CN101657203B - 抗癌药的组合物及递送方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含5-氟尿嘧啶或其药学上可接受的盐或类似物、亚叶酸或其药学上可接受的盐和环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物的组合物。本发明还涉及使用这种组合物治疗癌症的方法。

Description

抗癌药的组合物及递送方法
技术领域
本发明涉及用于治疗癌症的药物组合物。具体说，本发明涉及包含5-氟尿嘧啶、环糊精和亚叶酸的组合物及其在癌症治疗中的应用。
发明背景
化疗在包括结肠-直肠癌、乳腺癌和肝癌在内的许多癌症的治疗中起关键作用。化疗中常常使用的一种药物是5-氟尿嘧啶(5-FU)，已知5-氟尿嘧啶是特别强效的抗癌药。虽然在化疗应用中可单独使用5-FU，通常该药物与钙盐形式的亚叶酸(亚叶酸钙)联合使用(D.B.Longley，D.P.Harkin和P.G.Johnston，“5-Fluorouracil：mechanisms of action and clinical strategies(5-氟尿嘧啶：作用机制与临床战略)”，Nature Reviews：Cancer，第3卷，330-338，2003)。亚叶酸与5-FU存在协同作用，能够特异性提高5-FU抑制胸苷酸合酶的作用。
在临床应用中，通过两次单独的注射给予患者5-FU和亚叶酸，不能实现最佳的协同组合作用。通常，以pH9静脉内给予5-FU注射溶液，可导致患者严重而痛苦的静脉损伤(静脉炎)。因此，通常采用中心线(central line)来递送5-FU，这是目前给药技术的显著缺点。如果将5-FU配制成用于治疗皮肤癌的外用乳膏，可能发生广泛性炎症和疼痛。
因此，需要改良5-FU的递送以及采用5-FU和亚叶酸的联合抗癌疗法。
在更符合生理学要求的pH水平制备含有5-FU和亚叶酸的组合物。然而，当采用临床适当的5-FU浓度时，5-FU倾向于从溶液中析出而导致这些组合物不符合要求。因此，需要一种组合物，该组合物能够以临床应用适当的浓度在生理学上可接受的pH下并行给予5-FU和亚叶酸。
本发明者意外地发现，在环糊精衍生物的存在下，可以在生理学pH下制备5-FU和亚叶酸的均一溶液以使有害的副作用最小。
发明概述
第一方面，本发明提供了包含以下成分的组合物：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物；
(ii)亚叶酸(FA)或其药学上可接受的盐；和
(iii)环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物。
环糊精(CD)或其盐或衍生物的含量足以防止5-FU或其盐或类似物从溶液中析出。组合物的pH可约为5-9，或约6.5-8，或约7.0-7.8。以重量/体积百分含量为基准计，环糊精或其盐或衍生物的含量可约为0.1-30％或约1-30％，或约1-300毫克/毫升或约10-300毫克/毫升。5-FU或其盐或类似物的含量约为1-50毫克/毫升或约5-50毫克/毫升。亚叶酸或其盐的含量约为0.1-25毫克/毫升或约0.1-15毫克/毫升或约0.1-12毫克/毫升。
组合物可以是用于治疗和/或预防癌症的组合物。
组合物中5-FU和环糊精可以非共价复合物形式存在，即5-FU与环糊精复合而非共价结合。
组合物中亚叶酸和环糊精可以非共价复合物形式存在，即亚叶酸与环糊精复合而非共价结合。
组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。载体可以是水性载体，例如盐水溶液。组合物可以是水性组合物。
5-FU的类似物可以是例如5-氟-2-脱氧尿苷(5-FUdr)。
组合物可以是溶液形式，例如水性溶液。组合物中的每种成分(上述i、ii、iii)可以是溶液形式。组合物不包含固体物质。因此，组合物中的每种成分(上述i、ii、iii)可以完全是溶液形式。
组合物可以是协同作用组合物。
亚叶酸药学上可接受的盐可以是亚叶酸钙(甲酰四氢叶酸)或亚叶酸钠。盐可以是水合物形式，例如亚叶酸钙无水合物。
亚叶酸或其药学上可接受的盐可以是其对映异构体形式之一，或外消旋混合物的形式。可以是6(S)非对映异构体或6(R)非对映异构体(其中，亚叶酸或亚叶酸盐的谷氨酸残基是L构型)，或者可以是这些物质任意所需比率的混合物，例如约1∶1或一些其他比率。可以是这些物质的混合物，其中富含6(S)异构体。可以富含约51-100％，或约55-99％，55-95％，55-75％，55-65％，75-85％，75-95％，85-95％或75-99％，例如富含约51、52、53、54、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％。应理解，谷氨酸残基为L构型的6(S)形式是药物活性形式。
环糊精可以是α-环糊精、γ-环糊精或其衍生物或盐，或者可以是β-环糊精或其衍生物或盐。
环糊精可以是硫酸环糊精或其盐。
在一个实施方式中，环糊精是β-环糊精的硫酸化钠盐，任选地是多硫酸化钠盐或具有不同硫酸化程度的硫酸化钠盐的混合物。在另一实施方式中，环糊精是羟烷基β-环糊精，例如羟丙基-β-环糊精。或者，环糊精可以是不同类型环糊精的混合物，例如羟烷基β-环糊精和硫酸化β-环糊精的混合物。
在另一实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包含以下成分或由以下成分构成：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物；
(ii)亚叶酸或其药学上可接受的盐；
(iii)环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物；和
(iv)药学上可接受的载体；
其中，(i)、(ii)和(iii)溶解在(iv)中。
环糊精可选自下组：羟烷基β-环糊精和硫酸化β-环糊精，或它们的组合。羟烷基β-环糊精可以是羟丙基-β-环糊精，或者更具体是2-羟丙基-β-环糊精。
