CN101680892B - 诊断检测设备 - Google Patents

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Abstract

本发明包括提供用于检测液体样品中的被分析物的设备，所述液体样品被放置在设备的第一部分上，用于转运到设备的与第一部分流体接触的第二部分。在特定的实施方案中，所述设备包括被标记的缀合物，所述被标记的缀合物包括结合成员和标记物，所述结合成员与被分析物的第一表位具有反应性，所述标记物包括平均粒径优选为约50nm-约100nm的金胶体。在另外的实施方案中，所述设备包括捕获组分，所述捕获组分包括聚合链霉抗生物素蛋白。所述诊断设备对于制备妊娠检测试剂盒特别有用。

Description

诊断检测设备
相关申请的交叉引用
本申请与2007年3月1日提交的美国专利申请11/681,061有关，并且由其获得优先权。
发明领域
本发明涉及液体样品中的被分析物的诊断测定。特别地，本发明涉及使用表现出改进的检测的侧向流动检测单元来检测体液中的被分析物的设备。
发明背景
已经有许多类型的配体-受体测定法用于检测体液(例如，尿液、唾液、或血液)中的各种物质的存在。设计了许多试验来进行定量测定，但是在许多情况中，只需要定性的阳性/阴性指示。这种定性测定法的实例包括血型鉴定、妊娠检测、和许多类型的尿分析。对于这些试验，优选在视觉上可被观察到的标志，例如凝集的存在或变色。
阳性/阴性测定法必须非常灵敏，因为在供试流体中所关心的配体的浓度经常较低。假阳性可能带来麻烦，特别是对于凝集和其它快速检测方法例如浸渍检测法和变色检测法而言。由于这些问题，已经开发了利用金属溶胶或其它类型的彩色粒子的夹心检测法和其它灵敏的检测方法。
被全文并入本文作为参考的美国专利6,485,982描述了由细长的外罩壳形成的诊断检测单元，所述外罩壳容纳能够通过毛细作用、芯吸或简单的润湿来转运含水溶液的内部渗透性材料(例如玻璃纤维)。所述罩壳限定了样品入口、和被设计用作检测体积和储库体积的内部区域。所述储库体积被设置在与入口间隔开的检测单元部分中并且被吸附剂所填充。储库用于接受沿着由渗透性材料所限定的并且从入口延伸并通过检测体积的流动路径进行转运的液体。在检测体积中具有检测位置，所述检测位置包括第一蛋白，所述第一蛋白具有对配体的第一表位为特异性的结合部位，所述配体被固定为与流动路径流体相通(例如，结合于渗透性材料上，或结合于在渗透性材料中被截留的胶乳粒子上或者结合于与所述渗透性材料结合的胶乳粒子上)。罩壳的诸如孔或透明部分的窗口允许通过罩壳壁观察检测位置。这一使用检测单元的方法需要使用包括与彩色粒子(例如，金属溶胶或胶体，优选金)相结合的第二蛋白的缀合物。所述缀合物可以采取两种不同的形式，取决于所述测定是否被设计用于“夹心”技术还是“竞争性”技术。
被全文并入本文作为参考的美国专利7,045,342描述了包括双相色谱介质的诊断设备。所述双相基材由与捕获介质接合的释放介质形成，所述捕获介质位于释放介质的下游。优选释放介质和捕获介质包括具有不同特异性特征的两种不同的材料或相。所述两相接合在一起，形成单一液体通路，使得溶剂前沿可以不受阻碍地从释放介质的近端(上游)移动到捕获介质的远端(下游)。
尽管诸如上述的那些诊断设备表现出优于现有技术的改进，但是仍然需要提供更大的精确度和检测样品流体中甚至更低水平的被分析物的检测设备。例如，在妊娠检测领域，需要准确和快速检测低水平的hCG，以便允许用户在受孕已经发生之后早期确认怀孕。
发明内容
本发明比在现有技术中以前可能实现的程度提供了更大的精确度和更好的低水平被分析物的检测。具体地，本发明提供即使在被分析物以极低水平存在时也能够检测体液中被分析物的存在的诊断检测设备。
在某些实施方案中，本发明包括诊断设备，所述诊断设备包括用于甚至在低浓度被分析物的情况中也能进行被分析物检测的标记物组分。本发明一般地包括用于检测液体样品中的被分析物的设备，所述液体样品被放置在设备的第一部分上，用于转运到该设备的与第一部分流体接触的第二部分。在特定的实施方案中，所述设备在其第一部分中包括被标记的缀合物，所述缀合物包括与被分析物的第一表位具有反应性的结合成员和包括金胶体的标记物。优选地，在形成被标记的缀合物之前，所述金胶体的平均粒径为约60nm-约80nm。所述设备另外在其第二部分中包括捕获组分，所述捕获组分直接或间接地与被分析物的第二表位具有反应性。
在其它实施方案中，本发明包括诊断设备，所述诊断设备包括用于甚至在低浓度被分析物的情况中也能进行被分析物检测的捕获组分。本发明优选包括用于检测液体样品中的被分析物的设备，其中所述设备包括双相基材。在特定的实施方案中，所述双相基材包括由第一种材料形成的释放介质和与释放介质流体相通并由第二种不同材料形成的捕获介质。
在优选实施方案中，释放介质包括被标记的缀合物，所述被标记的缀合物包括标记物和与被分析物的第一表位具有反应性的结合成员。所述释放介质另外包括可捕获缀合物，其包括具有与被分析物的第二表位具有反应性的位置的结合成员和可捕获组分例如生物素。因此，在其中供试液体样品包括待检测的被分析物的诊断检测中，被分析物产生复合物，所述复合物包括被标记的缀合物、供检测的被分析物、和可捕获缀合物。
捕获介质优先包括捕获位置，所述捕获位置包括用于捕获上述复合物的捕获组分。在特定的实施方案中，所述捕获位置在其上面固定有捕获组分，所述捕获组分包括聚合链霉抗生物素蛋白(polymerizedstreptavidin)。
本发明特别的特征在于可以将本发明的多个方面合并，以提供包括可用于提供改善的检测结果的多成员的诊断设备，特别是准确性的改善、检测低水平被分析物的能力的改善、以及检测结果的总体改善。优选地，本发明将增强的标记物组分与增强的捕获组分相组合，以改善本发明诊断设备的总体效能，特别是在诊断设备的灵敏度方面有所改善。
在一个实施方案中，本发明包括用于检测被分析物的设备，其中所述设备包括双相基材，所述双相基材包括由第一种材料形成的释放介质和与释放介质流体相通并由第二种不同的材料形成的捕获介质。释放介质优选包括被标记的缀合物和可捕获缀合物二者。被标记的缀合物包括与被分析物的第一表位具有反应性的结合成员和标记物，所述标记物包括在形成被标记的缀合物之前平均粒径为约50nm-约100nm的金胶体。可捕获缀合物包括结合成员，所述结合成员具有与被分析物的第二表位具有反应性的位置，使得如果在样品中存在有被分析物，则被分析物产生复合物，所述复合物包括被金胶体标记的缀合物、供检测的被分析物、和可捕获缀合物。捕获介质优选包括用于捕获所述复合物的捕获位置，所述捕获位置在其上面固定有包括聚合链霉抗生物素蛋白的捕获组分。
在另一个方面中，本发明提供用于确定液体样品中被分析物的存在的各种方法。在一个实施方案中，所述方法包括提供用于检测液体样品中的被分析物的设备，所述液体样品被放置在设备的第一部分上，用于转运到设备的第二部分。优选地，所述设备包括双相基材，所述双相基材包括释放介质和捕获介质。释放介质一般由第一种材料形成并且包括被标记的缀合物，所述被标记的缀合物包括结合成员和标记物，所述结合成员与被分析物的第一表位具有反应性，所述标记物包括在形成被标记的缀合物之前平均粒径至少为约50nm的胶体金粒子。释放介质另外包括可捕获缀合物，所述可捕获缀合物包括结合成员，所述结合成员具有与被分析物的第二表位具有反应性的位置，使得如果在样品中存在有被分析物，则形成复合物，所述复合物包括被金胶体标记的缀合物、供检测的被分析物、和可捕获缀合物。捕获介质与释放介质流体相通并且典型地由第二种不同的材料形成，所述捕获介质包括用于捕获所述复合物的捕获位置，所述捕获位置在其上面固定有包括聚合链霉抗生物素蛋白的捕获组分。在优选实施方案中，所述方法另外包括向设备的第一部分添加液体样品并且允许液体样品流动通过释放介质和捕获介质。根据所述方法，液体样品中被分析物的存在通过肉眼观察捕获介质来确定，其中被分析物的存在表示为捕获位置显色，所述显色是由链霉抗生物素蛋白捕获组分与被金胶体标记的缀合物、供检测的被分析物、和可捕获缀合物形成的复合物相结合所引起的。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括提供被分析物检测设备，其包括具有第一部分和第二部分的基材，所述第一部分包括在其上面以可释放方式固定的平均粒径为50nm到100nm的胶体金，所述第二部分与第一部分流体相通并且包括在其上面固定的捕获组分。所述方法另外包括向设备的第一部分添加液体样品，允许液体样品流动通过基材的第一部分和第二部分，并且通过肉眼观察基材的第二部分来确定液体样品中被分析物的存在。优选地，被分析物的存在表示为在其中固定有捕获组分的区域中发生显色，所述显色是由于胶体金的蓄积所引起的。
