CN101631874B - 用于检测和/或鉴别细菌的介质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测介质，其包含：特异于一革兰氏阴性菌菌群的代谢活性的底物；β-葡糖苷酶或纤维二糖糖苷酶底物；β-葡糖苷酶或纤维二糖糖苷酶诱导剂，所述诱导剂是由在β-位置与葡萄糖相连的碳水化合物组成的碳水化合物，或者具有β-葡糖苷亚基的碳水化合物，优选选自纤维二糖、纤维素、淀粉、纤维三糖和海藻糖。

Description

用于检测和/或鉴别细菌的介质
本发明领域涉及微生物生物化学分析领域，特别涉及细菌的检测与鉴别。
病原性细菌、特别是革兰氏阴性菌如肠杆菌(entérobactéries)、弧菌(Vibrionaceae)或者假单胞菌(Pseudomonas)与每年的许多疾病、流行病等相关。
假单胞菌是遍在细菌，存在于土壤中、植物上，特别是在淡水和海水中。许多菌株可以在低温下生长，因此污染冰箱中贮存的食物，并且与胃肠道感染相关。它们也与医院内感染相关。
通常在临床细菌学中分离的肠杆菌属于柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。
大肠杆菌(E.coli)是主要存在于消化道中的需氧菌。然而，水中存在该细菌表示粪便污染，而且某些菌株是病原性的并导致腹膜、胆、阑尾或者生殖器化脓。
沙门氏菌属细菌是脊椎动物和鸟类的肠道寄生物并且通过污染的食物传播至人。然后导致胃肠炎和伤寒以及副伤寒。
最后柠檬酸杆菌如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)是人和动物消化道的共生菌，其可以分离自尿液、呼吸道分泌物或者甚至从血液中分离，并且与免疫抑制个体中的感染相关。
对于这些革兰氏阴性菌的早期和特异性检测使得可以提供在治疗方面消除污染的合适溶液等。
现有许多检测革兰氏阴性菌的介质。这种检测可特别基于使用对希望检测的细菌的代谢活性如酶活性是特异的特定底物：通过选择底物，根据是否有反应而可以鉴定微生物的性质。
可特别提及的是UriSelect 4介质(Bio-Rad)，其使用β-半乳糖苷酶底物组合β-葡糖苷酶底物并且组合检测色氨酸酶以检测大肠杆菌菌株以及分离β-半乳糖苷酶阳性/β-葡糖苷酶阴性柠檬酸杆菌属菌株。
也可提及的是UTI介质(oxoid)，其使用β-半乳糖苷酶底物组合β-葡糖苷酶底物并且组合检测色氨酸酶以检测大肠杆菌菌株以及分离β-半乳糖苷酶阳性/β-葡糖苷酶阴性柠檬酸杆菌属菌株。
CPS ID 3介质(bioMérieux)使用β-葡糖醛酸糖苷酶底物组合β-葡糖苷酶底物，任选组合检测色氨酸酶以检测大肠杆菌菌株。
BBL CHROMagar Orientation介质(Becton-Dickinson)使用β-半乳糖苷酶底物组合β-葡糖苷酶底物并且组合检测色氨酸酶以检测大肠杆菌菌株以及分离β-半乳糖苷酶阳性/β-葡糖苷酶阴性柠檬酸杆菌属菌株。
最后，Urine Specific Agar介质(AES Laboratoire)使用β-葡糖醛酸糖苷酶底物组合检测色氨酸酶以检测大肠杆菌菌株，并将其与柠檬酸杆菌属菌株区分。
然而，使用β-葡糖醛酸糖苷酶底物检测大肠杆菌的显色介质呈现极佳的特异性，但是由于不表达这种活性的少部分(5-10％)大肠杆菌菌株的存在而导致灵敏性不佳。此外，一些柠檬酸杆菌属菌株也可产生β-葡糖醛酸糖苷酶阳性菌落，具有与大肠杆菌相同的颜色。
对于使用β-半乳糖苷酶底物检测大肠杆菌的显色介质，需要通过进行区分大肠杆菌与其它表达β-半乳糖苷酶活性、但不表达或者微弱表达β-葡糖苷酶活性的肠杆菌特别是某些柠檬酸杆菌属菌株的额外检测证实鉴定结果。
关于沙门氏菌属的检测，可以提及的是SM ID介质，其使用葡糖醛酸和β-半乳糖苷酶底物。然而，需要进行生物化学和/或血清学证实以检测沙门氏菌属菌株并将其与其它肠杆菌特别是柠檬酸杆菌属菌株加以区分。
最后，关于假单胞菌属，可以提及的是Cetrimide介质，其使用Cetrimide并且通过检测绿脓菌素以检测铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株，并将其与其它革兰氏阴性菌区分。然而，这种介质特异性方面的改良将会具有优势。
