CN101655452B

CN101655452B - 蔗糖密度梯度紫外光定量法检测口蹄疫抗原146s含量的方法

Info

Publication number: CN101655452B
Application number: CN2009100927793A
Authority: CN
Inventors: 卢永干; 王伟峰; 刘玉梅
Original assignee: Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-09-24
Filing date: 2009-09-24
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2029-09-24
Also published as: CN101655452A

Abstract

本发明提供了蔗糖密度梯度紫外光定量法检测口蹄疫抗原146S含量的方法，先对待测病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度超速离心，再用紫外光分光光度计对各个级份连续测定OD_259nm值；然后计算被检测样品OD值峰面积，根据公式：

Description

蔗糖密度梯度紫外光定量法检测口蹄疫抗原146S含量的方法

技术领域

本发明涉及一种定量检测口蹄疫抗原146S含量的方法，具体来讲，涉及蔗糖密度梯度紫外光定量法检测口蹄疫抗原146S含量的方法。

背景技术

目前已经应用或有报道的口蹄疫抗原定量检测技术主要有：1.乳鼠半数致死量(LD50)测定口蹄疫病毒抗原含量，例如，选取2～3日龄乳鼠，将口蹄疫病毒抗原做10倍系列稀释，每个滴度按每只0.2ml的量颈背部皮下注射4只乳鼠，根据乳鼠发病死亡情况最终计算出病毒抗原含量；2.细胞半数感染量(TCID50)测定口蹄疫病毒抗原含量，例如，将病毒在96孔平底培养板上作10倍连续稀释，每孔病毒液的量为50ml，再加入100ml细胞悬液，置于37℃、5％的二氧化碳温箱中培养，72小时根据细胞病变情况计算病毒抗原含量；3.补体结合试验(CFT)定量口蹄疫病毒抗原含量，其原理是根据病毒抗原与血清抗体发生特异反应形成复合物时，加入的补体因子结合于该复合物而被消耗，溶血系统中没有游离补体将不发生溶血，试验显示阳性，将病毒做适当的连续稀释，根据最终阳性显示结果从而定量病毒抗原含量；4.间接夹心ELISA检测口蹄疫病毒抗原含量，即将口蹄疫病毒抗原做连续系列稀释，加入已包被口蹄疫特异性多克隆捕获抗体的ELISA板孔中，被捕获的抗原又与随后加入的特异性多克隆检测抗体反应，形成夹心式结合，通过酶促反应系统显色情况，结合已得出的线性回归方程计算出被检测病毒抗原的含量；5.单克隆抗体夹心ELISA定量口蹄疫完整病毒粒子，即筛选出针对口蹄疫病毒146S特异位点的单克隆抗体包被ELISA板，加入被检测的病毒抗原，随后再加入针对146S特异位点的单克隆抗体的酶促反应系统，根据最后的显色情况，应用图解法定量病毒抗原的146S含量。口蹄疫抗原146S是口蹄疫疫苗最主要的抗原成分，口蹄疫抗原146S的含量反映了口蹄疫疫苗的质量。方法1和方法2是对病毒核酸进行检测，不仅能测定完整病毒粒子的核酸，还能测定146S裂解产物的核酸，不能反应病毒的免疫原；方法3由于受到前补体和抗补体因子的干扰，检测的准确性与敏感性均受到制约，而且也不能很好的区分12S和146S；方法4存在的主要问题也是不能很好的区分12S和146S；方法5虽能够很好的区分12S和146S，但对不同型的病毒，该方法必须筛选出各自的单克隆抗体，建立各自独立的ELISA检测和计算系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较好的重复性和适用性，可用于各种口蹄疫病毒146S含量的准确定量测定的方法。

基于上述目的，本发明提供了蔗糖密度梯度紫外光定量法检测口蹄疫抗原146S含量的方法，包括以下步骤：

(1)预处理病毒液除去杂蛋白；

(2)超速离心病毒液，用PBS液重悬至原体积的1/8～1/12，得到病毒浓缩液，置于2～8℃冰箱中备用；

(3)制备15％～45％均匀线性蔗糖梯度；

(4)利用制备的15％～45％均匀线性蔗糖梯度对所述病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度超速离心；

(5)弃掉梯度顶部1～2ml液体，将连接在连续流紫外分光光度计流动样品池上进样端的长针头缓慢插入待检各管样品的管底，按照连续流紫外分光光度计的操作程序，对每管样品泵入流动样品池的各个级份进行连续不间断测定OD_259nm值；