在另一实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包含以下成分或由以下成分构成：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物，浓度约为1-50毫克/毫升；
(ii)亚叶酸或其药学上可接受的盐，浓度约为0.1-5毫克/毫升；
(iii)环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物，浓度约为10-300毫克/毫升；和
(iv)药学上可接受的载体；
其中，(i)、(ii)和(iii)溶解在(iv)中。
在另一实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包含以下成分或由以下成分构成：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物，浓度约为10-20毫克/毫升；
(ii)亚叶酸或其药学上可接受的盐，浓度约为0.5-2毫克/毫升；
(iii)环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物，浓度约为20-200毫克/毫升；和
(iv)药学上可接受的载体；
其中，(i)、(ii)和(iii)溶解在(iv)中。
环糊精可选自下组：羟烷基β-环糊精和硫酸化β-环糊精，或它们的组合。羟烷基β-环糊精可以是羟丙基-β-环糊精。
药学上可接受的载体可以是盐水溶液。
在另一实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包含以下成分或由以下成分构成：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)，浓度约为15毫克/毫升；
(ii)亚叶酸钙盐，浓度约为1毫克/毫升；
(iii)硫酸β-环糊精盐，浓度约为45毫克/毫升；和
(iv)药学上可接受的载体；
其中，(i)、(ii)和(iii)溶解在(iv)中。
在另一实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包含以下成分或由以下成分构成：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)，浓度约为15毫克/毫升；
(ii)亚叶酸钙盐，浓度约为1毫克/毫升；
(iii)硫酸β-环糊精盐，浓度约为175毫克/毫升；和
(iv)药学上可接受的载体；
其中，(i)、(ii)和(iii)溶解在(iv)中。
在另一实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包含以下成分或由以下成分构成：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)，浓度约为45毫克/毫升；
(ii)亚叶酸钙盐，浓度约为1毫克/毫升；
(iii)硫酸β-环糊精盐，浓度约为45毫克/毫升；和
(iv)药学上可接受的载体；
其中，(i)、(ii)和(iii)溶解在(iv)中。
硫酸β-环糊精盐可包含6和14个硫酸酯基。
药学上可接受的载体可以是0.9％的盐水溶液。
硫酸β-环糊精盐可以是钠盐。
在另一实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包含以下成分或由以下成分构成：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)，浓度约为15毫克/毫升；
(ii)亚叶酸钙盐，浓度约为1毫克/毫升；
(iii)2-羟丙基-β-环糊精，浓度约为100毫克/毫升；和
(iv)药学上可接受的载体；
其中，(i)、(ii)和(iii)溶解在(iv)中。
药学上可接受的载体可以是0.9％的盐水溶液。
在另一实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包含以下成分或由以下成分构成：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)，浓度约为15毫克/毫升；
(ii)亚叶酸钙盐，浓度约为1毫克/毫升；
(iii)七(6-O-磺基)-β-环糊精盐，浓度约为50毫克/毫升；和
(iv)药学上可接受的载体；
其中，(i)、(ii)和(iii)溶解在(iv)中。
药学上可接受的载体可以是0.9％的盐水溶液。
七(6-O-磺基)-β-环糊精盐可以是钠盐。
在本发明的第二方面，提供了制备组合物的方法，该方法包括组合以下成分：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物；
(ii)亚叶酸或其药学上可接受的盐；和
(iii)环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物。
各成分的浓度和具体物质如上文本发明的第一方面所述。该方法可包括：组合(i)与(iii)，然后加入(ii)。加入(ii)时，它可以是溶液，任选地水性溶液。该方法还包括对组合物进行灭菌。灭菌可包括过滤(例如微膜过滤)、UV照射、γ照射、一些其他形式的灭菌照射或一些其他形式的灭菌方法。进行灭菌而不导致上述成分(i)-(iii)中任意成分的破坏或降解。因此，如果使用灭菌照射(UV，γ或其他)，该照射的剂量应足够高以使组合物无菌、但同时又足够低以避免特定成分的破坏或降解。
该组合物可以是用于预防和/或治疗癌症的组合物。
在一个实施方式中，在载体、任选地水性载体的存在下组合(i)和(iii)以形成混合物，然后将(ii)加入混合物中。混合物可以是溶液，任选地水性溶液。载体可以是溶剂，任选地水性溶剂，例如盐水溶液。(i)和(iii)可以独立地部分溶解在载体中，任选地微溶于载体。在载体的存在下组合(i)和(iii)以形成混合物之后，可搅动该混合物以使(i)和(iii)至少部分地溶解在载体中。溶解可包括(i)和(iii)之间非共价复合物的形成。搅动可包括搅拌、涡旋、震摇、超声或其中两种或更多种方法的组合。搅动可在升高的温度，例如约30-60℃进行。组合物可以在加入(ii)之后进行搅动。搅动过程如上所述。
