\right)+N_{\mathrm{ad}0}u\left(t\right)---\left(10\right)$

F_ad(t)＝k_adfN_ad(t)                   (11)

在此，N_da(t)为供体分子在受体波段处于激发态时的单位体积中的荧光分子数；N_ad(t)为受体分子在供体波段处于激发态时的单位体积中的荧光分子数；K_da是供体分子在受体波段的发光跃迁速度常数和无辐射跃迁速度常数之和；K_ad是受体分子在供体波段的发光跃迁速度常数和无辐射跃迁速度常数之和；K_daf是供体分子在受体波段的发光跃迁速度常数；K_adf是受体分子在供体波段的发光跃迁速度常数；N_da0是供体分子在受体波段的0时刻处于激发态时的单位体积中的荧光分子数；N_ad0是受体分子在供体波段的0时刻处于激发态时的单位体积中的荧光分子数。

另外，细胞的自发荧光在供体波段上的荧光成分(对应于图5中的途径R₃)模式可由下述式(12)和下述式(13)来表示。另外，细胞的自发荧光在受体波段上的荧光成分(对应于图5中的途径R₆)模式可由下述式(14)和下述式(15)来表示。然而，在从细胞发出来的自发荧光中，由于考虑到还有来自多种分子的荧光，因此也认为上述模式与单一种类的荧光模式不同，但一般来说来自多种分子的荧光不是很强，因此在下述式(12)～下述式(15)中对这些综合特性按照一次近似的方式来计算。

【数式7】

$\frac{d{N}_{\mathrm{bd}}\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=-k_{\mathrm{bd}}{N}_{\mathrm{bd}}\left(t\right)+N_{\mathrm{bd}0}u\left(t\right)---\left(12\right)$

F_bd(t)＝k_bdfN_bd(t)                    (13)

$\frac{d{N}_{\mathrm{ba}}\left(t\right)}{\mathrm{dt}}=-k_{\mathrm{ba}}{N}_{\mathrm{ba}}\left(t\right)+N_{\mathrm{ba}0}u\left(t\right)---\left(14\right)$

F_ba(t)＝k_bafN_ba(t)                    (15)

对上述式(4)～上述式(15)实施拉普拉斯变换，且对每个供体波段和每个受体波段进行总结的话，供体波段上的荧光F_donor可由式(16)来表示，受体波段上的荧光F_accepter可由式(17)来表示。

【数式8】

$F_{\mathrm{donor}}\left(s\right)=(\frac{k_{\mathrm{df}}{N}_{d0}{\mathrm{\τ}}_d^{*}}{1+{\mathrm{\τ}}_d^{*}s}+\frac{k_{\mathrm{adf}}{N}_{\mathrm{ad}0}{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{ad}}}{1+{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{ad}}s}+\frac{k_{\mathrm{bdf}}{N}_{\mathrm{bd}0}{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{bd}}}{1+{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{bd}}s})\·U\left(s\right)---\left(16\right)$

$F_{\mathrm{acceptor}}\left(s\right)=\{k_{\mathrm{af}}(\frac{k_t{\mathrm{\τ}}_a}{1+{\mathrm{\τ}}_{a}s}\·\frac{N_{d0}{\mathrm{\τ}}_d^{*}}{1+{\mathrm{\τ}}_d^{*}s}+\frac{N_{a0}{\mathrm{\τ}}_a}{1+{\mathrm{\τ}}_{a}s})+\frac{k_{\mathrm{daf}}{N}_{\mathrm{da}0}{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{da}}}{1+{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{da}}s}+\frac{k_{\mathrm{baf}}{N}_{\mathrm{ba}0}{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{ba}}}{1+{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{ba}}s}\}\·U\left(s\right)---\left(17\right)$

其中，

τ_d ^*：发生FRET时的供体分子的荧光弛豫时间常数＝1/(k_d+k_t)

(k_t＝0(非FRET时)、τ_d ^*＝τ_d＝1/k_d)

τ_a：受体分子的荧光弛豫时间常数＝1/k_a

τ_ad：受体分子在供体波段上的荧光弛豫时间常数＝1/k_ad

τ_da：供体分子在受体波段上的荧光弛豫时间常数＝1/k_da

τ_bd：细胞的自发荧光在供体波段上的荧光弛豫时间常数＝1/k_bd

τ_ba：细胞的自发荧光在受体波段上的荧光弛豫时间常数＝1/k_ba.

图8是由式(16)、(17)来表示的、表示发生FRET时的荧光发光动力学的模式。可认为，FRET样品12经过图8所示的W₁～W₇过程发出各种荧光成分。在本发明中，可以认为：用这样的模式来表示的、经过W₁～W₇过程而发射出的各种荧光成分与图4所示的入射到光电转换器27a和27b的荧光成分(R₁～R₇)相对应。

在流式细胞仪10中，激光光源部22将调制了频率的激光输出信号高速地改变(调制)成正弦波信号后照射在样品上，并对样品所发射出的荧光强度信号进行高速处理，检测出每个细胞的振幅(荧光强度信息)和相位(相位信息)。即，检测出式(16)和式(17)的传递函数的频率响应特性。若对朝向激光功率u(t)施加角频率ω_M的正弦波时的荧光信号进行测量，则荧光信号以具有相同角频率的正弦波来发射。对于输入信号和输出信号的振幅之比和相位差，作为式(16)和式(17)的s＝jω_M时的、多个平面上的矢量总和，能够由下述式(18)和式(19)来表示。

【数式9】

$\frac{F_{\mathrm{donor}}\left(s\right)}{U\left(s\right)}=P_1{e}^{j{\mathrm{\θ}}_1}+P_2{e}^{j{\mathrm{\θ}}_2}+P_3{e}^{j{\mathrm{\θ}}_3}---\left(18\right)$

$\frac{F_{\mathrm{acceptor}}\left(s\right)}{U\left(s\right)}=P_7{e}^{j{\mathrm{\θ}}_7}{+P}_4{e}^{j{\mathrm{\θ}}_4}+P_5{e}^{j{\mathrm{\θ}}_5}+P_6{e}^{j{\mathrm{\θ}}_6}---\left(19\right)$

$P_1=\frac{k_{\mathrm{df}}{N}_{d0}{\mathrm{\τ}}_d^{*}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\τ}}_d^{*}{\mathrm{\ω}}_M\right)}^2}},$ ${\mathrm{\θ}}_1=-{\tan }^{-1}{\mathrm{\τ}}_d^{*}{\mathrm{\ω}}_M$

$P_2=\frac{k_{\mathrm{adf}}{N}_{\mathrm{ad}0}{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{ad}}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\τ}}_{\mathrm{ad}}{\mathrm{\ω}}_M\right)}^2}},$ θ₂＝-tan^-1τ_adω_M

$P_3=\frac{k_{\mathrm{bdf}}{N}_{\mathrm{bd}0}{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{bd}}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\τ}}_{\mathrm{bd}}{\mathrm{\ω}}_M\right)}^2}},$ θ₃＝-tan^-1τ_bdω_M