在另外的实施方案中，本发明的方法具体涉及检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)。优选的实施方案包括以下步骤：提供hCG检测设备，所述检测设备包括具有第一部分和第二部分的基材，所述第一部分包括在其上面以可释放方式布置的平均粒径为50nm到100nm、55nm到85nm、更优选60nm到75或80nm的胶体金，所述第二部分与第一部分流体相通并且包括在其上面固定的聚合链霉抗生物素蛋白；向设备的第一部分添加液体样品；允许液体样品流动通过基材的第一部分和第二部分；和通过肉眼观察基材的第二部分来确定液体样品中hCG的存在，其中hCG的存在表示为在其中聚合链霉抗生物素蛋白由于胶体金的蓄积而被固定的区域中发生显色。
在另一个实施方案中，本发明的方法特别地涉及通过检测促黄体生成激素(LH)水平的变化来预测受试者排卵。一个优选的实施方案包括以下步骤：提供LH水平检测设备，所述检测设备包括具有第一部分和第二部分的基材，所述第一部分包括在其上面以可释放方式布置的平均粒径为50nm到100nm的胶体金，所述第二部分与第一部分流体相通并且包括在其上面固定的聚合链霉抗生物素蛋白；向设备的第一部分添加液体样品；允许液体样品流动通过基材的第一部分和第二部分；和通过肉眼观察基材的第二部分来确定液体样品中LH变化的存在，所述LH变化的存在用高于预定LH阈值的LH水平来证明，其中高于预定阈值的LH水平的存在表示为在其中聚合链霉抗生物素蛋白由于胶体金的蓄积而被固定的区域中发生显色。
在又一个实施方案中，本发明的方法特别地涉及通过检测促卵泡激素(FSH)来测定女性的生育状态。一个优选的实施方案包括以下步骤：提供FSH检测设备，所述检测设备包括具有第一部分和第二部分的基材，所述第一部分包括在其上面以可释放方式布置的平均粒径为50nm到100nm的胶体金，所述第二部分与第一部分流体相通并且包括在其上面固定的聚合链霉抗生物素蛋白；向设备的第一部分添加液体样品；允许液体样品流动通过基材的第一部分和第二部分；和通过肉眼观察基材的第二部分来确定液体样品中低于预定FSH阈值的FSH的存在，其中所述低于预定阈值的FSH的存在表示为在其中聚合链霉抗生物素蛋白由于胶体金的蓄积而被固定的区域中发生显色。
本发明方法的另一个实施方案利用了本文中所述的聚合链霉抗生物素蛋白的特殊用途。特别地，本发明提供用于确定液体样品中被分析物的存在的方法，包括提供用于检测液体样品中的被分析物的设备。所述设备优选包括释放介质，所述释放介质包括由与被分析物的第一表位具有反应性的结合成员和标记物形成的被标记的缀合物，并且另外包括可捕获缀合物，所述可捕获缀合物包括结合成员，所述结合成员具有与被分析物的第二表位具有反应性的位置，使得如果在样品中存在有被分析物，则被分析物产生复合物，所述复合物包括被标记的缀合物、被分析物、和可捕获缀合物。所述设备另外包括与释放介质流体相通的捕获介质，其包括在其上面固定的聚合链霉抗生物素蛋白。所述方法另外包括向设备添加液体样品，允许液体样品流动通过释放介质和捕获介质，并且通过肉眼观察捕获介质来确定液体样品中被分析物的存在。优选地，被分析物的存在表示为发生由聚合链霉抗生物素蛋白组分与复合物结合所引起的显色，其中所述复合物由被标记的缀合物、被分析物、和可捕获缀合物形成。
附图说明
参考以下图形附图具体地描述本发明，但是这种附图只是用于说明本发明的优选实施方案，本发明不受其限制。
图1A是本发明的诊断检验设备的实施方案的俯视图；
图1B是本发明的诊断检验设备的实施方案的纵向侧视图；
图1C是本发明的诊断检验设备的实施方案的仰视图；
图1D是本发明的诊断检验设备的实施方案的后部端视图；
图1E是本发明的诊断检验设备的实施方案的顶部透视图；
图2A是本发明的诊断检验设备的优选实施方案的前面、顶部、左侧透视图；
图2B说明除去顶盖的情况下的图2A的检测设备实施方案；
图2C是图2A的检测设备实施方案的顶部平面图；
图2D是图2A的检测设备实施方案的底部平面图；
图2E是图2A的检测设备的左侧正视图；
图3是本发明一个实施方案的检测设备的示意性俯视图，示出了样品吸收剂、双相基材、和储库材料；
图4是本发明的一个实施方案的双相基材的示意性俯视图；
图5是在图2中说明的本发明的检测设备的实施方案的示意性侧视图；
图6是一个图表，说明了由本发明的包含平均粒径为60-75nm的胶体金粒子的某些实施方案提供的相对于使用平均粒径为40-47nm的胶体金粒子相比较的改善的颜色强度；
图7是一个图表，说明了由本发明的包含聚合链霉抗生物素蛋白的某些实施方案提供的与使用单体链霉抗生物素蛋白相比较的改善的颜色强度；
图8是一个图表，说明了由本发明的包含大的胶体金粒子和聚合链霉抗生物素蛋白的某些实施方案提供的与使用小的胶体金粒子和单体链霉抗生物素蛋白相比较的改善的颜色强度；
图9是用于评价与单体链霉抗生物素蛋白相比较的聚合链霉抗生物素蛋白的捕获效率的双相检测试条的示意性俯视图；
图10是一个图表，说明了本发明的检测设备将被分析物复合物收集和保持在检测试条上的改善的能力，所述检测试条具有聚合链霉抗生物素蛋白条纹的捕获位置；和
图11是一个图表，说明了已知的检测设备不能将被分析物复合物收集和保持在具有用单体链霉抗生物素蛋白形成的条纹状捕获位置的检测试条上。
发明的详细说明
下面参考本发明的具体实施方案、并特别参考与其一起被提供的各个附图来更完全地描述本发明。实际上，本发明可以体现为许多不同的形式，因此不应将本发明限制为本文中所述的实施方案，相反地，提供这些实施方案使得本公开满足所适用的法定要求。如说明书以及权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”、“该”包括复数形式，除非上下文明确地限定不是这样。
本发明一般地包括用于进行免疫测定的检测单元和使用该检测单元的方法和包括被标记的组分的缀合物。本发明的检测设备特征在于其提高了简化检测的效率和有效性，所述检测可以由未受训练的人员来可靠地分析液体样品中极小量的特定配体的存在而避免假阳性。本发明对用于非处方分析检测试剂盒中是理想的，所述检测试剂盒使得用户可以自我诊断例如妊娠、排卵、性病、和其它疾病、感染、或引起体液中存在抗原性标志物质的临床异常，包括确定药物及其代谢物或毒素的存在。所述分析方法和检测设备经过特别地设计，以便检测存在于体液或其它流体中的预先选择的特有配体的存在。
本发明的诊断设备可用于检测以前使用已知的免疫测定操作法进行分析的或已知可通过这种操作法进行检测的任何被分析物，所述操作使用多克隆或单克隆抗体或包括配体结合部位的其它蛋白质。有多种特定的分析规程、试剂、和蛋白质可根据本发明使用，诸如例如，在被并入本文作为参考的美国专利4,313,734中描述的那些。
诊断设备在本文中一般地在评价样品中被分析物的存在方面进行描述。对于特定的实施方案，被分析物可以具体地被描述为是配体。不应将涉及特定实施方案的这种描述看作是对本发明的限制。相反地，样品中的供检测的被分析物可以包括多种可检测的材料，并且术语配体只是指液体样品内的可检测材料的某些实施方案。
优选本发明的诊断设备使用缀合物，所述缀合物包括与标记物组分(其具体可以是彩色粒子，例如金属溶胶或胶体，优选金)结合的蛋白质。所述缀合物可以采取两种不同的形式，取决于所述测定法是否被设计用于“夹心”技术还是“竞争性”技术。
在其中本发明的诊断检测设备使用夹心技术的实施方案中，在检测中使用的蛋白质包括与供检测的配体上的表位相结合的位置。所述蛋白质优选具有与其结合以形成缀合物的标记物组分，其与液体样品中的配体反应以形成复合物。与缀合物结合的配体与结合蛋白质反应，以形成结合蛋白质、配体、缀合的蛋白质、和标记物组分的“夹心”。这种夹心复合物随着其中具有配体的供试液体沿着诊断设备中的检测试条连续地移动而逐渐产生。随着越来越多的缀合物被固定，标记物组分聚集并且变得可以通过观察窗被观察到，指示在液体样品中存在有配体。
