CN101677524B - 由二倍体亲本生产四倍体双壳类软体动物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于生产能养活的四倍体双壳类软体动物的方法，其包括：用二倍体雄性精子使二倍体雌性卵母细胞受精；接着诱导受精卵第一极体的保持；从得到的幼虫中分离富集四倍体的幼虫亚群；以及选择改良的亚群。
Description
技术领域
本发明涉及能养活的四倍体双壳类软体动物的生产。
背景技术
多倍体双壳类软体动物的生产目前引起人们相当大的兴趣，尤其就牡蛎而言。
实际上，三倍体牡蛎，也称为“四季牡蛎”，具有数种优点。因为它们具有奇数的染色体，所以它们通常无生殖力，这意味着一方面它们可以更快地生长(它们的能量用于生长而非用于繁殖)，另一方面它们在夏季期间不会产生精液，这意味着它们一年到头质量恒定。
通过二倍体亲本杂交、接着通过化学处理(通常用细胞分裂抑素B(CB)，或者任选地用6-二甲基-氨基嘌呤(6-DMAP)处理)、或者通过物理处理(特别是热休克或加压处理)保持第一或第二极体，可以得到三倍体牡蛎。然而，这两种技术具有某些缺陷。值得注意的是，我们会提到在倍数性水平上缺乏均一性；实际上，用于诱导极体保持的处理会导致混杂的幼虫种群，具有变化的倍数性水平。在幼虫发育的末尾，得到的种群通常含有至多90％的三倍体个体，其余的种群由二倍体组成。另外，在化学处理的情况下，利用毒性很高的产品的那些极体很少被公众察觉，这迫使人们经常采取严格的预防措施来避免任何对于处理者的危险。
这就是为什么该方法目前优选用于生产三倍体牡蛎的原因，所述三倍体牡蛎由四倍体牡蛎与二倍体牡蛎杂交而组成。除不要求重复依赖化学处理的优点之外，该方法还具有可以得到均质种群的优点，所有的个体都是三倍体。该方法的主要缺陷由得到能养活的四倍体亲本的难度所引起。
人们在用于生产三倍体的实验过程中已经观察到可变比例的四倍体幼虫的产生，该实验是通过二倍体亲本杂交、并且通过用细胞分裂抑素B(CB)处理排除第一极体的保持来生产三倍体。然而，四倍体幼虫的这种产生表现为瞬时的；人们仅描述了在第一次受精后24小时期间的这种现象(STEPHENS & DOWNING，J.Shellfish Res，7，550-51，1988；GUO et al.，Biol.Bull.，183，381-93，1992)。检测到的四倍体幼虫的比例显著地下降，结果在幼虫繁殖的剩余期间或者在幼虫定置时、尤其在微型保育器(micronursery)或保育器繁殖期间没有四倍体幼虫被检测到。
人们已经提出两种假设来解释所有用于直接从二倍体亲本得到能养活的四倍体的方法的失败：
根据第一种假设，由于特定隐性致死等位基因的表达，等位基因的复制数变得随着四倍体化而改变，因此四倍性将涉及不适宜幼虫存活的遗传负担(隐性致死等位基因的假设)。然而，通过使用同血亲系和野生系而进行的单雌生殖实验趋向于显示：隐性致死等位基因的表达不能独立地解释所有的四倍体在幼虫期期间的死亡现象(郭，博士论文：在太平洋牡蛎Crassostrea gigas.中的四倍体诱导的研究。华盛顿大学，西雅图。1991)。
根据第二种假设(核质比假设)，由二倍体母本产生的卵母细胞太小，以致不能支撑遗传物质随着四倍体化而加倍的细胞核。第二种假设是优选的，并且成为用于开发迄今为止预期可得到能养活的四倍体牡蛎的方法的基础。
第一个方法已经成功应用，包括使三倍体母本与二倍体父本杂交，并且通过诱导第一极体的保持来阻断减数分裂(MI)的第一阶段(PCT申请WO 95/19703；GUO & ALLEN，Mol Mar Biol Biotechnol 3，42-50，1994)。该方法基于如下事实：有生殖力的少数稀有的三倍体雌性产生的卵母细胞远远多于二倍体雌性生产的卵母细胞，以使得它们能够支撑四倍体细胞核。
最近，还描述了通过使四倍体雄性与二倍体雌性(此前选择大尺寸的它们的卵母细胞)杂交、接着进行第二极体的保持来进行能养活的四倍体牡蛎的生产(MCCOMBIE等，Mar Biotechnol(NY).7，318-30，2005)。然而，目前，在实践中使用的生产四倍体的仅有方法是使三倍体雌性与二倍体雄性杂交。然而，该方法具有如下两个主要缺点：