(6)计算被检测样品OD值峰面积，根据下列公式：

\frac{FR \times PA \times FSD \times 1000}{S \times PL \times E \times W}

计算出病毒液中146S的含量，其中：FR是蔗糖通过样品池的流速，这可以通过联接分光光度计的电脑在其软件系统中自行设定；PA是OD值峰面积，是紫外分光光度计对样品OD值连续扫描所形成曲线的峰面积；S是紫外分光光度计对样品OD值连续扫描的速度；FSD是紫外分光光度计吸光度单位，可自行选择设定；PL是紫外分光光度计所使用流动样品池的光程长度，可以选择0.1cm，0.2cm，0.5cm，1cm；W是加在梯度上的样品原始重量或体积；E为校正系数，为任选的正数。

这种情况下测得的数值为146S的相对含量，所以E可以为任意选取的正数，又因为所测得的146S的相对含量与绝对含量有线性关系(具体实施例部分将有进一步论述)，所以对疫苗的配制具有指导意义。

为了使测得的数值便于应用，可以做如下设定：FR为单位时间的体积流量，W是加在梯度上的样品原始体积，或者FR为单位时间的重量流量，W是加在梯度上的样品原始重量；E＝76。E＝76是一个经验值，根据该设定计算出的146S的含量的单位为μg/ml。

较佳地，步骤(1)中，预处理病毒液除去杂蛋白的方法为：将待检病毒液样品按照其体积2％～10％的量加入氯仿或三氯乙烯，将病毒液与有机溶剂充分乳化混匀5～10分钟后，采用3000～4000rpm离心5～15分钟，取上清病毒液。

较佳地，步骤(2)中，超速离心的转速为30000～40000rpm，离心时间为1.5～2.5小时。

较佳地，步骤(3)中，制备15％～45％均匀线性蔗糖梯度的方法为：用0.04mol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCl pH7.6～8.0的PBS缓冲液配制15％和45％的蔗糖溶液，用蔗糖密度梯度生成仪制备15％～45％均匀线性蔗糖梯度。

较佳地，步骤(4)中，超速离心为8～12℃下30000～40000rpm离心2.5～3小时。

此项检测技术解决了当前检测口蹄疫病毒抗原含量的方法存在的特异性、重复性不好问题。具有很好的特异性，它只检测病毒液中口蹄疫完整核衣壳蛋白粒子146S，而不检测病毒空衣壳75S抗原、病毒裂解后产生的亚单位12S抗原和核酸；具有很好的重复性，经统计学分析，实验内标准偏差及实验间标准偏差均不超过0.1μg/ml；具有广泛的适用性，该方法既能测定活病毒的146S含量，又能测定灭活病毒的146S含量；具有很好的通用性，该方法适用于口蹄疫任何型及亚型的检测。

具体实施方式

实施例一

其检测过程如下：

1.取大生产中贴壁或悬浮活病毒及灭活病毒抗原(例如a样品为猪O型OZK活毒，b样品为牛O型JMS活毒，c样品为牛O型JMS灭活毒，d样品为牛Asia-1型JSL活毒，e样品为牛Asia-1型JSL灭活毒)，对样品分别用有机溶剂(a，b，c用氯仿，d，e用三氯乙烯)进行预处理，有机溶剂的加入的体积量为样品的体积的5％，将病毒液与有机溶剂充分乳化混匀8分钟，采用3500rpm，离心10分钟，取上清病毒液；

2.病毒液浓缩：超速离心病毒液，用PBS液重悬至原体积的1/10，得到病毒浓缩液，置于2～8℃冰箱中备用；

3.制备15％～45％蔗糖梯度：用0.04mol/L磷酸盐，0.15mol/L Nacl pH7.6～8.0的PBS缓冲液制备6管15％～45％均匀线性蔗糖梯度；

4.蔗糖密度梯度超速离心：对加至15％～45％均匀线性蔗糖梯度顶部的5管浓缩病毒液及1管空白对照35,000rpm，10℃，超速离心3小时；

5.连续流紫外分光光度计定量检测：离必结束后，弃掉梯度顶部1～2ml液体，将连接在连续流紫外分光光度计流动样品池上进样端的长针头缓慢插入待检5管样品的管底，按照连续流紫外分光光度计的操作程序，对每管样品泵入流动样品池的各个级份进行连续不间断测定OD_259nm值；