在另一实施方式中，提供了制备组合物的方法，该方法包括：
·在水性溶剂的存在下，组合5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物和环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物以形成混合物；
·任选地搅动和任选地加热混合物以形成溶液；和
·在上述溶液中加入亚叶酸或其药学上可接受的盐的水性溶液以形成组合物。
可进行加入水性溶液的步骤以形成组合物，组合物中5-FU或其盐或类似物、环糊精或其盐或衍生物和亚叶酸或其盐都在溶液中，任选地组合物中不含固体物质。加入水性溶液的步骤之后，可任选地搅动和任选地加热组合物。组合物的搅动足以产生均一组合物或确保所有组合物的成分完全溶解在溶液中。
在另一实施方式中，提供了制备组合物的方法，该方法包括：
·在水性溶剂的存在下，组合5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物和环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物以形成混合物；
·任选地搅动和任选地加热混合物以形成溶液；
·在上述溶液中加入亚叶酸或其药学上可接受的盐的水性溶液以形成组合物；
·搅动和任选地加热组合物，足以确保所有成分溶解在溶液中；和
·对组合物进行灭菌。
在另一实施方式中，提供了制备组合物的方法，该方法包括：
·在水性溶剂的存在下，组合含量为每毫升最终组合物中约5-50毫克的5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物和含量为每毫升最终组合物中约20-200毫克的环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物以形成混合物；
·任选地搅动和任选地加热混合物以形成溶液；
·在上述溶液中加入亚叶酸或其药学上可接受的盐的水性溶液以形成组合物，所述水性溶液的浓度约为5-20毫克/毫升，含量为每毫升组织组合物中约50-200微升；
·搅动和任选地加热组合物，足以确保所有成分溶解在溶液中；和
·对组合物进行灭菌。
第三方面，本发明提供了在需要所述治疗或预防的患者中治疗或预防癌症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的第一方面所述的组合物。
第四方面，本发明提供了抑制癌细胞增殖的方法，所述方法包括使癌细胞接触第一方面所述的组合物。
癌症或癌细胞可以是原发性或继发性的，可包括以下一种或多种：前列腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、结肠-直肠癌(理解为包括结肠癌和肠癌)、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、原发性肝癌、皮肤癌、胰腺癌、胆管癌或头颈癌、以及由其得到的癌细胞。
皮肤癌可以是非黑色素瘤皮肤癌。
患者可以是哺乳动物，例如人。
定义
在本说明书的内容中，术语“包含”表示“主要包括，而非仅仅包括”。而且，术语“包含”的变体如“含有”和“包括”具有相应的可变涵义。
本文所用术语“协同作用”表示大于亚叶酸和5-FU组合产生的累加作用，超过单独使用5-FU或亚叶酸得到的作用。
本文所用术语“治疗有效量”的涵义包括非毒性但足够量的5-FU和亚叶酸以提供所需的治疗作用。所要求的准确的量根据诸如对象健康状况、对象年龄、对象性别以及癌症阶段和严重性等因素在对象间各不相同。
本文所用术语“预防”包括完全防止临床明显癌症的发生或延迟其发生。
本文所用术语“治疗”包括部分或完全抑制癌症生长，以及部分或完全破坏癌细胞。
本文所用术语“复合物”应理解为表示两种或更多种化学实体间的非共价物理相互作用。
本文所用术语“弗罗德(fluorodex)”(缩写FD)应理解为表示水溶液中包含5-FU和亚叶酸盐以及环糊精或其衍生物的组合物，如本发明所述。
附图简要说明
现在将参考附图，仅通过实施例的方式描述本发明的优选实施方式，其中
图1显示了本发明组合物(表示为FD2)的溶液和5-FU的pH随时间的变化；
图2显示了本发明组合物的溶液(表示为FD2)和5-FU在266nm的吸光度的变化；
图3显示了用提高浓度的各种5-FU制剂处理的5种癌细胞系的剂量效应曲线。72小时后，MTS试验测定细胞增殖并根据盐水对照处理(100％增殖)标准化。
Figure G2008800122995D00081
5-FU，■5-FU∶FA，
Figure G2008800122995D00082
FD45c，
Figure G2008800122995D00083
FD50-7Sc，●FD100HPc。虚线表示每种处理的IC50(GraphPad)。数值表示为均值±SD(n＝4，只是HCT-116FD50-7Sc和MDA-MB-231FD100HPc中n＝3)。
图4描绘了实施例5中与5-FU∶FA相比，本发明组合物的单剂量耐受性，其中，线表示均值±SEM，n＝3：(A)50mg/kg；(B)100mg/kg；(C)200mg/kg；(D)225mg/kg和(E)250mg/kg。
图5显示了实施例6中与5-FU∶FA相比，FD1的分次多剂量耐受性，其中，线表示均值±SEM：(A)20mg/kg×5；(B)40mg/kg×5；(C)60mg/kg×5和(D)80mg/kg×5。
图6描绘了实施例7中，与5-FU∶FA，本发明组合物对抗MDA-MB-231一种移植瘤的功效：(A)肿瘤生长-将包含等摩尔量5-FU和FA的本发明组合物(FD2)的剂量效应与5-FU∶FA和PBS(磷酸盐缓冲盐水)进行比较；对照小鼠：组大小为n＝10，线表示均值±SEM，星号表示相对于对照有显著差异(p＜0.05)(*)本发明组合物，(**)5-FU∶FA；(B)处理时的肿瘤重量-处理时的肿瘤肿瘤：数值表示均值±SEM(均值的标准误差)，n＝10，星号表示相对于对照有显著差异(p＜0.05)。
发明详述
组合物和制备方法
