CN101629136A - 微生物的高效培养分选方法和培养装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物的高效培养分选方法和培养装置。其特征是它包括温控培养箱，其内的上搁板有多个培养基瓶，下搁板上有相应个数的层析柱，其间有软管连通，在软管上设有流速控制器，且层析柱的出口端覆以25μm筛绢，并经由软管接入废液收集瓶。高效培养分选方法如下：1)微生物的采集和浓缩；2)微生物的包埋；3)包埋微生物的近自然条件培养；4)长有单克隆微球的分选和加富培养。本方法能够高效的培养和分选微生物，为获得微生物纯培养特别是微生物新种提供了新途径，并大大减少了传统方法获取微生物纯培养的工作量，为微生物的16rDNA测序，确定其种属以及研究微生物的基因功能和代谢产物等下游研究奠定基础。

Description

微生物的高效培养分选方法和培养装置

技术领域

本发明提供了一种微生物的高效培养分选方法和培养装置，以获得微生物的纯培养。

背景技术

自然环境中包含着大量未能获得纯培养的微生物物种。一般认为目前能被分离、培养和鉴定的微生物种类仅占自然界存在量的5％左右。绝大多数微生物不能被目前的纯培养技术所培养，而称为未培养微生物(unculturable microorganism)，如海洋微生物99％以上的种类未被培养。截止2003年初，在细菌域的53个门(按照环境16S rDNA序列划分)中，只有27个门中含有已被培养的微生物，而另外的26个门仅知道其16S rDNA序列。在已培养的细菌中，仅发现5个门，即放线菌门、拟杆菌门、蓝细菌门、变形菌门和厚壁菌门中的一些种类能够产生生物活性物质，而这5个门中已培养和发表的种类占所有已培养和发表的细菌种类的95％。据统计(截至2008年7月)，目前仅有约8500种细菌被培养和正式发表。因此，开发新的海洋微生物培养技术，尽可能多的得到微生物纯培养，然后筛选天然产物是非常必要的。

在过去的十几年间，许多研究者通过对环境样品的16S rDNA克隆测序来确定自然界微生物的多样性。海洋、土壤、淡水、动植物体和温泉等自然环境中都蕴藏着丰富的微生物。此外，学者们还用宏基因组学(Metagenomics)的方法来获取未培养微生物的基因资源，极大地拓展了人们对微生物多样性的认识，并且推动了对自然界中微生物资源的开发应用。然而，已有的这些技术并没有摆脱微生物未被培养所带来的弊端，因为这些方法仅仅能获取一定的微生物信息，但却无法获得足够量的微生物细胞，从而也就无法全面了解微生物细胞的生命活动以及微生物之间的互作规律。因此，要对微生物的生理特性进行深入了解，或者要了解基因组中某些基因表达产物的代谢途径，必须获得微生物纯培养。

同样，研究表明土壤、淡水、动植物体等各种环境下所含的绝大多数的微生物种类没有被培养出来，也迫切需要建立能快速高效分离培养而获得微生物单克隆，特别是微生物新种的方法。

自然环境中，微生物通常与很多不同种属的其他微生物共同生长。为了充分研究某一微生物的特性，必需获得微生物的纯培养。传统的平板涂布法是实验室微生物分离培养方法，虽然也能获得一定量的微生物菌株，但是耗时费力且获得的微生物多样性很低。其基本原因概括有以下方面：

1)经典培养方法阻碍了微生物之间的交流

自然环境中很多微生物都聚集生长，它们之间有共生、互生、寄生、拮抗等多种复杂关系，许多微生物的生长都受周围环境微生物代谢产物以及其它生长因子的影响，离开原生态环境则难以生长。实验室经典培养法往往破坏了微生物之间的这种共生状态，微生物之间的信息交流被阻断，生长必需的信号分子和生长因子缺乏。

2)培养条件与原生态环境的差别

自然界中微生物可利用的营养物质匮乏，多数处于“寡营养”状态，而常规实验室微生物培养基的营养物浓度远远高于微生物生长的自然环境。常规纯培养方法对这种认识不充分，高浓度的营养物质可能比较适合于那些生长速度快且对高浓度营养物质有抵抗能力的微生物，但是对那些生长速度较慢的微生物可能有抑制作用，对这些微生物提供营养成分丰富的培养基反而会成为阻碍其复苏的重要因素，甚至会出现底物加速死亡(Substrate accelerated death)现象。

3)氧化胁迫引起细胞损伤

当自然环境中的微生物突然转入人为环境时，一些对新环境适应能力较强或生长较快的微生物很快形成肉眼可见的克隆，这些生长快的微生物会产生大量过氧化物、自由基和超氧化物，这些物质的产生使那些适应能力较差或生长较慢的微生物细胞受到损伤，从而延缓或不能生长。