本发明计划通过提供新的介质解决现有技术中存在的问题，所述新的介质特别适于快速且廉价以及以易于执行的方式鉴别革兰氏阴性菌。
令人惊奇地，本发明人揭示了包含代谢活性底物与诱导剂的特定组合的介质使得可以快速且便利地检测革兰氏阴性菌。更特别地，本发明人特别揭示了碳水化合物、特别是纤维二糖对β-葡糖苷酶的诱导，使得可以减少产生与大肠杆菌相同颜色的菌落的柠檬酸杆菌属菌株的数目，从而可以极佳地分离这两种菌种。
在进行本发明之前，提供如下定义以便于理解本发明。
术语检测介质是指包含微生物存活和/或生长所需的所有元素的介质。这种检测介质可以仅作为检测介质，或者作为培养和检测介质。在第一种情况中，微生物的培养在接种之前进行；在第二种情况中，检测介质也组成培养介质。本发明的培养介质可含有其它可能的添加剂，例如：胨或者组织提取物，一或多种生长因子，碳水化合物，一或多种选择剂，缓冲液，一或多种胶凝剂等。这种培养介质可以是液体形式或者易于使用的凝胶，即易于接种在试管或烧瓶中或者培养皿上。
对于本发明，检测可以在液体介质中、条带(strip)上或者另一种固体支持物上进行。
术语革兰氏阴性菌是指在通过革兰氏染色法染色期间不保持结晶紫色而呈现粉红色的细菌菌群。
这种革兰氏阴性菌群可特别包含或者特别由肠杆菌属、沙门氏菌属、铜绿假单胞菌组成。
作为革兰氏阴性菌，可以特别提及的是肠杆菌科，弧菌科如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，或者假单胞菌，特别是铜绿假单胞菌。
作为肠杆菌，可以特别提及的是如下属：Alishewanella；Alterococcus；Aquimonas；Aranicola；杀雄菌属(Arsenophonus)；Azotivirga；Blochmannia(candidatus)；Brenneria；巴克纳氏菌属(Buchnera)；布戴约维采菌属(Budvicia)；布丘氏菌属(Buttiauxella)；鞘杆菌属(Calymmatobacterium)；西地西菌属(Cedecea)；柠檬酸杆菌属；Dickeya；爱德华氏菌属(Edwardsiella)；肠杆菌属；欧文氏菌属(Erwinia)，例如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)；埃希氏菌属，例如大肠杆菌；爱文氏菌属(Ewingella)；Grimontella；哈夫尼菌属；克雷伯氏菌属，例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)；克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)；勒克氏菌属(Leclercia)；勒米诺氏菌属(Leminorella)；莱文氏菌属(Levinea)；米勒氏菌属(Moellerella)；摩根氏菌属；肥杆菌属(Obesumbacterium)；泛菌属(Pantoea)；果胶杆菌属(Pectobacterium)；Phlomobacter(candidatus)；光杆状菌属(Photorhabdus)；邻单胞菌属(Plesiomonas)，例如类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)；布拉格菌属(Pragia)；变形杆菌属，例如普通变形杆菌(Proteus vulgaris)；普罗威登斯菌属；拉恩氏菌属(Rahnella)；Raoultella ；糖杆菌属(Saccharobacter)；沙门氏菌属；Samsonia；沙雷氏菌属，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；志贺氏菌属；Sodalis；塔特姆氏菌属(Tatumella)；Thorsellia，特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)；Wigglesworthia；致病杆菌属(Xenorhabdus)；耶尔森氏菌属，例如鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)；预研菌属(Yokenella)。
