CN101687913B - 激肽释放酶7调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及丝氨酸蛋白酶激肽释放酶7的晶体结构和该晶体结构在药物研发中的用途。本发明还涉及特异性结合激肽释放酶7的这一活性位点的化合物。

Description

激肽释放酶7调节剂
发明领域
本发明涉及丝氨酸蛋白酶激肽释放酶7的晶体结构和该晶体结构在药物发现中的用途。本发明还涉及特异性结合激肽释放酶7的这一活性位点的化合物。 
发明背景 
激肽释放酶7为展示出糜蛋白酶样活性的激肽释放酶基因家族的S1丝氨酸蛋白酶。人激肽释放酶7(hK7，KLK7或角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)，Swissprot P49862)主要在皮肤中表达并且表现出在皮肤生理学中起重要作用(1，2，3)。hK7涉及脱屑过程中角化鳞状上皮中细胞间粘合结合的降解。脱屑过程得到充分调节并且与角膜细胞重新产生达到微妙平衡以便维持角质层的恒定厚度。在这方面，据报导hK7能够裂解角膜桥粒的蛋白角膜锁链蛋白和桥粒胶蛋白1(4，5，6)。此外，近来已经证实两种脂质加工酶β-葡糖脑苷脂酶和酸性鞘磷脂酶可被hK7降解(7)。两种脂质加工酶与其底物葡糖苷酰鞘氨醇类和鞘磷脂共分泌，且将这些极性脂质前体加工成其更具有非极性的产物，例如神经酰胺类，它们随后被并入胞外片层膜。片层膜的结构对功能性皮肤屏障而言是关键的。最终，已经证实hK7活化促炎细胞因子前-白细胞介素-1β(IL-1β)(8)并且活化(灭活)杀微生物肽(hCAP18)，它们调节重要的防御机制以便防止对各种微生物病原体的感染(34)。 
近期研究将hK7活性增加与炎性皮肤病，如特应性皮炎、银屑病或内瑟顿综合征联系起来。hK7活性增加可以导致角化粒不受控制的降解从而导致脱屑失调，脂质加工酶增加的降解造成片层膜结构破坏或促炎细胞因子IL-1β或杀微生物肽hCAP18不受控制的活化或灭活。净结果可以导致 皮肤屏障功能受损和炎症(另外参见WO-A-2004/108139)。 
hK7活性在几种水平上受到控制。各种因素可以对炎性皮肤病中的hK7活性增加负责。首先，表达的蛋白酶的量可以受到遗传因素影响。近期描述了这类遗传关联，即hK7基因中3’-UTR的多态现象(9)。作者的推断在于所述的4个碱基对在激肽释放酶7基因3’-UTR中的插入使hK7mRNA稳定并且导致hK7超表达。其次，由于hK7作为酶原通过板层小体分泌至角质层细胞外隙，并且不能自活化，所以它需要通过另一种蛋白酶，例如激肽释放酶5活化(5)。这类活化酶的不受控制的活性可以导致hK7过度活化。第三，活化的hK7可以被天然抑制剂，如LEKTI、ALP或弹力素抑制(10，11)。表达减少或这类抑制剂缺乏可以导致hK7活化增强。近期发现编码LEKTI的spink5基因中的突变为内瑟顿综合征的病因(12)并且该基因中的单点突变与特应性皮炎相关(13，14)。最后，控制hK7活性的另一种水平为pH。hK7具有中性至弱碱性pH最佳值(2)，并且从皮肤最内层到最外层存在从中性到酸性的pH梯度。环境因素，如肥皂可以导致角质层最外层pH增加至hK7的最佳pH，由此增加hK7活性。 
hK7活性增加与炎性皮肤病相关的推断得到了下列研究的支持：首先，内瑟顿综合征患者表现出丝氨酸蛋白酶活性表型依赖性增加，角化粒减少，脂质加工酶β-葡糖脑苷脂酶和酸性鞘磷脂酶减少和屏障功能受损(15，16)。其次，超表达人激肽释放酶7的转基因小鼠表现出与在具有特应性皮炎的患者中发现的类似的皮肤表型(17，18，19)。第三，描述了在特应性皮炎和银屑病患者的皮肤中，hK7水平升高(17，20)。 
因此，认为hK7为治疗炎性皮肤病，如特应性皮炎、银屑病或内瑟顿综合征的潜在靶标并且对其特异性调节剂(激动剂或抑制剂)存在需求。 
为了满足这一需求，本发明人已经研发了hK7的克隆、表达、纯化和结晶的方法，并且能够首次在极高分辨率下获得人激肽释放酶7的结构。 
这种在极高分辨率下的人激肽释放酶7结构能够鉴定该酶的活性位点和特异性结合激肽释放酶7所述活性位点的化合物。 
发明概述 
为了满足上文所述鉴定的需求，本发明人已经研发了hK7的克隆、表达、纯化和结晶的方法，并且能够首次在极高分辨率下获得人激肽释放酶7的结构。 
这种在极高分辨率下获得的人激肽释放酶7结构能够鉴定该酶的活性位点和特异性结合激肽释放酶7所述活性位点的化合物。本发明人还能够证实这些化合物具有对激肽释放酶7的调节作用。 
本发明由此涉及人激肽释放酶7的晶体，其包含具有特征在于下表3中的结构坐标的三维结构的结合袋。该晶体还包含共结晶的配体。 
本发明还涉及计算机可读媒体，其包含使用计算机可读数据编码的数据储存资料，其中所述数据包含本发明晶体的结构坐标，且本发明涉及该晶体在生成结晶结构数据中的用途。 
本发明的另一个实施方案为鉴定结合激肽释放酶7的配体的方法，该方法包括下列步骤：(i)使用按照本发明生成的三维结构数据选择和/或设计结合激肽释放酶7的潜在配体，和(ii)在步骤(i)中选择的潜在配体中鉴定那些在体外、体内或基于细胞的试验中结合激肽释放酶7的配体。 
本发明的另一个实施方案涉及激肽释放酶7调节剂，其特征在于它结合具有特征在于表3结构坐标的三维结构的结合袋。这种激肽释放酶7调节剂可以为下式的化合物 
Figure G2008800225455D00031
其中 
R1为氢、氰基、(C1-8)烷基、(C2-8)链烯基、(C2-8)炔基、卤素、(C1-8)烷基氨基、(C1-8)烷基氨基(C1-8)烷基、(C1-8)烷氧基、卤代(C1-8)烷基， 
X为CH＝CH、NH、N＝CH、O或S， 
Y为下式的基团 
Figure G2008800225455D00041
其中 
-含N环系任选地与(C3-8)环烷基、(C6-18)芳基或具有5-6个环成员和1-4个选自N、O、S的杂原子的杂环基稠合， 
-n为1、2或3， 
-R2为 
-(C1-8)烷基、(C1-8)烷基氨基、(C1-8)烷基氨基(C1-8)烷基、二(C1-8)烷基氨基(C1-8)烷基、卤代(C1-8)烷基、(C1-8)烷氧基、(C1-8)烷氧基(C1-8)烷基， 
或 
-(CH2)m-Z，其中Z为未取代或取代的(C3-8)环烷基、(C6-18)芳基或具有5-6个环成员和1-4个选自N、O、S的杂原子的杂环基，且m为0、1或2， 
-R3为氢、(C1-8)烷基、(C1-8)烷氧基、(C6-18)芳基或具有5-6个环成员和1-4个选自N、O、S的杂原子的杂环基。 
特别地，该调节剂可以为化合物，其中 
R1为氢、乙炔基、氯或溴， 
X为CH＝CH或S， 
Y为式(II)的基团，其中 
-含N环系任选地与环丙基、环戊基或苯基稠合， 
-n为1或2， 
-R2为(C1-8)烷基、(C1-4)烷基氨基、二(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、(C1-4)烷氧基(C1-4)烷基或 
基团(CH2)m-Z，其中Z为未取代的环己基、未取代的苯基、被(C1-4)烷氧基取代的苯基、被具有6个环成员和1或2个选自N、O的杂原子的杂环基取代的苯基，或 
具有6个环成员和1或2个选自N、O的杂原子的未取代或取代的杂环基； 
-m为1或2， 
-R3为氢或(C1-4)烷氧基。 
在这类调节剂的另一个实施方案中，Y可以为式(II)的基团，其中 
-含N环系任选地与环丙基、环戊基或苯基稠合， 
-R2为甲基、二甲基氨基乙基、甲氧基乙基，或 
基团(CH2)m-Z，其中Z为未取代的环己基、未取代的苯基、被甲氧基取代的苯基、哌嗪基或吗啉基； 
吡啶基，哌啶基，四氢呋喃基，未取代的哌嗪基或被甲基或苯基取代的哌嗪基， 
且m、n、R1、R3和X如上文所定义。 
本发明的化合物可以为盐的形式和/或用作药物。本发明由此还涉及药物组合物，其包含上文所述的化合物与至少一种药用赋形剂，且本发明涉及治疗激肽释放酶-7活性介导的障碍的方法，该治疗方法包括对有这类治疗需要的个体施用有效量的本发明化合物。 
本发明由激肽释放酶-7活性介导的障碍可以选自炎性和/或过度增殖性和瘙痒性皮肤病诸如瘢痕疙瘩、肥大性瘢痕、痤疮、特应性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或其它瘙痒性皮肤病诸如结节性痒疹、中老年人未指明的瘙痒以及其它与上皮屏障功能障碍相关的疾病诸如老化皮肤、炎性肠病和克罗恩病以及胰腺炎或癌症，特别是卵巢癌。 
发明详述 
缩写表 
Figure G2008800225455D00051
Figure G2008800225455D00061
激肽释放酶7为展示出糜蛋白酶样活性的激肽释放酶基因家族的S1丝氨酸蛋白酶。人激肽释放酶7(hK7、KLK7或角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)，Swissprot P49862)在皮肤生理学中起重要作用(1、2、3)。 
本发明提供了人激肽释放酶7的晶体，其包含具有特征在于下表3中的结构坐标的三维结构的结合袋。本发明还提供了计算机可读媒体，其包含使用计算机可读数据编码的数据储存资料，其中所述数据包含本发明晶体的结构坐标，以及该晶体在生成结晶结构数据中的用途。此外，本发明提供了鉴定结合激肽释放酶7的配体的方法，该方法包括下列步骤：(i)使用按照本发明生成的三维结构数据选择和/或设计结合激肽释放酶7的潜在配体，和(ii)在步骤(i)中选择的潜在配体中鉴定那些在体外、体内或基于细胞的试验中结合激肽释放酶7的配体。本发明激肽释放酶7调节剂的特征在于它结合具有特征在于表3结构坐标的三维结构的结合袋并且可以为下式的化合物 
Figure G2008800225455D00071
其中 
R1为氢、氰基、(C1-8)烷基、(C2-8)链烯基、(C2-8)炔基、卤素、(C1-8)烷基氨基、(C1-8)烷基氨基(C1-8)烷基、(C1-8)烷氧基、卤代(C1-8)烷基， 
X为CH＝CH、NH、N＝CH、O或S， 
Y为下式的基团 
其中 
-含N环系任选地与(C3-8)环烷基、(C6-18)芳基或具有5-6个环成员和1-4个选自N、O、S的杂原子的杂环基稠合， 
-n为1、2或3， 
-R2为 
-(C1-8)烷基、(C1-8)烷基氨基、(C1-8)烷基氨基(C1-8)烷基、二(C1-8)烷氨基(C1-8)烷基、卤代(C1-8)烷基、(C1-8)烷氧基、(C1-8)烷氧基(C1-8)烷基， 
或 
-(CH2)m-Z，其中Z为未取代或取代的(C3-8)环烷基、(C6-18)芳基或具有5-6个环成员和1-4个选自N、O、S的杂原子的杂环基，且m为0、1或2， 
-R3为氢、(C1-8)烷基、(C1-8)烷氧基、(C6-18)芳基或具有5-6个环成员和1-4个选自N、O、S的杂原子的杂环基。 
本发明的晶体优选属于斜方晶空间群P212121(三斜晶系)。这些晶体具有1个分子/不对称单位。 
根据用于结晶的条件的不同，表征晶胞的参数可以在有限范围内改变，至少在可分辨的范围内。x射线晶体学的分辨率一般≤ 
Figure G2008800225455D00073
并且其中所述的 纯化方法能够提供这类高内部秩序，即可以获得≤ 
Figure G2008800225455D00081
的分辨率。 
术语“晶胞”意指基本形状块。晶体的整个体积可以通过这类块的有规则装配构建。每个晶胞包含模式单元的完整代表，其重复构成晶体。 
本发明的术语“空间群”意指晶体对称元素的排列。 
术语“结构坐标”或“原子坐标”意指来源于与包含hK7的晶体原子(散射中心)的X-射线单色光束散射时获得的模式相关的数学方程的数学坐标。该散射数据用于计算晶体重复单位的电子密度图。电子密度图用于建立晶体晶胞内各原子的位置。hK7的结构坐标可以在表3中找到。 
激肽释放酶7的“片段”包含激肽释放酶7的序列中50％以上的连续氨基酸。 
本文所用的该序列的“同源物”在进行最佳序列对比时与相应的序列共有至少70％的同一性，优选80％的同一性，更优选90％，且甚至更优选95％的同一性。用于测定比较窗的序列的最佳序列对比可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法(J.Theor.Biol.，91(2)pgs.370-380(1981)，Needleman和Wunsch，J.Miol.Biol.，48(3)pgs.443-453(1972)的同源性序列对比算法，通过Pearson和Lipman，PNAS，USA，85(5)pgs.2444-2448(1988)方法的相似性研究或通过这些算法的计算机执行(WisconsinGenetics Software Package Release 7.0，Genetic Computer Group，575，Science Drive，Madison，Wisconsin中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)进行。 
为测定百分比同一性选择所述各种方法生成的最佳序列(即在比较窗内产生最高同一性百分比)。 
术语“配体”或“调节剂”在本文中可以互换使用，意指结合激肽释放酶7的一个或多个特异性位点的分子或分子基团。本发明的配体可以为激动剂或拮抗剂。此外，本发明的配体优选低分子量分子。 
术语本发明的″低分子量分子″意指优选具有低于约1000，更优选低于约500的分子量的有机化合物。 
更优选所述配体抑制激肽释放酶7生物活性。只要它具有0.001nM-1.0μM的IC50，即认为化合物为激肽释放酶7抑制剂。 
优选的调节剂为有机化合物，例如含N环系诸如例如吡咯烷的1，2-二甲酰胺类，例如为激肽释放酶-7活性的拮抗剂。 
本发明的一个方面在于下式的化合物 
Figure G2008800225455D00091
其中 
R1为氢、氰基、烷基、链烯基、炔基、卤素、烷基氨基、烷基氨基烷基、烷氧基、卤代烷基， 
X为CH＝CH、NH、N＝CH、O或S， 
Y为下式的基团 