在使用竞争性技术的实施方案中，结合蛋白质与配体竞争性地同缀合蛋白质发生反应。结合蛋白质包括例如对被缀合的蛋白质有可比亲合力的配体或其片段的真实样品。通常，在设备中存在有检测位置，并且随着液体样品被转运而接触检测位置，如果存在配体的话，则配体和缀合物竞争连接于缀合蛋白质的位置。如果没有配体存在的话，则标记物粒子聚集在检测位置，并且颜色的存在显示了样品中没有可检测水平的配体。如果存在有配体的话，则在检测位置处结合的缀合物的量减小，并且不显色或者显示较浅的颜色。
用于诊断设备的缀合物可以以多种方式形成。例如，可以在检测单元外使供试液体与缀合物混合(即，在将供试液体放置到检测单元中之前)。在另一个实施方案中，可以将缀合物布置到在入口和检测位置之间的检测试条的渗透性材料上(例如为冷冻干燥形式或其它保存形式)，并且样品液体在其沿流动路径流过时使缀合物重构。
本发明的诊断设备可以包括一种或多种标准样品或内部对照，用于确定信号出现(例如，显色)是样品中配体存在或不存在的真实指示还是只不过是假象，例如由非特异性吸收所引起的。例如，在使用夹心技术的一个实施方案中，所述标准样品包括阴性对照位置，优选被布置为邻近检测位置，并且可通过靠近第一个窗口的第二个窗口被观察到。所述阴性对照位置优选以与检测位置相同的方式被制备，不同之处在于省略了结合蛋白质的固定。因此，尽管缀合物会到达对照位置，但是其仅仅由于非特异性结合而发生聚集。如果检测位置不比对照位置的颜色明显更强烈，则认为分析结果是阴性的。
在另一个实施方案中，所述诊断设备可以包括阳性对照。因此，在采用夹心技术时，所述单元可以具有在对照位置处被固定的供检测的配体的真实样品。如果在这个对照位置没有显色，则认为该分析是非确定性的。在采用竞争性技术时，在阳性对照位置处的显色意味着检测结果是非确定性的。
在又一个实施方案中，该实施方案对于包括双相检测试条介质的诊断设备特别有用，所述双相介质包括对照位置，该对照位置被布置到捕获位置下游的捕获介质上。所述对照位置在其上面固定有能够捕获标记抗的试剂。对照位置的主要作用是捕获和固定没有在捕获位置被捕获的抗体。在优选实施方案中，所述对照位置在其上面固定有对标记抗体具有特异性的多克隆抗血清。对照位置处的标记物组分的存在的指示表示该检测被正常执行，而与样品中被分析物的存在或不存在无关。捕获位置和对照位置二者都可以通过罩壳的窗口被观察到。
在本发明的一个实施方案中，诊断设备对于检测供试样品(例如人尿样品)中的指示妊娠的配体例如人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促卵泡激素(FSH)、或促黄体生成激素(LH)的存在特别有用。通常，供试样品和蛋白质-标记物缀合物沿着流动路径向前移动，导致接触包括被固定的对配体的表位具有特异性的结合蛋白质的检测位置，并且如上所述，优选还接触对照位置。将检测单元放置在样品中或为入口施加样品使流动开始，并且通过观察在检测位置处的显色来读取结果或通过将在检测位置处的颜色与在对照位置处的颜色相比较来读取结果。
在优选实施方案中，本发明的诊断设备包含双相色谱介质(或检测试条)，其提高了测定的速度和灵敏度。通常，本发明使用的双相基材成员包括释放介质，所述释放介质与位于释放介质下游的捕获介质接合。释放介质和捕获介质优选包括具有不同特异性特征的两种不同的材料或相。所述两相接合在一起，形成单一液体通路，使得溶剂前沿可以不受阻碍地从释放介质(其可被定义为诊断设备的第一部分)的近端(上游)移动到捕获介质(其可被定义为诊断设备的第二部分)的远端(下游)。
用于检测、标记、和捕获所关心的被分析物的试剂被布置在释放介质和捕获介质上。位于释放介质上的是被标记的缀合物，其包括与所关心的被分析物上的特定位置(有时称为“第一表位”)具有反应性的结合成员。被标记的缀合物另外包括可检测的标志物(或标记物)，优选胶体金。可捕获缀合物位于被标记的缀合物下游的释放介质上，该可捕获缀合物包括与所关心的被分析物上的另一个特定位置(有时称为“第二表位”)具有反应性的结合成员。第一表位和第二表位优选是被分析物上的不同位置。可捕获缀合物还包括亲合对的一个成员并且能够与被标记的结合成员和被分析物形成复合物。被标记的缀合物和可捕获缀合物二者都以可释放方式结合于释放介质，使得在由被分析的液体样品所产生的溶剂前沿通过释放介质时，被标记的缀合物和可捕获缀合物二者都由于液体而发生重构并且随溶剂沿着液体路径流动。操作中，如果液体样品存在有任何被分析物，该被分析物首先与被标记的缀合物反应，然后随着前沿沿着液体路径与可捕获缀合物反应，以形成可扩散的夹心，其然后通过毛细作用被转运。因此，在溶剂前沿到达双相材料的捕获介质部分时，形成可捕获的夹心复合物。
捕获介质包含用于捕获上述夹心复合物的试剂。通常，所述试剂位于捕获位置上并且包括亲合对的另一成员(该成员对于可捕获缀合物具有特异性)以及对于被标记的结合成员具有特异性的试剂。在扩散到捕获介质中时，所述可扩散的夹心复合物通过捕获亲合成员与可捕获的亲合部分的相互作用而被浓缩，产生可见信号。所述亲合成员被固定(优选通过简单的吸附被固定)在捕获位置，并且不随溶剂前沿前进。
释放介质由允许释放指示剂试剂的物质形成。在某些实施方案中，释放介质包括吸水性的亲水性材料，例如吸收剂材料。用作释放介质的优选材料包括但不限于棉绒、纤维素材料、或由纤维素与聚合物纤维材料(例如，聚酰胺或人造丝纤维)制成的材料、和玻璃纤维材料。释放介质的主要作用首先是支持并且随后释放和转运供试的各种免疫组分，例如被标记的缀合物和可捕获缀合物(其二者对于所关心的被分析物都具有特异性亲合力)。这种释放和转运在常规的检测操作期间进行。通常，释放介质可以由能够执行容纳、释放、和转运供试的各种免疫部分(例如，被标记的供试组分)的功能的任何材料形成。
用于形成释放介质的材料的具体的非限制性实例包括：棉绒纸，例如S&S 903和S&S GB002(得自Schleicher and Schuell，Inc.，Keene，N.H.)、和BFC 180(得自Whatman，Fairfield，N.J.)；纤维素材料，例如由纤维素与聚酰胺制成的Grade 939、由纤维素共混纤维制成的Grade989、和由纤维素和人造丝与聚酰胺制成的Grade 1278和Grade 1281(得自Ahlstrom Corporation，Mt.Holly Springs，Pennsylvania)；和玻璃纤维，例如Lydall硼硅酸盐(得自Lydall，Inc.，Rochester，N.H.)。释放介质优选涂布有包含牛血清白蛋白(BSA)和非离子型表面活性剂(例如，TritonX-100，得自Rohm & Haas Co.，Philadelphia，Pa.)的水溶液以防止非特异性结合和促进可扩散试剂的释放。为此目的可以使用约3％BSA和约0.1％Triton X-100的组合。
捕获介质由允许固定用于检测供试流体中被分析物存在的试剂的物质形成。捕获介质一般包括亲水性的聚合物材料，例如微孔膜或薄膜，其允许蛋白质试剂通过被动吸附而被直接固定到膜上，而无需化学固定或物理固定。当然，本发明不排除使用化学固定或物理固定，可以使用用于将试剂固定到薄膜的任何已知方法。
可用作捕获介质的材料的非限制性实例包括硝化纤维、尼龙(例如，尼龙66)、或类似材料、或者这种材料的组合的微孔性聚合物膜。用作捕获介质的材料优选具有约5μm-约20μm的孔径大小。在特定的实施方案中，硝化纤维薄膜可以是单独的硝化纤维，或者是硝化纤维的混合酯，例如与硝酸和/或其它酸的酯的组合物。优选硝化纤维薄膜被涂覆或叠层到半透明或透明的聚合物膜上，以便为薄膜提供物理支持。
在优选实施方案中，使用被浇铸到聚酯薄膜例如
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上的硝化纤维聚合物。或者，还可以使用被叠层到聚酯薄膜上的硝化纤维薄膜，尽管可以使用除聚酯之外的其它背层材料。可用于本发明的预叠层的或预浇铸的片材是市售的，例如得自Millipore Corporation，Bedford，Mass.和Sartorius Corporation，Edgewood，New York。两种介质都是平面试条的形式，其被接合在一起，形成单一流动路径。