4)生长缓慢的微生物被忽视

在平板培养基上，一个菌落中细胞的数目至少为10⁵个才能用肉眼观察到，而那些生长速度较慢、其生长达不到高密度的细菌种类，在培养基上用肉眼是看不到菌落的，从而导致这些微生物的生长不被发觉，表现为“不可培养”。

5)活的非可培养(viable but nonculturable state，VBNC)状态细菌的存在

细菌的VBNC状态，是指某些细菌处于不良环境条件下，其整个细胞常缩小成球形，用常规培养基在常规条件下培养时不能使其繁殖，但它们仍然具有代谢活性。

针对这些微生物不能被培养的原因，很多研究者提出了一些提高微生物可培养性的方法，如：向培养基中加入微生物相互作用的信号分子(如酰基高丝氨酸内酯、cAMP或ATP等)简单地模拟微生物间的喜好交流，满足微生物生长繁殖的需求；在培养基中添加对毒性成分具有降解能力的物质，如丙酮酸钠、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶等，降低优势菌种代谢所产生的过氧化物、自由基和一些拮抗物质对其他微生物细胞的毒害作用；通过将微生物群体稀释至痕量，降低少数几种优势微生物对主要存在的寡营养微生物的竞争干扰，而使主体寡营养微生物可培养性大大提高，即稀释培养法(Dilution culture)；将常规微生物培养基进行稀释，使营养物浓度降低，增加可培养微生物的数量等等。虽然不同程度提高了微生物的可培养性，但是它们只是对传统培养法形式上的改进，仍然不能避免传统培养法本身的弊端，如微生物之间的交流、培养条件的巨大差别、微生物活的非可培养状态不能被打破，以及生长缓慢的微生物被忽视等等。

自然条件下微生物所处的寡营养条件及其生存环境的复杂性，使微生物很难用一种方法被大量培养出来。所以现代微生物培养中，提出了自然培养法和近自然条件培养法的概念，并出现了一些新的培养方法，如扩散盒培养法，这种方法模拟了微生物生长的自然环境。Kaeberlein等设计了一种培养装置名为扩散盒(diffusion chamber)。该扩散盒由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连的0.1μm滤膜组成。将海洋微生物样品加至封闭的扩散盒中，在模拟采样点环境条件的玻璃缸中进行培养。扩散盒的膜可使化学物质在盒内和环境之间进行交换，但是细胞却不能自由移动。尽管用这种方法没有培养出新的微生物种类，但是在扩散盒中培养一周后却得到大量形态各异的菌落。获得的菌株在人工合成的固体培养基中不能生长，但是在其他微生物的存在下却能形成菌落。这种培养方法能较大程度地模拟微生物所处的自然环境，由于化学物质可以自由穿过薄膜，可保证微生物群落间作用的存在，提高了微生物的可培养性。

这些培养法和装置，都在一定程度上模拟了自然环境，提高了微生物的可培养性，但仍然无法避免获取大量微生物纯培养所需的繁琐步骤，如微生物或菌落的挑取和划线纯化等。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物的高效培养分选方法和培养装置，以克服已有技术的不足。

本发明提供了一种模拟自然条件的微生物培养装置。该装置包括用于维持微生物生长温度的温控培养箱、其内的搁板上有多个培养基瓶，下搁板上有相应个数的层析柱，其间凭借软管连通，在软管上设有控制培养基流速的流速空制器，且层析柱的出口端覆以25微米孔径的筛绢，并经由软管接入废液收集瓶。本发明提供的装置用于微生物高效培养分选方法中——包埋微生物的近自然培养这一步骤中。

本发明中微生物高效培养分选方法的基本工艺如下：1)微生物的采集和浓缩；2)微生物的包埋；3)包埋微生物的近自然条件培养；4)长有单克隆微球的分选和加富培养。详细具体的实施方案如下：