1)因为由具有可评估的繁殖力的三倍体得到这些四倍体，故这些用于生产新一代三倍体的相同的四倍体的使用会导致由连续世代得到的三倍体繁殖力的增强。因此，研究发现平均繁殖力从第一代三倍体的2％(在通过CB处理进行第二极体的保持之后得到的“化学”三倍体)增强至由四倍体父本与二倍体母本杂交而得到的第二代三倍体的13.4％(GUO & ALLEN，Biol.Bull.，187，309-18，1994)。这种在整个世代繁殖期间繁殖力增强的风险导致会出现在繁殖力将不断增强的三倍体种群的长期或短期中，使得我们冒累进的环境不育化的风险，冒土生二倍体牡蛎的保藏污染的风险。这是三倍体牡蛎繁殖的结果，该三倍体牡蛎的后代显著地是非整倍体。
2)需要经过三倍体，这使得在四倍体水平上导入任何通常在二倍体水平上所获得的遗传改进特别困难和繁重。实际上，作为遗传选择程序的结果的改良二倍体系必须首先通过传统的化学诱导方法用于生产三倍体。仅仅在后来，能够达到成熟并产生卵母细胞的很少的三倍体才可以用作母本以便生产四倍体。
因此，似乎特别期望有一种生产四倍体牡蛎的方法，通过该方法有可能直接由二倍体阶段跨至四倍体阶段，而无需经过三倍体阶段。
本发明人提出如下假设：通过杂交二倍体亲本产生的四倍体除幼虫期外不能存活的原因可能不是因为二倍体卵母细胞相对于四倍体细胞核太小，并且其原因可能显著地包括由四倍性导致的适应值(即，总体存活能力)的普遍下降。这种适应值下降或许归因于特定的负性等位基因的表达，该基因通常在二倍体和三倍体中被抑制、但是在四倍体中不被抑制或仅被局部地抑制。
这将导致四倍体幼虫的低竞争性，并且因此当将四倍体幼虫与二倍体和三倍体幼虫混合繁殖时，它们会快速消失。这种情况也存在于由二倍体亲本杂交、接着保持第一极体而得到的幼虫种群中。
基于这种假设，本发明人断定对幼虫进行分类以便分离出四倍体，并且使它们能够避免由二倍体和三倍体幼虫产生的极强的竞争，将有可能从仅涉及野生型二倍体亲本的杂交开始而得到能养活的四倍体。
发明内容
发明人因此开发了一种方法，该方法基于如下步骤：检测四倍体幼虫；分离含有高比例四倍体幼虫的幼虫亚群；以及繁殖该亚群。根据在开发过程中的需要多次重复这些阶段。
这样，发明人发现，四倍体幼虫显著地具有如下特征：与二倍体和三倍体幼虫相比，其在相同的生长阶段具有更慢的生长以及更小的尺寸。这一观测证实了本发明人创立的关于四倍体幼虫的适应值会下降的假设。另外，这可以简化用于得到富集四倍体幼虫的种群的幼虫的分类，因为该分类可基于幼虫大小来进行。
因此，本发明涉及一种生产四倍体双壳类软体动物的方法，其特征在于，其包括：
a)用来自二倍体雄性的精子使来自二倍体雌性的卵母细胞受精，接着诱导受精卵第一极体的保持；
b)培养在所述受精之后得到的幼虫；
c)从在b)阶段培养的幼虫种群中分离出富集四倍体的亚群，该亚群包含至少20％、优选至少30％的四倍体幼虫；
d)培养在c)阶段分离的幼虫亚群。
经典地，通过任何可诱导微小管组装抑制性的处理，能够诱导第一极体的保持，该处理通常在受精后第5分钟至第25分钟之间进行，处理时间可在10-20分钟之间改变。例如，能够用化学试剂比如秋水仙碱、咖啡因、诺考达唑(nocodazole)、细胞分裂抑素B、或6-DMAP处理；或者用物理处理方法比如适度的热休克或高压休克处理。
具体实施方式
根据本发明的优选实施方式，用细胞分裂抑素B处理来诱导第一极体的保持。用细胞分裂抑素B处理能够在受精后第5分钟至第25分钟之间进行，处理10至20分钟。优选从受精后第10分钟开始进行，处理约15分钟。尤其有利的是，细胞分裂抑素B以0.3至0.7mg、优选0.5mg左右每升处理介质的终浓度被使用。这些浓度，其强度相当于通常用于诱导在三倍体牡蛎生产中第一极体的保持的那些浓度的一半，这可以限制细胞分裂抑素B的毒性作用，但是不会减小诱导的效果。
也可以使用其它的化学试剂比如秋水仙碱、咖啡因、诺考达唑、或6-DMAP(300至500μm)代替细胞分裂抑素B；或者使用物理处理手段比如适度的热休克(30至40℃)或高压休克。对于每一种处理，所选择的条件优选相比当使用相同的处理用于在三倍体牡蛎的生产中诱导第一极体的保持时更适度。
特别有利地，根据本发明的方法包含下述附加的阶段：
e)从前阶段培养的幼虫亚群中，分离出富集四倍体的亚群，该亚群包含至少20％、优选至少30％四倍体幼虫；
f)培养在e)阶段分离的幼虫亚群。