$P_7=k_{\mathrm{af}}\frac{k_t{\mathrm{\τ}}_a}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\τ}}_a{\mathrm{\ω}}_M\right)}^2}}\frac{N_{d0}{\mathrm{\τ}}_d^{*}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\τ}}_d^{*}{\mathrm{\ω}}_M\right)}^2}},$ ${\mathrm{\θ}}_7=-({\tan }^{-1}{\mathrm{\τ}}_a{\mathrm{\ω}}_M+{\tan }^{-1}{\mathrm{\τ}}_d^{*}{\mathrm{\ω}}_M)=-{\tan }^{-1}\frac{({\mathrm{\τ}}_a+{\mathrm{\τ}}_d^{*}){\mathrm{\ω}}_M}{1-{\mathrm{\τ}}_a{\mathrm{\τ}}_d^{*}{\mathrm{\ω}}_M^2}$

$P_4=\frac{k_{\mathrm{af}}{N}_{a0}{\mathrm{\τ}}_a}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\τ}}_a{\mathrm{\ω}}_M\right)}^2}},$ θ₄＝-tan^-1τ_aω_M

$P_5=\frac{k_{\mathrm{daf}}{N}_{\mathrm{da}0}{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{da}}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\τ}}_{\mathrm{da}}{\mathrm{\ω}}_M\right)}^2}},$ θ₅＝-tan^-1τ_daω_M

$P_6=\frac{k_{\mathrm{baf}}{N}_{\mathrm{ba}0}{\mathrm{\τ}}_{\mathrm{ba}}}{\sqrt{1+{\left({\mathrm{\τ}}_{\mathrm{ba}}{\mathrm{\ω}}_M\right)}^2}},$ θ₆＝-tan^-1τ_baω_M

然而可知，式(18)的第一项对应于图8的W₁；第二项对应于图8的W₂；第三项对应于图8的W₃；另外，式(19)的第一项对应于图8的W₇(FRET成分)；第二项对应于图8的W₄；第三项对应于图8的W₅；第四项对应于图8的W₆。

以往，难以定量地求出发生FRET时的供体分子的荧光弛豫时间常数τ_d ^*或发生FRET时的受体分子的等效荧光弛豫时间常数τ_a ^*(＝tanθ₇/ω_M)。然而如果能分别求出τ_d ^*和τ_a ^*的话，就能高精度地检测出FRET的发生。从上述关系中可知，若知道P₁、θ₁就能求出τ_d ^*，若求出上述P₇、θ₇就能求出τ_a ^*。

在此，若将供体波段的荧光(包括图8中的W₁～W₃)的荧光强度设定为P_donor、相位设定为θ_donor，则式(18)可变形为下述式(20)。从式(20)能够判断出：若知道在供体波段的(包括图8中的W₁～W₃)荧光强度P_donor、相位θ_donor，P₂/P₄、P₄、P₃和θ₃，则能求出P₁和θ₁。

【数式10】

$P_1{e}^{j{\mathrm{\θ}}_1}=P_{\mathrm{donor}}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{donor}}}-P_2{e}^{j{\mathrm{\θ}}_2}-P_3{e}^{j{\mathrm{\θ}}_3}$

$=P_{\mathrm{donor}}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{donor}}}-\frac{P_2}{P_4}{P}_4{e}^{j{\mathrm{\θ}}_2}-P_3{e}^{j{\mathrm{\θ}}_3}---\left(20\right)$

另外，若将受体波段的荧光(包括图8中的W₄～W₇)的荧光强度设定为P_acceptor、相位设定为θ_acceptor，则式(19)可变形为下述式(21)。从式(21)能够判断出：若知道在受体波段的荧光强度P_acceptor、相位θ_acceptor，P₅/P₁、P₁、P₆和θ₆，则能求出P₇和θ₇。

【数式11】

$P_7{e}^{j{\mathrm{\θ}}_7}=P_{\mathrm{acceptor}}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{acceptor}}}-P_4{e}^{j{\mathrm{\θ}}_4}-P_5{e}^{j{\mathrm{\θ}}_5}-P_6{e}^{j{\mathrm{\θ}}_6}$

$=P_{\mathrm{acceptor}}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{acceptor}}}-P_4{e}^{j{\mathrm{\θ}}_4}-\frac{P_5}{P_1}{P}_1{e}^{j{\mathrm{\θ}}_5}-P_6{e}^{j{\mathrm{\θ}}_6}---\left(21\right)$

在分析装置80的荧光弛豫时间常数计算单元96中，首先，当将上述激光照射在附着有供体分子和受体分子的标记样品上时，从上述cos成分和sin成分中求出此时供体波段的荧光(包括图5中的R₁～R₃)的荧光强度P_d和相位θ_d、以及受体波段的荧光(包括图5中的R₄～R₇)的荧光强度P_a和相位θ_a。测量值P_d对应于上述P_donor、θ_d对应于上述θ_donor；同样地P_a对应于P_acceptor、θ_a对应于θ_acceptor。在分析装置80的存储器84中，存储有通过后述的第一校准单元88～第四校准单元94来计算的、对应于上述P₂/P₄、P₃和θ₃、P₆和θ₆、P₄的值，并利用这些值求出P₁和θ₁或者P₇和θ₇。然后从附带在上述式(18)和式(19)的P_i和θ_i(i＝1～7的整数)的定义式和τ_a ^*＝tanθ₇/ω_M的定义式中，求出τ_d ^*、τ_a ^*、τ_a，即求出供体分子荧光成分的FRET荧光寿命、受体分子荧光成分的FRET荧光寿命和受体分子荧光成分的非FRET荧光寿命。此时，荧光弛豫时间常数计算单元96中，将如式(20)和式(21)所示的、用相位和振幅来表示的式转换为矢量后进行矢量计算。

在FRET效率计算单元98中，利用供体波段中供体分子的荧光成分(对应于不发生FRET的情况下的图4中的途径R₁)的荧光弛豫时间常数τ_d，求出规定在下述式(22)的FRET效率E_t。然而，该荧光弛豫时间常数τ_d例如通过后述的第二校准单元90或第四校准单元97被预先求出，并存储在存储器84。

【数式12】

$E_t=1-{\mathrm{\τ}}_d^{*}/{\mathrm{\τ}}_d---\left(22\right)$

对于供体分子的荧光弛豫时间常数来说，FRET的发生程度越大即从供体分子朝向受体分子的能量转移越大，供体分子的荧光弛豫时间常数越短。这样的FRET效率E_t表示从从供体分子朝向受体分子的能量转移程度(FRET程度)。

另外，在本发明中，也从受体分子的波段中的测量结果中定量地测量出FRET。当然，荧光弛豫时间常数τ_a也可以使用存储在存储器84的值。该荧光弛豫时间常数τ_a，例如也可以使用通过后述的第三校准单元92或第四校准单元97预先求出且被存储的值。