在一个实施方案中，通过将释放介质的下游边缘叠置在捕获介质的上游边缘上而将释放介质和捕获介质接合在一起，然后将得到的双相材料粘着于透明的聚合物膜或片材，从而保持介质在适当的位置。所述叠置区域允许包含被分析物的流体进行从释放介质向捕获介质的有效且快速的转移。
尽管与叠置区域有关的快速转移是有用的，但是与重复生产小的叠置区域(例如，用于小的诊断设备所需的)有关的生产问题可能是困难的。因此，在某些实施方案中，本发明还提供具有本文中所述双相设计的检测设备，但是其中释放介质和捕获介质不叠置，而是通过非叠置的对抵接头联系起来。在这种实施方案中，沿着检测试条向前移动的流体前沿通过毛细作用而跨接非叠置区域，从而被从释放介质转移到捕获介质。
有利地，并且是可选地，两相的对抵接头保持与将两相叠置相同的效果，即使在设备的加速老化之后。因此，使用对抵接头简化了本发明的检测设备的生产，而设备性质没有任何损失。
生产双相色谱介质的方法描述在美国专利5,846,835中，所述文献被并入本文作为参考。简而言之，将释放介质和捕获介质设置为彼此邻接，并将粘合剂布置在各自背面(所述背面是与将接受试剂的面相反的面)。所述粘合剂可以是不会填充释放介质或捕获介质的孔的任何压敏粘合剂或热熔性粘合剂，因此允许溶剂前沿不受阻碍地流动通过介质。可用于本发明的粘合剂是市售的，例如得自Adhesives ResearchCorp.。在一个实施方案中，粘合剂被布置到透明聚合物背层上。然后使释放介质和捕获介质与背面的粘合剂通过层压机的层压辊，形成捕获介质和释放介质、粘合剂和聚合物背层的层压制品。然后得到的层压的双相基材可准备用于接受试剂，其作为连续的“条”被布置到基材的上面。一旦试剂已经放置并且干燥，如有必要，将基材切成所需的尺寸。根据本发明使用的双相检测试条的一个实施方案在图3中说明，并进一步如下所述。
可以通过任何技术对释放介质和捕获介质分别施加可扩散的和不可扩散的试剂。在一个实施方案中，通过将可扩散的抗体试剂直接施加到释放介质表面上并且干燥以形成窄的谱带而将可扩散的抗体试剂施加在释放介质上。优选不可扩散的试剂通过被动吸附而被施加到捕获介质上。
可以特别地将色谱基材布置在检测设备内，所述检测设备至少包括包住用于进行检测的色谱基材的外壳。一个有用的外壳构造显示在美国专利D361,842中，所述文献被并入本文作为参考。罩壳的另一个实施方案描述在美国专利5,739,041中，所述文献被并入本文作为参考。
在优选实施方案中，所述诊断设备包括限定样品入口、检测体积、和储库体积的罩壳。在罩壳内布置有样品吸收剂、双相色谱基材、和储库吸收剂。样品吸收剂优先被布置在罩壳内并且延伸到其外部。在样品吸收剂下游设置双相色谱基材，其包括被接合在一起形成单一液体路径的释放介质和捕获介质。释放介质和捕获介质可以被层压到透明的塑料薄膜或片材上。
优选样品吸收剂是吸水性的亲水性材料，其促进流体样品的吸附和转运到双相色谱介质。这种材料可以包括醋酸纤维素、亲水性聚酯、和具有类似性质的其它材料。另外，还可以使用吸收剂材料的组合。有用的材料的非限制性实例包括结合型醋酸纤维素、结合型聚烯烃、或亲水性聚酯，例如购自Filtrona Fibertec Company(Colonial Heights，Virginia)的那些材料。其它有用的材料包括吸收性基质，例如Grade939、Grade 989、Grade 1278、或Grade 1281，得自Ahlstrom Corporation。优选样品吸收剂涂覆有包含BSA和非离子型表面活性剂例如TritonX-100的缓冲溶液。BSA和表面活性剂的存在使得被分析物的非特异性吸收减到最小。为此目的，在三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的约1％BSA和约0.2％表面活性剂的浓度是有效的。
通过在色谱基材上方提供吸收剂材料的储库，可以吸引相对大体积的供试液体及其所包含的任何被分析物通过试验区域，以有助于灵敏度。储库材料优选包括可以与上游的样品吸收剂是相同的亲水性材料。储库吸收剂一般地促进沿着色谱基材的毛细作用并且吸收设备内所包含的过量液体。储库吸收剂优选包括由长棉绒纤维制成的吸收纸，例如S&S 300、S&S 470和S&S 900(得自Schleicher & Schuell，Inc.)，或纤维素材料例如Grade 3MM(得自Whatman)和Grade 320(得自Alhstrom)。
广泛而言，本发明的设备和方法可用于检测在此之前使用已知的免疫测定法进行分析的或可通过这种测定法进行检测的任何被分析物，所述测定法使用多克隆或单克隆抗体或其它蛋白质。用于实践本发明的各种具体的试验规程、试剂、和被分析物公开在美国专利4,313,734、和美国专利4,366,241中，两个文献都被并入本文作为参考。
在根据本发明的这一实施方案使用所述诊断设备时，使双相基材的近端接触被分析的液体样品。设备的罩壳可被构造为允许与体液直接接触或作为用于浸渍在体液或其它试验溶液的容器中的量杆。液体样品通过表面效应例如毛细作用的推动沿着由基材形成的液体路径移动。更具体地，供试样品流动通过双相色谱基材并且与检测位置(和可选的一个或多个对照位置)反应性接触。优选地，至少检测位置可被使用者观察到，例如通过设备的外罩壳中的一个或多个窗口被观察到。在优选实施方案中，对被分析物具有特异性的被标记的结合成员以保存形式被布置到在设备内的流动路径中的释放介质上。
如果样品存在有所关心的被分析物，则其流动通过设备的入口和内部，在设备的内部，被分析物顺序地与被标记的缀合物和具有亲合试剂的可捕获缀合物反应，从而形成可捕获的复合物。由被分析物、被标记的缀合物、和可捕获缀合物形成的复合物然后与被固定在捕获位置处的捕获组分反应，所述捕获组分对可捕获缀合物上的亲合试剂具有特异性。这一过程导致被标记的复合物蓄积在捕获位置处。通过观察捕获位置处的可检测的标志物的存在来确定被分析物的存在。如果样品中没有被分析物，则不形成可捕获的复合物，并且在捕获位置不会存在可检测的标志物。如果存在对照位置的话，则未结合的复合物或游离的被标记的结合成员会蓄积在对照位置处。
根据本发明的检测设备的一个实施方案的例证表示在图1A-E中。检测设备5包括外部的模制的罩壳10，其限定一个中空的细长壳体。罩壳10包括供试液体入口14和开口16，所述开口16构成通过其可以观察到捕获位置(和对照位置，如果适当的话)的窗口。如图1A-E中说明的，窗口16设置在罩壳10的与样品入口14相反的一面上。这种构造降低被布置在罩壳10内部并且通过窗口16被暴露的检测位置被污染的发生率。罩壳10另外限定沿着罩壳10的各侧面并且处于罩壳10的远端的通气开口38、40、和42。通气开口38降低在使用过程中设备内的“气阻”的发生率。开口40和42的存在有助于减少色谱基材的“浸水”，其可以在使用者为设备施加太多样品时发生。
检测设备5的优选实施方案在图2A-E中说明。从图2A-E中可见，检测设备5包括外部的模制的罩壳10，其限定一个中空的细长壳体。罩壳10包括开口16，所述开口16构成可以观察到捕获位置(和对照位置，如果适当的话)的窗口。检测设备5另外包括供试液体入口14，其被可去掉的顶盖60所覆盖。在这个实施方案中，供试液体入口14在罩壳10的外部，并且在除了使用以外的时间之外被顶盖60所覆盖。在罩壳10外部提供供试液体入口14允许容易地为检测设备5施加供试液体，例如通过将供试液体入口14置于尿流路径中或浸渍在容纳供试液体的容器中。顶盖60是可再次连接的(例如卡扣配合到从罩壳10伸出的凸缘62上)并且可以在施加供试液体之后更换，以避免样品在进行试验时被污染。在罩壳外部的供试液体入口14可以是吸收剂材料12的一部分，如以下所述。在另外的实施方案中，供试液体入口14可以是双相色谱基材18的一部分。罩壳10另外包括位于罩壳10底表面上的检测试条支持体70。