通常，在阶段b)中的培养进行6至10天、优选约8天；并且在阶段d)和f)中的培养进行2至3天。
富集四倍体的亚群的分离以及分离的亚群的培养的这些阶段可重复若干次，直到幼虫达到匐足面盘幼虫阶段(大小在220至250μm之间)。这些阶段优选重复至少3次、优选至少4次、优选重复间隔2至3天。
根据本发明方法的尤其优选的实施方式，将幼虫分类以分离富集四倍体的亚群是基于它们的大小而进行的。
实际上，如上所述，四倍体幼虫小于在相同生长阶段的二倍体和三倍体幼虫。一般来讲，在相同的生长阶段、并且在相同的条件下培养，四倍体幼虫的平均尺寸比相同种类的二倍体幼虫的平均尺寸小20至30％，比相同种类的三倍体幼虫的平均尺寸小25至35％。
这意味着幼虫能够简单地经过有适当网孔的筛子而被容易地分类，该筛子根据所讨论的种类、幼虫演变阶段、以及培养条件选择。
优选地，包括分离富集四倍体的亚群和培养分离的亚群的附加阶段能够在匐足面盘幼虫阶段之后、在定置牡蛎卵上进行。从该阶段开始，优选附加阶段与此前阶段的重复相比重复间隔更长，例如每次重复为8到15天。
在该情况下，为了进行筛子分类，提供给匐足面盘幼虫的附着基底包含大小大致等于幼虫定置期间的大小的颗粒，从而允许每个颗粒上附着单个幼虫。使用的基底显著地能够是通过研磨牡蛎壳得到的微裂(microsplinter)颗粒。
在每个亚群分离阶段以后，如果需要，选择的亚群中四倍体的百分比能够通过惯常的倍数性水平测定的方法进行检验。例如，我们能够在取自所述亚群的含至少100个个体的样本上使用流式细胞术。
根据本发明的方法可以用于我们希望其用于生产四倍体(显著地着眼于通过使用它们用于生产三倍体)的所有种类的双壳类软体动物(例如Pectinidae(扇贝)、贻贝(Mytilusedulis和Mytilus galloprovincialis)、蛤等)。这对于四倍体牡蛎的生产特别有益，并且，例如，这不仅能够用于如下述实施例中所示太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)种类的牡蛎，而且能够用于巨蛎属Crassostrea(特别是美洲牡蛎(Crassostrea virginica))、Saccostrea(例如商品牡蛎(Saccostrea commercialis)的任何其他种类、或者用于长牡蛎属中的种类比如食用牡蛎(Ostrea edulis)。
根据本发明的方法有可能从任何二倍体亲本开始得到能养活的四倍体双壳类软体动物，特别是牡蛎。特别地，其不需要以它们的卵母细胞大小为基准而任意选择母本。
其有可能直接从二倍体野生型亲本产生四倍体亲本--无需经过三倍体阶段。然后这些四倍体亲本能够用于三倍体的生产，而没有如上所述的风险，这与在整个繁殖期间三倍体的繁殖力增强有关系。
根据本发明的方法还有可能在四倍体中直接导入在二倍体中得到的遗传改良。为此，足以使用由所选择二倍体系的动物得到的卵母细胞和精子作为用于该方法的起始原料。得到的四倍体然后能够用于三倍体的生产，该三倍体也结合了相同的改良。
通过补充的下述内容，对本发明进行更好的理解。参考实施例，其显示了本发明用于生产能养活的四倍体牡蛎的应用。
实施例1：多倍性的诱导和幼虫的繁殖
用于实验的二倍体亲本来自在法国牡蛎Oléron海湾(Marennes Oléron Bay)天然的野生型二倍体牡蛎卵采集区域。六个母本和四个父本被用于通过生殖腺划破法进行聚集配对。由10个亲本得到的1500万个卵母细胞和30亿个游动精子被用于在1升的过滤海水中于25℃下进行杂交。通过使用溶于DMSO的细胞分裂抑素B(CB)来影响第一极体的保持，直至终浓度为0.5mg/L。从受精后第10分钟开始，CB被使用15分钟。
用于诱导多倍性的该方案类似于已经在文献中公开的用于生产三倍体的那些方案(GUO et al.，Biol.Bull.，183，381-93，1992；
et al.，Aquaculture，174，229-421999)。然而，CB的终浓度被降低(0.5mg/L，而不是1mg/L)，以便限制该产品的毒性作用，但没有降低多倍性的诱导程度。
然后在通过10μm网孔的尼龙过滤器筛选胚胎并且在含有0.1％DMSO的过滤海水中洗涤15分钟之后除去CB。