适用下述式(23)，从受体分子的荧光弛豫时间常数τ_a和τ_a ^*中求出发生FRET时的供体分子的荧光弛豫时间常数τ_d ^*，由此不仅从供体波段而且从受体波段两个波段中多方面地求出发生FRET时的荧光弛豫时间常数信息。

【数式13】

${\mathrm{\τ}}_a^{*}\≡\tan {\mathrm{\θ}}_t/{\mathrm{\ω}}_M=\frac{{\mathrm{\τ}}_a+{\mathrm{\τ}}_d^{*}}{1-{\mathrm{\τ}}_a{\mathrm{\τ}}_d^{*}{\mathrm{\ω}}_M^2}---\left(23\right)$

接下来，分别对第一校准单元88～第四校准单元94进行说明。在第一校准单元88中，将由不附着有荧光色素的细胞等的发出自发荧光的样品组成的样品作为无标记样品时，求出该无标记样品发出的自发荧光的荧光强度信息和相位信息。在第一校准单元88中，以无标记样品作为测量对象物且朝向该测量物照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个光电转换器中收集含有相位信息的检测值，并从这些检测值求出荧光强度信息和相位信息。

具体来讲，在第一校准部88中，如图9所示，朝向无标记样品照射激光，求出细胞自身所发出的荧光在供体波段和受体波段的荧光强度信息和相位信息。在此，可以假定细胞自身所发出的荧光不受供体分子或受体分子等标记的影响。即，在第一校准部88获得的、供体波段中的自发荧光的荧光强度测量值P_md1、供体波段中的自发荧光的相位测量值θ_md1表示的是由图5所示的R₃来表示的荧光成分的信息。受体波段中自发荧光的荧光强度的测量值P_ma1、受体波段中自发荧光的相位差的测量值θ_ma1表示的是由图5所示的R₆来表示的荧光成分的信息。这样的测量值可直接用于图8所示的FRET发生过程的模式，且使下述式(24)和下述式(25)的关系成立。这样求出来的P₃和θ₃、P₆和θ₆均被存储在存储器84。

【数式14】

$P_3{e}^{j{\mathrm{\θ}}_3}=P_{\mathrm{md}1}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{md}1}}---\left(24\right)$

$P_6{e}^{j{\mathrm{\θ}}_6}=P_{\mathrm{ma}1}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{ma}1}}---\left(25\right)$

在第二校准单元90中，对于仅具有供体荧光色素的供体标记样品，求出该供体标记样品发出荧光的荧光强度和相位。而且利用所求出的供体标记样品的荧光强度和相位信息、以及在第一校准单元所求出的无标记样品的荧光强度和相位(P₃和θ₃、P₆和θ₆)，从而求出相对于供体波段的荧光成分的荧光强度的、受体波段的荧光成分的荧光强度之比(供体荧光漏泄率)。

具体来讲，在第二校准部90中，如图10所示，朝向供体标记样品照射激光，并求出供体分子发出的荧光和细胞自身发出的荧光在供体波段和受体波段的荧光强度和相位。在此，将在第二校准部90所获得的、供体波段中的荧光的荧光强度的测量值设定为P_md2、供体波段中的荧光的相位差的测量值设定为θ_md2、受体波段中的荧光的荧光强度的测量值设定为P_ma2、受体波段中的荧光的相位差的测量值设定为θ_ma2。而且，若将供体标记样品的供体分子所发出的荧光(用图10中的R₁’来表示)在供体波段的荧光强度设定为P₁’、将该荧光的相位设定为θ₁’、将供体标记样品的供体分子所发出的荧光(用图10中的R₅’来表示’)在受体波段上的荧光强度设定为P₅’、将该荧光的相位设定为θ₅’，则下述式(26)和下述式(27)的关系成立。如上所述，对于自发荧光的成分可直接使用第一校准单元求出的值。

【数式15】

${P_1}^{,}{e}^{j{{\mathrm{\θ}}_1}^{,}}=P_{\mathrm{md}2}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{md}2}}-P_2{e}^{j{\mathrm{\θ}}_3}---\left(26\right)$

${P_5}^{,}{e}^{j{{\mathrm{\θ}}_5}^{,}}=P_{\mathrm{ma}2}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{ma}2}}-P_6{e}^{j{\mathrm{\θ}}_6}---\left(27\right)$

在第二校准单元90中，从存储器84调出第一校准单元88求出的P₃和θ₃、P₆和θ₆，且利用式(26)和式(27)的关系，求出P₁’和θ₁’、P₅’和θ₅’。在第二校准单元90中，也可以根据这些结果求出没有发生FRET时的供体分子在供体波段中的荧光弛豫时间常数τ_d、供体分子在受体波段中的荧光弛豫时间常数τ_da。

如上所述，发生FRET时，在供体分子中同时进行发光跃迁、无辐射跃迁、激发能量转移。而且，如果标记量不同，则荧光强度也不同，因此P₁’和θ₁’、P₅’和θ₅’不能作为表示可由图5所示的R1或R5来表示的荧光成分的信息，且这样的测量值无法直接用于图8所示的FRET发生过程的模式。但是，对于供体分子的荧光在供体波段中的荧光强度和供体分子的荧光在受体波段中的荧光强度之比P₅’/P₁′(供体荧光的漏泄率)，可以假定即使是在样品不同的情况下，其值也是一定的。即，能够在式(20)和式(21)中表示为P₅/P₁＝P₅’/P₁′。第二校准单元90所求出的P₅’/P₁′(以下表示为P₅/P₁)被存储在存储器84。然而，此时，将P₁’和θ₁’、P₅’和θ₅’、还有不发生FRET情况下供体分子在供体波段中的荧光弛豫时间常数τ_d、供体分子在受体波段中的荧光弛豫时间常数τ_da值等也一并存储下来。

在第三校准单元92中，对仅具有受体荧光色素的受体标记样品，求出该受体标记样品所发出的荧光的荧光强度和相位。而且利用所求出的受体标记样品的荧光强度和相位信息、以及第一校准单元所求出的无标记样品的荧光强度和相位(P₃和θ₃、P₆和θ₆)，求出相对于受体波段的荧光成分的荧光强度的、供体波段的荧光成分的荧光强度之比(受体荧光漏泄率)。

具体来讲，在第三校准部92中，如图11所示，朝向受体标记样品照射激光，求出受体分子发出的荧光和细胞自身发出的荧光在供体波段和受体波段中的荧光强度和相位。将在第三校准部92所获得的供体波段中的荧光的荧光强度的测量值设定为P_md3、供体波段中荧光的相位差的测量值设定为θ_md3、受体波段中的荧光的荧光强度的测量值设定为P_ma3、受体波段中荧光的相位差的测量值设定为θ_ma3。而且，若将受体标记样品的受体分子所发出的荧光(用图11中的R₂’来表示)在供体波段上的荧光强度设定为P₂’、将该荧光的相位设定为θ₂’、将受体标记样品的受体体分子所发出的荧光(用图11中的R₄’来表示)在受体波段上的荧光强度设定为P₄’、将该荧光的相位设定为θ₄’，则下述式(28)和下述式(29)的关系成立。如上所述，对于自发荧光的成分可直接使用第一校准单元求出来的值。