根据本发明使用的试验材料的具体实施方案说明在图3中。在设备经过完全组装时，图3的试验材料优选被布置在罩壳内。试验材料包括吸收剂材料12、双相色谱基材18、和储库材料24。试验材料和罩壳的内部一起限定了流动路径。在入口14被布置在液体样品中或以其它方式与液体样品接触时，液体通过毛细作用、芯吸、或简单的润湿沿着流动路径向下游被转运通过吸收剂12，沿着色谱基材18向前，进入储库24，大体上如箭头所示。吸收剂材料还起到过滤器的作用，其可以除掉不纯的供试样品颗粒物质和干扰因素。
图4说明的是双相色谱基材18，其包括释放介质30和捕获介质32。水平虚线表示释放介质30和捕获介质32之间的接合面。如前所述，这个接合面可以是叠置关系的形式。或者，释放介质30可以抵接于捕获介质32。在释放介质30上以可释放方式布置有被标记的结合成员的谱带26，例如，抗体-金属溶胶。在一个实施方案中，所述被标记的结合成员是脱水形式。随着液体样品移动通过谱带26，被标记的结合成员被夹带在液体中，经过重构(在脱水的结合成员的情况中)，并与存在于液体样品中的任何被分析物反应或与之竞争。被布置在被标记的结合成员下游的是优选经过脱水的可捕获的复合物的谱带28。可捕获的复合物包括与被分析物的第二表位结合的结合成员(例如，抗体)和可捕获的亲合组分(例如，生物素)。所述可捕获的复合物也被夹带在液体样品中，并且随之沿着基材18前进。
被固定到捕获介质32上的分别是捕获位置34和对照位置36。在图4中，对照位置和捕获位置被举例说明为沿着流动路径被串联布置。或者，对照位置和捕获位置可以并排布置或者以其它空间关系进行布置。捕获位置34包括预选量的对被布置到释放介质上的可捕获的亲合组分具有特异性的捕获亲合成员。例如，在可捕获的亲合成员是生物素时，捕获组分可以是链霉抗生物素蛋白。当然，可以使用任何的这种组分互补系统来代替生物素和链霉抗生物素蛋白。对照位置36典型地包括对被标记的结合成员具有特异性的被固定的抗血清或抗体，并且因此也能够结合被标记的结合成员。
图5中用示意图举例说明了试验材料的可操作部分的一个实施方案的侧视图。如图5所示，吸收剂材料12被布置为紧邻释放介质30，并且在一端与释放介质30叠置。释放介质30又与捕获介质32叠置，所述捕获介质32被布置为在释放介质30的远端。此外，释放介质30和捕获介质32可以选择性地借助于对抵接头连接，而非叠置连接。储库24与捕获介质32的远端叠置。这四个组件合起来形成单一流体路径，并且它们互相配合，使得样品液体从吸收剂12沿着释放介质30和捕获介质32流到储库24中。
本发明不受捕获位置34和相应的对照位置36的明确的性质所限制，实际上，如果需要，完全可以省略对照位置36。通常，可以根据本身已知的方法使用吸收、吸附、或离子或共价偶联来将抗体或其它亲合试剂固定在捕获位置34和对照位置36处。捕获介质32优选经过选择而无需化学偶联就能结合捕获试剂。硝化纤维和尼龙二者都允许捕获组分和对照试剂的非化学结合。
被布置在捕获介质32下游的是储库24，其包括相对大体积的吸收性或超吸收性材料。储库24的用途通常是确保有适当大量的供试液体被吸引穿过色谱介质。在某些实施方案中，样品吸收剂12可被省略，并且释放介质30本身可以作为样品吸收剂。试验材料的这种实施方案可用于实施浸渍检测法。
如上所述，本发明的检测设备通常可被描述为包括第一部分和第二部分。检测设备的第一部分包括至少一种被标记的缀合物。所述被标记的缀合物包括与要由所述设备检测的被分析物的第一表位具有反应性的结合成员。这种结合成员可以是本领域中典型地已知用于这种用途的任何试剂，并且可以具体地为本文中所述的各种材料中的任一种。所述缀合物另外包括标记物组分。根据本发明，可以使用本领域中通常已知可以使用的任何标记物。在具体的实施方案中，所述标记物具体地包括胶体金，如本文中更具体描述的那样。
在其中检测设备包括双相基材的实施方案中，所述检测设备的第一部分可以指双相基材的释放介质部分。如上所述，释放介质通常在其上面布置有两种组分：(i)被标记的缀合物，其包括特异性结合蛋白质(例如，与被分析物的第一表位具有反应性的单克隆抗体)，所述蛋白质用视觉上可检测的标记物(例如，胶体金粒子)标记；和(ii)可捕获缀合物，包括结合蛋白质(例如，抗体)和亲合成员(例如，生物素)，所述可捕获缀合物优选被布置在被标记的缀合物的下游。所述生物素酰基化的抗体与被分析物的第二表位具有反应性，并且能够与被标记的抗体和被分析物形成夹心复合物。
可以在本发明中用作结合成员和捕获材料的具有特异性结合性质和对于实质上任何抗原物质都有高亲合力的多克隆抗血清和单克隆抗体或其片段是已知的并且是市售的，或者可以使用公知的细胞融合和筛选技术从稳定的细胞系产生。有许多文献能够提供用于生产和固定蛋白质的规程。参见，例如，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，Tijssen，Vol.15，Practice and Theory of Enzymeimmunoassays，chapter 13，The Immobilization of Immunoreactants onSolid Phases，第297-328页，以及其中引用的参考文献。
在免疫测定法中用作标志物物质的金属溶胶和其它类型的彩色粒子本身也是已知的。参见，例如，美国专利4,313,734。关于与彩色粒子缀合物的合成有关的细节和设计原则，参见Horisberger，Evaluation ofColloidal Gold as a Cytochromic Marker for Transmission and ScanningElectron Microscopy，Biol.Cellulaire，36，253-258(1979)；Leuvering等人，Sol Particle Immunoassay，J.Immunoassay，1(1)：7791(1980)；和Frens，Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size inMonodisperse Gold Suspensions，Nature，Physical Science，241：20-22(1973)。
本发明提供具有改善的总体灵敏度的检测设备。例如，在妊娠检测设备的情况中，本发明通过指示比在此之前可能实现的水平更低的水平存在hCG并同时仍保持检测特异性而提供改善的灵敏度。在一个实施方案中，这是通过在检测线中显色强度的增加来实现的。这样特别地改善了消费者对产品的总体可读性。
金属溶胶(例如，胶体金)的使用通常允许个体根据金属溶胶引起的颜色变化来使用诊断设备。例如，在家用妊娠设备中，由于用金胶体标记的抗hCG抗体提供的颜色，用户能够视觉上读取检测结果。这种已知的检测设备典型地利用相对小的平均粒径的胶体金粒子，例如平均粒径在40-47nm的范围内。
如图3的双相色谱基材18中所示，捕获位置34和对照位置36串联位于基材18上。捕获位置和对照位置典型地在窗口16的视野内(参见图2A)并且分别构成检测线和对照线。在这些线处的颜色的存在或不存在是用于读取检测结果的指示物。由于在没有由金胶体提供的颜色的情况下检测线和对照线不可见，在检测设备中使用的金粒子的可见度增加引起检测线和对照线处的颜色强度的增加。这种增加的颜色强度直接地对应于消费者可读性的改善。
在某些实施方案中，本发明通过使用平均粒径比以前用于这种诊断设备中的平均粒径更大的胶体金粒子而实现本文中所述检测设备的可读性改善。通常，本文中所述的粒径是指胶体金粒子与前述结合成员结合之前的粒径。在优选实施方案中，本发明的诊断检测设备包括平均粒径大于约50nm的胶体金粒子。在另外的实施方案中，胶体金粒子的平均粒径大于约52nm，大于约55nm，大于约57nm，或大于约60nm。
视觉上观察到的胶体金粒子的颜色通常依赖于粒径。例如，粒径最大约100nm的粒子表现出强烈的红色，而粒径大于约100nm的粒子表现出稍微更柔和的红色。因此，尽管本发明也可能使用粒径大于约100nm的金粒子，在优选实施方案中，优选本发明的检测设备使用提供红色的金粒子粒径。