作为对照，由相同亲本得到的1500万个卵母细胞和50亿个游动精子被用于在相同的条件下进行杂交，只是不用CB处理。
然后将来自两个组(对照组和CB处理组)中每一组的胚胎返回到在含有150L过滤海水的圆柱状锥顶罐中，在22℃下，通过并入繁殖罐的鼓泡器通气进行培养。
如此能够估计孵化的速度和幼虫的可能死亡率，后者在受精24小时后通过45μm直径的过滤器被筛出来、收集在含有1L或2L过滤海水的量筒中，并且由在50μl样本中的计数来估计幼虫的总数。
另外，通过流式细胞术确定幼虫的倍数性。在每次筛选后，取幼虫样本(至少100个幼虫)并且放进1.5mL试管中。在通过短暂离心除去海水后，将幼虫加入1mL溶菌缓冲液(5mM MgCl2，85mM NaCl，10mM Tris，0.1％TRITON X-100，pH7)中。然后，用塑料塞子磨碎幼虫，并且通过30μm网孔的尼龙过滤器(Partec Celltrics)过滤释放出的细胞核，收集在细胞计数分析试管中。然后，通过加入1mL含有2μg/ml DAPI的溶菌缓冲液和2μL倍数性内部对照物(鳟鱼红血球，TRBC，Coulter DNA参照标准No.629972)，用终浓度为1μg/ml的DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)进行标记。
在冰上避光孵育30min的最小孵育时间之后，通过使用Partec PAII细胞计数器进行细胞计数分析。每一个分析(通道FL4，1024个通道的线性刻度)都是对最少2000个颗粒进行的。得到的结果显示在频率直方图表格中，在每个峰内都有高斯分布的发生。当它们被FloMaxTM软件自动识别时，峰被记录为“峰x”；或者当它们被操作者人工识别时，峰被记录为“RN/PK x”(x是峰的数量)。
在CB处理组中，幼虫D在D1(即，受精后第1天)的比例估计为16.5％(相对于未处理对照组的42％)，其代表幼虫D的种群为大约250万个幼虫。
从受精后第二天开始，在筛选后每隔一天更新一次水。直至受精后D6(即，第6天)，通过45μm的过滤器筛出幼虫。在每次更新时，对幼虫进行计数，并且如上所述，通过流式细胞术确定它们的倍数性水平。
然后使幼虫返回到它们各自的圆柱状锥形繁殖罐中，观察到在受精后D4(即，第4天)幼虫的最大密度10,000个幼虫/L，并且在受精后D6(即，第6天)为6500个幼虫/L。
每天用在实验室中培养并且含有70％大溪地(Tahiti)菌株金藻(Isochrysis galbana)和30％纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)的食物藻类混合物以25个细胞/μL/天的浓度喂养幼虫。
在繁殖第一时期期间的存活率监控显示，在受精后第1天和第6天之间幼虫存活率有明确的降低(图1)。该降低能够同时被下述两种影响解释：用CB处理的有害影响和尤其是在繁殖罐中幼虫的高密度的影响。
在受精后第1天和第6天之间，未处理的幼虫和用CB处理的幼虫的细胞计数分析显示：
-对照物杂交具有排他的二倍体细胞核的种群(图2，“峰1”)；
-由GPI保持的诱导得到的幼虫样本显示出(图3和图4)三个类型细胞核的种群，分别对应于下述倍数性水平：二倍体(平均20％左右，“峰1”)、三倍体(平均40％左右，“峰2”)和四倍体(平均40％左右，“峰3”)。
在受精第6天后，幼虫种群稳定化，并且幼虫的繁殖可连续，未发生值得注意的死亡率，直至幼虫定置。
筛选在早上进行，并且每隔两天或三天进行。直至受精后第6天，通过45μm的筛子非选择性地筛出幼虫。
紧接着，采用针对幼虫目标种群的筛分尺寸进行选择性的筛分，并且基于它们的生长速度(从不同的筛子尺寸估计)、以及它们的倍数性水平(通过流式细胞术检验)组成不同的幼虫种群。
用这种方法，组成称为“批次头部”的具有较强演变的种群、称为“批次躯干”的具有中等演变的种群、以及称为“批次尾部”的具有缓慢演变的种群作为上述两个标准的函数，并且被保持在相分离的罐中。这种与大小和倍数性有关的选择性分类方法的最终目的是，在繁殖批次不同部分内部通过最大化来最有利于四倍体幼虫的生长和存活，最有利于它们相对于二倍体和三倍体幼虫的比例。