【数式16】

${P_2}^{,}{e}^{j{{\mathrm{\θ}}_2}^{,}}=P_{\mathrm{md}3}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{md}3}}-P_3{e}^{j{\mathrm{\θ}}_3}---\left(28\right)$

${P_4}^{,}{e}^{j{{\mathrm{\θ}}_4}^{,}}=P_{\mathrm{ma}3}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{ma}3}}-P_6{e}^{j{\mathrm{\θ}}_6}---\left(29\right)$

在第三校准单元92中，从存储器84调出第一校准单元88求出的P₃和θ₃、P₆和θ₆，且利用式(30)和式(31)的关系，从而求出P₂’和θ₂’、P₄’和θ₄’。在第三校准单元92中，也可以根据这些结果求出没有发生FRET时受体分子的荧光弛豫时间常数τ_a、受体分子在供体波段中的荧光弛豫时间常数τ_ad。如上所述，如果标记量不同，则荧光强度也不同，因此P₂’和θ₂’、P₄’和θ₄’不能适用于图8所示的发生FRET时的模式。但是，对于受体分子的荧光在受体波段中的荧光强度和受体分子的荧光在供体波段中的荧光强度之比P₂’/P₄′(受体荧光的漏泄率)，可以假定即使是在样品不同的情况下，其值也是一定的。即，在式(20)和式(21)中能够表示为P₂/P₄＝P₂’/P₄′。第三校准单元92所求出的P₂’/P₄′(以下表示为P₂/P₄)被存储在存储器84。然而，此时，对P₂’和θ₂’、P₄’和θ₄’、不发生FRET的情况下受体分子在受体波段中的荧光弛豫时间常数τ_a、受体分子在供体波段中的荧光弛豫时间常数τ_ad值等也一并存储下来。

在第四校准单元94中，对具有供体荧光分子和受体荧光分子两种荧光分子、且为了不产生FRET按照导入对蛋白质的结构变化和结合表现出非活性的非活性因子等的方式进行了调整和处理的非FRET样品，求出该非FRET样品所发出的荧光强度和相位信息。而且利用所求出的非FRET的荧光强度和相位信息、第一校准单元求出的无标记样品的荧光强度和相位(P₃和θ₃、P₆和θ₆)、第二校准单位90求出的供体荧光的漏泄率(P₅/P₁)、第三校准单元92求出的受体分子荧光的漏泄率(P₂/P₄)，求出受体标记样品通过激光直接被激发后发出的荧光的荧光强度(下述式(31)中的P₄”)和相位(下述式(31)中的θ₄”)。

具体来讲，在第四校准单元94中，如图12所示朝向非FRET样品照射激光，求出非FRET样品中供体分子和受体分子分别发出的荧光、以及细胞自身所发出的荧光在供体波段和受体波段的荧光强度和相位，即求出下述式(30)、(31)中的P₁”、θ₁”、P₄”和θ₄”。将在第四校准单元94所获得的供体波段中的荧光的荧光强度的测量值设定为P_md4、供体波段中荧光的相位差的测量值设定为θ_md4、受体波段中的荧光的荧光强度的测量值设定为P_ma4、受体波段中荧光的相位差的测量值设定为θ_ma4；且若将非FRET样品中供体分子所发出的荧光(用图12中的R₁”来表示)在供体波段上的荧光强度设定为P₁”、同样地将该荧光的相位设定为θ₁”、将非FRET样品的受体分子所发出的荧光(用图12中的R₂”来表示)在供体波段上的荧光强度设定为P₂”、同样地将该荧光的相位设定为θ₂”、将非FRET样品中供体分子所发出的荧光在受体波段上的荧光(用图12中的R₅”来表示)的荧光强度设定为P₅”、同样地将该荧光的相位设定为θ₅”、非FRET样品的受体分子发出的荧光在受体波段中的荧光(用图12中的R₄”来表示)的荧光强度设定为P₄”、同样地将该荧光的相位设定为θ₄”，则下述式(30)和下述式(31)的关系成立。如上所述，对于自发荧光的成分可直接使用第一校准单元求出来的值。

【数式17】

${P_1}^{,,}{e}^{j{{\mathrm{\θ}}_1}^{,,}}=P_{\mathrm{md}4}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{md}4}}-{P_2}^{,,}{e}^{j{{\mathrm{\θ}}_2}^{,,}}-P_3{e}^{j{\mathrm{\θ}}_3}$

$=P_{\mathrm{md}4}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{md}4}}-\frac{{P_2}^{,,}}{{P_4}^{,,}}{P_4}^{,,}{e}^{j{{\mathrm{\θ}}_2}^{,,}}-P_3{e}^{j{\mathrm{\θ}}_3}---\left(30\right)$

${P_4}^{,,}{e}^{j{{\mathrm{\θ}}_4}^{,,}}=P_{\mathrm{ma}4}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{ma}4}}-{P_5}^{,,}{e}^{j{{\mathrm{\θ}}_5}^{,,}}-P_6{e}^{j{\mathrm{\θ}}_6}$

$=P_{\mathrm{ma}4}{e}^{j{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{ma}4}}-\frac{{P_5}^{,,}}{{P_1}^{,,}}{P_1}^{,,}{e}^{j{{\mathrm{\θ}}_5}^{,,}}-P_6{e}^{j{\mathrm{\θ}}_6}---\left(31\right)$

对于式(31)中的P₅”/P₁”，如上所述，可以直接使用第二校准单元90所求出的供体荧光的漏泄率(P₅/P₁)(其原因是：对于供体荧光的漏泄率，即使标记量发生了改变，漏泄率也不会发生变化)。同样地对于P₂”/P₄”，如上所述，也可以直接使用第四校准单元92所求出的受体荧光的漏泄率(P₂/P₄)。在第四校准单元94中，从存储器84调出第一校准单元88所求出的P₃和θ₃、P₆和θ₆，另外，调出第二校准单元90所求出的P₅/P₁、第三校准单元92所求出的P₂/P₄，且利用式(30)和式(31)的关系求出P₄”和θ₄”。同时求出P₁”和θ₁”。θ₂”使用了由第三校准单元所求出的θ₂’、θ₅”使用了由第二校准单元所求出的θ₅’。然而，式(30)和式(31)通过P₁”、P₄”而相互进行干涉，但由于P₅”/P₁”或P₂”/P₄”的值在0～之间，因此求出P₄”和θ₄”的解时，例如使用逐次代入法使得解收敛，由此能够简单地求出解。

P₄”和θ₄”是在样品上附着有供体分子和受体分子的情况下的、受体标记样品通过激光直接被激发后发出荧光的荧光强度和相位。从式(21)中可知，发生FRET时的受体分子的荧光中，在通过直接激发而发生的受体的荧光项上仅添加有FRET荧光项。因此，对于受体标记样品通过激光直接被激发而发出荧光的荧光强度和相位，也可以直接使用与测量FRET的样品具有相同标记量(受体分子和供体分子两种分子附着在细胞上的状态)的非FRET细胞的测量结果(P₄”和θ₄”)(可作为P₄”＝P₄和θ₄”＝θ₄来使用)。