以前使用的较小粒径的胶体金提供合乎需要的红色，然而，其颜色强度不足，并且不能总是提供可由用户容易进行识别的确定性的颜色变化。然而，本发明已经发现，通过特别地使用更大粒径的胶体金可以显著地增加特征性红色的强度。事实上，使用更大的粒子提供强烈的红色并且为甚至极低水平的被分析物的存在提供正确指示。这与早期检测是有关的，因为早期检测对于诸如妊娠检测的检测来说是高度合乎需要的。因此，在另外的实施方案中，用于本发明的胶体金粒子的平均粒径为50nm-100nm、55nm-90nm、55nm-85nm、60nm-80、60nm-75nm、或65nm-75nm。
优选地，根据本发明使用的金粒子基本上是球状的。然而，也可以使用其它形状。金粒子特别的特征在于它们被制备为单分散性并且在制备后具有窄的粒径分布。通过Coulter N4 ParticleAnalyzer(Beckman Coulter，Fullerton，CA)测定，所述粒子具有大于95％的单分散性。
用于诸如这种应用的各种应用的金粒子的生产是本领域中公知的，并且所述粒子可以通过任何常规方法制备。更大的金粒子的生产不在这些知识的范围内(builds off of this knowledge)，但是应该作为商业秘密处理。
本发明得到的结果特别地令人惊讶，在于只有几个纳米的平均粒径变化与颜色强度的显著增加相对应。具体地，在将本发明的包含更大金粒子的设备对比已知设备使用包含hCG的尿标准样品进行试验时，本发明的包括更大金粒子的检测设备一致性地优于使用较小金粒子的已知设备。具体地，在定量测量时，本发明的设备表现出颜色强度至少有25％的增加。
图6提供的图表举例说明了根据本发明使用更大平均粒径的金粒子提供的可读性改善。这个试验评价了使用平均粒径为40-47的胶体金粒子制备的设备和使用平均粒径为60-75nm的胶体金粒子制备的设备的检测线的颜色强度。设备的所有其它方面都是相同的。向设备添加包括12.5mIU hCG/mL的样品并且允许在检测线处显色。然后通过使用Biodot试验机(Biodot Test Strip Reader(带有图像分析软件的CCDCamera)Part Number TSR 3000)量化检测线处的相对颜色强度来进行评价。用于量化相对颜色强度的其它方法是常规的、本领域中公知的，并且也可被使用。较小金粒子的G/Dens值为约0.6，而本发明的更大的金粒子的G/Dens值为约1.4。
本发明的使用更大胶体金粒径的设备相对于使用较小金粒子粒径的设备提供颜色强度有至少25％的增加。如图6所示，在12.5mIUhCG/mL样品进行检测时，根据本发明使用更大平均粒径的金粒子相对于使用较小金粒子提供约40％的颜色强度增加。
使用更大胶体金粒子提供的改善允许在各种检测方法中增加精确度和效率。在包含单相介质的实施方案中，更大的胶体金粒径可以有效地改善试验的可读性。因此，本发明可用于提高各种已知诊断检测设备的性能。
在包含双相基材的实施方案中，释放介质提供被标记的缀合物(其可以包括上述的更大的胶体金粒子)和可捕获缀合物。优选地，可捕获缀合物包括可捕获组分和对供试样品中的被分析物(例如，hCG)具有反应性的抗体。被布置在捕获介质上的是用于捕获和固定所述复合物的捕获位置。捕获位置在其上面固定有捕获组分，所述捕获组分对可捕获组分具有高的亲合力。目前，基于双相基材的妊娠检测使用化学连接于抗体的生物素作为可捕获缀合物和使用链霉抗生物素蛋白作为捕获组分。这种试验依靠链霉抗生物素蛋白与生物素之间的强烈的亲合力而在检测线处生成阳性结果。因此，在存在有hCG时，在金-hCG-生物素复合物之间形成的“夹心复合物”通过单体链霉抗生物素蛋白分子与“夹心复合物”的生物素部分相结合而在检测线处被捕获。
尽管生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用是强烈的，但是检测线处的总体信号受到链霉抗生物素蛋白与硝化纤维之间的结合的限制。以前已知的利用链霉抗生物素蛋白作为捕获组分的检测设备利用单体链霉抗生物素蛋白，但是单体链霉抗生物素蛋白存在与硝化纤维基材的结合弱的缺点。这种单体链霉抗生物素蛋白的弱结合使得在供试流体被芯吸沿基材上行时结合于硝化纤维的一部分链霉抗生物素蛋白被洗掉。链霉抗生物素蛋白被从基材被容易地移去这一事实降低了被分析物捕获的总体效率。本发明通过提高链霉抗生物素蛋白和基材之间的结合强度来克服这种缺陷。因此，通过链霉抗生物素蛋白的更好保持而实现捕获位置的更强的信号。
在本发明的某些实施方案中，检测设备包括聚合链霉抗生物素蛋白。聚合链霉抗生物素蛋白特别有用，因为其保持了作为单体链霉抗生物素蛋白的特征的对生物素的高亲合力，但是具有更大分子大小的链霉抗生物素蛋白聚合物的聚合物性质使得聚合链霉抗生物素蛋白被更有效地固定于检测设备基材如硝化纤维薄膜上。聚合链霉抗生物素蛋白的更强的固定引起可捕获的“夹心”组分(例如，金-hCG-生物素复合物)的更有效捕获。因此，在捕获位置包括聚合链霉抗生物素蛋白的本发明的检测设备提供被检测到的被分析物信号的增强，因为聚合链霉抗生物素蛋白不会被液体试样通过基材的芯吸作用而移去，而链霉抗生物素蛋白被液体试样通过基材的芯吸作用而移去对于使用单体链霉抗生物素蛋白是一个问题。
单体链霉抗生物素蛋白典型地具有约53kDa的平均分子大小。本发明的聚合链霉抗生物素蛋白具有显著更大的平均分子大小。如以下进一步描述的，用于本发明的聚合链霉抗生物素蛋白可以包括聚合链霉抗生物素蛋白物质的混合物。优选地，聚合链霉抗生物素蛋白混合物包括大于50重量％的分子大小为至少约100kDa的链霉抗生物素蛋白物质。在另外的实施方案中，聚合链霉抗生物素蛋白包括大于55重量％、大于60重量％、大于70重量％、或大于80重量％的分子大小为至少约100kDa的链霉抗生物素蛋白物质。
根据本发明使用的聚合链霉抗生物素蛋白可以使用本领域中已知的任何方法从单体链霉抗生物素蛋白制备。在一个实施方案中，聚合链霉抗生物素蛋白是通过与醛(例如，甲醛、戊二醛等)进行培养而使单体链霉抗生物素蛋白发生交联来制备的。
用于将单体链霉抗生物素蛋白或聚合链霉抗生物素蛋白连接于基材的方法根据本发明也可以有所不同。例如，在某些实施方案中，链霉抗生物素蛋白可以直接连接于基材。在其它实施方案中，链霉抗生物素蛋白可以间接地连接于基材，例如通过天然的或合成的中间物质。在一个特定的实施方案中，链霉抗生物素蛋白可以经由颗粒材料(例如，胶乳珠子)连接于基材。例如，链霉抗生物素蛋白可以通过被动吸附或化学偶联而连接于胶乳珠子，并且可以通过将胶乳珠子粘合在基材上而将与胶乳结合的链霉抗生物素蛋白分配到基材上。优选地，这种胶乳珠子的大小为约0.1μm到约0.5μm，更优选为约0.1μm到约0.3μm。在又一个实施方案中，可以将链霉抗生物素蛋白缀合于中间蛋白质，而中间蛋白质结合于基材。可用作用于将链霉抗生物素蛋白连接于基材的中间蛋白质的材料的非限制性实例包括免疫球蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。
在针对包含不同水平的hCG的尿标准样品进行试验时，本发明的在检测线处包括聚合链霉抗生物素蛋白设备一致性地优于包含单体链霉抗生物素蛋白的设备。本发明的这种改善的性质在图7中举例说明，所述图7图解示出了聚合链霉抗生物素蛋白优于单体链霉抗生物素蛋白的益处。具体地，使用单体链霉抗生物素蛋白或者聚合物化链霉抗生物素蛋白制备检测设备，设备的所有其它方面相同(包括使用比本领域中典型地使用的更小的胶体金粒子)。使用包含6.25mIU hCG/mL样品、12.5mIU hCG/mL样品、和25mIU hCG/mL样品的尿标准样品评价所述设备。在施加尿样品5分钟之后使用Biodot试验仪量化检测线处的显色。如图7所示，在检测线处包括聚合物化链霉抗生物素蛋白的本发明的设备一致性地表现出与在检测线处使用单体链霉抗生物素蛋白的平行设备相比在检测线处的颜色强度的2-3倍增加。
聚合链霉抗生物素蛋白不仅提供颜色强度的增加，而且允许进行比使用单体链霉抗生物素蛋白可能实现的浓度更低的样品浓度下的被分析物的检测。如图7所示，包含仅6.25mIU hCG/mL样品的尿样品是可检测的(表现出可量化的颜色形成)，而在检测线使用单体链霉抗生物素蛋白在这一低浓度下没有可检测的颜色形成。