*这样，在受精后D8(即，第8天)，进行用于幼虫大小的第一次筛分选择，并且两个幼虫种群分离地繁殖：种群“批次I头部”具有正常生长和80μm的最小尺寸，而种群“批次I尾部”具有较慢的生长，并且大小在65μm和80μm之间。
下述筛选分别在受精后D11、D13、D15、D18、D20、D23、D25、D27、以及D29进行。
*在受精后D11，在对照组上、以及在用CB处理的两个幼虫种群上进行的细胞计数分析显示：
-对照物杂交仍然具有排他的二倍体细胞核的种群(图5，“峰1”，而峰“峰2”对应于内部对照TRBC)；
-由具有最小尺寸80μm(T≥80μm)的种群“批次I头部”得到的处理后的幼虫样本表明，该种群单独地由二倍体幼虫(占57％，“PK1”)和三倍体幼虫(占43％，“PK2”)组成。在那里没有检测出四倍体幼虫的比例(图6，峰“PK3”，对应于内部对照TRBC)。
-由具有小于80μm(65μm＜T＜80μm)大小的种群“批次I尾部”得到的处理过的幼虫样本表明，该种群具有完全不同的组成，不论就倍数性分类而言，还是就倍数性分类比例而言。细胞计数分析表明，该种群由15％的二倍体幼虫(峰1)、40％的三倍体幼虫(峰2)和尤其是45％的四倍体幼虫(峰3)组成(图7中峰“峰4”对应于内部对照TRBC)。
该结果显示，繁殖的全部幼虫种群中的四倍体组分限制在幼虫繁殖的“批次尾部”，因此证实了我们的假设，根据该假设，当具有不同倍数性水平的幼虫被混合在一起繁殖时，它们存在着有差别的演变。因此，倍数性的四倍体水平显示，当其与二倍体和三倍体水平竞争时，其给出了最低的生长速率。
下述繁殖，要特别注意种群“批次I尾部”，其是唯一一个含有四倍体的种群，并且对所述“批次I尾部”种群进行两次选择性的筛选，即，在通过60μm和80μm筛选之后，从而能够分离出四倍体幼虫逐渐富集的两个亚群。
这样，第一个亚群(称为“批次I尾部”)的幼虫组成是：其尺寸大于65μm，并且小于80μm；而第二个亚群(称为“批次I躯干”)的幼虫组成是：其尺寸大于或等于80μm，并且通常直至100μm。
*在受精后D13，对未处理的幼虫或用CB处理的幼虫进行的细胞计数分析显示：
-未处理的对照物仍然仅显示排他的二倍体细胞核(图8中峰“RN1”，峰“RN2”对应于内部对照TRBC)。
-处理过的幼虫种群“批次I头部”继续唯一地由二倍体幼虫(45％，峰1)和三倍体幼虫(55％，峰2)组成(图9中“峰3”对应于内部对照TRBC)。该种群由展示出正常生长的并且已经达到最小尺寸100μm的幼虫组成。
-处理过的幼虫种群“批次I躯干”和“批次I尾部”是仅有的两个仍然显示较高四倍体幼虫比例(40至50％，在图10中表示为峰“峰3”，并且在图11中为“RN3”)的种群。峰“峰1-2-4”和“RN1-2-4”分别对应于图10和图11中的二倍体、三倍体细胞核和内部对照TRBC。
*在受精后D15，我们的努力集中在处理过的幼虫(含有四倍体)种群“批次I躯干”和“批次I尾部”的繁殖的条件。通过使用网孔65、100和125μm的筛子，对这些种群进行选择性的筛选，以便组成新的亚群：
-具有较强的生长，称为“批次II头部”，其大小在125和150μm之间；
-具有中等生长，称为“批次II躯干”，其大小在100和125μm之间；
-具有很弱的生长，称为“批次II尾部”，其大小在65和100μm之间。
对未处理的幼虫和用CB处理的幼虫进行的细胞计数分析显示：
-未处理的对照物仍然仅显示排他的二倍体细胞核(图12中“峰1”；“峰2”对应于内部对照TRBC)。
-处理过的幼虫种群“批次I头部”仍然唯一地由二倍体幼虫(以45％的水平)和三倍体幼虫(以55％的水平)组成。
-用CB处理的幼虫种群“批次II头部”(150μm＞T≥125μm)、“批次II躯干”(125μm＞T≥100μm)和“批次II尾部”(100μm＞T≥65μm)继续显示出值得注意的四倍体幼虫比例(图13、图14、图15中峰“RN 1-2-3-4”分别对应于二倍体、三倍体、四倍体细胞核、以及内部对照TRBC)。然而，该四倍体种群的尺寸使繁殖批次的一个部分明显不同于另一个部分。四倍体幼虫的比例在“批次II头部”中是最低的(15％)(图13，峰“RN3”)，并且在“批次II尾部”中是最高的(50％)(图15，峰“RN3”)。在“批次II躯干”部分，四倍体幼虫的比例具有中间值(28％，图14，峰“RN3”)。因此，显而易见，具有最大四倍体幼虫含量的繁殖批次是杂交最慢的幼虫，这再一次强调了三个倍数性水平的适应性一般数值的差异，并且需要进行选择性分类以维持四倍体幼虫。