Figure G2008800225455D00092
其中 
-含N环系任选地与环烷基、芳基或具有5-6个环成员和1-4个选自N、O、S的杂原子的杂环基稠合， 
-n为1、2或3， 
-R2为 
-烷基、烷基氨基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、卤代烷基、烷氧基、烷氧基烷基， 
或 
-(CH2)m-Z，其中Z为未取代或取代的环烷基、芳基或 
具有5-6个环成员和1-4个选自N、O、S的杂原子的杂环基，且m为0、1或2， 
-R3为氢、烷基、烷氧基、芳基或具有5-6个环成员和1-4个选自N、O、S的杂原子的杂环基。 
本文定义的任意基团(取代基)可以包含1-18个碳原子，例如 
-烷基，例如包括(C1-12)烷基，诸如(C1-4)烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正-丁基、叔-丁基、仲-丁基、正-戊基、新戊基、正-己基； 
-链烯基，例如包括(C2-12)链烯基，诸如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、二烯烃类等； 
-炔基，例如包括(C2-12)炔基，诸如乙炔基； 
-环烷基，例如包括(C3-12)环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基； 
-烷氧基，例如包括(C1-12)烷氧基，诸如甲氧基、乙氧基； 
-芳基，包括(C6-18)芳基，例如苯基、萘基； 
-脂族杂环基和芳族杂环基； 
-具有1-4个选自N、O、S的杂原子的杂环基；诸如具有1-2个选自N、O的杂原子的杂环基，例如，包括 
吡啶基，例如吡啶-3-基、吡啶-4-基； 
哌啶基，例如哌啶-4-基； 
哌嗪基，例如哌嗪-1-基； 
吗啉基，例如吗啉-4-基； 
四氢呋喃基，例如四氢呋喃-2-基； 
-卤素，包括F、Cl、Br、I，诸如氯、溴； 
本文所定义的任意基团可以未被取代或被取代，例如一次或多次。 
取代基包括例如甲基、甲氧基、乙炔基、氯、溴。 
烷基、链烯基、炔基、芳基和杂环基包括未取代或取代的烷基、芳基或杂环基，例如被有机化学中常见的基团取代。 
在一个方面中，本发明为如上所述的式(I)的化合物，其中 
R1为氢、氰基、(C1-8)烷基、(C2-8)链烯基、(C2-8)炔基或卤素 
X为CH＝CH、NH、N＝CH、O或S， 
Y为下式的基团 
其中 
-含N环系任选地与(C3-8)环烷基、(C6-18)芳基或具有5-6个环成员和1-2个选自N、O、S的杂原子的杂环基稠合， 
-n为1、2或3， 
-R2为 
-(C1-8)烷基、(C1-8)烷基氨基、(C1-8)烷基氨基(C1-8)烷基、二(C1-8)烷氨基(C1-8)烷基、(C1-8)烷氧基、(C1-8)烷氧基(C1-8)烷基，或 
-(CH2)m-Z，其中Z为未取代或取代的(C3-8)环烷基、(C6-18)芳基或具有5-6个环成员和1-2个选自N、O、S的杂原子的杂环基且m为1或2， 
-R3为氢、(C1-8)烷基或(C1-8)烷氧基。 
在一个方面中，本发明为式(I)的化合物，其中 
R1为氢、乙炔基、氯或溴， 
X为CH＝CH或S， 
Y为式(II)的基团，其中 
-含N环系任选地与环丙基、环戊基或苯基稠合， 
-n为1或2， 
-R2为(C1-8)烷基、(C1-4)烷基氨基、二(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、(C1-4)烷氧基(C1-4)烷基或 
基团(CH2)m-Z，其中Z为未取代的环己基、未取代的苯基、 
被(C1-4)烷氧基取代的苯基，被具有6个环成员和1或2个选自N、O的杂原子的杂环基取代的苯基，或 
具有6个环成员和1或2个选自N、O的杂原子的未取代或取代的杂环基； 
-m为1或2， 
-R3为氢或(C1-4)烷氧基。 
在一个方面中，本发明为式(I)的化合物且Y为式(II)的基团，其中 
-含N环系任选地与环丙基、环戊基或苯基稠合， 
-R2为甲基、二甲基氨基乙基、甲氧基乙基、或 
基团(CH2)m-Z，其中Z为未取代的环己基、未取代的苯基、 
被甲氧基取代的苯基、哌嗪基或吗啉基； 
吡啶基、哌啶基、四氢呋喃基、未取代的哌嗪基或被甲基或苯基取代的哌嗪基， 
且m、n、R1、R3和X如上述所定义。 
在一个方面中，本发明为式(I)的化合物，其中 
X为CH＝CH， 
R1为乙炔基或氯， 
Y为式(II)的基团，其中 
n为1， 
R3为氢， 
R2为甲基、甲氧基乙基、二甲基氨基乙基、吡啶-3-基甲基、吡啶-4-基甲基、吡啶-3-基-乙基、吡啶-4-基-乙基、6-甲氧基-吡啶-3-基甲基、(4-甲氧基-苯基)-乙基、(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙基、(4-苄基-哌嗪-1-基)-乙基、4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苄基、1-甲基-哌啶-4-基甲基、2-(4-吗啉-4-基甲基)-苄基。 
在一个方面中，本发明为式(I)的化合物，其中 
X为CH＝CH， 
R1为氢， 
Y为式(II)的基团，其中 
含N环系任选地与苯基稠合， 
R3为氢或苯基， 
n为1或2， 
R2为苄基、苯乙基、环己基甲基、(4-甲氧基-苯基)-乙基、3-甲基-丁基、四氢呋喃-2-基甲基。 
在一个方面中，本发明为式(I)的化合物，其中 
X为CH＝CH， 
R1为乙炔基， 
Y为式(II)的基团，其中 
含N环系任选地与环丙基、环戊基、苯基稠合， 
R3为氢， 
n为1， 
R2为吡啶-3-基甲基。 
在一个方面中，本发明为式(I)的化合物，其中 
X为CH＝CH 
R1为乙炔基， 
Y为式(II)的基团，其中 
R3为甲氧基， 
n为1， 
R2为吡啶-3-基甲基。 
在一个方面中，本发明为式(I)的化合物，其中 
X为CH＝CH 
R1为乙炔基， 
Y为式(II)的基团，其中 
R3为氢， 
n为2， 
R2为吡啶-3-基甲基。 
在一个方面中，本发明为式(I)的化合物，其中 
X为S 
R1为氯或溴， 
Y为式(II)的基团，其中 
R3为氢， 
n为1， 
R2为(4-甲氧基-苯基)-乙基。 
在式I的化合物中，每个单一定义的取代基可以为优选的取代基，例如定义的取代基彼此独立。 
在另一个方面中，本发明提供了式I的化合物，其选自： 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(2-吡啶-3-基-乙基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-[(2-二甲基氨基-乙基)-酰胺]1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(2-吡啶-4-基-乙基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(6-甲氧基-吡啶-3-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苄基酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-(4-吗啉-4-基甲基-苄基酰胺)， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-甲基酰胺， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-{[2-(4-苄基-哌嗪-1-基)-乙基]-酰胺}1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(2-甲氧基-乙基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-4-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲基-哌 嗪-1-基)-乙基]-酰胺}， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(6-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(5-溴-苯并[b]噻吩-3-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(5-氯-苯并[b]噻吩-3-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}， 
-(2S，4R)-4-甲氧基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-哌啶-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]1-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-2，3-二氢-吲哚-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-1，3-二氢-异吲哚-1，2-二甲酸2-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]1-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]， 
-(1R，2S，5S)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]， 
-(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]2-(苯乙基-酰胺)， 
-(2S，4S)-4-苯基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]2-(苯乙基-酰胺)， 
-(2S，4R)-4-苯基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]2-(苯乙基-酰胺)， 
-(S)-3，4-二氢-1H-异喹啉-2，3-二甲酸2-[(萘-1-基甲基)-酰胺]3-(苯乙基-酰胺)， 
-(S)-哌啶-1，2-二甲酸1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]2-(苯乙基-酰胺)， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-苄基酰胺1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-环己基甲基-酰胺1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-[(3-甲基-丁基)-酰胺]1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]， 
-(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(四氢-呋喃-2-基甲基)-酰胺]， 
-(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]，和 
-(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}。 
如本文所示的本发明化合物的化学名从ISIS，version 2.5(AutoNom2000 Name)复制而来。 
本发明提供的化合物在下文中称作″本发明的化合物″。本发明的化合物包括任意形式的化合物，例如游离形式、盐形式、溶剂合物形式和盐和溶剂合物形式。 
本发明的另一个方面提供了盐形式的本发明化合物。 
这类盐优选包括药学上可接受的盐，不过，包括药学上不可接受的盐，例如为了制备/分离/纯化的目的。 
游离形式的本发明化合物可以被转化成相应的盐形式的化合物；且反之亦然。游离形式或盐形式和溶剂合物形式的本发明化合物可以被转化成相应的游离形式或非溶剂合物形式中的盐形式的化合物；且反之亦然。 
本发明的化合物可以以异构体及其混合物形式存在；例如光学异构体、 非对映异构体，顺式/反式构象异构体。本发明的化合物可以包含，例如不对称碳原子且由此可以以对映体或非对映异构体及其混合物形式，例如外消旋物存在。本发明的化合物就本发明化合物的特定位置而言可以以(R)-、(S)-或(R，S)-构型存在，优选(R)-或(S)-构型。 
本发明提供的化合物可以为式I化合物的(R)-和(S)-构型，例如包括其混合物，且优选为(R)-或(S)-构型。 
如果合适，可以例如按照例如与常规方法类似的方式分离异构体混合物而得到纯的异构体。本发明包括任意异构体形式和任意异构体混合物形式的本发明化合物。 
本发明还包括其中可以存在互变异构体的本发明化合物的互变异构体。 
本发明在另一个方面中提供了生产本发明化合物，例如式I的化合物的方法，包括下列步骤： 
A.使下式的化合物 
Figure G2008800225455D00171
其中R1和R3如上所述，与下式的化合物 
R2-NH2(IV) 
其中R2如上所定义，在适当条件下反应，例如在有N-(3-二甲基氨基-丙基)-N-碳二亚胺-HCl、N，N-二异丙基乙胺、CH2Cl2、三氟乙酸、乙腈存在下，在适当温度下，例如室温，反应进行适当时间，例如过夜； 
或 
B)使下式的化合物 
Figure G2008800225455D00172
其中R2、R3和n如上所定义，与下式的化合物 
Figure G2008800225455D00181
其中R1和X如上所定义，在适当条件下反应，例如在有4-硝基苯基氯甲酸酯、吡啶、N，N-二异丙基乙胺、CH2Cl2存在下，在适当温度下，例如室温，反应进行适当时间，例如过夜； 