荧光弛豫时间常数计算单元96如此地利用由第一校准单元88～第四校准单元94计算出且存储在存储器84的各个信息(P₂/P₄、P₃和θ₃、P₆和θ₆、P₄等值)、作为FRET样品12的测量值的P_donor和θ_donor、同样地P_acceper和θ_acceper、上述式(20)和式(21)，求出τ_d ^*或者τ_a ^*。然后，FRET效率计算单元98求出由式(22)来表示的FRET效率E_t。

在这样的流式细胞仪10中进行如图13所示的处理，由此FRET效率被计算出来。对于各处理的详细情况如上所述。首先，准备FRET样品(步骤S10)。此时，多个FRET样品在测量溶液中以浑浊的状态准备，该FRET样品溶液利用鞘液在管道30内形成流动池。朝向该流动池照射以规定频率进行了强度调制的激光后进行荧光的测量(步骤S20)。

荧光测量是根据通知FRET样品12通过管道30中的测量点的时间的、受光部24生成的触发信号，开始通过波段各不相同的光电转换器27a和27b来进行的测量。在通过测量所获得的荧光信号中，含有荧光信号的cos成分和sin成分的处理信号被信号处理部42的相位差检测器56捕获。该处理信号中的高频信号被控制部44中的低通滤波器62去除，由此荧光信号的cos成分和sin成分通过AD转换后被求出来。

求出来的cos成分和sin成分被提供至分析装置80，被求出测量信息(各FRET样品在供体受光波段中的荧光强度信息和相位信息、在受体波段中的荧光强度和相位信息)。然后，利用在规定的测量时间内所求出的、供体受光波段的荧光强度信息和受体受光波段中的荧光强度信息，将分布图(二维相关图)显示在显示器94上(步骤S30)。

接下来，为了对发生FRET的样品进行特定，在被显示在显示器94的分布图中选择发生了FRET的样品在荧光领域的样品群。该选择可以通过操作员使用鼠标等输入操作系统来进行，也可以例如通过CPU82来进行自动选择。包括在被选择的样品群领域内的FRET样品的荧光强度信息或相位信息的代表值(例如，平均值、重心值、频率峰值)(步骤S40)被求出。将该代表值作为上述的P_d和θ_d、P_a和θ_a来使用。

接下来，从分析装置80的存储器84中读取通过第一校准单元88～第四校准单元94预先计算出来而被存储的各个校准信息(第一校准信息～第四校准信息)(步骤S50)。

然后，利用上述的P_d和θ_d、P_a和θ_a和各校准信息求出P₁和θ₁或者P₇和θ₇，从而求出τ_d ^*、τ_a ^*或者τ_a，即求出供体分子荧光成分的FRET荧光寿命、或者、受体分子荧光成分的FRET荧光寿命、受体分子荧光成分的非FRET荧光寿命等。此时，在荧光弛豫时间常数计算单元96中，将由如式(20)和式(21)所示的相位和振幅来表示的式转变为矢量，并逐次进行矢量计算(步骤S60)。

然后，利用供体波段中供体分子的荧光成分(不发生FRET的状态下的、对应于图5中的途径R₁)的荧光弛豫时间常数τ_d，例如求出FRET效率E_t(步骤S70)。

图14是在流式细胞仪10中进行的第一校准流程图。在第一校准中首先准备无标记样品(步骤S110)。

接下来，在流式细胞仪中对无标记样品进行测量(步骤S120)。对于通过流式细胞仪来进行的测量(步骤S120)和分布图的显示器显示(步骤S130)、在无标记样品的荧光领域中进行样品群的选择(步骤S140)，由于其与图13所示的步骤S20～步骤S40进行相同的处理，因此省略其说明。在第一校准中，将上述步骤S140中被提取的代表值作为上述P_md1、θ_md1和P_ma1、θ_ma1。然后，该测量信息的代表值P_md1、θ_md1和P_ma1、θ_ma1作为第一校准信息被存储在存储器84(步骤S150)。第一校准信息表示：当朝向无标记样品照射激光时，细胞自身发出的荧光在供体波段和受体波段的荧光强度信息P₃、P₆和相位信息θ₃、θ₆。然而，利用第一校准求出的各种信息(第一校准信息)和第一校准中详细的处理情况与之前所述相同。

图15是在流式细胞仪10中进行的第二校准流程图。在第二校准中首先准备供体标记样品(步骤S210)。

接下来，在流式细胞仪中对供体标记样品进行测量(步骤S220)。对于通过流式细胞仪来进行的测量(步骤S220)和分布图的显示器显示(步骤S230)、在供体标记样品的荧光领域中进行样品群选择(步骤S240)，由于其与图13所示的步骤S20～步骤S40进行相同的处理，因此省略其说明。在第二校准中，将上述步骤S240中被提取的代表值作为上述P_md2、θ_md2和P_ma2、θ_ma2。接下来，从存储器84中读取第一校准单元所求出的第一校准信息(步骤S250)。然后，利用P_md2、θ_md2和P_ma2、θ_ma2和第一校准信息计算出第二校准信息(步骤S260)。在第二校准信息中包括P₅/P₁，P₅/P₁表示在供体标记样品发出的荧光中相对于供体波段的荧光成分的荧光强度的、受体荧光波段的荧光成分的荧光强度之比(供体荧光漏泄率)。此时，如上所述，也可以求出不发生FRET时的、供体分子在供体波段中的荧光弛豫时间常数τ_d、供体分子在受体波段中的荧光弛豫时间常数τ_da等。这些常数也被包括在第二校准信息中。该第二校准信息被存储在存储器84(步骤S270)。然而，利用第二校准求出的第二校准信息和第二校准中详细的处理情况与之前所述相同。

图16是在流式细胞仪10中进行的第三校准流程图。在第三校准中首先准备受体标记样品(步骤S310)。

接下来，在流式细胞仪中对受体标记样品进行测量(步骤S320)。对于通过流式细胞仪来进行的测量(步骤S320)和分布图的显示器显示(步骤S330)、在受体标记样品的荧光领域中进行样品群的选择(步骤S340)，由于其与图13所示的步骤S20～步骤S40进行相同的处理，因此省略其说明。在第三校准中，将上述步骤S340中被提取的代表值作为上述P_md3、θ_md3和P_ma3、θ_ma3。接下来，从存储器84中读取第一校准单元所求出的第一校准信息(步骤S350)。然后，利用P_md3、θ_md3和P_ma3、θ_ma3和第一校准信息计算出第三校准信息(步骤S360)。在第三校准信息中包括P₂/P₄，P₂/P₄表示在受体标记样品发出的荧光中相对于受体波段的荧光成分的荧光强度的、供体荧光波段的荧光成分的荧光强度之比(受体荧光漏泄率)。此时，如上所述，也可以求出不发生FRET时的、受体分子在受体波段中的荧光弛豫时间常数τ_a、受体分子在供体波段中的荧光弛豫时间常数τ_ad等。这些常数也被包括在第三校准信息中。该第三校准信息被存储在存储器84(步骤S370)。然而，利用第三校准求出的第三校准信息和第三校准中详细的处理情况与之前所述相同。