1)微生物的采集和浓缩：

采用常规微生物样品采集方法采集环境样品，并浓缩获得浓度至少为10⁶个/ml的微生物量用于包埋。

2)微生物的包埋：

将上述浓缩得到的微生物样品采用膜乳化法进行包埋，以实现对单个微生物进行包埋。

微生物包埋的具体工艺如下：

a)用生理盐水配制无菌天然高聚糖包埋材料溶液(如1％至5％的海藻酸钠溶液，或1％至5％的低凝固点琼脂糖溶液，或0.5％至5％的结冷胶溶液)；

b)将浓缩后的微生物加入包埋材料溶液中，且加入微生物的量为包埋材料所形成微球数量的1/10～1/100，并混合均匀得到微生物和聚合物溶液；

c)将上述微生物和聚合物溶液按小于1∶5比例加入含司盘80的石蜡油或植物油中，搅拌均匀，用膜乳化法，制备成包含粒径均一微滴的乳液；

d)采用相应的固化方法，将乳液中的微滴固化成微球，用无菌盐水洗涤微球，直至将油完全洗去，得到包埋有单个微生物的微球。

3)将上述包埋有单个微生物微球(包埋微生物)进行近自然条件培养，培养的具体工艺是：

a)将上一步骤中包埋有单个微生物的微球装入层析柱中，层析柱出口端覆以25微米筛绢，防止微球冲出，且能使长出微球的微生物随培养基排出层析柱；

b)将层析柱放入温控箱中，装入培养基瓶中的无菌寡营养培养基从层析柱进口端通入；

c)在适宜生长温度下培养数周，直至包埋有单个微生物的微球内有单克隆形成，然后进行下一步。

4)长有单克隆微球的分选和加富培养：

采用人工分选或流式细胞仪分选的方法将上一步骤中培养得到的长有单克隆的微球分选出来，进一步加富培养，获得大量微生物克隆。

上述包埋有单个微生物微球的近自然条件培养是在本发明专门设计的模拟自然条件的微生物培养装置中来进行的。

本方法能够高效的培养和分选微生物，为获得微生物纯培养特别是微生物新种提供了新途径，并且大量减少了传统方法获取微生物纯培养所需的工作量和劳动力。将单克隆微球分选到96孔板后使后续扩大培养变得更加容易，并为获得微生物纯培养后下游的研究提供了方便，如对获得纯培养的微生物16rDNA测序，确定其种属；研究微生物生理和基因功能；研究微生物的代谢产物等。

附图说明

图1本发明的高效培养分选方法流程图。

图2本发明的模拟自然条件的微生物培养装置。

其中：1-温控培养箱；2-培养基瓶；3-搁板；4-软管；5-流速控制器；6-层析柱；7-下搁板；8-筛绢；9-收集瓶。

具体实施方式

如图2，本发明包括用于维持微生物生长温度的温控培养箱1、其内的搁板3上有多个培养基瓶2，下搁板7上有相应个数的层析柱6，其间凭借作为输送培养基的管道的软管4连通，在软管4上设有控制培养基的流速的流速控制器5，且层析柱6的出口端覆以25微米的筛绢8，并经由软管接入废液收集瓶9。本发明提供的装置用于微生物高效培养分选方法中——包埋微生物的近自然培养这一步骤。

本发明中微生物高效培养分选方法的基本工艺如下：1)微生物的采集和浓缩：2)微生物的包埋：3)包埋微生物的近自然条件培养：4)长有单克隆微球的分选和加富培养。详细具体的实施方案如下：

1)微生物的采集和浓缩：

在自然环境，绝大多数微生物都生长在寡营养的环境中，所以微生物的量都很少，必需将环境样品的微生物进行浓缩，获得浓度至少为10⁶个/ml的微生物量用于包埋。

微生物的浓缩采用离心和滤膜过滤相结合的方法。某些环境样品直接用滤膜浓缩大量时，很容易将滤膜堵塞；直接用离心的方法，获得的样品中杂质含量太高，影响包埋。用离心的方法先将样品浓缩，然后再用滤膜进一步逐级粗滤，去除样品中的杂质，再进一步用离心或滤膜的方法浓缩，最后获得杂质较少、浓度较高的菌体，这样不仅能提高包埋的成功率也提高了浓缩的效率和倍数。

2)微生物的包埋：

将上述浓缩得到的微生物样品采用膜乳化法制备微球进行包埋。

用膜乳化法包埋微生物可用的包埋材料广泛，如海藻酸钠，低凝固点琼脂糖，结冷胶，卡拉胶等。这些天然高分子材料来源广泛，具有简单可控的成胶性能和良好的生物相容性。材料胶凝后形成的网格结构可以作为物理屏障，对生物体起到保护作用；材料所具有的一定的网格孔径，可以允许氧气、营养物和代谢产物的出入，以及微生物间小信号分子的交换，这样就可以保证细胞在包埋基质中自由生长；另外，材料所具有的机械性能能限制快速生长微生物的生长。

膜乳化法制备微球的过程是：将一定比例的分散相和连续相混合均匀，抽滤，使混合物透过孔径均一的微孔膜，在膜另一侧形成乳化微滴，液滴从膜表面剥离后形成粒径均一的乳液。将得到的乳液进一步固化，形成粒径在30～70微米之间的单分散性微球。