并且分离获自反应混合物中的式I化合物。 
在式(III)、(IV)、(V)或(VI)的中间体(原料物质)中，官能基(如果存在)可以任选被保护形式或盐的形式，只要存在成盐基团。任选存在的保护基可以在适当的阶段，例如按照例如与作为常规的方法类似的方式被除去。 
可以将由此获得的式I的化合物转化成式I的另一种化合物，例如或可以将获得的游离形式的式I的化合物转化成式I的化合物的盐，且反之亦然。 
式(III)、(IV)、(V)或(VI)的中间体(原料物质)为已知的或可以按照例如与作为常规或如本文指定的方法类似的方式制备。 
如果合适，可以例如按照与作为常规，例如或如本文指定的方法类似的方式制备本文所述的任何化合物例如本发明的化合物或式(III)、(IV)、(V)或(VI)的中间体。 
本发明的化合物，例如包括式I的化合物表现出药理学活性且由此用作药物。例如，发现本发明的化合物抑制激肽释放酶-7活性。 
本发明的化合物具有例如在下列测定法中测定的1nM-10μM的IC50值： 
材料和缓冲液 
荧光-猝灭底物Ac-Glu-Asp(EDANS)-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe^Arg-Leu-Gly-Lys(DABCYL)-Glu-NH2(其中^表示断裂键，通过MS分析鉴定)购自Biosyntan(Berlin，Germany)且作为5mM在DMSO中的储备溶液保存在-20℃下。所有其它化学物质具有分析级。 
酶反应在含150mM NaCl和0.05％(w/v)CHAPS的pH5.6的50mM柠檬酸钠缓冲液中进行。 
在硅化处理管中操作含所有蛋白质和肽的溶液(Life Systems Design，Merenschwand，Switzerland)。通过CyBi-Well 96-通道吸移管处理器(CyBio AG，Jena，Germany)将化合物溶液和酶和底物溶液转至384-孔平板(黑色Cliniplate；cat.no.95040020 Labsystems Oy，Finland)。 
FI测定仪器 
为了进行荧光强度(FI)测定，使用Ultra Evolution读出器(TECAN，Maennedorf，Switzerland)。给该仪器安装分别用于荧光激发和发射获取的350nm(20nm带宽)和500nm(25nm带宽)带通道滤器组合。为了增加信号：背景比，使用适当的分色镜。滤光器和分色镜购自TECAN。每次测定通过三次闪烁激发每孔中的荧光团。 
IC50值的测定 
为了测定IC50值，在384-孔平板中和室温下进行测定。所有最终测定体积均为30μl。将测试化合物溶于90％(v/v)DMSO/水并且用水(含0.05％(w/v)CHAPS)稀释至3倍于所需测定浓度。11个最终化合物浓度为：0.3nM、1nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM、10μM和30μM。对每次测定而言，每孔加入10μl水/CHAPS(±测试化合物)，随后加入10μl蛋白酶溶液(用1.5x测定缓冲液稀释)。最终测定溶液中的蛋白酶浓度为0.2nM(按照通过Bradford方法测定的酶浓度)。在室温下孵育1小时后，通过添加10μl底物溶液(溶于1.5x测定缓冲液的底物，终浓度为2μM)启动反应。化合物对酶活性的作用获自线性发展曲线并且根据两次读数确定，第一次在添加底物后直接取得，而第二次在1小时后取得。根据抑制百分比与抑制剂浓度关系的图，使用非线性回归分析软件(XLfit，Vers.4.0；ID Business Solution Ltd.，Guildford，Surrey，UK)计算IC50值。 
本发明的化合物在该测定法中表现出活性且由此表示可以用于治疗激肽释放酶-7活性介导的障碍(疾病)。 
本发明化合物的IC50值在低于10μM的范围，优选低于10nM，例如实施例36的化合物具有3nM的IC50值。 
激肽释放酶-7活性介导的障碍，例如包括疾病易于成功地使用激肽释放酶-7拮抗剂，例如使用本发明的化合物进行治疗，包括障碍，其中激肽释放酶-7活性起病因或促成作用，例如涉及上皮功能障碍的疾病，诸如炎性和/或过度增殖性和瘙痒性皮肤病，如，例如特应性皮炎、银屑病、内瑟顿综合征或其它瘙痒性皮肤病，诸如结节性痒疹，未指定的瘙痒以及具有上皮屏障功能障碍的其它疾病，诸如炎性肠病或克罗恩病。 
本发明在另一个方面中提供了 
-用作药物的本发明的化合物， 
-本发明的化合物作为药物的用途， 
-本发明的化合物在制备例如用于治疗激肽释放酶-7活性介导的障碍的药物中的用途。 
就药物用途而言，可以使用本发明的一种或多种化合物，例如本发明的一种或两种或多种化合物的组合，优选使用本发明的一种化合物。 
本发明的化合物可以作为药物组合物形式的药物使用。 
本发明的另一个方面提供了药物组合物，其包含本发明的化合物与至少一种药学上可接受的赋形剂，例如适当的载体和/或稀释剂，例如，包括填充剂、粘合剂、崩解剂、流动调节剂、润滑剂、糖类或甜味剂、香料、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。 
本发明在另一个方面中提供了 
-用于治疗激肽释放酶-7活性介导的障碍中的本发明的药物组合物。 
-本发明的药物组合物在治疗激肽释放酶-7活性介导的障碍中的用途。 
本发明在另一个方面中提供了治疗激肽释放酶-7活性介导的障碍的方法，例如，包括如上所述的障碍，该治疗方法包括对有这类治疗需要的个体施用有效量的本发明化合物；例如药物组合物形式。 
本发明在另一个方面中提供了 
-用于制备药物的本发明化合物， 
-本发明的化合物在制备用于治疗激肽释放酶-7活性介导的障碍，例如用于治疗皮肤病的药物，例如药物组合物中的用途，所述的皮肤病如，例如特应性皮炎、银屑病、内瑟顿综合征或其它瘙痒性皮肤病，诸如结节性痒疹、未指定的瘙痒。 
治疗包括治疗和预防(防止)。可以通过局部或全身施用，诸如，例如霜剂、软膏剂或栓剂或分别通过口服，sc或iv施用进行治疗。 
就这类治疗而言，适当的剂量当然根据例如本发明化合物的化学性质和药代动力学数据、个体宿主、施用方式和所治疗病症的性质和严重性的不同而改变。然而，一般而言，为了在较大哺乳动物，例如人中获得令人满意的效果，指定的每日剂量包括如下范围： 
-约0.001g-约1.5g，诸如0.001g-1.5g； 
-约0.01mg/kg体重-约20mg/kg体重，诸如0.01mg/kg体重-约20mg/kg体重， 
例如每天以至多4次的分次剂量施用。 
可以通过与常用于其它激肽释放酶-7活性介体，例如低分子量抑制剂类似的方式将本发明的化合物施用于较大哺乳动物，例如人。 
可以通过任意常规的途径施用本发明的化合物，例如肠道，例如，包括鼻部、口含、直肠、口服施用；非肠道，例如，包括静脉内、动脉内、肌内、心内、皮下、骨内输注、经皮(通过完整皮肤扩散)、跨粘膜(通过粘膜扩散)、吸入施用；局部；例如，包括表皮、鼻内、气管内施用；腹膜内(输注或注入腹腔)；硬膜上(硬膜外)(注入或输注入硬膜外腔)；鞘内(输注或注入脑脊髓液)；玻璃体内(通过眼施用)；例如以包衣或非包衣片、胶囊、(可注射)溶液、输注溶液、固体溶体、混悬液、分散液、固体分散体的形式；例如以安瓿、小瓶的形式，霜剂、凝胶、糊剂、吸入粉末、泡沫、酊剂、唇膏、滴剂、喷雾剂的形式或栓剂形式。优选通过局部施用本发明的化合物。 
就局部应用而言，例如，包括对眼施用，可以使用局部施用0.5-10％，诸如1-3％浓度的活性物质几次，例如每日2-5次获得令人满意的效果。 
可以以药学上可接受的盐形式或游离形式，任选溶剂合物形式施用本发明的化合物。盐形式和/或溶剂合物形式的本发明化合物表现出与游离形式的本发明相同级别的活性。 
本发明的化合物可以单独或与一种或多种，至少一种其它的第二种药物物质用于本文所述的任意的方法或用途。 
本发明在另一个方面中提供了 
-本发明的化合物与至少一种第二种药物物质的组合； 
-包含本发明化合物与至少一种第二种药物物质的药物组合； 
-包含本发明化合物与至少一种第二种药物物质和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物； 
-本发明的化合物，其与至少一种第二种药物物质组合，例如在药物组合或组合物形式中，用于如本文所定义的任意方法中，例如 
-包含本发明化合物与至少一种第二种药物物质的用作药物的组合、药物组合或药物组合物； 
-本发明化合物与至少一种第二种药物物质、例如在药物组合或组合物形式中作为药物的用途； 
-本发明的化合物在制备与第二种药物物质组合的药物中的用途； 
-治疗有需要的个体激肽释放酶-7活性介导的障碍的方法，包括同时或依次共同施用治疗有效量的本发明化合物和至少一种第二种药物物质，例如在药物组合或组合物形式中； 
-本发明的化合物，其与至少一种第二种药物物质组合，例如在药物组合或组合物形式中，用于制备药物，该药物用于激肽释放酶-7活性介导的障碍。 
组合包括：固定组合，其中本发明的化合物和至少一种第二种药物物质在相同的制剂中；药盒，其中将本发明的化合物和至少一种在不同制剂中的第二种药物物质提供在同一包装中，例如具有用于共同施用的说明书；和自由组合，其中分别包装本发明的化合物和至少一种第二种药物物质， 但给出用于同时或依次施用的说明书。 
本发明的另一个方面提供了 
-包含为本发明化合物的第一种药物物质和至少一种第二种药物物质以及用于联合施用的说明书的药物包装； 
-包含本发明化合物与用于与至少一种第二种药物物质联合施用的说明书的药物包装； 
-包含至少一种第二种药物物质和与本发明化合物联合施用的说明书的药物包装。 
使用本发明的组合进行治疗可以提供与单一治疗相比的改善。 
本发明在另一个方面中提供了 
-包含一定量的本发明化合物和一定量的第二种药物物质的药物组合，其中所述用量适合于产生协同治疗作用； 
-用于改善本发明化合物治疗应用的方法，包括共同施用，例如同时或依次施用治疗有效量的本发明化合物和第二种药物物质。 
-用于改善第二种药物物质治疗应用的方法，包括共同施用，例如同时或依次施用治疗有效量的本发明化合物和第二种药物物质。 
可以通过任意常规的途径施用本发明和作为组合伴侣的组合，例如如上所述的本发明化合物。如果合适，可以在剂量中施用第二种药物，例如在与用于单一治疗类似的剂量范围中，或，例如就协同作用而言，甚至低于常规的剂量范围。 
可以按照，例如与作为常规的方法类似的方式，例如通过混合、制粒、包衣、溶解或冻干方法制备本发明的药物组合物。单位剂型可以包含，例如约0.1mg-约1500mg，诸如1mg-约1000mg。 
如果合适，例如可以按照，例如与作为常规的方法或如本文所述用于本发明药物组合物的方法提供包含本发明的组合的药物组合物和包含如本文所述第二种药物的药物组合物。 
所谓术语″第二种药物物质″意指抗炎、免疫调节药、抗癌药、麻醉药或化疗药。“第二种药物物质”还可以为具有激肽释放酶-7活性的化合物， 但并非本发明的化合物。 
如果将本发明的化合物与其它药物共同施用，那么作为使用本发明化合物的情况，共同施用的第二种药物的剂量当然根据共同使用的药物的类型、使用的具体药物、所治疗的病症的不同而改变。一般而言，与第二种药物提供者提供的那些类似的剂量可能是合适的。 
在下列实施例中，所有所示的温度均以摄氏度(°)表示。 
还使用下列缩写： 
aq.     水 
Ac2O    乙酐 
AcOH    乙酸 
CH2Cl2  二氯甲烷 
DCE     1，2-二氯乙烷 
DIPEA   N，N-二异丙基乙胺 
DMA     N，N-二甲基乙酰胺 
EtOAc   乙酸乙酯 
HATU    O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐 
NMP     N-甲基吡咯烷酮 
rt      室温 
TFA     三氟乙酸 
THF     四氢呋喃 
TLC     薄层色谱法 
TMOF    三甲基原甲酸酯 
激肽释放酶7抑制剂还可以为“肽”或“肽衍生物”，该术语用以包括“肽模拟物”或“肽类似物”，其补充激肽释放酶7结合袋的三维结构或可以设计具有改善的物理或化学特性以便结合作为本发明提供的的激肽释放酶7的三维结合袋。 
术语“突变体”意指通过一种或多种选择的氨基酸的缺失、插入或优选取代的突变序列，只要这类突变序列与进行最佳序列对比时相应的片段序 列共有至少90％的同一性，更优选95％，且甚至更优选99％的同一性。 
制备蛋白质突变体的方法为本领域中通常公知的。例如，可以通过用寡核苷酸定向诱变在其编码区中表达预先修饰的激肽释放酶7DNA制备激肽释放酶7突变体。 
本文所用的术语“结合袋”意指激肽释放酶7区作为其形状和物化特性的结果有利于结合另一种化学实体或化合物并且由表3的坐标定义。 
用于结晶的激肽释放酶7蛋白可以为生物活性的或无活性的。可以通过本领域众所周知的形态、生化或活力分析确定这类能力。 
重组激肽释放酶7或其片段的表达可在真核或原核系统或体外表达系统中实现。 
按照优选的实施方案，激肽释放酶7在结晶前在任意步骤时结合至少一种配体。 
激肽释放酶7作为融合蛋白表达，例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或组氨酸-标记的融合蛋白。如果需要，在结晶前除去融合配偶体。 
为了实施制备晶体的方法的结晶步骤，可以使用各种方法，包括按照本领域公知的方法蒸汽扩散、透析或分批结晶(“Crystallization ofBiological Macromolecules”，A.McPherson，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA)。 
在蒸汽扩散结晶中，将小体积的(即几微升)蛋白质溶液与含沉淀剂的溶液混合。将该混合的体积悬浮在含少量，即约1ml沉淀剂的孔上。从液滴到孔中的蒸汽扩散导致液滴中结晶形成。 