图17是在流式细胞仪10中进行的第四校准流程图。在第四校准中首先准备非FRET样品(步骤S410)。

接下来，在流式细胞仪中对非FRET样品进行测量(步骤S420)。对于通过流式细胞仪来进行的测量(步骤S420)和分布图的显示器显示(步骤S430)、在非FRET样品中的荧光样品群的选择(步骤S440)，由于其与图13所示的步骤S20～步骤S40进行相同的处理，因此省略其说明。在第四校准中，将上述步骤S440中被提取的代表值作为上述P_md4、θ_md4和P_ma4、θ_ma4。接下来，从存储器84中读取第一～第三校准单元所求出的第一～第三校准信息(步骤S450)。然后，利用P_md4、θ_md4和P_ma4、θ_ma4和第一～第三校准信息计算出第四校准信息(步骤S460)。在第四校准信息中包括表示受体标记样品通过激光直接被激发而发出荧光的荧光强度P₄和相位θ₄的信息。而且所求出的第四校准信息被存储在存储器84(步骤S470)。通过第一～第四校准求出来的各个校准信息均被用于由图13所示的流程图来表示的、使用FRET样品的FRET的检测。然而，利用第四校准求出的各种信息(第四校准信息)和第四校准中详细的处理情况与之前所述相同。

如上所述，在本发明中，利用标记量与FRET标记样品不同的样品(供体标记样品或受体标记样品)预先求出测量FRET的对象的标记量不变的、供体分子荧光漏泄率(P₅/P₁)或受体荧光漏泄率(P₂/P₄)。利用这样的漏泄率信息来处理FRET样品的测量信息，因此能够高精度地求出FRET样品的荧光寿命。另外，使用经过处理以不发生FRET的非FRET样品，预先求出受体分子经过激光直接被激发而产生的荧光成分。通过利用这样的信息来处理FRET样品的测量信息，能够更高精度地求出FRET样品的荧光寿命。另外，通过去除附着有供体分子或受体分子的细胞所发出的自发荧光，能够更高精度地求出FRET样品的荧光寿命。

然而，在上述的实施例中，使用具有供体荧光分子和受体荧光分子两种分子、且通过导入对蛋白质的结构变化或结合具有非活性的非活性因素以不发生FRET的方式进行调整和处理的非FRET样品。通过求出该非FRET样品发出的荧光的荧光强度和相位信息，而求出受体标记样品通过激光直接被激发而发出的荧光成分的荧光强度和相位。例如，朝向被标记为受体分子的样品照射两种具有不同波长的激光，受体分子通过各个激光被激发而发出荧光时，可以假定在一个波段上进行测量的来自各个激光的荧光成分之比与样品的标记量无关，是一定的。即，可以假定通过两个激光而发出荧光的FRET标记样品的荧光成分之比相对于通过两个激光而发出荧光的受体标记样品的荧光成分比的变化量与FRET成分有关。若求出通过该两个激光而发出荧光的受体标记样品的荧光成分之比，则可以说通过两个激光而发出荧光的FRET标记样品的荧光成分之比，能够求出受体标记样品通过激光直接被激发而发出的荧光成分的荧光强度信息或相位信息。在本申请中，也可以通过这种方式求出受体标记样品通过激光直接被激发而发出的荧光成分的荧光强度或相位信息。然而，作为对两个激光发出的荧光成分进行独立检测的装置，可以使用本申请的申请人作为在先申请而提出的、记载在特愿2005-37399号说明书和特愿2006-054347号说明书上的装置。

综上所述，对本发明的FRET检测方法和FRET检测装置进行了详细的说明，但本发明并不限定在上述实施例，当然可以在不脱离本发明主题的范围内所进行各种改进或改变。

Claims (22)

1.一种FRET检测方法，将激光照射在用第一分子和第二分子进行了标记的测量对象样品上，此时通过接收测量对象样品所发出的荧光，检测出第一分子的能量朝向第二分子转移的FRET，其特征在于：

所述FRET检测方法，包括下述步骤：

收集检测值的步骤，其中，朝向所述测量对象样品照射以规定频率对强度进行了时间调制的激光，且使用接收波段不同的多个检测传感器来接收所述测量对象样品在此时所发出的荧光，由此收集含有所述测量对象样品的荧光的荧光强度信息和相位信息的检测值，其中，所述接收波段包括以使所述第一分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第一波段和以使所述第二分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第二波段；

读取并得到预先存储在存储装置的校准信息的步骤，其中，所述校准信息至少包括下述信息：第一强度比，其表示的是所述测量对象样品的所述荧光中所述第一分子发出的第一分子荧光成分在所述第二波段的荧光强度与其在所述第一波段的荧光强度之比；相对于所述激光时间调制的所述第一分子荧光成分的相位信息；第二强度比，其表示的是所述荧光中所述第二分子发出的第二分子荧光成分在所述第一波段的荧光强度与其在所述第二波段的荧光强度之比；相对于所述激光时间调制的所述第二分子荧光成分的相位信息；在没有发生所述FRET的状态下所述第一分子荧光成分的非FRET荧光寿命，其被定义为通过激光被激发的第一分子发出的荧光做出一次滞后系统的弛豫响应的时刻；

求出所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命的步骤，从各个检测传感器所收集的所述检测值中，求出在每个所述接收波段中所述测量对象样品的荧光的荧光强度信息和相位信息，并利用所求出的所述荧光强度信息和所述相位信息、所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的所述相位信息、所述第二强度比、所述第二分子荧光成分的所述相位信息，求出被定义为通过激光被激发的第一分子发出的荧光做出一次滞后系统的弛豫响应时的所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命；

求出FRET发生信息的步骤，其中，利用所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命与所述第一分子荧光分子的所述非FRET荧光寿命之比，求出FRET发生信息。

2.如权利要求1所述的FRET检测方法，在求出所述FRET发生信息的步骤中，将所述非FRET荧光寿命设定为τ_d、将所述FRET荧光寿命设定为τ_d ^*时，求出作为所述FRET发生信息的由1-(τ_d ^*/τ_d)表示的FRET效率E_t。

3.如权利要求1或2所述的FRET检测方法，其中，

在收集所述检测值的步骤中，将所述激光照射在多个所述测量对象样品上，并利用所述传感器收集关于多个所述测量对象样品的每个所述检测值；

在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，根据各个检测值求出每个所述测量对象样品的荧光强度信息和相位信息，且从求出的多个荧光强度信息和相位信息中求出所述FRET荧光寿命。