6.计算146S含量：分别计算5个被检测样品OD值峰面积，根据下列公式：

\frac{FR \times PA \times FSD \times 1000}{S \times PL \times E \times W}

计算出病毒液中146S的含量。

检测时，所用连续流紫外分光光度计的比色皿的光程长度为0.5cm，E的经验值＝76，加在梯度上的样品的原始体积为10ml，设定FR为1ml/min，FSD为0.5，S为1cm/min，检测a样品的PA为3.19cm²，则推算出其146S含量为4.2μg/ml；检测b样品的PA为2.89cm²，则推算出其146S含量为3.8μg/ml；检测c样品的PA为1.98cm²，则推算出其146S含量为2.6μg/ml；检测d样品的PA为4.78cm²，则推算出其146S含量为6.3μg/ml；检测e样品的PA为3.72cm²，则推算出其146S含量为4.9μg/ml。

从上述检测结果可以看出，该方法具有广泛的适用性，既能测定活病毒的146S含量，又能测定灭活病毒的146S含量；同时具有很好的通用性，即适用于口蹄疫任何型及亚型的检测。

实施例二

PD₅₀试验的方法在<OIE陆栖动物诊断试验和疫苗手册>中有所描述，是公认的疫苗效力检验方法。用本发明的方法(用氯仿对样品进行预处理，其它步骤与实施例一相同)及PD_5o的方法对下表中各同样的灭活抗原液分别进行检测，结果如下：

样品	本发明方法测得的146S含量(μg/ml)	半数保护(PD_5o)值
			牛O型JMS灭活抗原液1	0.55	9.1
牛O型JMS灭活抗原液2	0.87	13.2
			牛O型JMS灭活抗原液3	0.34	5.8
牛Asia-1型JSL灭活抗原液1	0.98	12.4
			牛Asia-1型JSL灭活抗原液2	0.56	7.3
牛Asia-1型JSL灭活抗原液3	0.32	4.1

将本发明方法测得的146S含量设为x，将半数保护(PD₅₀)值设为y，经过统计分析，有如下线性关系：牛O型JMS株的线性关系方程为y＝1.94x+1.58；牛Asia-1型JSL株的线性关系方程为y＝2.07x+1.1。

本发明方法测得的146S含量x与半数保护(PD₅₀)值y具有线性关系，从而说明本发明的方法能够准确地测定146S的相对含量(相当于含量指数)，从而对疫苗的配制具有指导意义。

Claims

1.蔗糖密度梯度紫外光定量法检测口蹄疫抗原146S含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)预处理病毒液除去杂蛋白；

(3)制备15％～45％均匀线性蔗糖梯度；

(5)弃掉梯度顶部1～2ml液体，将连接在连续流紫外分光光度计流动样品池上进样端的长针头缓慢插入待检各管样品的管底，按照连续流紫外分光光度计的操作程序，对每管样品泵入流动样品池的各个级份进行连续测定OD_259nm值；

(6)计算被检测样品OD值峰面积，根据下列公式：

\frac{FR \times PA \times FSD \times 1000}{S \times PL \times E \times W},

计算出病毒液中146S的含量，其中，FR是蔗糖通过样品池的单位时间的体积流量，W是加在梯度上的样品原始体积；或者FR是蔗糖通过样品池的单位时间的重量流量，W是加在梯度上的样品原始重量；PA是峰面积；FSD是吸光度单位；S是速度；PL是流动样品池的光程长度；E为校正系数，E＝76；

步骤(1)中，预处理病毒液除去杂蛋白的方法为：将待检病毒液样品按照其体积2％～10％的量加入氯仿或三氯乙烯，将病毒液与有机溶剂充分乳化混匀5～10分钟后，采用3000～4000rpm离心5～15分钟，取上清病毒液；

步骤(2)中，超速离心的转速为30000～40000rpm，离心时间为1.5～2.5小时；

步骤(3)中，制备15％～45％均匀线性蔗糖梯度的方法为：用0.04mol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCl pH7.6～8.0的PBS缓冲液配制15％和45％的蔗糖溶液，用蔗糖密度梯度生成仪制备15％～45％均匀线性蔗糖梯度；

步骤(4)中，超速离心为8～12℃下30000～40000rpm离心2.5～3小时。