透析结晶方法使用保留蛋白质，但允许小分子(即缓冲剂和沉淀剂)扩散进出的半透性的大小排阻膜。在透析中，允许沉淀剂缓慢通过所述膜扩散并且降低蛋白质的溶解度，同时保持固定的蛋白质浓度，而非通过蒸发浓缩蛋白质和沉淀剂。 
分批方法一般包括缓慢将沉淀剂添加到蛋白质水溶液中，直到溶液恰好变混浊，此时密封容器并且保持稳定一定时间期限，直到结晶发生。在分批技术中，简单混合沉淀剂和靶分子溶液。直接而非通过扩散实现过饱 和。分批技术通常在油中进行。油防止蒸发并且可以使用极小的液滴。因此，使用术语″微批″。这项技术的改进并不使用石蜡油(防止完全蒸发)，而是使用硅油或硅氧烷与石蜡油的混合物，以便能够缓慢蒸发。 
请求保护的本发明可以包括任意和所有的结晶方法。本领域技术人员可以选择这类方法中的任意种并且改变参数，使得选择的方法产生所需的晶体。 
一种优选的激肽释放酶7结晶方法包括混合激肽释放酶7溶液与“储库缓冲液”。为了晶体形成，例如，必须通过添加沉淀剂，例如通过逐步增加或通过经结晶缓冲液与储库缓冲液(不一定与原始储库缓冲液相同)之间扩散使沉淀剂浓度达到平衡增加混合物中沉淀剂的浓度。在适当的条件下，这类沉淀剂的扩散沿沉淀剂的梯度发生，例如从具有较高浓度沉淀剂的储库缓冲液扩散进入具有较低沉淀剂浓度的结晶缓冲液。例如，可以通过蒸汽扩散技术实现扩散，使得水在通常的气相中扩散。已知的技术为，例如蒸汽扩散法，诸如“悬滴”或“坐滴”法。在蒸汽扩散法中，除更大的储库缓冲液库外，含蛋白质的结晶缓冲液液滴也悬或坐。或者，可以通过半透膜实现沉淀剂平衡，所述半透膜使结晶缓冲液与储库缓冲液分离并且防止蛋白质稀释入储库缓冲液。 
可以在主要通过下列参数确定的各种条件下形成激肽释放酶7：pH、存在盐和添加剂、沉淀剂、蛋白质浓度和温度。pH可以在例如约4.0-9.0。 
在另一个具体的实施方案中，本发明涉及制备与配体复合的激肽释放酶7共结晶的方法。 
激肽释放酶7晶体的晶型还可以用于通过浸入所关注的化合物交换配体，例如用于化合物优化或发现基于片段的筛选手段的新平台。 
可以将本发明的结晶组合物的结构坐标以机器可读形式储存在机器可读储存媒体上，例如计算机硬盘驱动器、磁盘、DAT带等，以便展示为三维形状或其它应用，包括基于结构坐标或它们定义的三维结构的计算机辅助的处理或计算。例如，一般可以使用能够从所述储存媒体读取数据并且使用从这类数据生成所述代表的指令编程的计算机将确定激肽释放酶家族 蛋白质三维结构或这类蛋白质部分或结构相似同源物的数据储存在机器可读的储存媒体中，并且可以展示为蛋白质结构的图示三维代表。 
按照本发明，三维激肽释放酶7模型可获自包含激肽释放酶7、其片段或同源物的激肽释放酶7晶体。 
本发明还涉及储存了激肽释放酶7晶体结构模型的计算机可读媒体。在优选的实施方案中，所述模型由所有或选择的部分，即来源于X-射线衍射数据的表3的原子坐标构建。 
所谓“选择的部分”意指表3中所示至少10个连续氨基酸的结构坐标，且优选至少50个氨基酸，且更优选至少100个连续的氨基酸。 
可以以各种方式使用获自激肽释放酶7的三维模型的知识。例如，它可以用于鉴定化学实体，例如小有机和生物有机分子，诸如假肽和合成有机分子，它们结合激肽释放酶7且优选阻断或防止激肽释放酶7-介导或相关的过程或事件，或作为激肽释放酶7激动剂起作用。此外，该信息可以用于设计和制备激肽释放酶7突变体，例如具有改变的催化活性、模拟三维结构和拆分蛋白质晶体结构，诸如激肽释放酶7同源物、激肽释放酶7突变体或激肽释放酶7共复合物的突变体，包括，例如分子取代或同源性模拟。 
术语″分子取代″意指方法，其包括通过对其结构坐标已知，例如未知晶体晶胞内的激肽释放酶7坐标的分子定向和定位生成其结构坐标未知的晶体的初步结构模型，以便最好地解释未知晶体的观察到的衍射图案。然后可以根据这一模型计算阶段，并且与观察到的振幅合并成其坐标未知的近似傅里叶合成结构。它由此可以进行几种形式的精修以便提供未知晶体的最终精确结构。使用本发明提供的结构坐标，分子取代可以用于确定晶体共复合物、未知配体、突变体或同源物或激肽释放酶7的不同晶型的结构坐标。另外，请求保护的晶体及其坐标可以用于确定与激肽释放酶7结合的化学实体的结构坐标。 
本发明的“同源性模拟”包括使用一种或多种相关蛋白、蛋白质结构域和/或子结构域，诸如激肽释放酶7的结构坐标构建未知结构的模型。可以 通过拟合其三维结构被拆分成同源结构元件的三维结构的蛋白质或肽的常见或同源部分进行同源性模拟。同源性模拟可以包括重建用拆分的相关结构的那些氨基酸取代氨基酸或其它成分的三维结构的部分或全部。 
基于如本发明提供的激肽释放酶7的三维结构并且使用表3的原子坐标或选择的部分，可以预测位点特异性突变的作用。更具体地说，本文提供的结构信息允许鉴定氨基酸修饰、特别是氨基酸突变的所需位点，从而产生取代、插入或缺失变体。可以设计具有特殊特性、特别是不同于野生型激肽释放酶7的特性，诸如改变的催化活性的这类变体。可以合并取代、缺失和插入以便获得所需变体。可以通过本领域众所周知的方法，例如从野生型激肽释放酶7开始或通过重新合成制备这类变体。 
本文提供的激肽释放酶7结构信息用于设计能够选择性与激肽释放酶7，而不是其它非激肽释放酶7的蛋白酶发生相互作用且由此调节激肽释放酶7而非其它激肽释放酶7蛋白酶生物活性的配体。 
可以由本领域技术人员构建具有模拟激肽释放酶7结合袋的可及表面的具有表面的化学实体。作为实例，本领域技术人员可以筛选化合物的三维结构数据库以便鉴定那些化合物，它们按照类似的三维结构排列使适当的官能团定位，然后构建接近这类化学实体的组合化学库以便鉴定对激肽释放酶7结合袋具有高度亲和力的那些。 
在本发明的一个具体的实施方案中，设计基于细胞的试验以便鉴定抑制激肽释放酶7生物活性的配体。 
可以从筛选化合物数据库或文库中并且使用使拟合操作形成激肽释放酶7上的结合位点的计算机方式鉴定配体，诸如小分子量化合物。作为本发明提供的表3的结构坐标或选择的部分的激肽释放酶7的三维结构可以与各种停靠程序共同使用。 
可以分析化学实体对激肽释放酶7的潜在抑制或结合作用，此后通过使用计算机模拟技术对其进行实际合成和测试。如果指定化学实体的理论结构提示它与激肽释放酶7之间的相互作用和结合不充分，那么排除对合成和测试化学实体的需求。然而，如果计算机模拟显示了强相互作用，那 么可以合成分子并且测试其结合激肽释放酶7的能力。因此，可以避免昂贵和费时的无效化合物的合成。 
这种“in silico”分析可以通过目视检查例如计算机屏幕上完全或部分基于表3结构坐标的结合袋开始。然后可以以各种方向使选择的片段或化学实体定位或″停靠″在激肽释放酶7结合袋内。可以使用软件，诸如Quanta和SYBYL，随后使用能量最低化和使用标准分子力学力场的分子动力学，诸如CHARMM和AMBER进行停靠。具体的计算机程序可以用于选择有意义的片段或化学实体。这些程序包括，例如购自OxfordUniversity，Oxford，UK的GRID；购自Molecular Simulations，Burlington，MA的5MCSS或CATALYST；购自Scripps Research Institute，La Jolla，CA的AUTODOCK；购自University of California，San Francisco，CA的DOCK，和购自University College of London，UK的XSITE。 
优选用于设计在激肽释放酶7底物结合位点或任意其它结合位点上发生相互作用的激肽释放酶7抑制剂的方法。本发明能够使用的一种手段在于使用激肽释放酶7的结构坐标以便设计结合或连接激肽释放酶7的化学实体并且以不同方式改变该化学实体的物理特性。因此，诸如，例如溶解度、亲和力、特异性、功效、开/闭速率(on/off rates)或其它结合特征这类特性均可以改变和/或最大化。可以通过使用不同实体的文库探测包含本发明结合袋的激肽释放酶7以便确定候选化学实体与激肽释放酶7之间相互作用的最佳位点设计所需化学实体。例如，从使用溶剂饱和的晶体中采集的高分辨率X-射线衍射数据能够确定每种类型的溶剂分子附着的位置。然后可以设计和合成紧密结合那些位点的小分子，并且测试所需活性。一旦获得了所需活性，就可以进一步改变分子以便使所需特性最大化。 
一旦通过上述方法设计或选择了化合物，就可以使用计算机或实验评价测试该化合物可以结合激肽释放酶7的效率并且为最大所需的特性修饰它。可以根据所需效果的不同使各种参数最大化。它们包括，但不限于特异性、亲和力、开/闭速率、疏水性、溶解度和本领域技术人员易于确定的其它特征。 
在一个优选的实施方案中，激肽释放酶7的表3的结构坐标用于上述基于计算机的设计步骤。 
本发明进一步涉及选择结合激肽释放酶7的配体的方法，包括： 
a.使候选化合物或化合物与激肽释放酶7的混合物在适当条件下共结晶或孵育， 
b.通过X-射线或NMR方法测定与候选化合物发生相互作用的激肽释放酶7的氨基酸， 
c.选择至少与结合袋的一种或多种氨基酸发生相互作用的化合物。 
为了进行步骤b.，通常通过使用候选化合物记录NMR光谱并且鉴定受配体结合影响的蛋白质的那些共振态对配体结合位点进行作图。这需要在分析前分配蛋白质共振态或与在配体结合公知结合位点时发生的化学位移改变模式进行比较。或者，使用具有已知结合位点的所述配体的竞争性实验可以产生等同的信息。 
本发明进一步提供了使用片段连接手段设计激肽释放酶7新配体的方法。首先选择结合激肽释放酶7不同结合区的化合物。基于空间方向彼此连接配体，使得设计的新化合物在两结合位点内适宜。 
本发明由此涉及设计激肽释放酶7配体的方法，其中该方法包括： 
a.提供结合激肽释放酶7的第一结合区的一个或多个氨基酸的第一种配体， 
b.提供结合激肽释放酶7的第二结合区的一个或多个氨基酸的第二种配体，和 
c.连接所述第一种配体与所述第二种配体以便设计结合激肽释放酶7第一和第二结合袋的配体。 
基于有机化学领域众所周知的键角和键长信息，通过维持配体彼此和与激肽释放酶7的空间方向对适当的连接基进行选择。 
此外，激肽释放酶7的拮抗剂可以用于治疗患者或用于制备治疗如下疾病的药物：炎性和/或过度增殖性瘙痒性皮肤病诸如瘢痕疙瘩、肥大性瘢痕、痤疮、特应性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征 或其它瘙痒性皮肤病诸如结节性痒疹、中老年人未指明的瘙痒以及其它与上皮屏障功能障碍相关的疾病诸如老化皮肤、炎性肠病和克罗恩病以及胰腺炎或癌症，特别是卵巢癌。 
下列实施例用于例证本发明，但不应视为对其进行限定。本发明特别涉及这些实施例中所述的具体实施方案。 
实施例
克隆 
为了防止hK7自我裂解，通过位点定向诱变，按照标准方案，使用pET24_His-Pro-EK-KLK7(aa37-253)作为模板(QuickChange位点定向诱变试剂盒；Stratagene；诱变引物：5’GACTGCACGAAGGTTCGCAAGGACTTACTGGAAAATTCCATGC)使Tyr180位上的自我裂解位点(按照Swiss-Prot entry P49862编号)突变成Arg。克隆载体pET24_His-Pro-EK-KLK7(aa37-253)为本领域常用的方式。最终载体称作pET24c-His-ProKLK7-Enterok-KLK7(aa37-253)_Y180R。 
表达和纯化 
在37C下和包含34μg/ml氯霉素和30μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养隐含前-hK7表达质粒的大肠杆菌(E.coli)菌株BL21(DE3)。在37℃下使用0.4mM IPTG在OD6001.0下开始诱导4小时。随后通过离心收集细胞。除非另作陈述，否则全部纯化步骤在4C下进行。将来自10升大肠杆菌细胞培养物的细胞(25g细胞沉淀)重新悬浮于含1mM MgCl2的200ml 50mM Tris/HCl缓冲液、pH 8.0中并且储存在-20℃下过夜。在融化后，加入1μlBenzonase(ROCHE)并且将样品在37℃下孵育10min。通过超声处理破碎细胞(4次，20秒，在70％振幅下；Branson Digital SonifierW-450D)并且以7000g将匀化物离心15min。用含25％蔗糖、1％Triton100和1μl Benzonase的50mM Tris pH 8.0缓冲液将含包含体的沉淀洗涤3次，且最终用含1mM MgCl2的H2O洗涤2次。通过HPLC，使用反相柱进一步纯化包含体，将包含体溶于6M GuHCl(10mg/ml)和100mM DTT 并且上用0.1％TFA和10％乙腈平衡的GE Source RPC柱(Fine line35S)。通过使乙腈浓度从10％递增至100％洗脱蛋白质。收集含蛋白酶的级分并且冻干。用含2M脲、500mM NaCl、10mM CaCl2、0.1M NH4Cl、1mM EDTA、1.25mM GSH和0.5mM GSSG的50mM Tris/HCl pH 8.0缓冲液(10℃冷)将干燥的蛋白质稀释至50μg/ml终浓度。随后将样品对10mM Tris pH 8.0缓冲液透析并且上Q-琼脂糖柱(50ml)。通过使盐浓度从0递增至0.5M NaCl洗脱蛋白质并且收集含pro-hK7的级分且浓缩至约5ml。随后在8℃下通过添加肠激酶(1∶100)使样品活化24h。最终使hK7上用50mM Tris、100mM NaCl、pH 8平衡的大小排阻色谱柱(Superdex75，HiLoad 26/60，Amersham)，流速为2.5ml/min。为了进行结晶试验，通过对pH 5.6下的50mM乙酸钠和100mM氯化钠透析交换蛋白质缓冲液并且将蛋白质储存在4℃下。 
结晶 
将hK7浓缩至24.6mg/ml并且通过蒸汽扩散法在20℃下和悬滴中结晶。将含pH 5.6下的50mM乙酸钠、100mM氯化钠、2mM抑制剂和1.8％(v/v)DMSO的0.5μl蛋白质溶液与由35％(w/v)PEG 3350、200mM氯化钙和pH 4.8下的100mM乙酸钠组成的0.5μl储库溶液混合。使液滴对1ml储库溶液平衡。散射特性晶体在1-3天内出现。 
数据采集 