术语包含柠檬酸杆菌的菌群是指包含属于柠檬酸杆菌属的细菌的菌群。这个菌群也包含其它种。因此，优选的包含柠檬酸杆菌的菌群是包含或者由柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属和沙雷氏菌属细菌组成的菌群(也称作KESC菌群)。
术语底物是指由于微生物的酶或者代谢活性而能直接或者间接产生可检测信号的任何分子。
所述底物可以特别是与指示剂偶联的代谢底物如碳源或者氮源，所述指示剂在存在代谢产物之一的条件下产生颜色。
所述底物也可以是酶底物，即可以被酶水解产生能直接或者间接检测微生物的产物的底物。这种底物可以特别包含第一部分和第二部分，所述第一部分对要被揭示的酶活性是特异的，所述第二部分作为标记，在后文称作标记部分。这个标记部分可以是生色的、荧光的、发光的等。作为适于固体支持物(滤膜、琼脂、电泳凝胶)的生色底物，可以提及的是基于吲哚酚及其衍生物的底物，以及基于羟基喹啉或者七叶亭及其衍生物的底物，其可以检测osidase和酯酶活性。还可以提及的是基于硝基酚和硝基苯胺及衍生物的底物，其用于在基于硝基酚的底物的情况中检测osidase和酯酶活性，以及在基于硝基苯胺的底物的情况中检测肽酶活性。最后，可以提及的是基于萘酚和萘胺及其衍生物的底物，其可以通过萘酚检测osidase和酯酶活性，以及通过萘胺检测肽酶活性。这种底物可以特别地但以非限制性的方式使得可以检测酶活性如osidase、肽酶、酯酶等的活性。酶底物也可以是天然底物，其水解产物可以被直接或者间接检测。作为天然底物，可以特别提及的是色氨酸，用以检测色氨酸酶或者脱氨酶活性；环形氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、酪氨酸)，用以检测脱氨酶活性；磷脂酰肌醇，用以检测磷脂酶活性等。
根据本发明，所述底物优选选自基于如下成分的底物：吲哚酚(3-吲哚酚、5-溴-3-吲哚酚、4-氯-3-吲哚酚、5-碘代-3-吲哚酚、5-溴-4-氯-3-吲哚酚、5-溴-6-氯-3-吲哚酚、6-溴-3-吲哚酚、6-氯-3-吲哚酚、6-氟-3-吲哚酚、5-溴-4-氯-N-甲基-3-吲哚酚、N-甲基-3-吲哚酚等)；伞形酮(4-甲基伞形酮、环己并七叶亭(cyclohexenoesculetin)等)；茜素；对萘酚基苯甲醇；硝基酚(正硝基酚、对硝基酚等)；萘酚(α-萘酚、2-萘酚、萘酚-ASBI等)；氨基苯酚(对氨基苯酚、二氯氨基苯酚等)；羟基喹啉；邻苯二酚(邻苯二酚、二羟基黄酮、羟基黄酮等)；试卤灵；氯酚红；荧光素；氨基香豆素(7-氨基-4-甲基-香豆素等)；萘胺；吖啶(氨基苯基吖啶)；或者氨基吩噁嗪(aminobenzophenoxazinone、氨基戊基试卤灵等)。
术语代谢活性是指在细菌中发生的化学反应的总称。这些化学反应可以与一或多种酶活性、与分子的降解、合成或者修饰关联。
短语革兰氏阴性菌菌群特异性代谢活性是指由该革兰氏阴性菌群优先产生的代谢活性。
对于包含或者由大肠杆菌组成的菌群而言，可以特别提及的是β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、乳糖的酸化、色氨酸酶、β-核糖苷酶(β-ribosidase)、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶以及L-亮氨酸氨肽酶。优选所述代谢活性是β-葡糖醛酸糖苷酶或者β-半乳糖苷酶。
用于检测β-葡糖醛酸糖苷酶活性的底物可以特别是4-甲基伞形基-β-葡糖苷酸(4-Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸、6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸、茜素-β-葡糖苷酸或者环己并七叶亭-β-葡糖苷酸或者其盐，浓度优选在10至1000mg/l之间。