用于制备本发明的检测设备的链霉抗生物素蛋白优选包括可被施用于检测设备并且由此将链霉抗生物素蛋白固定到基材上的链霉抗生物素蛋白溶液。溶液中的链霉抗生物素蛋白可以包括多种聚合形式，例如二聚、三聚、四聚形式等等。尽管可以在溶液中存在单体链霉抗生物素蛋白，但是溶液优选主要包括聚合链霉抗生物素蛋白，溶液中的任何单体链霉抗生物素蛋白的总含量只占溶液总含量的小部分，在特定的实施方案中，链霉抗生物素蛋白溶液包括的聚合链霉抗生物素蛋白的量为使得聚合链霉抗生物素蛋白占链霉抗生物素蛋白溶液的至少50重量％。优选地，所述溶液包括至少约55重量％、至少约60重量％、至少约75重量％、或至少约90重量％的聚合链霉抗生物素蛋白。
在特定的实施方案中，本发明的免疫测定设备用于检测人妊娠。在这种实施方案中，优选被标记的结合成员是用视觉上可检测的标记物(例如，胶体金)标记的针对人绒毛膜促性腺激素(hCG)的单克隆抗体(MAb)。为此目的，特别优选命名为11D6的MAb(得自Church & DwightCo.，Inc.)。对于可捕获的复合物，可以使用用生物素标记的抗-hCG抗体(优选单克隆抗体)。为此目的，特别优选命名为CCF01的单克隆抗体(得自Scripps Laboratory)。用于将生物素缀合于抗体的方法是本领域中已知的。在优选实施方案中，捕获位置包括链霉抗生物素蛋白，其对生物素具有高的亲合力。对照位置优选位于捕获位置的下游，并且可以在其上面固定有对抗-hCG抗体具有特异性的山羊抗-小鼠IgG(得自Scantibodies Laboratory)。
本发明的检测设备是特别有用的，在于它们允许检测令人惊讶地低水平的hCG。这是有利的，因为检测低水平hCG的能力与受孕不久以后检测妊娠的能力直接相关。具体地，本发明的设备能够比本领域中以前所提供的设备在受孕之后可能更早地检测妊娠。在特定的实施方案中，本发明的检测设备能够检测样品中低至6.25mIU hCG/mL浓度的hCG。在其它实施方案中，本发明的检测设备能够检测样品中低至3.15mIU hCG/mL浓度的hCG。
考虑到上述关于分别使用相对大的胶体金粒子和聚合链霉抗生物素蛋白所描述的令人惊讶的优点，在特定的实施方案中，本发明提供特别是优于已知的检测试剂盒的改善的妊娠检测试剂盒。所述特别的优点起因于本文中所述的改善的组合。所述改善的组合的令人惊讶的效果进一步在实施例中描述。
在一个特定的实施方案中，本发明提供人妊娠检测设备，其检测供试样品(例如尿)中hCG的存在。该设备对于早在预期月经开始之前五天或月经过期当天之前六天测量尿中的hCG特别有用。这代表了优于其中不能在预期月经开始之前五天检测hCG的已知技术的显著的改进。
根据本发明的妊娠检测设备提供改善的检测结果，而不牺牲临床准确性(即，正确地确定检测状况例如是否怀孕的能力)。如以下实施例3中所述，除改善的可读性(其改善检测精确度或用户解释检测结果的能力)和更早诊断之外，本发明的妊娠检测设备提供极高的临床准确性。
优选地，本发明的检测设备能够提供确定的临床精确度水平。这种准确性可以与可以被检测的检测状况的特定时间相关。例如，在妊娠检测的情况中，本发明的设备可以根据在预期月经开始前的具体天数来确定妊娠的能力进行描述。在特定的实施方案中，本发明的检测设备可以在预期月经开始前的最多三天以至少98％的临床准确性确定妊娠。
在另一个实施方案中，本发明的免疫测定设备用于预测人排卵。在这种实施方案中，优选被标记的结合成员包括单克隆抗体，例如用标记物例如胶体金标记的克隆编号057-10036(得自Church & DwightCo.，Inc.)，所述抗体对促黄体生成激素(LH)具有特异性。所述可捕获的复合物优选包括被命名为5304的生物素酰基化的LH-特异性单克隆抗体(得自Biospecific，Emeriville，California)。捕获位置优选包括链霉抗生物素蛋白，对照位置包括对被标记的Mab具有特异性的山羊抗-小鼠IgG。
在又一个实施方案中，所述设备可以适合于检测传染剂，例如链球菌。在这种实施方案中，被标记的结合成员优选是用胶体金或其它直接标志物标记的对链球菌具有特异性的多克隆抗体(例如，兔多克隆抗体)。可捕获的复合物优选是缀合于生物素的相同的多克隆抗体，并且捕获组分和对照组分可以包括链霉抗生物素蛋白和山羊抗-兔IgG。
在另外的实施方案中，本发明提供用于检测液体样品中被分析物(例如hCG)的存在的各种方法。本发明的方法一般地包括使用本文中所述的检测设备。典型地，本发明的方法包括向本发明的设备的第一部分添加液体样品，允许液体样品流动通过检测设备中的基材(例如，包括释放介质和捕获介质的双相基材)，并且通过肉眼观察来确定液体样品中被分析物的存在。优选地，被分析物的存在表示为在捕获位置处由于标记物组分的蓄积所发生的显色。
实验部分
下面具体参考各实施例描述本发明。以下实施例意在不限制本发明，而是作为示例性实施方案提供。
实施例1
妊娠检测试剂盒的可读性
制备了根据本发明的妊娠检测设备的三个具体实施方案。基本上如上所述使用双相基材制备本发明的妊娠检测设备，但是结合有本文中所述的创造性方面。具体地，本发明的妊娠检测设备使用本文中所述的大的胶体金粒子和聚合链霉抗生物素蛋白，并且释放介质和捕获介质是非叠置形式的(即，通过对抵接头形式连接)。在本发明的试条1中，将大的胶体金粒子(即，平均粒径60-75nm)以在533nm测量时为30的光密度(即，30OD533)涂覆在检测线上。对于本发明的试条2和3，分别以25OD533和20OD533涂覆大的胶体金粒子。制备了对比试条1-3：使用单体链霉抗生物素蛋白；以30OD533、25OD533、和20OD533涂覆的小的金粒子(即，平均粒径40-47nm)；和将释放介质和捕获介质叠置。试条组成在以下表1中概述。
表1
Figure G200880012370XD00301
在针对包含不同水平的hCG的尿标准样品进行试验时，包含本发明的试条的妊娠检测试剂盒一致性地优于使用已知技术的对比用妊娠检测试剂盒。这些结果在图8中图解说明。具体地，使用hCG浓度为6.25、12.5、或25mIU hCG/mL的样品对每个检测试条进行试验，并且使用Biodot试验仪评价颜色强度(G/Dens)。本发明的分子大小更大的、可见性更高的金探针与在检测线处与聚合链霉抗生物素蛋白有关的捕获效率提高的创造性组合产生了在检测线处提供更大颜色强度(例如，增加了3倍以上)的设备。非叠置的双相介质的包括对于总体性质没有积极或消极的影响。尽管从生产的观点可能是有利的，但是对于分子大小大的金和聚合链霉抗生物素蛋白有关的益处，非叠置形式被看作是非关键因素。
实施例2
聚合链霉抗生物素蛋白的捕获效率
评价了用作捕获组分的聚合链霉抗生物素蛋白引起显色增加的能力。使用了双相检测试条，并且释放介质布置有本发明的OD 25的大的金探针粒子的条纹。将生物素条纹设置在金探针条纹下游的释放介质上。捕获介质布置有聚合链霉抗生物素蛋白的三个检测线条纹(T1、T2和T3)或布置有单体链霉抗生物素蛋白的三个检测线条纹(T1、T2和T3)。检测试条在图9中举例说明。使用1.5mg/mL的单体链霉抗生物素蛋白溶液施加单体链霉抗生物素蛋白条纹。同样地，使用1.5mg/mL的聚合链霉抗生物素蛋白溶液施加聚合链霉抗生物素蛋白条纹。
使用包含25、50、和100mIU hCG/mL样品的尿标准样品进行5个样品的重复试验。所有的检测试条在施加尿标准溶液5分钟之后在Biodot Test Strip Reader(得自Biodot，Inc.，Irvine，CA)上读数，以便量化每个单独的检测线的显色。结果数据总结在以下表2中。
表2
Figure G200880012370XD00311
表2中提供的单体链霉抗生物素蛋白和聚合链霉抗生物素蛋白在最初的检测线的颜色强度的对比显示，如前所述，使用聚合链霉抗生物素蛋白在所述的最初检测线处提供的显色是单体链霉抗生物素蛋白的显色的约三倍。这些检测结果在图10(说明了聚合链霉抗生物素蛋白检测结果)和图11(说明了单体链霉抗生物素蛋白检测结果)中进行说明。
在另外的检测线处(T2和T3)观察到的结果显示，随着hCG被分析物复合物沿双相材料向下流动，在对其进行捕获方面，聚合链霉抗生物素蛋白更有效。具体地，如表2和图10中所示，在最初的检测线处(T1)具有高的结合，而在另外的下游的检测线处(T2和T3)具有相对低的结合。在T2和T3处观察到的低水平结合显示，在使用聚合链霉抗生物素蛋白时，hCG被分析物复合物在最初的检测线处被有效地捕获和保持。因此，只有非常少的复合物保留在试验溶液中以向下移动并且在T2或T3处结合。此外，只有非常少的复合物从T1脱离并向下移动。