为了进行X-射线数据采集，将晶体速冻在液氮中，不额外添加冷冻保护剂。在95K和Swiss Light Source的光束线X10SA下，使用MAR225镶嵌的CCD检测器在 
Figure G2008800225455D00321
波长下从hK7-抑制剂复合物的单晶中采集X-射线衍射数据。就与抑制剂复合的hK7晶体而言，采集299或300图像，其中各自振动0.5°。使每个图像的曝光时间在0.5s与1s之间。晶体到检测器的距离为100mm-120mm。处理原始的散射数据并且使用HKL程序组version 1.98.0(21)或XDS/XSCALE(22)，使用APRV(23)界面分级。将晶体数据和数据采集统计概括在表1中。 
表1：数据采集统计 
Rmerge＝∑|Io-<I>|/∑<I> 
结构测定和结构精修 
通过使用程序MOLREP version 9.2.10(24)，使用人激肽释放酶1的坐标(pdb代码1SPJ，精修成 
Figure G2008800225455D00341
分辨率(25))作为研究模型拆分与化合物1复合的hK7结构。使用不对称单位形式的一种蛋白质-调节剂复合物在空间群P212121中发现了具有高分辨率截止值 
Figure G2008800225455D00342
的明确的解决方案(相关系数0.34，R-因子0.48)。使用刚性-体、模拟退火和程序CNX version 2005(26)的结合体精修方案和 
Figure G2008800225455D00343
的高分辨率数据截止值施加最初的精修循环。构建hK7结构并且通过使用程序O version 9的手动模型(重)建(27)和使用程序CNX version 2005的最小和结合体方案的自动化精修的交替循环精修。随后将分辨延伸至 使用程序CNX version 2005的喷水器方案加入209个水分子并且最终加入调节剂。包括各向异性取代参数，以便使用CNX 2005的adp方案在 
Figure G2008800225455D00345
分辨率下进行最终精修循环。精修靶标为具有Engh和Huber(28)使用振幅描述的参数的最大似然函数。在整个精修过程中使用从精修中排除的9.8％的反射率使用交叉确认。使用程序CNX 2005和PROCHECK评价最终模型的品质(29)。将精修统计概括在表2中。 
表2：精修统计 
Rcryst＝∑|Fo-Fc|/∑Fo 
可以在高质量电子密度图中跟踪224个氨基酸中的219个。氨基酸 166RKDLL170(除非另作陈述，否则在本文件中使用按照糜蛋白酶原编号方案(30)的氨基酸编号)缺乏电子密度并且不包括在最终的结构中。这种混乱的环的精氨酸残基在用于结晶的构建体中突变(按照Swiss-Prot编号入口P49862，该残基为Tyr180)。野生型酪氨酸残基易于自动催化裂解，这并非精氨酸突变体的情况，正如通过MS分析证实的。 
正如预计的，在残基Cys22-Cys157、Cys42-Cys58、Cys129-Cys232、Cys136-Cys201、Cys168-Cys182和Cys191-Cys220之间发现6个二硫键，并且为氨基酸Pro147和Pro219构建顺式-肽键。由于该结构的高分辨率，所以构建两种构象的氨基酸30、38、39、49、50、84、90、110、138、153、161、164、187、192和200的侧链。 
hK7的结构 
hK7的结构模拟hK1、hK6和hK8的总体结构(25，31，32)并且遵循典型的糜蛋白酶样折叠，它由两个β-桶和一个C-末端α-螺旋组成。活性位点，包括由His57、Asp102和Ser195组成的催化三联体位于两个β-桶的界面上。 
与hK5和hK6类似并且与hK1相反，hK7缺乏所谓的激肽释放酶环。激肽释放酶环为具有某些激肽释放酶的特征，尤其是典型特征的Thr96与Gln97之间至多11个氨基酸残基的插入物。它超过了非预处理的结合位点，如盖。hK7在该区中不具有氨基酸插入物并且在长度上无法与胰蛋白酶或糜蛋白酶区分。 
尽管与其它激肽释放酶具有总体结构相似性，但是hK7的S1袋不同于例如hK1、hK5、hK6和hK8的胰蛋白酶样特异性的方面在于极性Asn189取代了在袋底部的带负电荷的Asp并且疏水性Ala190取代了极性Ser/Thr残基。这些S1袋的特异性结构特征与观察到的偏好具有极性头的中等到较大尺寸的S1残基的hK7的糜蛋白酶样特异性充分一致。hK7对 Tyr具有的偏好特异性超过了P1中的Ala、Met和Phe(1，33)。 
混乱的环位于S3/S4底物结合袋远端。在其它S1中，丝氨酸蛋白酶与结合S1-S3的抑制剂复合，同源性环排序并且反向折叠成S3/S4结合袋的组成部分，由此促成了抑制剂结合。因此，可能的情况是，这一激肽释放酶7结构的组成部分在结合占据S3/S4袋的抑制剂时得到排序。此外，由于在纯化过程中该环的酪氨酸残基后面发生自动裂解，所以该酪氨酸被精氨酸残基取代，这也可能影响这种环的构象。 
我们的调节剂采用跨越S1到引导的结合位点令人意外的结合模式结合激肽释放酶7的活性位点。 
就化合物1而言，萘基和甲氧基苯基部分分别结合S1和S2’袋。中心吡咯烷环结合S1’袋并且诱导His57侧链的构象改变，由此破坏由His57、Asp102和Ser195组成的催化三联体。在抑制剂结合时，His57侧链面向S2袋摆动(与hK6pdb代码1L2E的结构相比，围绕chi1旋转120°并且围绕chi2旋转90°)并且与Cys42和Cys58之间的二硫键共同构成吡咯烷环抑制剂占据的疏水性袋。抑制剂脲部分的羰基氧原子占据氧阴离子孔并且处于与Gly193和Ser195的骨架氮原子的H-键合距离中。一个脲氮原子使得与His57的侧链和Ser214的骨架羰基发生水为媒介的相互作用。抑制剂酰胺氮原子与His41的骨架羰基氧原子发生相互作用。甲氧基苯基部分处于与具有苯基环的Val149和Phe151的范德瓦尔斯距离上，使得与Phe151的侧链发生边缘-与-界面的相互作用。 
在晶体环境内，对称连接的hK7分子包装了接近hK7的活性位点。如上所述，调节剂结合诱导了催化His57侧链的运动。这种取代的His57侧链的一个氮原子处于与对称连接的分子的Phe151骨架羰基的H-键合距离中。此外，调节剂引导的位点部分接触同一对称连接的分子的Pro21和Asp154的侧链。因此，不能完全排除晶体接触对调节剂结合模式的影响。然而，结晶接触不会阻止结合不同主要位点袋中的不同主要位点平台。 
表3：激肽释放酶7的新结合袋的三维结构 
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实施例1： 
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(2-吡啶-3-基-乙基)-酰胺] 
A)7-氯-萘-1-甲酸甲酯
将50ml的2-糠酸甲酯和400ml氯苯的混合物在0°下搅拌30分钟，在RT下搅拌1,5小时并且在100°下搅拌16小时。在0°下分部分加入121g无水AlCl3。冷却获得的溶液，倾入冰浴并且搅拌30分钟，此后用乙醚萃取水相。用10％NaHCO3水溶液和盐水洗涤获得的有机相，干燥并且蒸发溶剂。通过硅胶快速色谱法纯化获得的残余物(洗脱剂：环己烷/EtOAc99/1 to 95/5)而得到标题化合物。 
B)(7-氯-萘-1-基)-甲醇
将在-78°下的0.7M氢化二异丁基铝在CH2Cl2中的溶液滴加到22g在CH2Cl2中的7-氯-萘-1-甲酸甲基酯中。在-78°下搅拌1小时后，将获得的 混合物温至0°，用10％酒石酸钠水溶液猝灭并且再搅拌几分钟。分离获得的有机相，用盐水洗涤，干燥并且蒸发溶剂。通过硅胶快速色谱法纯化获得的残余物(洗脱剂：环己烷/EtOAc 8/1至4/1)并且得到标题化合物。 
MS：175[M-H2O+H]+TLC，Rf(环己烷/EtOAc 3/1)＝0.3 
C)1-叠氮基甲基-7-氯-萘
将1.52ml二苯基磷酰基氮化物和1.10ml 1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯加入到在18ml甲苯中的1.3g(7-氯-萘-1-基)-甲醇中。将获得的混合物在rt下搅拌1小时，用盐水洗涤，干燥有机相并且蒸发溶剂。通过硅胶快速色谱法纯化获得的残余物(洗脱剂：环己烷/EtOAc 99/1)而得到标题化合物。 
TLC，Rf(环己烷/EtOAc 99/1)＝0.333 
D)C-(7-氯-萘-1-基)-甲胺盐酸盐
将1.24g三苯膦和410μl H2O加入到在20ml THF中的998mg 1-叠氮基甲基-7-氯-萘中。将获得的化合物在50°下搅拌5小时并且蒸发溶剂。用1N HCl水溶液酸化获得的残余物并且用EtOAc萃取。用10％NaHCO3水溶液碱化获得的水相并且用EtOAc萃取。干燥获得的有机相并且蒸发溶剂。获得标题化合物，为游离胺化合物，并且通过添加4M在二噁烷中的HCl溶液将其转化成盐酸盐。蒸发溶剂并且将获得的残余物与乙醚一起搅拌，过滤获得的混合物并且干燥获得的滤液而得到标题化合物。 
MS：192[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝0.25 
E)C-(7-三乙基硅烷基乙炔基-萘-1-基)-甲胺
将500mg的C-(7-氯-萘-1-基)-甲胺盐酸盐、5.4mg双(乙腈)钯(II)氯化物、29.8mg 2-二环己基膦基-2’，4’，6’-三异丙基-1，1’-联苯和1.7g碳酸铯在7.5ml乙腈中的溶液在rt下搅拌25分钟。在添加495μl(三乙基甲硅烷基)乙炔后，将获得的混合物在90°下搅拌2小时，用H2O猝灭并且用EtOAc萃取。用盐水洗涤获得的有机相，干燥并且蒸发溶剂。通过硅胶快速色谱法纯化获得的残余物(洗脱剂：CH2Cl2/MeOH/NH4OH 99/1/0.01- 95/5/0.01)。获得标题化合物。 
MS：279[M-NH3+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH98/2/0.01)＝0.22 
F)(S)-1-[(7-三乙基硅烷基乙炔基-萘-1-基甲基)-氨基甲酰基]-吡咯烷-2-甲酸
将20％在8ml甲苯中的光气溶液加入到在40ml甲苯中的500mgC-(7-三乙基硅烷基乙炔基-萘-1-基)-甲胺和479μl二异丙基乙胺中。将获得的溶液在回流状态下搅拌3小时并且再加入部分20％在8ml甲苯中的光气溶液并且在回流状态下再搅拌1小时，蒸发溶剂。向获得的蒸发残余物中加入在40ml THF中的559μl二异丙基乙胺和213mg(S)-吡咯烷-2-甲酸。将获得的混合物搅拌1小时并且蒸发溶剂。通过制备型HPLC纯化获得的残余物(Waters Sun Fire C18柱，水/乙腈95/5-0/100梯度)而得到标题化合物。 
MS：437[M+H]+HPLC(方法B)：4.366分钟 
G)(S)-1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-氨基甲酰基]-吡咯烷-2-甲酸
将250mg(S)-1-[(7-三乙基硅烷基乙炔基-萘-1-基甲基)-氨基甲酰基]-吡咯烷-2-甲酸在14ml THF中的溶液在rt下搅拌1小时。蒸发溶剂并且通过制备型HPLC纯化获得的残余物(Waters Sun Fire C18柱，水/乙腈95/5-0/100梯度)而得到标题化合物。 
MS：323[M+H]+TLC，Rf(EtOAc/AcOH 50/1)＝0.16 
H)(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(2-吡啶-3-基-乙基)-酰胺]
将11.6mg 3-(2-氨基乙基)吡啶、4.05μl二异丙基乙胺、13.1mg 1-羟基苯并三唑和18.8mg N-(乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到在1ml CH2Cl2中的20mg(S)-1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-氨基甲酰基]-吡咯烷-2-甲酸中。将获得的反应混合物在rt下搅拌16小时，蒸发溶剂并且通过制备型HPLC纯化获得的残余物(Waters Sun Fire C18柱，水/乙腈95/5-0/100梯度)而得到标题化合物。 
MS：427[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝ 0.37。 
实施例2：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-[(2-二甲基氨基-乙基)-酰胺]1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]
按照与实施例1中所述类似的方式使用N，N-二甲基乙二胺而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：393[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝0.07 
实施例3：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(2-吡啶-4-基-乙基)-酰胺]
按照与实施例1中所述类似的方式使用4-(2-氨基乙基)吡啶而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：427[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝0.10 
实施例4：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(6-甲氧基-吡啶-3-基甲基)-酰胺]