本发明涉及包含5-FU或其药学上可接受的盐或类似物、亚叶酸或其药学上可接受的盐和环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物的组合物，所述环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物能够防止pH约5-9时5-FU从溶液中析出。本发明还考虑使用所述组合物来治疗癌症。
在本发明的内容中，5-FU的类似物尤其在人体中，具有与5-FU相当或类似药理学活性，并且具有类似溶解度/复合作用性质，使得在本发明的组合物中，用该类似物制备时，类似物保留在溶液中。在本说明书中，除非另有相反说明或涵义，描述5-FU时相应地包括其药学上可接受的盐或类似物，描述亚叶酸时相应地包括其药学上可接受的盐或衍生物，描述环糊精时相应地包括其药学上可接受的盐或衍生物。
与现有的使用5-FU和亚叶酸的癌症治疗方法相比，采用本发明的组合物具有以下优点：
(i)通过同时给予5-FU和亚叶酸而改善这两种化合物的递送；
(ii)使得在pH约为9的较高pH值给予5-FU时的普遍副作用最小；
(iii)通过以单剂量给予抗癌药及其生物调节剂的组合来降低给药时间和成本(临床中)；
(iv)较低的pH意味着不再需要为防止静脉炎而通常引入的中心线，从而显著简化给药过程；和
(v)可能地降低对患者的应激。
在本发明的组合物中，环糊精和5-FU可在溶液中形成复合物。该复合物可以是“宿主-客体”或“包合复合物”。复合物可使原本不溶的5-FU在pH约5-8的pH值变得可溶。或者，环糊精和5-FU可通过一些其他形式的非共价相互作用发生缔合。环糊精和亚叶酸也可在溶液中形成复合物。该复合物可以是“宿主-客体”或“包合复合物”。
本发明组合物中的5-FU可以是药学上可接受的盐的形式。“药学上可接受的盐”表示适合与人和其他动物的组织接触使用而没有过度毒性、刺激和过敏反应等的5-FU的盐，具有合理的效益/风险比。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。
例如，5-FU合适的药学上可接受的盐包括与氢氧化钠反应获得的钠盐。
组合物中的亚叶酸可以是碱金属盐(例如钠盐、钾盐)或碱土金属盐(例如镁盐、钙盐)。在一个实施方式中，亚叶酸是亚叶酸钙的形式。
适用于本发明的环糊精包括天然和化学改性的环糊精。环糊精可以是α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精，或其衍生物或药学上可接受的盐。本发明的组合物也考虑两种或更多种上述环糊精的混合物。
组合物中可使用的环糊精的衍生物可包括一个、或一些、或所有羟基被转化为其他官能团的环糊精。这样，环糊精的取代度可以不同。
在一个实施方式中，一个或多个羟基可转化为OR基团。R可以是1-20个碳原子、或约1-15，或约1-10，或约1-9，或约1-8，或约1-7，或约1-6，或约1-5，或约1-4碳原子的烃基，例如甲基、烯丙基、乙基、丙基、异丙基、炔丙基、丁基、丁-2-烯基、叔丁基、戊基、3-甲基-戊-2-烯基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。在一个实施方式中，烃基是支链或直链烷基。烃基可任选地被一个或多个卤素基团和/或一个或多个羟基取代，使得R成为卤素取代烃或羟基取代的烃，例如羟烷基。羟烷基的例子包括但不限于：-CH2CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-CH2CH2CH2(OH)CH3、-CH(OH)CH2CH2CH3和-CH(OH)CH2CH2CH2CH3。在一个实施方式中，环糊精是羟烷基β-环糊精，例如羟丙基-β-环糊精。
环糊精的衍生物还包括阴离子环糊精，例如羧甲基环糊精、硫酸环糊精、磺酸环糊精、苯酚环糊精和磷酸环糊精、或它们的混合物。在一个实施方式中，环糊精衍生物可以是硫酸化α-、β-或γ-环糊精，或其盐，例如钠盐。硫酸化环糊精可以是多硫酸化或包括硫酸酯基和羟基的混合物。在一个实施方式中，硫酸化环糊精是包含约3-20、或约3-18、或约4-16、或约4-14、或约5-13、或约5-12、或约5-11、或约6-10、或约7-9、或约9-12、或约5-10个硫酸酯基的β-环糊精。硫酸酯基(sulfate group)可以盐的形式，例如钠盐形式存在。在一个实施方式中，环糊精衍生物是七(6-O-磺基)-β-环糊精或其盐。
并且，可使用的环糊精衍生物还包括硫醚环糊精，例如磺基烷基醚环糊精，其中烷基包含1-5，或约1-12，或1-10，或1-9，或1-8，或1-7，或1-6，或1-5，或1-4个碳原子，例如磺基丁基β-环糊精
Figure G2008800122995D00111
烷基可具有通式-(CH2)n-，其中n为1-8，或约1-7，或约1-6，或约1-5或1-4。
本发明组合物中可使用的其他环糊精衍生物参见“Chemical Reviews：Cyclodextrins(化学综述：环糊精)”，V.T.D′Souza和K.B.Lipkowitz，第98卷，第5篇(美国化学协会，1998)，其内容被纳入本文作为参考。
如上所述，环糊精的取代度可变。因此，合适的环糊精包括例如其中一个、或一些、或所有羟基被取代的环糊精。取代度可约为1-20，或约5-20，10-20，1-10，1-5，5-15，5-10或10-15，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。环糊精可以是不同取代度的环糊精的混合物。在这种情况下，平均取代度可约为1-20，或约5-20，10-20，1-10，1-5，5-15，5-10或10-15，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一个环糊精是羟丙基-β-环糊精的实施方式中，平均取代度可约为4-12，或约5-10，或约5-9，或约6-8，或约7。