4.如权利要求1所述的FRET检测方法，其中，在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，将从所述检测值中求出的所述荧光强度和相位信息用矢量表示在每个所述接收波段上，并将该矢量与所述第一强度比、所述第二强度比用于每个所述接收波段上，由此求出在产生FRET的状态下所述第一分子荧光成分的荧光强度信息和相位信息与所述第二分子荧光成分中因FRET的产生而发出FRET成分的荧光强度信息和相位信息，并利用所求出的信息求出所述FRET荧光寿命。

5.如权利要求4所述的FRET检测方法，其中，

在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，

至少使用通过所述第一波段的所述检测传感器所收集的检测值来表示的第一波段中的所述矢量和所述第二强度比，求出在产生所述FRET的状态下所述第一分子荧光成分的荧光强度信息和相位信息；

至少使用通过所述第二波段的所述检测传感器所收集的检测值来表示的第二波段中的所述矢量和所述第一强度比，求出所述FRET成分的荧光强度信息和相位信息。

6.如权利要求5所述的FRET检测方法，其中，

在所述存储装置中，所述第二分子荧光成分中第二分子通过所述激光直接被激发，由此产生的直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息被预先存储在所述存储装置；

在获得所述校准信息的步骤中，调出被存储在所述存储装置的所述直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息，并用矢量来表示直接激发荧光成分信息；

在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，至少利用所述直接激发荧光成分的所述矢量和所述第二波段中的所述矢量，求出产生所述FRET的状态下的所述第二分子荧光成分的荧光强度信息和相位信息。

7.如权利要求5所述的FRET检测方法，其中，

在所述存储装置中，所述第二分子荧光成分中第二分子通过所述激光而直接被激发，由此产生的直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息被预先存储在所述存储装置；

在获得所述校准信息的步骤中，调出所述第二分子荧光成分中第二分子通过所述激光而直接被激发后所产生的直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息，且用所述直接激发荧光成分的矢量来表示；

在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，使用所述校准信息以求出所述第一分子荧光成分的FRET寿命，而且至少使用所述第二波段中的所述矢量和所述第一强度比，求出所述FRET成分的相位信息，然后利用所求出的所述FRET成分的相位信息和所述直接激发荧光成分的所述矢量，求出产生所述FRET的状态下的所述第二分子荧光成分的FRET荧光寿命和不产生FRET状态下的所述第二分子荧光成分的非FRET荧光寿命，进而使用所述第二分子荧光成分的FRET荧光寿命和所述第二分子荧光成分的所述非FRET荧光寿命，求出所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命。

8.如权利要4～7中任一项所述的FRET检测方法，其中，

所述测量对象样品是用所述第一分子和所述第二分子在通过所述激光被激发而发出自发荧光的自发荧光样品上做了标记的样品；

在所述存储装置中，预先存储有通过将激光照射在所述自发荧光样品的方式而使所述自发荧光样品发出的荧光的、每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息；

在获得所述校准信息的步骤中，调出被存储在所述存储装置的、所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，并用矢量来表示所述自发荧光样品的荧光；

在求出所述FRET荧光寿命的步骤中，从每个所述接收波段的所述测量对象样品的各个所述矢量中减去所述自发荧光样品的荧光的所述矢量，并利用进行减法计算后得到的矢量以求出所述FRET荧光寿命。

9.如权利要求8所述的FRET检测方法，其中，

在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过自发荧光校准而得到的信息的方式来获得信息；

在所述自发荧光校准中，

将所述自发荧光样品作为测量对象物且朝向所述自发荧光样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集每个所述接收波段中含有荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且将所求出的信息存储在所述存储装置。

10.如权利要求1所述的FRET检测方法，其中，

在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过非FRET校准而得到的信息的方式来获得信息；

在所述非FRET校准中，

样品上附着有所述第一分子和所述第二分子、且将进行了不发生FRET处理的非FRET样品作为测量对象物，朝向所述非FRET样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集每个所述接收波段中含有荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述非FRET样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，然后利用所求出的每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息、预先被存储在所述存储装置的所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的相位信息、预先被存储在所述存储装置的所述第二强度比和所述第二分子荧光成分的相位信息，求出通过激光照射直接被激发的第二分子所发出的直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息，且将所求出的信息存储在所述存储装置。

11.如权利要求10所述的FRET检测方法，其中，

所述非FRET样品是用所述第一分子和所述第二分子在通过所述激光被激发而发出自发荧光的自发荧光样品上做了标记的样品；

在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过自发荧光校准而得到的信息的方式来获得信息；

所述自发荧光校准是在所述非FRET校准之前进行的校准，其中，将所述自发荧光样品作为测量对象物且朝向所述自发荧光样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集每个所述接收波段中含有荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且将所求出的信息存储在所述存储装置；

在所述非FRET校准中，从用矢量表示所述非FRET样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的非FRET样品矢量中，减去用矢量表示的通过所述自发荧光校准而求出的所述自发荧光信息的自发荧光矢量，然后利用通过该减法计算而得到的矢量、预先存储在所述存储装置的所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的相位信息、预先存储在所述存储装置的所述第二强度比和所述第二分子荧光成分的相位信息，导出所述直接激发荧光成分矢量，并将导出的结果存储在所述存储装置。

12.如权利要求1所述的FRET检测方法，其中，

在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过第一分子校准而得到的信息的方式来获得信息；

在所述第一分子校准中，

将仅以所述第一分子来进行标记的第一分子样品作为测量对象物且朝向所述第一分子样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集含有所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且求出所述第一分子样品在所述第二波段的荧光强度和其在所述第一波段的荧光强度之比并将其作为所述第一强度比，然后将所求出的所述第一强度比和所述相位信息存储在所述存储装置。

13.如权利要求12所述的FRET检测方法，其中，

所述第一分子样品是用所述第一分子在通过所述激光被激发而发出自发荧光的自发荧光样品上做了标记的样品；

在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过自发荧光校准而得到的信息的方式来获得信息；

所述自发荧光校准是在所述第一分子校准之前进行的校准，其中，将所述自发荧光样品作为测量对象物且朝向所述自发荧光样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集在每个所述接收波段上含有荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且将所求出的信息存储在所述存储装置；

在所述第一分子校准中，从用矢量表示所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的第一分子样品矢量中，减去用矢量来表示的通过所述自发荧光校准而求出的所述自发荧光样品的荧光信息的自发荧光矢量，然后利用通过该减法计算而得到的矢量，求出所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，并将所求出的信息存储在所述存储装置。

14.如权利要求1所述的FRET检测方法，其中，

在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过第二分子校准而得到的信息的方式来获得信息；

在所述第二分子校准中，

将仅以所述第二分子来进行标记的第二分子样品作为测量对象物，且朝向所述第二分子样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段中含有荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且求出所述第二分子样品在所述第一波段的荧光强度和其在所述第二波段的荧光强度之比并将其作为所述第二强度比，然后将所求出的所述第二强度比和所述相位信息存储在所述存储装置。