用于检测β-半乳糖苷酶活性的底物可以特别是4-甲基伞形基-β-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷、茜素-β-半乳糖苷或者环己并七叶亭-β-半乳糖苷或者其盐，浓度优选在10至1000mg/l之间。
对于包含或者由沙门氏菌组成的菌群而言，也可以提及的是α-半乳糖苷酶、酯酶、葡糖醛酸盐/酯(glucuronate)的酸化、山梨糖醇、丙二醇、蜜二糖和甘露醇。作为α-半乳糖苷酶底物，可以提及的是4-甲基伞形基-α-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-α-半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-α-半乳糖苷、茜素-α-半乳糖苷或者硝基苯基-α-半乳糖苷，浓度在10至1000mg/l之间。
在酯酶底物中，可以提及的是4-甲基伞形基辛酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚酚辛酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚酚壬酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚酚辛酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚酚己酸酯、6-氯-3-吲哚酚辛酸酯或者茜素辛酸酯，浓度在20至1000mg/l之间。
对于包含或者由铜绿假单胞菌组成的菌群，也可以提及的是酯酶、氨肽酶或者氧化酶。
在酯酶底物中，可以提及的是4-甲基伞形基辛酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚酚辛酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚酚壬酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚酚辛酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚酚己酸酯、6-氯-3-吲哚酚辛酸酯或者茜素辛酸酯，浓度在20至1000mg/l之间。
在氨肽酶底物中，可以特别提及的是β-丙氨酰酰胺苯酚(beta-Alanyl-amidophénol)、β-丙氨酰二氯酰胺苯酚、β-丙氨酰-对硝基酰苯胺、β-丙氨酰-β-萘胺、7-N-(β-丙氨酰)氨基吩噁嗪-1-戊基-3-酮或者7-N-(L-焦谷氨酰)氨基吩噁嗪-1-戊基-3-酮，浓度在10至1000mg/l之间。
术语诱导剂是指诱导靶向的代谢活性表达增加的化合物；所有实验条件均相同，当以适当浓度应用诱导剂时，与无所述诱导剂或者应用不合适浓度的诱导剂时相比代谢活性更强。
可以特别提及的是：
·对于β-葡糖苷酶或纤维二糖苷酶，由在β-位置与葡萄糖相连的碳水化合物组成的碳水化合物，或者具有β-葡糖苷亚基的碳水化合物，特别是纤维二糖、纤维素、淀粉、纤维三糖或者海藻糖。
也可以提及的是甲基-β-葡糖苷、异丙基-β-硫代葡糖苷、吲哚酚-β-葡糖苷或者甲基-β-硫代葡糖苷；
·对于β-葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸盐/酯，甲基-β-葡糖苷酸或者其它β-葡糖苷酸；
·对于β-半乳糖苷酶，乳糖，异丙基-β-硫代半乳糖苷或者其它β-半乳糖苷。
非限制性地，特别适合本发明的浓度在100ng/l至10g/l之间，优选在10mg/l至3g/l之间。
术语生物学样品是指得自生物学体液样品的临床样品，或者得自任何类型食物的食物样品，或者环境样品如表面样品、水样品、空气样品等。这种样品因此可以是液体或者固体，可以非限制性提及的是来自血液、血浆、尿液或粪便的临床样品，取自鼻、咽喉、皮肤、伤口或者脑脊液的样品，得自水或者饮料如奶或者果汁的食物样品；得自酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黄酱或者奶酪的样品；得自鱼等的样品，或者得自动物饲料的食物样品，例如得自动物食物的样品。