通常，本发明组合物中环糊精的用量足以确保组合物中存在的5-FU保持在溶液中。CD∶5-FU的摩尔比可约为1∶10-3∶1、或约1∶10和1∶1、1∶10和1∶2、1∶10和1∶5、1∶5和3∶1、1∶5和1∶1、1∶3和3∶1、1∶8和3∶1、1∶8和2∶1、1∶8和1∶1、1∶8和1∶2、1∶8和1∶5、1∶3和2∶1、1∶3和1∶1、1∶3和1.1∶1、1∶3和1.2∶1、1∶3和1.3∶1、1∶3和1.4∶1、1∶3和1.5∶1、1∶3和2∶1、1∶3和2.5∶1、1∶2.5和3∶1、1∶2和3∶1、1∶1.5和3∶1、1∶1.4和3∶1、1∶1.3和3∶1、1∶1.2和3∶1、1∶1.1和3∶1、1∶1和3∶1、1.5∶1和3∶1、2∶1和3∶1、2.5∶1和3∶1、2∶1和1∶2、1.5∶1和1∶1.5、1.4∶1和1∶1.4、1.3∶1和1∶1.3、1.2∶1和1∶1.2或1.1∶1和1∶1.1、e.g.about1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4.5、1∶4、1∶3.5、1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5、1∶1.4、1∶1.3、1∶1.2、1∶1.1、1∶1、1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1或3∶1。该比率取决于具体使用的CD。
组合物可以是弱酸或适度酸性、中性、或者弱碱或适度碱性。组合物的pH可约为5.0-9.0、或约5.0-8.0、或约5.0-7.0、或约5.5-8.0、或约6.0-8.0、或约6.5-8.0、或约7.0-8.0、或约7.5-8.0、或约7.0-9.0、或约7.5和7.8、或约7.5-7.7、或约7.6-7.7、或约6.7-7.7、或约6.8-7.6、或约7.0-7.6、或约7.2-7.6、或约7.3-7.6、或约7.3和7.5。例如，pH可约为5.0、5.1、5.3、5.5、5.7、5.9、6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。
在一个实施方式中，可通过以下方法制备本发明的组合物：混合固体5-FU(15mg)、盐水(0.9％，0.87ml)、氢氧化钠溶液(0.9M，30μL)和环糊精(例如，硫酸化β-环糊精钠盐，每个环糊精残基9-12个硫酸酯基的混合物：45mg)。所得悬浮液在约30-60℃超声直到几乎所有5-FU均溶解。然后加入亚叶酸(例如，亚叶酸钙(1毫克∶10毫克/毫升)在0.9％盐水中的溶液，将混合物在30-60℃超声直到形成均一溶液。超声温度约为30-50，30-40，40-60，40-60或40-50℃，例如约30、35、40、45、50、55或60℃，或者可以高于60℃或低于30℃。
将均一溶液冷却并在室温下静置约1小时。然后将溶液在无菌条件下过滤并避光室温储存。溶液的pH约为7.3-7.5。
在可选的实施方式中，本发明组合物可通过以下方法制备：将环糊精(例如，硫酸化β-环糊精钠盐或2-羟丙基-β-环糊精)溶解在水中，加入5-FU溶液(例如，5-氟尿嘧啶注射BP，50毫克/毫升)和亚叶酸溶液(例如，约200微升10毫克/毫升的溶液)。这样，每毫升制剂使用300微升上述溶液，得到最终浓度15毫克/毫升的5-FU。搅动所得溶液以便于混合。然后在需要时可加入酸(例如HCl)以使pH为7.4±0.1。然后将溶液在无菌条件下过滤并且避光室温储存。
在其他实施方式中，可以去除溶剂并干燥组合物，后续使用时重新悬浮在溶液中。冻干的制剂相对于液体制剂具有一些缺点。冻干制剂可能需要医疗工作者进行广泛超声和额外的制备。
药物组合物及给药方法
通过给予对象治疗有效量的组合物，本发明组合物可用于治疗患者癌症。
尤其适合用本发明组合物和方法治疗的癌症包括：原发性或继发性癌症、例如前列腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、上消化道癌症、原发性肝癌、胰腺癌、胆管癌、结肠-直肠癌(理解为包括结肠癌和肠癌)、胰腺癌、头颈癌、乳腺癌和皮肤癌、例如非黑色素瘤皮肤癌。
在治疗应用中，给予患有癌症的患者组合物，给药量足以治愈、或者至少部分地阻止癌症及其并发症。组合物应提供足以有效治疗癌症的5-FU和亚叶酸。
通常，根据本发明方法使用的合适的组合物可根据本领域普通技术人员已知的方法和工艺进行制备，相应地可包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。稀释剂、佐剂和赋形剂必须是在与组合物其他组分相容性方面“可接受的”并且不对受者有害。
组合物可通过标准途径给予。通常，可静脉内、腹膜内、动脉内或外用给予组合物。组合物也可肌内、皮下或透皮给予(例如，透皮贴片)。给药可以是全身、区域性或局部的。任何给定情况下采用的具体给药途径将取决于许多因素，包括治疗的癌症类型、癌症的严重性和程度、需要递送的5-FU和亚叶酸的剂量以及任何潜在的副作用。
药学上可接受的载体或稀释剂的例子是去除矿物质的水或蒸馏水、BP或USP水、盐水溶液、林格溶液、葡萄糖溶液、基于植物的油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油，如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙基醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉聚糖；黄芪树胶或阿拉伯胶和石油凝胶。通常，一种或多种载体占组合物重量10％-99.9％。
本发明组合物可以是适合注射给药的形式，适合外用的软膏、乳膏或洗剂的形式，或适合静脉内、腹膜内或动脉内注射给药的形式。
对于以可注射溶液或悬浮液形式给药，非毒性胃肠外可接受的稀释剂或载体可包括：林格溶液、等渗盐水、葡萄糖溶液、蒸馏水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1，2丙二醇。
佐剂通常包括：软化剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。