单体链霉抗生物素蛋白不能提供这种有利的性质。首先，单体链霉抗生物素蛋白在捕获hCG被分析物复合物方面不那么有效。如表2和图11中所示，最初的检测线表现出比图10中的最初检测线(T1)低得多的结合。另外，与T1相比，在图11中下游的T2和T3观察到的结合比在图10中观察的相应结果大得多。事实上，在使用单体链霉抗生物素蛋白时，在50mIU hCG/mL和25mIU hCG/mL的条件，在T2处捕获的被分析物复合物的量与在T1处捕获和保持的量几乎相等。在下游检测线(T2和T3)的这种高水平结合显示，在使用单体链霉抗生物素蛋白时，更大比例的被分析物复合物流动通过最初的检测线而没有被结合，并且可被获得以进行下游结合。此外，在使用单体链霉抗生物素蛋白时，所结合的复合物更容易脱离。
实施例3
妊娠检测临床准确性
对本发明的妊娠检测设备进行评价，以便确定所述设备的准确性。基本上如上所述使用双相基材制备本发明的妊娠检测设备，但是结合有本文中所述的创造性方面。具体地，本发明的妊娠检测设备使用本文中所述的大的胶体金粒子(即，平均粒径60-75nm)和聚合链霉抗生物素蛋白。对总共153个尿样品经历检测，已知每个样品包括hCG(即，指示妊娠)或不含hCG(即，指示未妊娠)。检测结果总结在以下表3中。
表3
实施例4
检测设备的hCG灵敏度
使用掺有8、10、或12mIU hCG/mL样品的阴性尿汇集物(NUP)评价本发明的妊娠检测设备的分析灵敏度。NUP包括得自至少20名未妊娠个体供体的尿样品。使用25个相同的本发明的检测设备来评价样品。基本上如上所述使用双相基材制备本发明的妊娠检测设备，但是结合有本文中所述的创造性方面。具体地，本发明的妊娠检测设备使用本文中所述的大的胶体金粒子(即，平均粒径60-75nm)和聚合链霉抗生物素蛋白。对包括hCG的样品进行试验，以便确保本发明的设备给出阳性妊娠结果。结果提供在以下表4中。
表4
Figure G200880012370XD00332
为了确认上述提供的结果，在经过制备以在其中包含不同水平的hCG的尿标准样品中，对五个本发明的设备分别进行试验(总共40个检测设备)。试验了包含hCG的样品，以确保本发明的设备提供阳性妊娠结果，并且试验了其中不含hCG的样品以确保本发明的设备提供阴性的妊娠结果。结果在以下表5中提供。如其中可见，在所有的hCG浓度，试验的所有样品都表现出预期的阴性或阳性检测结果。
表5
Figure G200880012370XD00341
实施例5
检测设备的H-hCG灵敏度
评价本发明的检测设备，以确定对于高糖基化hCG(H-hCG)的灵敏度，H-hCG是存在于早期妊娠的主要的hCG相关分子。在经过制备以在其中包含不同水平的H-hCG的尿标准样品中对五个本发明的设备分别进行试验(总共40个检测设备)。基本上如上所述使用双相基材制备本发明的妊娠检测设备，但是结合有本文中所述的创造性方面。具体地，本发明的妊娠检测设备使用本文中所述的大的胶体金粒子(即，平均粒径60-75nm)和聚合链霉抗生物素蛋白。试验了包含H-hCG的样品，以确保本发明的设备提供阳性妊娠结果，并且试验了其中不含H-hCG的样品以确保本发明的设备提供阴性的妊娠结果。结果在以下表6中提供。如其中可见，在所有的hCG浓度条件下，所有的供试样品都表现出预期的阴性或阳性检测结果。
表6
Figure G200880012370XD00342
实施例6
早期妊娠临床样品中hCG的检测
使用得自总共52个个体受孕周期的大约575个样品进行早期妊娠研究。每个受孕周期的试验时间段从两个连续的阴性样品开始(hCG值＜1mlU/mL)，随后在预期的受精卵植入时间左右(大约在排卵后的5-7天)收集的第一个样品显示hCG升高(＞1mlU/mL)，并使用在预期经期(EMP)之后3天收集的样品结束试验时间段。使用本发明的有创造性的妊娠检测设备对每个样品进行检测，所述全部检测设备基本上都是如上所述使用双相基材来制备的，但是结合有本文中所述的创造性方面。具体地，本发明的妊娠检测设备使用本文中所述的大的胶体金粒子(即，平均粒径60-75nm)和聚合链霉抗生物素蛋白。
检测结果提供在以下表7和表8中。根据试验相对于EMP的天数将试验分组(例如EMP-8是指预期经期开始之前第八天，单独的EMP是指预期开始的当天，并且EMP+1是指月经过期的天数)。作为参考，还提供了相对于排卵(OV)的日子(例如，OV+7是指发生排卵之后的第7天)。以相对于给定周期所进行的总检测数提供其中本发明的检测设备提供阳性妊娠检测结果的周期数。该表另外提供了hCG经检测呈阳性的周期的累积百分数。
表7
Figure G200880012370XD00351
表8
Figure G200880012370XD00361
实施例7
妊娠检测结果的用户评估
评价了用户使用本发明的妊娠检测设备执行和解释检测结果的能力。在研究中，由年龄为18到45岁、未经过实验室检测的104名妇女参加。要求每名受试者解释使用本发明的设备进行试验所得到的结果。基本上如上所述使用双相基材制备所述设备，但是结合有本文中所述的创造性方面。具体地，本发明的妊娠检测设备使用本文中所述的大的胶体金粒子(即，平均粒径60-75nm)和聚合链霉抗生物素蛋白。由试验受试者评价的每个设备用包含0、8、10、或12mlU hCG/mL的尿标准样品进行预检测。
受试者在没有研究监视人员的帮助下根据包装说明书解释结果。总的说来，有六个结果被不正确地解释，3个是使用8mIU hCG进行的预检测，3个是使用10mIU H-hCG/mL进行的预检测。对于不含hCG或含12mIU H-hCG/mL的预检测，没有产生不正确的解释。检测结果提供在以下表9中。
表9
Figure G200880012370XD00371
本发明所属领域的技术人员在掌握前述教导之后可以想到本文中所述的本发明的许多修饰和其它实施方案。因此，应该理解，本发明不限于所公开的特定的实施方案，并且其修饰和其它实施方案意在被包括在权利要求范围内。尽管在本文中使用了专有名词，但是它们只是以一般的和描述性的意义使用而不用于限制。

Claims (8)

1.用于检测液体样品中的被分析物的设备，所述液体样品被放置在设备的第一部分上，用于转运到设备的第二部分，其中所述设备是侧向流动检测单元，所述侧向流动检测单元包括：
A)由第一种材料形成的释放介质，所述释放介质包括：
i)被标记的缀合物，其包括与被分析物的第一表位具有反应性的结合成员和标记物；和
ii)生物素酰基化的可捕获组分，其具有与被分析物的第二表位具有反应性的位置，使得如果在样品中存在有被分析物，则被分析物产生复合物，所述复合物包括被标记的缀合物、供检测的被分析物、和生物素酰基化的可捕获组分；和
B)与释放介质流体相通并且由第二种不同的材料形成的捕获介质，所述捕获介质包括用于捕获复合物的捕获位置，所述捕获位置在其上面固定有包括聚合链霉抗生物素蛋白的捕获组分。
2.权利要求1的设备，其中超过50重量％的聚合链霉抗生物素蛋白的分子大小为至少100kDa。
3.权利要求1的设备，其中捕获组分通过聚合链霉抗生物素蛋白与捕获介质的直接连接被固定于捕获介质，或者其中捕获组分通过聚合链霉抗生物素蛋白与捕获介质的间接连接被固定于捕获介质。
4.权利要求3的设备，其中间接连接借助于合成的中间体材料进行，或者其中间接连接借助于天然的中间体材料进行，或者其中间接连接借助于选自胶乳珠子、免疫球蛋白、牛血清白蛋白及其组合的中间体材料进行。
5.权利要求1的设备，其中被分析物包括人绒毛膜促性腺激素(hCG)，或者其中被分析物包括促黄体生成激素(LH)，或者其中被分析物包括促卵泡激素(FSH)。
6.权利要求1的设备，其中标记物包括在形成被标记的缀合物之前平均粒径为至少50nm到100nm的胶体金粒子。
7.权利要求6的设备，其中胶体金粒子的平均粒径为60nm到75nm。
8.权利要求1的设备，其中的捕获介质包含硝化纤维、尼龙或其组合的微孔性聚合物膜。
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