*在受精后D18，在种群“批次I头部”(T≥250μm)中一些处理过的幼虫是匐足面盘幼虫，并且在未处理的对照物幼虫之前两天开始定置。在D18进行的细胞计数分析继续在对照物中显示排他的二倍体水平(图16中“峰1”；“峰2”对应于内部对照TRBC)、以及在种群“批次I头部”中二倍体(30％，“峰1”)和三倍体(70％，“峰2”)的混合物(图17中“峰3”对应于内部对照TRBC)。
*在受精后D20和D23，而未处理的对照物继续显示排他的二倍体水平(图18和图22，“峰1”)，含有四倍体幼虫的繁殖批次((批次II头部(T≥180μm)；批次II躯干(180μm＞T≥150μm)和批次II尾部(150μm＞T≥100μm))大致显示出与受精后D15相同的四倍体幼虫比例(四倍体分别为20％、35％和45％，由图19-21和图23-25中峰“RN/峰3”表示，其中其他的峰“峰/RN 1-2-4”分别对应于二倍体、三倍体、以及内部对照TRBC)。另外，即使它们的生长与未处理的对照物相比似乎明显较慢，但这些幼虫始终显示出它们最小尺寸的增加(在受精后D23各自的最小尺寸为180μm、150μm和100μm，而在受精后D15为125μm、100μm和65μm)。
*在受精后D25，含有30％四倍体幼虫(图26中峰“RN3”，其他的峰“RN 1-2-4”分别对应于二倍体、三倍体、以及内部对照TRBC)的第一群匐足面盘幼虫(T≥250μm)定置在牡蛎壳的微小碎片上。在D27和D29四倍体幼虫的第一次附着之后，含有20至40％范围的可变比例的四倍体幼虫(图27、28和29中峰“峰3”；其他的峰“峰1-2-4”分别对应于二倍体和三倍体细胞核、以及内部对照TRBC)的匐足面盘幼虫紧接着进行三次定置。
实施例2：四倍体牡蛎卵的定置和生长
定置后1个月
在定置后1个月，通过流式细胞术在成功变性和定置的幼虫种群内部进行四倍体牡蛎卵的存在的检查。由于在该阶段牡蛎卵的较小尺寸，在某时在含有一些牡蛎卵的样本上破坏性地进行该操作。将牡蛎卵放进1.5mL试管。然后它们在1mL的溶菌缓冲液中孵育，并且通过使用塑料塞子将它们磨碎。最后，通过30μm网孔的尼龙过滤器(PartecCelltrics)过滤释放出的细胞核，并且收集在细胞计数分析试管中，按照在上述实施例1中描述的方法用DAPI标记并进行分析。
细胞计数结果使我们能够证实，除三倍体和二倍体种群之外，四倍体牡蛎卵(29％)种群也显著存在(图30中“峰3”；峰“峰1-2-4”分别对应于二倍体和三倍体细胞核以及内部对照TRBC)。该四倍体牡蛎卵种群因此在微型培育器中成功地定置并且继续其生长。
该结果表明，可直接由二倍体亲本产生四倍体牡蛎卵，其可存活至幼虫繁殖阶段并且存活至允许定置的变形。另外，得到的四倍体牡蛎卵甚至在定置以后可继续生长。
定置后2个月
在定置后2个月，再一次通过流式细胞术在3个月大牡蛎卵种群内部检查四倍体牡蛎卵的存在，以破坏性模式但是在各个互不相同的牡蛎卵上进行。
我们的研究结果使我们能够证明3个月大四倍体牡蛎卵的存在(图31)。如同在幼虫繁殖期间显示的那样，个体的倍数性水平与其在微型培育器繁殖期间的大小相关也显示了有差别的演变。实际上，生长缓慢的四倍体牡蛎卵种群表现出相当受限于繁殖的“批次尾部”和“批次躯干”部分，而“批次头部”部分表现为由生长更快的二倍体和三倍体牡蛎卵组成。
此后，为了促进四倍体的生长，我们因此采用与幼虫繁殖期间采用的相同的方法：即，用于根据牡蛎卵的大小和倍数性水平对它们进行分类的系统，从而组成具有最大可能含量的四倍体牡蛎卵的繁殖批次，并且使四倍体牡蛎卵与三倍体和二倍体牡蛎卵进行最小可能的竞争。
在实践中，通过网孔范围为150μm至2mm、穿过中间尺寸为350μm、500μm和1000μm的矩形筛子(45×35×12厘米)，使各个互不相同的牡蛎卵经受连续的选择性筛分。
这些选择性筛分每隔15天的定期间隔进行。根据与下述幼虫繁殖阶段期间类似的方法，分别组成并繁殖“批次头部”、“批次躯干”和“批次尾部”种群。
定置后6个月