制备胃肠外给药的组合物的方法是本领域技术人员所明白的，更具体的内容例如可参见《雷明登药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Science)，第15版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Company，Easton，Pa.)，其内容被纳入本文作为参考。
外用制剂包含本发明的组合物以及一种或多种可接受的载体，任选地包含任何其他治疗成分。适合外用的制剂包括适合渗透通过皮肤到达需要滞留部位的液体或半液体制剂，例如搽剂、洗剂、乳膏、软膏或糊剂。
本发明的洗剂包括适合应用于皮肤的洗剂。应用于皮肤的洗剂或搽剂也可包含加速皮肤干燥和冷却的试剂，例如纯或丙酮，和/或保湿剂，例如甘油、或油如蓖麻油或花生油。
组合物可包含任何合适的表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，例如去水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。也可包含助悬剂，例如天然树胶，纤维素衍生物或无机物，如胶态二氧化硅(silicaceous silicas)和其他成分如羊毛脂。
对于任何特定患者的治疗有效剂量水平取决于许多因素，包括：治疗的癌症和癌症严重性，患者年龄、体重、健康状况、性别和饮食，给药时间，给药途径，治疗持续时间，与治疗联合或并行使用的药物，以及医学领域公知的其他相关因素。
本领域技术人员能够通过常规实验来确定治疗可应用的疾病或病症所需的药物或化合物的有效、非毒性剂量。
通常，5-FU的有效剂量范围约为0.0001-1000毫克/千克体重/24小时；常常约0.001-750毫克/千克体重/24小时；约0.01-500毫克/千克体重/24小时；约0.1-500毫克/千克体重/24小时；约0.1-250毫克/千克体重/24小时；约1.0-250毫克/千克体重/24小时。更典型地，有效剂量范围约为1.0-200毫克/千克体重/24小时；约1.0-100毫克/千克体重/24小时；约1.0-50毫克/千克体重/24小时；约1.0-25毫克/千克体重/24小时；约5.0-50毫克/千克体重/24小时；约5.0-20毫克/千克体重/24小时；约5.0-15毫克/千克体重/24小时；或约5.0-10.0毫克/千克体重/24小时。
通常，亚叶酸的有效剂量范围约为0.0001-1000毫克/千克体重/24小时；常常约0.001-750毫克/千克体重/24小时；约0.01-500毫克/千克体重/24小时；约0.1-500毫克/千克体重/24小时；约0.1-250毫克/千克体重/24小时；约1.0-250毫克/千克体重/24小时。更典型地，有效剂量范围约为1.0-200毫克/千克体重/24小时；约1.0-100毫克/千克体重/24小时；约1.0-50毫克/千克体重/24小时；约1.0-25毫克/千克体重/24小时；约5.0-50毫克/千克体重/24小时；约5.0-20毫克/千克体重/24小时；约5.0-15毫克/千克体重/24小时。可以是低剂量或高剂量的亚叶酸组合物。
在本发明的组合物中，5-FU和亚叶酸可以是药物有效浓度。5-FU的含量约为1-50毫克/毫升，或约1-40，1-30，1-20，1-10，1-5，5-50，10-50，20-50，5-30，5-20或10-20毫克/毫升，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50毫克/毫升。亚叶酸的含量约为0.01-25毫克/毫升，或约0.01-25，0.1-20，0.1-15，0.1-10，0.1-5，0.1-2，0.1-1，1-25，5-25，10-25，15-25，1-15，1-10，1-5，0.5-5，0.5-2，5-20，5-10或10-20毫克/毫升，例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25毫克/毫升。CD的含量约为1-300毫克/毫升，或约1-250，1-200，1-150，1-100，1-50，1-20，1-10，5-300，5-250，5-200，5-150，5-100，5-50，5-20，5-10，10-300，20-300，30-300，40-300，50-300，100-300，200-300，50-200，5-100，45-125，25-100，50-100，或100-200毫克/毫升，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250或300毫克/毫升。
通常，在治疗应用中，治疗可用于癌症持续治疗。
而且，本领域普通技术人员应理解，最佳剂量和每次给药的间隔将根据所治疗的癌症的性质和程度、给药形式、途径和部位、以及治疗的具体对象的性质来确定。并且，这种最佳条件下可通过常规技术进行确定。
本领域普通技术人员应理解，采用常规治疗时程确定实验本领域技术人员能够确定最佳治疗时程，例如每天给予的组合物的剂量数，持续限定的天数。
本领域技术人员应理解，根据本发明的方法，可单独给予或与一种或多种作为联合疗法的一部分的其他药物联合给予本发明的组合物。例如，本发明组合物可与一种或多种能够减少细胞增殖和侵入并提高癌症凋亡的其他化合物一起给予。
对于这种联合疗法，联合疗法中的每一种组分可以同时或在不同时间以任意顺序相继给予，以提供所需的效果。单独给予时，优选通过相同给药途径给予各组分，虽然不一定要这样做。
联合方案
治疗优势可通过联合方案来实现。在联合疗法中，各药物同时或以任何实现相继给予。因此，本发明的治疗方法可与常规疗法如放疗、化疗、外科手术或其他形式的医疗干预联用。
现在将参照具体实施例来描述本发明，这些实施例不应以任何方式解释为限定本发明的范围。
实施例
实施例1-组合物的制备
1.1从固体5-氟尿嘧啶制备组合物(FD2方法)。
制备1mL组合物：混合5-FU(15mg)，0.9％盐水(870μL)，NaOH(30μL，0.9M)和硫酸化β-环糊精钠盐(45mg)，将该悬浮液在40-50℃超声直到几乎所有5-FU均溶解。加入亚叶酸溶液(甲酰四氢叶酸钙10mg/mL，100μL)，将该混合物在40-50℃超声直到形成均一溶液。使混合物冷却并在室温下静置1小时。溶液的pH为7.4±0.1。将溶液在无菌条件下过滤并避光室温储存。该组合物称为FD1。采用该方法但将硫酸化β-环糊精钠盐的浓度增加至175mg/mL则产生称为FD2的组合物。