按照与实施例1中所述类似的方式使用C-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-甲胺而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：443[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝0.275 
实施例5：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-酰胺]
按照与实施例1中所述类似的方式使用1-(甲基哌啶-4-基)甲胺而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：433[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2 /MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝0.072 
实施例6：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苄基酰胺]
按照与实施例1中所述类似的方式使用4-(4-甲基哌嗪基)苄胺而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：510[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝0.1 
实施例7：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-(4-吗啉-4-基甲基-苄基酰胺)
按照与实施例1中所述类似的方式使用4-(吗啉代甲基)苄胺而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：511[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 98/2/0.01)＝0.26 
实施例8：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-甲基酰胺
按照与实施例1中所述类似的方式使用甲胺盐酸盐而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：336[M+H]+TLC，Rf(乙酸乙酯)＝0.1 
实施例9：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-{[2-(4-苄基-哌嗪-1-基)-乙基]-酰胺}1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]
按照与实施例1中所述类似的方式使用2-(4-苄基-哌嗪-1-基)-乙胺而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：524[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝0.32 
实施例10：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(2-甲氧基-乙基)-酰胺]
按照与实施例1中所述类似的方式使用2-甲氧基乙胺而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：380[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝0.276 
实施例11：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]
按照与实施例1中所述类似的方式使用3-吡啶甲基胺而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：413[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝0.17 
实施例12：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-4-基甲基)-酰胺]
按照与实施例1中所述类似的方式使用4-吡啶甲基胺而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：413[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝0.215 
实施例13：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙基]-酰胺}
按照与实施例1中所述类似的方式使用1-(2-氨基乙基)4-甲基哌嗪而不是3-(2-氨基乙基)吡啶制备标题化合物。 
MS：448[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.01)＝0.088 
实施例14：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(6-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}
A)C-(6-氯-萘-1-基)-甲胺三氟乙酸盐
按照与实施例1步骤C和D中所述类似的方式使用(6-氯-萘-1-基)-甲醇而不是(7-氯-萘-1-基)-甲醇制备标题化合物。 
MS：175[M-NH3+H]+HPLC(方法B)：1.935min 
B)(S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基氨基甲酰基]-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将18.9g N-(乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到冷却的20.04g(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-叔丁酯、14.9g 4-甲氧基苯乙基胺、16.9ml二异丙基乙胺和13.2g 1-羟基-苯并三唑在250ml CH2Cl2中的溶液中。将获得的反应混合物在rt下搅拌16小时，用2N HCl水溶液使反应停止，并且用CH2Cl2萃取合并的水相。用2N HCl水溶液、盐水和饱和NaHCO3水溶液洗涤获得的合并的有机相，干燥并且蒸发溶剂。通过使用EtOAc/己烷(1/3)重结晶纯化获得的残余物而得到标题化合物。 
MS：349[M+H]+TLC，Rf(乙酸乙酯/己烷1/1)＝0.21 
C)(S)-吡咯烷-2-甲酸[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺
将在41ml二噁烷中的4N HCl溶液加入到16.78g(S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基氨基甲酰基]-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯在40ml二噁烷中的精制混悬液中。在用冰浴弱冷却下搅拌2.5小时后，蒸发溶剂，在0°下将获得的残余物冷却过夜并且将所得晶体与150ml叔-丁基甲基醚一起搅拌，过滤并且干燥而得到标题化合物。 
MS：249[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝0.35 
D)(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(6-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}
将33mg C-(6-氯-萘-1-基)-甲胺三氟乙酸盐、22mg 4-硝基苯基氯甲酸酯和25μl吡啶在3ml CH2Cl2中的溶液在rt下搅拌1小时。加入30mg(S)- 吡咯烷-2-甲酸[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺和37μl二异丙基乙胺。将获得的反应混合物在rt下搅拌16小时，蒸发溶剂并且通过制备型HPLC纯化获得的残余物(Waters Sun Fire C18柱，水/乙腈95/5-0/100梯度)而得到标题化合物。 
MS：466[M+H]+TLC，Rf(EtOAc)＝0.363 
实施例15：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}
按照与实施例14中所述类似的方式使用C-(7-氯-萘-1-基)-甲胺三氟乙酸盐而不是C-(6-氯-萘-1-基)-甲胺三氟乙酸盐制备标题化合物。 
MS：466[M+H]+TLC，Rf(EtOAc)＝0.45 
实施例16：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(5-溴-苯并[b]噻吩-3-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}
按照与实施例14中所述类似的方式使用C-(5-溴-苯并[b]噻吩-3-基)-甲胺而不是C-(6-氯-萘-1-基)-甲胺三氟乙酸盐制备标题化合物。 
MS：518[M+H]+TLC，Rf(EtOAc/环己炔2/1)＝0.1 
实施例17：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(5-氯-苯并[b]噻吩-3-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}
按照与实施例14中所述类似的方式使用C-(5-氯-苯并[b]噻吩-3-基)-甲胺盐酸盐而不是C-(6-氯-萘-1-基)-甲胺三氟乙酸盐制备标题化合物。 
MS：472[M+H]+TLC，Rf(EtOAc/环己炔2/1)＝0.209 
实施例18：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}
A)(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}1-[(7-三乙基硅烷基乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]
按照与实施例14中所述类似的方式使用C-(7-三乙基硅烷基乙炔基-萘-1-基)-甲胺而不是C-(6-氯-萘-1-基)-甲胺三氟乙酸盐制备标题化合物。 
MS：570[M+H]+ 
B)(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}
按照与实施例1的G部分中所述类似的方式使用(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}1-[(7-三乙基硅烷基乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]而不是(S)-1-[(7-三乙基硅烷基乙炔基-萘-1-基甲基)-氨基甲酰基]-吡咯烷-2-甲酸制备标题化合物。 
MS：456[M+H]+TLC，Rf(EtOAc/环己烷2/1)＝0.15 
实施例19：(2S，4R)-4-甲氧基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]
A)(2S，4R)-4-甲氧基-2-[(吡啶-3-基甲基)-氨基甲酰基]-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
按照与实施例14步骤B中所述类似的方式使用(2S，4R)-4-甲氧基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-叔丁酯而不是(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-叔丁酯和3-吡啶甲基胺而不是4-甲氧基苯乙基胺制备标题化合物。 
MS：336[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝0.36 
B)((2S，4R)-4-甲氧基-吡咯烷-2-甲酸(吡啶-3-基甲基)-酰胺
按照与实施例14步骤C中所述类似的方式使用(2S，4R)-4-甲氧基-2-[(吡啶-3-基甲基)-氨基甲酰基]-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯而不是(S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基氨基甲酰基]-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯制备标题化合物。 
MS：236[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝0.31 
C)(2S，4R)-4-甲氧基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]1-[(7-三乙基硅烷基乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]
按照与实施例1的F部分中所述类似的方式使用((2S，4R)-4-甲氧基-吡咯烷-2-甲酸(吡啶-3-基甲基)-酰胺而不是(S)-吡咯烷-2-甲酸制备标题化合物。 
MS：557[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝0.44 
D)(2S，4R)-4-甲氧基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]