15.如权利要求14所述的FRET检测方法，其中，

所述第二分子样品是用所述第二分子在通过所述激光被激发而发出自发荧光的自发荧光样品上做了标记的样品；

在获得所述校准信息的步骤中，按照从所述存储装置中调出通过自发荧光校准而得到的信息的方式来获得信息；

所述自发荧光校准是在所述第二分子校准之前进行的校准，其中，将所述自发荧光样品作为测量对象物且朝向所述自发荧光样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集每个所述接收波段中含有荧光强度信息和相位信息的检测值，并求出所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且将所求出的信息存储在所述存储装置；

在所述第二分子校准中，从用矢量表示所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的第二分子样品矢量中，减去用矢量来表示的通过所述自发荧光校准而求出的所述自发荧光样品的荧光信息的自发荧光矢量，然后利用通过该减法计算而得到的矢量，求出所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，并将所求出的信息存储在所述存储装置。

16.一种FRET检测装置，将激光照射在用第一分子和第二分子进行了标记的测量对象样品上，此时通过接收测量对象样品所发出的荧光的方式，检测出第一分子的能量朝向第二分子转移的FRET，其特征在于：

所述FRET装置包括：

检测信息获得部，其中，朝向所述测量对象样品照射以规定频率对强度进行了时间调制的激光，且使用接收波段不同的多个检测传感器来接收所述测量对象样品在此时所发出的荧光，由此获得含有所述测量对象样品荧光的荧光强度信息和相位信息的检测值，其中，所述接收波段包括以使所述第一分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第一波段和以使所述第二分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第二波段；

存储装置，其对至少包括下述信息的校准信息进行预先存储：第一强度比，其表示的是所述测量对象样品的所述荧光中所述第一分子发出的第一分子荧光成分在所述第二波段的荧光强度与其在所述第一波段的荧光强度之比；所述第一分子荧光成分的相位信息；第二强度比，其表示的是所述第二分子发出的第二分子荧光成分在所述第一波段的荧光强度与其在所述第二波段的荧光强度之比；所述第二分子荧光成分的相位信息；没有发生所述FRET的状态下的所述第一分子荧光成分的非FRET荧光寿命，其被定义为通过激光被激发的第一分子发出的荧光在做出一次滞后系统的弛豫响应时的寿命；

FRET荧光寿命计算部，其从所述检测信息获得部所获得的所述检测值中，求出针对每个所述接收波段的所述测量对象样品的荧光的荧光强度信息和相位信息，并利用所求出的所述荧光强度信息和所述相位信息、从所述存储装置中读取的所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的所述相位信息、所述第二强度比、所述第二分子荧光成分的所述相位信息，求出被定义为通过激光被激发的第一分子发出的荧光在做出一次滞后系统的弛豫响应时的所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命；

FRET发生信息计算部，求出利用所述第一分子荧光成分的FRET荧光寿命与所述第一分子荧光分子的所述非FRET荧光寿命之比来表示的FRET发生信息。

17.如权利要求16所述的FRET检测装置，其中，

在所述FRET荧光寿命计算部中，将从所述检测值中求出的所述荧光强度和相位信息用矢量表示，并利用所述矢量、所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的所述相位信息、所述第二分子荧光成分的所述第二强度比、所述第二分子荧光成分的所述相位信息，求出产生FRET状态下的所述第一分子荧光成分的荧光强度信息和相位信息与所述第二分子荧光成分中因FRET的产生而发出FRET成分的荧光强度信息和相位信息，并利用这些所求出来的信息求出所述FRET荧光寿命。

18.如权利要求16或17所述的FRET检测装置，

所述传感器的各个接收波段是以使所述第一分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第一波段和以使所述第二分子荧光成分的荧光强度最大的峰值波长为中心的第二波段；

在所述FRET荧光寿命计算部中，

至少利用从通过所述第一波段的检测传感器而得到的所述检测值中求出来的第一波段中的所述矢量和所述第二强度比，求出产生所述FRET状态下的所述第一分子荧光成分的荧光强度信息和相位信息；

至少利用通过所述第二波段的所述检测传感器而得到的所述检测值来表示的第二波段中的所述矢量和所述第一强度比，求出所述FRET成分的荧光强度信息和相位信息。

19.如权利要求16所述的FRET检测装置，其中，

所述FRET检测装置还具有自发荧光校准部，

在所述自发荧光校准部中，将通过激光被激发而发出自发荧光的自发荧光作为测量对象物，且朝向所述自发荧光照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个所述检测传感器中收集含有所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的检测值，求出所述自发荧光样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，并将其存储在所述存储装置；

在所述FRET荧光寿命计算部中，用矢量来表示每个所述接收波段的所述测量对象样品的荧光信息，且从该矢量中减去表示所述自发荧光样品的所述荧光强度信息和所述相位信息的矢量，并利用进行减法计算后得到的矢量求出所述FRET荧光寿命。

20.如权利要求16所述的FRET检测装置，其中，

所述FRET检测装置还具有非FRET校准部，

在所述非FRET校准部中，在将样品上附着有所述第一分子和所述第二分子、且进行了不发生FRET处理的非FRET样品作为测量对象物，且朝向所述非FRET样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集每个所述接收波段中含有荧光强度信息和相位信息的检测值时，求出所述非FRET样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，然后利用所求出的荧光强度信息和相位信息、所述第一强度比、所述第一分子荧光成分的所述相位信息、所述第二强度比和所述第二分子荧光成分的所述相位信息，求出因第二分子通过激光照射直接被激发而产生的直接激发荧光成分的荧光强度信息和相位信息，且导出用矢量来表示这些信息的直接激发荧光成分矢量，并将导出结果存储在所述存储装置；

在所述FRET荧光寿命计算部中，利用所述直接激发荧光成分矢量求出所述FRET荧光寿命。

21.如权利要求16所述的FRET检测装置，其中，

所述FRET检测装置还具有第一分子校准部，

在所述第一分子校准部中，

在将仅以所述第一分子来进行标记的第一分子样品作为测量对象物，且朝向所述第一分子样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集含有所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的检测值时，求出所述第一分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且求出所述第一分子样品在所述第二波段的荧光强度和其在所述第一波段的荧光强度之比并将其作为所述第一强度比，并将所求出的所述第一强度比和所述第一分子样品的荧光的所述相位信息存储在所述存储装置。

22.如权利要求16所述的FRET检测装置，其中，

所述FRET检测装置还具有第二分子校准部，

在所述第二分子校准部中，

在将仅以所述第二分子来进行标记的第二分子样品作为测量对象物，且朝向所述第二分子样品照射以规定频率进行了时间调制的激光，由此从各个检测传感器中收集含有所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息的检测值时，求出所述第二分子样品的荧光在每个所述接收波段的荧光强度信息和相位信息，且求出所述第二分子样品在所述第一波段的荧光强度和其在所述第二波段的荧光强度之比并将其作为所述第二强度比，并将所求出的所述第二强度比和所述第二分子样品的荧光的所述相位信息存储在所述存储装置。

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