本发明还涉及检测介质，其包含：
·一革兰氏阴性菌菌群特异性代谢活性的底物；
·β-葡糖苷酶或纤维二糖苷酶底物；
·β-葡糖苷酶或纤维二糖苷酶诱导剂，所述诱导剂是由在β-位置与葡萄糖相连的碳水化合物组成的碳水化合物，或者具有β-葡糖苷亚基的碳水化合物。
用于检测β-葡糖苷酶活性的底物可特别是4-甲基伞形基-β-葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷、茜素-β-葡糖苷、环己并七叶亭-β-葡糖苷、硝基苯基-β-葡糖苷或者二氯氨基苯基葡糖苷或者其盐，浓度优选在10至1000mg/l之间。
作为纤维二糖苷酶底物，可以提及的是4-甲基伞形基-β-纤维二糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-纤维二糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-纤维二糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-纤维二糖苷或者硝基苯基-β-纤维二糖苷。
根据本发明一个优选的实施方案，β-葡糖苷酶或纤维二糖苷酶诱导剂的浓度在100ng/l至10g/l之间，优选在10mg/l至3g/l之间。
优选地，诱导剂选自纤维二糖、纤维素、淀粉、纤维三糖和海藻糖。
根据本发明一个优选的实施方案，β-葡糖苷酶或纤维二糖苷酶诱导剂是纤维二糖。优选地，纤维二糖的浓度在100ng/l至10g/l之间，甚至更优选在10mg/l至3g/l之间。
根据本发明一个优选的实施方案，所述革兰氏阴性菌群包含肠杆菌。根据本发明一个更优选的实施方案，所述革兰氏阴性菌群由肠杆菌组成。
根据本发明一个优选的实施方案，所述肠杆菌是大肠杆菌。因此，所述肠杆菌群可包含或者由大肠杆菌组成。在这个实施方案中，所述代谢活性的底物是大肠杆菌特异的并且优选选自β-葡糖醛酸糖苷酶的底物、β-半乳糖苷酶的底物或者α-半乳糖苷酶的底物、乳糖酸化的底物、或者色氨酸酶的底物、β-核糖苷酶的底物、磷酸酶的底物、L-丙氨酸氨肽酶的底物或者L-亮氨酸氨肽酶的底物。优选地，所述底物是β-葡糖醛酸糖苷酶的底物或者β-半乳糖苷酶的底物。
根据本发明另一个优选的实施方案，所述肠杆菌是沙门氏菌。因此，所述肠杆菌群可包含或者由沙门氏菌组成。在这个实施方案中，所述代谢活性的底物是沙门氏菌特异性的且优选选自α-半乳糖苷酶的底物、酯酶的底物或者葡糖醛酸盐/酯酸化的底物、或者山梨糖醇、丙二醇、蜜二糖或者甘露醇。
根据本发明另一个优选的实施方案，所述革兰氏阴性菌群包含或者由铜绿假单胞菌组成。优选地，所述代谢活性的底物是铜绿假单胞菌特异的且选自酯酶的底物、氨肽酶的底物或者氧化酶的底物。
根据本发明一个优选的实施方案，所述检测介质还包含所述革兰氏阴性菌群特异性代谢活性的诱导剂，所述革兰氏阴性菌群优选包含肠杆菌。
根据本发明一个特定的实施方案，β-葡糖醛酸糖苷酶的诱导剂优选选自葡糖醛酸、甲基-β-葡糖苷酸或者其它β-葡糖苷酸。
根据本发明另一个优选的实施方案，β-半乳糖苷酶的诱导剂优选选自乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖苷或者其它β-半乳糖苷。
根据本发明一个优选的实施方案，所述检测介质还包含第二种β-葡糖苷酶或纤维二糖苷酶诱导剂，如甲基-β-葡糖苷、异丙基-β-硫代葡糖苷、吲哚酚-β-葡糖苷或者甲基-β-硫代葡糖苷。优选地，所述诱导剂是甲基-β-葡糖苷。
优选地，所述第二种诱导剂的浓度在100ng/l至10g/l之间，优选在100mg/l至3g/l之间，更优选在50至200mg/l之间。
本发明还涉及上述介质在区分包含柠檬酸杆菌的菌群与另一革兰氏阴性菌群中的应用。根据本发明的一个优选实施方案，所述介质用于区分包含或者由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由大肠杆菌组成的菌群。