按照与实施例18的B部分中所述类似的方式使用(2S，4R)-4-甲氧基-吡咯烷-1，2-二甲酸2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]1-[(7-三乙基硅烷基乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]而不是(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}1-[(7-三乙基硅烷基乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]制备标题化合物。 
MS：443[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝0.23 
实施例20：(S)-哌啶-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]
按照与实施例19中所述类似的方式使用(S)-哌啶-1，2-二甲酸1-叔丁酯而不是(2S，4R)-4-甲氧基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-叔丁酯制备标题化合物。 
MS：427[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝0.36 
实施例21：(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]1-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]
A)(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-叔丁酯1-乙酯
将2,36g二(叔-丁基)二碳酸酯分3-次加入到1.65g(S)-八氢-环戊[c]吡咯-1-甲酸乙酯和1.45g NaCO3在20ml二噁烷和10ml H2O的混合物中。将获得的反应混合物在rt下搅拌4小时，用盐水使反应停止并且用EtOAc萃取获得的残余物。用盐水洗涤获得的有机相，干燥并且蒸发溶剂，此后 通过硅胶快速色谱法进行纯化(洗脱剂：环己烷/EtOAc 9/1)而得到标题化合物。 
MS：228[M-异丁烯+H]+TLC，Rf(环己烷/EtOAc 4/1)＝0.353 
B)(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-叔丁酯
将2g(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-叔丁酯1-乙酯和449mgLiOH在30ml THF和10ml H2O中的混合物在rt下搅拌16小时。用盐水使反应停止，用2N HCl水溶液酸化至pH 2并且用EtOAc萃取。用盐水洗涤获得的合并的有机相，干燥并且蒸发溶剂而得到标题化合物。 
MS：200[M+H]+TLC，Rf(己烷/EtOAc/AcOH 3/6/1)＝0.71 
C)(S)-1-[(吡啶-3-基甲基)-氨基甲酰基]-六氢-环戊[c]吡咯-2-甲酸叔丁酯
将50％丙基膦酸酐在650μl DMF中的溶液加入到200mg(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-叔丁酯、7.42mg 4-二甲基氨基吡啶和650μl二异丙基乙胺在CH2Cl2中的溶液中。在rt下搅拌16小时后，用2N NaOH水溶液使反应停止，通过Chem Elut洗脱，用CH2Cl2萃取并且蒸发溶剂，此后通过制备型HPLC进行纯化(Waters Sun Fire C18柱，水/乙腈95/5-0/100梯度)而得到标题化合物。 
MS：346[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝0.42 
D)(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]1-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]
按照与实施例19中所述类似的方式使用(S)-1-[(吡啶-3-基甲基)-氨基甲酰基]-六氢-环戊[c]吡咯-2-甲酸叔丁酯而不是(2S，4R)-4-甲氧基-2-[(吡啶-3-基甲基)-氨基甲酰基]-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯制备标题化合物。 
MS：453[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝0.29 
实施例22：(S)-2，3-二氢-吲哚-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]
按照如实施例21中所述类似的方式使用(S)-2，3-二氢-吲哚-1，2-二甲酸1-叔丁酯而不是(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-叔丁酯制备标题化合物。 
MS：461[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝0.42 
实施例23：(S)-1，3-二氢-异吲哚-1，2-二甲酸2-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]1-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]
按照如实施例21中所述类似的方式使用1，3-二氢-异吲哚-1，2-二甲酸2-叔丁酯而不是(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-叔丁酯制备标题化合物。 
MS：461[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝0.34 
实施例24：(1R，2S，5S)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]
按照如实施例21中所述类似的方式使用(1R，2S，5S)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-叔丁酯而不是(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-叔丁酯制备标题化合物。 
MS：425[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝0.32 
实施例25：(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]
按照如实施例21中所述类似的方式使用(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-叔丁酯而不是(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-叔丁酯制备标题化合物。 
MS：425[M+H]+TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/9/1)＝ 0.36 
实施例26：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]2-(苯乙基-酰胺)
A)(4-聚苯乙烯基氧基-2，6-二甲氧基-苄基)-苯乙基-胺
用DCE和TMOF的10/3混合物(150ml)将25g商购的2-(3，5-二甲氧基-4-甲酰基苯氧基)乙氧基甲基聚苯乙烯洗涤4次。将获得的树脂再悬浮于上述DCE和TMOF的10/3混合物(150ml)并且用15.1g苯乙胺处理。将获得的淤浆在rt下和定轨振荡器上振摇16小时，排出获得的树脂并且依次用DMA、THF和CH2Cl2洗涤。将预先形成的5.1ml MeOH、7.2ml AcOH和125mmol硼烷-吡啶复合物在CH2Cl2中的溶液加入到树脂中并且在rt下继续振摇4小时。排除获得的树脂并且依次用DMA、AcOH/DMA(1/19)、DMA、THF/H2O(9/1)、THF、CH2Cl2、MeOH、THF、MeOH洗涤。在真空中充分干燥标题化合物至恒重。 
B)(S)-2-[(4-聚苯乙烯基氧基-2，6-二甲氧基-苄基)-苯乙基-氨基甲酰基]-吡咯烷-1-甲酸9H-芴-9-基甲酯
将122mg(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯，随后将126μlDIPEA加入到140mg HATU在1.20ml NMP中的溶液中。将获得的溶液加入到200mg(4-聚苯乙烯基氧基-2，6-二甲氧基-苄基)-苯乙基-胺树脂上(作为约0.6mmol/g，0.12mmol加载)并且将获得的淤浆在60°下振摇2小时。依次用DMA、MeOH、CH2Cl2洗涤获得的树脂并且在rt下用1M的Ac2O和2M的DIPEA在5ml CH2Cl2中的溶液处理1小时。排出获得的树脂并且连续使用上述DMA、MeOH和CH2Cl2溶剂次序洗涤3次。 
C)(S)-吡咯烷-2-甲酸(4-聚苯乙烯基氧基-2，6-二甲氧基-苄基)-苯乙基-酰胺
将步骤B中获得的树脂(S)-2-[(4-聚苯乙烯基氧基-2，6-二甲氧基-苄基)-苯乙基-氨基甲酰基]-吡咯烷-1-甲酸9H-芴-9-基甲酯(0.12mmol结合种类)悬浮于哌啶和DMA(1/4，3ml)的混合物中并且在定轨振荡器上振摇20分钟，此后排出并且依次用DMA、MeOH和CH2Cl2洗涤。使获得的树脂再次接触哌啶和DMA溶液20分钟，此后最终用DMA、MeOH和CH2Cl2 洗涤而得到标题化合物。 
D)(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-[(4-聚苯乙烯基氧基-2，6-二甲氧基-苄基)-苯乙基-酰胺]1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]
将210mg 1-(氨基甲基)萘，随后将210μl DIPEA谨慎加入到249mg 4-硝基苯基氯甲酸酯在2.60ml DCE中的溶液中。将获得的溶液在rt下搅拌2.5小时并且加入到步骤C中获得的树脂(0.12mmol结合种类)中。将获得的树脂淤浆在rt下和定轨振荡器上振摇17小时。排出获得的树脂并且使用DMA、MeOH和CH2Cl2的次序洗涤3次而得到标题化合物。 
E)(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]2-(苯乙基-酰胺)
用20％TFA在2ml CH2Cl2中的溶液将步骤D)的树脂(0.12mmol结合种类)处理1小时。过滤获得的树脂并且用2ml CH2Cl2洗涤3次。浓缩获得的合并滤液并且将获得的残余物溶于MeOH且通过制备型HPLC进行纯化而得到标题化合物。 
MS：402[M+H]+，424[M+Na]+HPLC：4.44min，100％UV纯度 
实施例27：(2S，4S)-4-苯基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]2-(苯乙基-酰胺)
按照如实施例26中所述类似的方式使用(2S，4S)-4-苯基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯而不是步骤B中的(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯制备标题化合物。 
MS：478[M+H]+，500[M+Na]+HPLC：5.22分钟 
实施例28：(2S，4R)-4-苯基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]2-(苯乙基-酰胺)
按照如实施例26中所述类似的方式使用(2S，4R)-4-苯基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯而不是步骤B中的(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯制备标题化合物。 
MS：478[M+H]+，500[M+Na]+HPLC：5.13分钟 
实施例29：(S)-3，4-二氢-1H-异喹啉-2，3-二甲酸2-[(萘-1-基甲基)-酰胺]3-(苯乙基-酰胺)
按照如实施例26中所述类似的方式使用(S)-3，4-二氢-1H-异喹啉-2，3-二甲酸2-(9H-芴-9-基甲基)酯而不是步骤B中的(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯制备标题化合物。 
MS：464[M+H]+，486[M+Na]+HPLC：5.04分钟 
实施例30：(S)-哌啶-1，2-二甲酸1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]2-(苯乙基-酰胺)
按照如实施例26中所述类似的方式使用(S)-哌啶-1，2-二甲酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯而不是步骤B中的(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-(9H-芴-9-基甲基)酯制备标题化合物。 
MS：438[M+Na]+HPLC：4.77分钟 
实施例31：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]
按照如实施例26中所述类似的方式使用2-(4-甲氧基-苯基)-乙胺而不是步骤A中的苯乙胺制备标题化合物。 
MS：432[M+H]+，454[M+Na]+HPLC：4.23分钟 