在定置后6个月时，7个月大的牡蛎卵开始可进行单个的标记，并且从它们的鳃活检样本进行非破坏性倍数性水平检验。这样，每个个体通过用环氧树脂粘合剂胶粘至其壳的塑料标签而被识别。然后使待分析的个体在含有150g的MgCl2的3升海水池中麻醉，从而有可能得到鳃活检样本，用于进行动物的倍数性测量。在该阶段，对总共600个个体进行的细胞计数分析已经使我们能够分类出超过90个建立的幼小四倍体牡蛎，平均15％比例的四倍体牡蛎直接从野生型二倍体亲本诱导而来(图32)。
定置后8-9个月
在定置后8个月，我们的细胞计数分析使我们能够进行超过200个尤其是在“批次尾部”和“批次躯干”种群中发现的四倍体个体的分类。
出于对可用空间的考虑，个体的分类在该阶段被终止。
在定置后9个月，将平均大小为6厘米的约20个个体调节成允许开始成熟并产生配子。这些未来的亲本习惯于20℃、含有2×109个细胞的浮游植物/每天/每个体的海水。在该适合于成熟的时期后，对四倍体亲本进行数次休克(热休克和外显性(of exondation)，以便引起产卵。在30个被调节成熟的亲本中，18个亲本以明显有利于雄性性别比率(17个雄性和1个雌性)的方式产卵，这完美地符合太平洋牡蛎(C.gigas)的雄性先熟本性。为了测试这些四倍体亲本产生的配子，我们进行了两种类型的杂交：
第一类型是，通过与17个四倍体雄性产生的四倍体精子混合，使仅由四倍体雌性得到的四倍体卵母细胞受精。
第二种类型是，使来自6个野生型二倍体雌性的卵母细胞用由17个四倍体雄性得到的精子受精。
我们的结果清楚地显示，受测亲本产生的配子完全能养活并受精。因此，通过它们之间杂交，新的四倍体仅产生四倍体幼虫(图33，100％的四倍体，由峰“RN1”表示；峰“RN2”代表内部对照TRBC)，并且通过与二倍体雌性杂交，四倍体雄性仅产生三倍体后代(图34，100％的三倍体，由峰“峰1”表示；峰“峰2”代表内部对照TRBC)。目前，这些新的四倍体世代和三倍体世代已经变性并且定置，并且在微型培育器(大小在500μm和1000μm之间)中被繁殖。
总之，我们成功地由二倍体亲本生产出四倍体牡蛎。这些相同的四倍体，在用于配子成熟的调节性处理之后成功地经历配子形成，并且能够产生完全能养活并受精的四倍体雌性、雄性配子。当这些四倍体彼此杂交时，它们能够生产新一代的完全能养活的四倍体。最后，当它们被用作父本用于使二倍体雌性受精时，这些相同的四倍体生产出新一代的也完全能养活的三倍体，这样就开发出了一种能使用这些四倍体亲本作为提供三倍体系的亲本的途径。
定置后超过9个月(2007年2月至2008年3月)
通过细胞计数分析并且使用经典的染色体组型技术进行鳃组织的染色体计数后，确定了由二倍体雄性和雌性杂交而得到的第一代四倍体牡蛎(直系的四倍体牡蛎，在下文中称为“TM1”)的倍数性水平。与同岁并在相同环境中繁殖的普通的四倍体牡蛎(即，由三倍体雌性而得到的那些)相比，第一代直系四倍体牡蛎“TM1”已经显示出甚至更大的耐久性，并且重量增加(图35)。因此，在繁殖20个月后，第一代四倍体(TM1)比普通的四倍体(2006-01)重1.86倍。另外，TM1保藏证明是特别耐久，因为那里没有发生死亡；相比之下普通四倍体的保藏(2006-01)已经遭受数个死亡，尤其在夏季。
在2007年初，第一代直系四倍体牡蛎“TM1”被用作雄性和雌性亲本以便紧接着自然产卵后生产第二代直系四倍体牡蛎(在下文中称为“G2TM1”)。G2TM1幼虫和牡蛎卵的四倍体性也通过细胞计数分析和使用经典染色体组型技术的染色体计数确定。G2TM1牡蛎卵全部是四倍体，并且不论是在幼虫阶段、微型培育器阶段还是培育器阶段，它们的繁殖都不会以任何方式不同于普通的繁殖。在繁殖期间，G2TM1牡蛎卵显示出非常好的性状，尤其就耐久力、生长和四倍性水平稳定性而言。因此、与同岁并且在相同环境中繁殖的普通的(即、由三倍体雌性得到的)四倍体牡蛎卵(2007-01)相比，即使G2TM1牡蛎卵的水平恢复至较低倍数性水平，也不会表现出与普通四倍体牡蛎卵不同，它们显示出优良得多的生长性和耐久力。实际上，在繁殖9个月后，G2TM1保藏物由四倍体个体组成，其平均总重量是75克左右，而普通四倍体仅是27克左右，这意味着G2TM1个体平均比同岁的普通四倍体重2.7倍(图36)。另外，相比2007-01保藏物，G2TM1保藏物已经证明特别强壮，因为那里没有发生死亡。