根据本发明的另一个优选实施方案，所述介质用于区分包含或者由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由沙门氏菌组成的菌群。
根据本发明的另一个优选实施方案，所述介质用于区分包含或者由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由铜绿假单胞菌组成的菌群。
本发明还涉及包含如下成分的培养介质：
·β-葡糖苷酶底物；
·β-葡糖苷酶或纤维二糖苷酶诱导剂，所述诱导剂是由在β-位置与葡萄糖相连的碳水化合物组成的碳水化合物，或者具有β-葡糖苷亚基的碳水化合物，优选选自纤维二糖、纤维素、淀粉、纤维三糖和海藻糖，浓度在10mg/l至10g/l之间。
这个介质特别适于区分包含或者由柠檬酸杆菌组成的菌群与另一革兰氏阴性菌群。在此方面，本发明还涉及上述介质在区分包含柠檬酸杆菌的菌群与另一革兰氏阴性菌群中的应用。
优选地，本发明涉及上述介质在区分如下菌群中的应用：
·包含或由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由大肠杆菌组成的菌群；
·包含或由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由沙门氏菌组成的菌群；
·包含或由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由铜绿假单胞菌组成的菌群。
本发明还涉及包含如下成分的介质在区分包含柠檬酸杆菌的菌群与另一革兰氏阴性菌群中的应用：
·β-葡糖苷酶底物；
·β-葡糖苷酶或纤维二糖苷酶诱导剂，所述诱导剂是由在β-位置与葡萄糖相连的碳水化合物组成的碳水化合物，或者具有β-葡糖苷亚基的碳水化合物，优选选自纤维二糖、纤维素、淀粉和纤维三糖，
所述介质优选用于区分：
·包含或由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由大肠杆菌组成的菌群；
·包含或由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由沙门氏菌组成的菌群；
·包含或由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由铜绿假单胞菌组成的菌群。
本发明还涉及区分生物学样品中包含柠檬酸杆菌的菌群与革兰氏阴性菌群的方法，所述方法包括如下步骤：
·将生物学样品接种于上述检测介质上以获得细菌菌落；或者接种于包含β-葡糖苷酶底物和β-葡糖苷酶或纤维二糖苷酶诱导剂的介质上以获得细菌菌落，所述诱导剂是由在β-位置与葡萄糖相连的碳水化合物组成的碳水化合物，或者具有β-葡糖苷亚基的碳水化合物，优选选自纤维二糖、纤维素、淀粉和纤维三糖；
·将与所述β-葡糖苷酶底物反应的菌落鉴别为属于包含或者由柠檬酸杆菌组成的菌群，与所述革兰氏阴性菌特异性底物反应的菌落鉴别为革兰氏阴性菌。
优选地，所述方法用于区分：
·包含或由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由大肠杆菌组成的菌群；
·包含或由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由沙门氏菌组成的菌群；
·包含或由柠檬酸杆菌组成的菌群与包含或者由铜绿假单胞菌组成的菌群。
微生物接种可以通过本领域技术人员已知的任何接种技术进行。保温步骤可以在对于希望检测的酶活性是最佳的温度下进行，本领域技术人员根据检测的酶活性可易于选择所述温度。
可以通过目测法或者通过比色法或荧光测定法进行鉴别。
实施例
如下实施例只是解释了本发明而无限制本发明之意。通过如下实施例可以更清晰地理解本发明。
实施例1：纤维二糖对区分大肠杆菌与柠檬酸杆菌的贡献