实施例32：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-苄基酰胺1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]
按照如实施例26中所述类似的方式使用苄胺而不是步骤A中的苯乙胺制备标题化合物。 
MS：388[M+H]+，410[M+Na]+HPLC：4.11分钟 
实施例33：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-环己基甲基-酰胺1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]
按照如实施例26中所述类似的方式使用C-环己基-甲胺而不是步骤A中的苯乙胺制备标题化合物。 
MS：394[M+H]+，416[M+Na]+HPLC：4.68分钟 
实施例34：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-[(3-甲基-丁基)-酰胺]1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]
按照如实施例26中所述类似的方式使用3-甲基-丁胺而不是步骤A中的苯乙胺制备标题化合物。 
MS：368[M+H]+，390[M+Na]+HPLC：4.34分钟 
实施例35：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(四氢-呋喃-2-基甲基)-酰胺]
按照如实施例26中所述类似的方式使用C-(四氢-呋喃-2-基)-甲胺而不是步骤A中的苯乙胺制备标题化合物。 
MS：382[M+H]+，404[M+Na]+HPLC：3.47分钟 
实施例36：(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]
按照与实施例1步骤F中所述类似的方式使用(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2-甲酸(吡啶-3-基甲基)-酰胺而不是(S)-吡咯烷-2-甲酸和C-(7-氯-萘-1-基)-甲胺而不是C-(7-三乙基硅烷基乙炔基萘-1-基)-甲胺制备标题化合物。将标题化合物溶于CH2Cl2并且用聚合物结合的苄胺进行处理。 
MS：434.9[M+H]+，432.8[M-H]-TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.5)0.10 
实施例37：(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}
按照与实施例1步骤F中所述类似的方式使用(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环 [3.1.0]己烷-2-甲酸[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺而不是(S)-吡咯烷-2-甲酸和C-(7-氯-萘-1-基)-甲胺而不是C-(7-三乙基硅烷基乙炔基萘-1-基)-甲胺制备标题化合物。将标题化合物溶于CH2Cl2并且用聚合物结合的苄胺处理。 
MS：477.9[M+H]+，475.8[M-H]-TLC，Rf(CH2Cl2/MeOH/NH4OH 95/5/0.5)0.40 
表1： 
下式的化合物 
Figure G2008800225455D01731
其中R2如表1所定义。 
Figure G2008800225455D01732
Figure G2008800225455D01741
表2： 
下式的化合物 
Figure G2008800225455D01742
其中Y如表2所定义。 
Figure G2008800225455D01743
Figure DEST_PATH_GSB00000903758100011
表3： 
下式的化合物 
Figure DEST_PATH_GSB00000903758100012
其中Y如表3所定义。 
Figure DEST_PATH_GSB00000903758100013
Figure G2008800225455D01761
Figure G2008800225455D01762
Figure G2008800225455D01771
实施例38： 
A)对小鼠中皮肤屏障破坏恢复的试验 
方法：在使用S- 
Figure G2008800225455D01772
皮肤采样圆盘反复剥离的无毛SKH1S小鼠的组中进行皮肤屏障破坏。当经表皮水份丢失(TEWL)达到≥40mg/cm2/h时完成操作。使用Tewameter TM210(Courage Khazaka，Cologne，DE)评价TEWL。在屏障破坏后即刻将实施例37的化合物(＝测试化合物1)以10mM浓度施用。类似地用单独的溶剂(EtOH/丙二醇，3/7(v/v))处理对照组动物。在屏障破坏前、屏障破坏后即刻和破坏后3hrs时测定TEWL。在每只动物中，使用公式：(1-[3hrs时的TEWL-基线TEWL]/[剥离后即刻的TEWL-基线TEWL])x100％计算恢复百分比。 
表1表示单一施用测试化合物比使用单独溶剂处理的小鼠加速屏障修复达65-76％(p＜0.001)。 
表1： 
  动物   屏障破坏恢复平均值％(SD值)，n：8或  12只动物/组)
  用测试化合物1在10mM下处理   76(3.3)＊＊＊
  单独用溶剂处理   56(7.1)
＊＊：与溶剂对照组相比p＜0.001 
B)对刺激性接触性皮炎(ICD)的鼠模型的抗炎活性试验 
方法：Crl：用10μl 0.005％佛波醇12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(TPA)攻击NMRI小鼠右耳内表面。将未攻击的左耳用作正常对照组并且根据攻击后6小时耳重(作为炎症性肿胀取测量值)的差异评价皮炎。在攻击前30分钟局部用10μl测试化合物1或溶剂处理动物。将处理功效计算为相对于单独用媒介物处理的动物而言对炎性耳肿胀抑制的百分比。 
表2表示TPA-诱导的刺激性皮炎为浓度-依赖性抑制的。在20mM浓度下炎性肿胀被抑制了54-73％；在3mM下未观察到具有统计学显著性的抑制作用。 
表2： 
    炎性肿胀抑制％  [平均值±SEM值(n只动物))
  浓度   测试化合物1
  30mM   73±7.0＊＊＊24
  10mM   41±5.3＊＊＊24
  3mM   13±6.1ns24
＊＊＊：p＜0.001，＊＊：与对照组相比p＜0.01，ns：不具有统计学显著性(p＞0.05) 
C)对变应性接触性皮炎(ACD)猪模型的抗炎活性试验 
在引起ACD前8天，将500μl10％2，4-二硝基氟苯(DNFB，溶于DMSO/丙酮/橄榄油[1/5/3，v/v/v])以分次体积施用于两耳基底表皮和两腹股沟上(100μl/部位)以致敏。在刮净的背外侧对侧测试部位(每个7cm2大小)上用15μl DNFB(1.0％)引起攻击性反应。就处理而言，在攻击后0.5和6小时将实施例11的化合物(＝测试化合物2)和安慰剂(仅为溶剂)在 对侧施用于每只动物的2个测试部位。在攻击后24小时当炎症达到峰值时以临床方式检查测试部位。对改变以0-4的等级评分(表XY)，允许每个指定的部位最大合并评分为12。使用a＊值通过反射分光光度法测定皮肤发红(参见表3) 
表3：使用ACD侵害的测试部位的临床症征候评分 
Figure G2008800225455D01791
表4概括了使用ACD侵害的测试部位的处理结果：1％的测试化合物2溶液抑制临床炎症改变达42％(p＜0.01)并且测定皮肤发红为32(p＜0.05) 
表4： 
  测试部位   临床评分 (平均值，SD，n：8+)   A＊值 (平均值，SD，n：8+)
  用1％测试化合物2处理   4.1(1.3)   7.7(1.6)
  用安慰剂(溶剂)处理   7.1(1.8)   11.7(2.3)
  与安慰剂处理的部位相比的抑  制   42.4(11.1)   31.9(18.4)
+：4只动物每只2个测试部位 
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Figure G2008800225455D01831
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Claims (7)

1.化合物，其选自：
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(2-吡啶-3-基-乙基)-酰胺]，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-[(2-二甲基氨基-乙基)-酰胺]1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(2-吡啶-4-基-乙基)-酰胺]，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(6-甲氧基-吡啶-3-基甲基)-酰胺]，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-酰胺]，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苄基酰胺]，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-(4-吗啉-4-基甲基-苄基酰胺)，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-甲基酰胺，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-{[2-(4-苄基-哌嗪-1-基)-乙基]-酰胺}1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(2-甲氧基-乙基)-酰胺]，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-4-基甲基)-酰胺]，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙基]-酰胺}，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(6-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(5-溴-苯并[b]噻吩-3-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(5-氯-苯并[b]噻吩-3-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}，
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}，
(2S，4R)-4-甲氧基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]，
(S)-哌啶-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]，
(S)-六氢-环戊[c]吡咯-1，2-二甲酸2-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]1-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]，
(S)-2，3-二氢-吲哚-1，2-二甲酸1-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]，
(S)-1，3-二氢-异吲哚-1，2-二甲酸2-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]1-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]，
(1R，2S，5S)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]，
(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-乙炔基-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]，
(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-[(吡啶-3-基甲基)-酰胺]，
(1S，2S，5R)-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2，3-二甲酸3-[(7-氯-萘-1-基甲基)-酰胺]2-{[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺}。
2.权利要求1的盐形式的化合物。
3.权利要求1的用作药物的化合物。
4.药物组合物，其包含权利要求1-3中任意一项的化合物与至少一种药用赋形剂。
5.权利要求1-3中任意一项的化合物在制备用于治疗激肽释放酶-7活性介导的障碍的药物中的用途。
6.权利要求5的用途，其中所述由激肽释放酶-7活性介导的障碍选自炎性皮肤病和瘙痒性皮肤病。
7.权利要求6的用途，其中所述皮肤病选自特应性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征、结节性痒疹和老年性瘙痒症。
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