从2007年11月开始，定置后9个月大的G2TM1四倍体被调节成熟，并且2.5个月后，它们被用作亲本以通过诱导产卵来生产配子，这些配子在2008年2月被用于生产在下文中称为“G3TM1”的第三代直系四倍体。G2TM1四倍体亲本的性别比率和它们的繁殖力不会不同于二倍体亲本。产生的G3TM1幼虫当然是四倍体。并行地，为了生产三倍体，G2TM1雄性也被有效地用于使二倍体雌性产生的卵母细胞受精。
上述结果表明，根据本发明得到的四倍体可非常有效地用于生产三倍体。如同二倍体一样，四倍体牡蛎在它们的第一岁期间达到成熟。这些成熟四倍体牡蛎(商氏太平洋牡蛎(Crassostreagigas Thunberg)具有正常的性别比率和可与二倍体相比的繁殖力。在四倍体和二倍体之间杂交能够容易并通常地进行。根据流式细胞术的倍数性检查，所有四倍体与二倍体杂交(反之亦然)皆可唯一地产生三倍体牡蛎卵。
实施例3：在贻贝中四倍体的生产
通过使用在实施例1和2中详述的方法，在贻贝(M.edulis和Mytilus galloprovincialis)中有效地得到了四倍体。
在贻贝中，细胞计数结果证实，除了三倍体和二倍体种群之外，还存在占优势的四倍体牡蛎卵种群。因此，
-对照物杂交可提供排他的二倍体细胞核的种群(图37，峰“RN1”)；
-由GPI保持的诱导得到的样本显示出三个类型的细胞核种群(图38)，分别对应于下述倍数性水平：二倍体(平均10％左右，峰“RN1”)、三倍体(平均20％左右，峰“RN2”)和四倍体(平均70％左右，峰“RN3”)。得到的四倍体个体正处于繁殖过程中。
总而言之，通过使用上述实施例详述的方法，采用与用于太平洋牡蛎和贻贝的方式相同的方式，在所有的双壳类软体动物中都能够制备出能养活的四倍体。
Claims (11)
1.一种生产四倍体双壳类软体动物的方法，其特征在于，其包括：
a)用来自二倍体雄性的精子使来自二倍体雌性的卵母细胞受精，接着诱导受精卵第一极体的保持；
b)培养在所述受精之后得到的幼虫；
c)从b)阶段培养的幼虫种群中分离出富集四倍体的亚群，所述亚群包含至少20％的四倍体幼虫；
d)培养在c)阶段分离的幼虫亚群。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过用细胞分裂抑素B处理，来诱导所述第一极体的保持，所述处理在受精后第5分钟至第25分钟进行，处理时间为10至20分钟。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞分裂抑素B以0.3至0.7mg每升处理介质的终浓度被使用。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在b)阶段的所述培养进行6至8天。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在d)阶段的所述培养进行2至3天。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，还包含下述附加的阶段：
e)从前阶段培养的幼虫亚群中，分离出富集四倍体的亚群，所述亚群包含至少20％的四倍体幼虫；
f)培养在e)阶段分离的幼虫亚群。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在f)阶段的所述培养进行2至3天。
8.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述富集四倍体的亚群的分离是基于所述幼虫的大小通过对幼虫分类而进行的。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述富集四倍体的亚群的分离是通过穿过适当网孔的筛子而进行的，并且所选择的幼虫不被所述筛子保留。
10.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述双壳类软体动物是牡蛎。
11.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述双壳类软体动物是贻贝。
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