1.2从5-氟尿嘧啶溶液制备组合物(FD4方法)。
制备1mL组合物：将硫酸化β-环糊精钠盐(45mg)溶解于水(525μL)。将5-FU溶液(5-氟尿嘧啶注射BP，50mg/mL，300μL)和100μL亚叶酸溶液(甲酰四氢叶酸钙10mg/mL)加入环糊精溶液，搅动至混合。将HCl(75μL1.000M的溶液)加入溶液中以使pH为7.4±0.1。将溶液在无菌条件下过滤并避光室温储存。该组合物称为FD45c。
1.3从5-氟尿嘧啶溶液制备组合物(FD4方法)。
制备1mL组合物：将(2-羟丙基)-β-环糊精(100mg)溶于水(527μL)。将5-FU溶液(5-氟尿嘧啶注射BP，50mg/mL，300μL)和100μL亚叶酸溶液(甲酰四氢叶酸钙10mg/mL)加入环糊精溶液，搅动至混合。将HCl(73μL 1.000M的溶液)加入溶液中以使pH为7.4±0.1。将溶液在无菌条件下过滤并避光室温储存。该组合物被称为FD100HPc。
1.4从5-氟尿嘧啶溶液制备组合物(FD4方法)。
制备1mL组合物：将七(6-O-磺基)-β-环糊精钠盐(50mg)溶于水(527μL)。将5-FU溶液(5-氟尿嘧啶注射BP，50mg/mL，300μL)和100μL亚叶酸溶液(甲酰四氢叶酸钙10mg/mL)加入搅动混合的环糊精溶液中。将HCl(73μL 1.000M的溶液)加入溶液中以使pH为7.4±0.1。将溶液在无菌条件下过滤并避光室温储存。该组合物被称为FD50-7Sc。
实施例2-组合物的初步稳定性研究
在三周时间内进行组合物稳定性的初步评价。采用上述FD2方法制备测试样品并在室温储存。已知5-FU光敏感，因而样品避光保存。采用相等浓度的5-FU的盐水(0.9％)溶液作为对照，在设定的时间间隔监测样品，观察分解迹象。监测溶液的方法是物理外观(固体形成等)、pH和UV-VIS吸收光谱(266nm)。将5-FU溶液升温并进行超声处理以使析出的任何固体5-FU溶解，然后再读取pH和吸光度数值。
结果
1.组合物物理外观无变化，仍然是澄清，几乎无色的溶液。
2.组合物或5-FU的pH随时间无显著性变化(参见图1)。
3.由测试溶液的系列稀释得到样品的UV-VIS吸光度测定结果。这可解释吸光度读数的微小偏差(图2)。组合物或5-FU在A266的吸光度未发现随时间的总体变化趋势。
实施例3-组合物
可注射的胃肠外组合物
可通过以下方法制备适合注射给药的药物组合物：将1-5重量％本发明组合物混入10体积％的丙二醇和水中。溶液过滤除菌。组合物的总量在患者与患者之间存在差异，虽然一般剂量可能约为750mg 5-FU，即50mL制剂，可用5％葡萄糖、0.9％盐水或无菌水稀释至体积100、500或1000mL。
胃肠外给药的组合物
可制备肌内注射的组合物，包含1mL无菌缓冲的水和1mL本发明的组合物。
类似地，静脉内输注的组合物可包含250ml无菌林格溶液和5mL本发明的组合物。
可注射的胃肠外组合物
适合注射给药的组合物可通过以下方法制备：混合1重量％的本发明组合物与一定体积百分比的丙二醇和水。该溶液过滤除菌。
实施例4-体外细胞毒性
采用三种不同的本发明组合物(FD45c，FD50-7Sc和FD100HPc)，在5种不同的癌细胞系中(MDA-MB-231，HCT-116，COLO-201，PC-3和PC-14)进行体外细胞毒性试验。MDA-MB-231是乳腺癌细胞系，HCT-116和COLO-201是结肠癌细胞系，PC-3是前列腺癌细胞系，PC-14是非小细胞肺癌细胞系。
每种组合物中5-FU和FA的水平保持恒定。为了比较，采用5-FU和FA的组合(5-FU∶FA)以及单用5-FU进行试验。所有细胞系中IC50值的总结列于下表1中，用于产生这些IC50值的代表性的剂量-效应曲线示于图3中。这些结果通过双向ANOVA(GraphPad)进行分析，比较不同细胞系和不同治疗对IC50值的影响。
各细胞系之间对5-FU的总体敏感性显著不同(P＜0.0001)。PC-3细胞最敏感，然后是HCT-116、MDA-MB-231、PC-14和COLO-201细胞。并且，在COLO-201和PC-14细胞中，5-FU∶FA的效力显著高于5-FU(P＝0.0084)。所有细胞系中，每种组合物FD45c、FD50-7Sc和FD100HPc均显示相当于5-FU∶FA的体外细胞毒性(P＞0.05，通过Bonferroni后检验比较所有治疗与5-FU∶FA，GraphPad)。
Figure G2008800122995D00201
实施例5-体内单剂量耐受性
本发明组合物的体外评价表明，5-FU、5-FU∶FA和5-FU/β-CD对抗乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和结肠直肠癌细胞(HCT-116)具有类似的IC50值。因此，进行体内毒理学评价。采用剂量逐步升高的方案，将含有等摩尔质量5-FU和FA的本发明组合物的剂量耐受性与5-FU∶FA和PBS对照小鼠进行比较。4-5周龄的雌性Balb/c小鼠得自ARC(WA，澳大利亚)。腹腔注射不超过200μL的剂量。治疗后5天对动物进行称重，然后每周两次进行称重，直到观察阶段结束(治疗后21天)。终点限定为从治疗日开始体重持续减轻15％或其他不良征兆。图4显示了与5-FU∶FA相比，本发明组合物的单剂量毒性。
实施例6-分次的多剂量耐受性
采用剂量逐步升高的方案，将包含等摩尔质量比5-FU和FA的本发明组合物的剂量耐受性与5-FU∶FA和PBS对照小鼠进行比较。4-5周龄的雌性Balb/c小鼠得自ARC(WA，澳大利亚)。腹腔注射不超过200μL的剂量。14天内给予5个剂量(在图5中以箭头表示)。给药期间每天以及在最后一次给药后5天对动物进行称重，然后每周两次进行称重，直到观察阶段结束(最后一次治疗后21天)。终点限定为从第一次治疗开始体重持续减轻15％或其他痛苦迹象。当六只小鼠中有2只小鼠达到给终点时处死各组小鼠(n＝6)。图5显示了与5-FU∶FA相比，FD1的多剂量毒性。