向CPS ID 3介质(bioMérieux)中加入不同浓度的纤维二糖(0-100-350-1000mg/l)。这些介质含有250mg/l的6-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸和50mg/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷。将这些介质以20ml每个培养皿比例分布于培养皿中。将来自申请人收集的微生物接种于这些介质上，通过半定量分离0.5McFarland的10μl悬浮液，稀释至1/20。将这些培养皿在37℃保温48小时。在接种24小时和48小时之后目测形成的菌落。记录这些菌落的颜色。结果在下表1中示出。
表1：CPS ID 3介质中纤维二糖浓度对于菌落颜色的影响
在上表1中可以看出在存在纤维二糖的条件下，柠檬酸杆菌菌株表达β-葡糖苷酶活性，这通过菌落由绿色变为紫色而反映出，根据所述菌株是否平行表达β-葡糖醛酸糖苷酶活性而定。因此，在不存在纤维二糖的条件下，弗氏柠檬酸杆菌022菌株(在24小时的粉红色菌落)可以与大肠杆菌菌株混淆，而在存在纤维二糖的条件下不再出现这种情况。
实施例2：纤维二糖浓度对区分柠檬酸杆菌与其它肠杆菌的影响
向补加50mg/l的5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷及50mg/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷的Trypticase大豆培养基(bioMérieux)中加入不同浓度的纤维二糖(0-0.1-1-5-10g/l)。将这些培养基以20ml每个培养皿比例分布于培养皿中。将来自申请人收集的微生物接种于这些培养基上，通过半定量分离0.5McFarland的10μl悬浮液，稀释至1/20。将这些培养皿在37℃保温48小时。在接种24小时和48小时之后目测形成的菌落。记录这些菌落的颜色。结果在下表2中示出。
表2：补加5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷的Trypticase大豆培养基中纤维二糖的浓度对于菌落颜色的影响
在上表2中可以看出在存在纤维二糖的条件下，柠檬酸杆菌菌株表达β-葡糖苷酶活性，这通过菌落的颜色由绿色变为紫色而反映出来，根据该菌株是否平行表达β-半乳糖苷酶活性而定。因此在不存在纤维二糖的条件下，弗氏柠檬酸杆菌菌株(在24小时的紫红色菌落)可与大肠杆菌菌株混淆，在存在纤维二糖的条件下不再出现这种情况。然而，这种区分在纤维二糖浓度高于5g/l时不太明显。

Claims (9)

1.一种用于检测革兰氏阴性菌的检测介质，其包含：
·革兰氏阴性菌菌群特异性代谢活性的底物，选自β-葡糖醛酸糖苷酶的底物、β-半乳糖苷酶的底物或者α-半乳糖苷酶的底物，乳糖酸化的底物，或者色氨酸酶的底物、β-核糖苷酶的底物、磷酸酶的底物、L-丙氨酸氨肽酶的底物或者L-亮氨酸氨肽酶的底物；
·产生可检测信号的β-葡糖苷酶底物；
·β-葡糖苷酶或纤维二糖糖苷酶诱导剂，其中所述诱导剂是纤维二糖。
2.权利要求1的介质，其中所述β-葡糖苷酶或纤维二糖糖苷酶诱导剂的浓度在100 mg/l至1000 mg/l之间。
3.权利要求1的介质，其中所述革兰氏阴性菌菌群包含肠杆菌。
4.权利要求3的介质，其中所述肠杆菌是大肠杆菌。
5.权利要求1的介质，其中所述代谢活性的底物是β-葡糖醛酸糖苷酶的底物或者β-半乳糖苷酶的底物。
6.权利要求1-5任一项的介质，其中所述检测介质还含有第二种β-葡糖苷酶或纤维二糖糖苷酶诱导剂。
7.权利要求6的介质，其中所述第二种β-葡糖苷酶或纤维二糖糖苷酶诱导剂选自甲基-β-葡糖苷、异丙基-β-硫代葡糖苷、吲哚酚-β-葡糖苷或者甲基-β-硫代葡糖苷。
8.权利要求1-7任一项的介质在制备用于区分包含柠檬酸杆菌的菌群与另一革兰氏阴性菌菌群的试剂盒中的应用。
9.包含如下成分的介质在制备用于区分包含柠檬酸杆菌的菌群与另一革兰氏阴性菌菌群的试剂盒中的应用：
·产生可检测信号的β-葡糖苷酶底物；
·β-葡糖苷酶或纤维二糖糖苷酶诱导剂，其中所述诱导剂是纤维二糖。
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