实施例7-功效I
3-4周龄的雌性Balb/c裸小鼠得自ARC(WA，澳大利亚)。将2百万个MDA-MB-231细胞(约100μL)单次皮下注射接种到小鼠的乳房脂肪垫中。异种移植物生长10天后，可见肿瘤形成。然后用剂量40mg/kg×5(14天内)腹腔注射处理小鼠。对于5-FU∶FA组，首先给予小鼠FA，然后直接注射5-FU。用测径器在外部测量小鼠肿瘤，根据体积＝a×b2/2计算肿瘤体积，其中a和b分别是最长和最短直径。终点限定为肿瘤大小为15×15mm，或者移动受阻、或持续15％重量损失或痛苦行为。图6显示了与5-FU∶FA相比，本发明组合物对抗MDA-MB-231异种移植物的功效：(A)肿瘤生长：将含有等摩尔量的5-FU和FA的本发明组合物(FD2)的剂量效应与5-FU∶FA和PBS对照小鼠组进行比较，组大小为n＝10，线表示均值±SEM。星号表示相对于对照的显著差异(p＜0.05)(*)本发明组合物，(**)5-FU∶FA；(B)处死时的肿瘤重量：处死时的肿瘤重量。数值表示均值±SEM，n＝10。星号表示相对于对照的显著性差异(p＜0.05)。
实施例8-功效II
每部位2百万个MDA-MB-231细胞皮下接种到4-5周龄雌性无胸腺裸小鼠的乳房脂肪垫中，诱导乳腺肿瘤。2周后，绝大多数接种部位观察到可触知的肿瘤。乳腺癌接种后三周，给予小鼠先前确定的临床相关剂量的FD100HPc组合物或不含环糊精的5-FU∶FA。每组由10只小鼠组成，以便进行统计学分析。每只小鼠进行常规监测，存活终点限定为与第0天相比持续(＞1，≤3)15％体重减轻，或痛苦的行为(例如，活动缺失、无进食或无饮水)，或者直到肿瘤直径大于＞15mm。所有动物的监测不超过3个月。接受FD100HPC制剂的小鼠的平均肿瘤体积为750mm3±72mm3(n＝8)，而接受不含环糊精的5-FU∶FA的小鼠的体积为830±101mm3(n＝9)。还发现，各处理组均没有与细胞毒性相关的体重下降。

Claims (19)

1.一种用于治疗或预防癌症的组合物，所述组合物包含：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物；
(ii)亚叶酸或其药学上可接受的盐；和
(iii)环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH约为5-9。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述环糊精或其盐或衍生物的含量约为10-300mg/mL。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述5-FU或其盐或类似物的含量约为5-50mg/L。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述亚叶酸或其盐的含量约为1-15mg/mL。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述环糊精或药学上可接受的盐或衍生物与5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物的摩尔比约为1∶10-3∶1。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，所述组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
8.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，所述组合物包含水性载体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，所述组合物是水性溶液的形式。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其特征在于，所述亚叶酸的药学上可接受的盐是亚叶酸钙或亚叶酸钠。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其特征在于，所述环糊精选自：羟烷基环糊精、硫酸化环糊精和磺基烷基醚环糊精，或它们的盐。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述环糊精是β-环糊精或其盐。
13.一种制备用于预防和/或治疗癌症的组合物的方法，所述方法包括组合以下成分：
(i)5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物；
(ii)亚叶酸或其药学上可接受的盐；和
(iii)环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物。
14.如权利要求13所述的方法，所述方法包括组合(i)和(iii)，然后加入(ii)。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，(ii)以水性溶液的形式加入。
16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，在水性溶剂的存在下进行组合(i)和(iii)的步骤以形成水性溶液。
17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，所述方法还包括对组合物进行灭菌。
18.一种由如权利要求13-17中任一项所述方法制备的用于治疗或预防癌症的组合物。
19.5-氟尿嘧啶(5-FU)或其药学上可接受的盐或类似物、亚叶酸或其药学上可接受的盐以及环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物在制造用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
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