本方法是将单个的微生物经行包埋，并通过控制微生物和制备微球的数量，使其比例小于等于1∶10，保证绝大多数微生物被单个包埋，且一个微球中含有两个或两个以上的菌体的几率极低。

微生物包埋的具体工艺如下：

a)配制无菌天然高聚糖包埋材料溶液，如海藻酸钠溶液，低凝固点琼脂糖溶液，结冷胶溶液；

b)将浓缩后的微生物加入包埋材料溶液中，保证加入微生物的量为包埋材料所形成微球数量的1/10～1/100(比如500微升生物材料溶液可以制备平均粒径为60微米的微球约10⁸个，这样加入100微升10⁸个/ml的菌液，即可使微生物和微球的比值为1∶10)，混合均匀得到微生物和聚合物溶液；

c)将上述微生物和聚合物溶液按小于1∶5比例加入含司盘80的石蜡油或植物油中，搅拌均匀，用膜乳化法，制备成包含粒径均一微滴的乳液；

d)将形成的乳液采用相应的固化方法，将乳液中微滴固化成微球，用无菌盐水洗涤微球，直至将油完全洗去，得到包埋有单个微生物的微球。

3)包埋有单个微生物微球(包埋微生物)的近自然条件培养：

自然界微生物生长的环境一般是寡营养的，通过对微生物自然原位生长环境的模拟，可以阻止优势菌株的生长，减少对其他菌株的生长抑制，使得传统培养方式下不能生长的菌株得以生长。

包埋微生物在模拟自然条件的微生物培养装置中进行培养。模拟的原位生长环境是指：在培养过程中，尽管每个微生物细胞被单独包埋，但是来自环境的所有被包埋的细胞都在一起培养，这在一定程度上模拟了自然环境，而且由于微球的孔径较大，代谢产物和一些其他分子(如信号分子)可以互相交换，保证不同微生物之间信号的交流；包埋微生物是在一个开放的、连续补充营养的系统中，而不是在一个封闭的系统中，模拟了大多数自然开放环境；培养中的寡营养条件模拟了原位生态环境。

微生物培养的具体工艺是：

a)将上一步骤中包埋有微生物的微球装入层析柱中，层析柱出口端覆以25微米筛绢，防止微球冲出，且能使长出微球的微生物随培养基排出层析柱；

b)将层析柱放入温控培养箱中，装入培养基瓶的灭菌寡营养培养基(如天然海水、淡水、土壤浸提液)从层析柱进口端通入；

c)在适宜生长温度下培养数周，直至包埋有单个微生物的微球内有单克隆形成，然后进行下一步实验。

4)长有单克隆微球的分选和加富培养：

这一步的目的是分选出上一步骤中培养得到的长有单克隆的微球，进一步加富培养，使其长出微球获得大量微生物纯培养。在微生物的包埋步骤中，通过控制微生物和制备微球的数量，使其比例小于等于1∶10，从而保证了绝大多数微生物被单个包埋，加富培养后获得的是一株微生物的单克隆。

可以采用人工分选和流式细胞仪分选。人工分选可以避免荧光染色等步骤，保证了微生物的活性，但效率稍差；流式细胞仪分选效率极高，缺点是荧光染色会对微生物活性不利。

人工分选程序如下：

a)将近自然条件培养后的微球稀释至10³～10⁴个/ml，使吸取10微升的稀释液时，其中仅含一个长有单克隆的微球；用排枪将上述稀释液加到96孔板中；

b)96孔板中加入100～200微升的加富培养基，使单克隆进一步生长，获得大量微生物纯培养。

流式细胞仪分选程序如下：

a)用LIVE/DEAD式剂盒中的SYTO-9染色将长有克隆的微球经行染色后，用流式细胞仪进行分选，将长有克隆的微球分选到96孔板中；

b)96孔板中加入100～200微升的加富培养基，使单克隆进一步生长，获得大量的微生物纯培养。

上述的加富培养基是指用于培养某类微生物的特定培养基，如海洋细菌可用2216E或海水R2A培养基，陆生细菌可用R2A培养基和胰蛋白胨培养基，放线菌可用高氏1号培养基。

实施例1

以低凝固点琼脂糖为材料配制无菌包埋材料溶液，包埋海水样品为例详细说明本方法的具体步骤。

1)微生物的采集和浓缩：

a)采集青岛近海海水环境的样品后，首先对微生物进行计数，获得其初始浓度为2.7×10⁵个/ml；

b)用滤纸相滤对水样进行预处理，去除样品中较大的固体颗粒；

c)取400毫升粗滤过的水样10000rpm离心收集菌体，用10毫升的灭菌海水重新悬浮，用5微米的滤膜粗虑，去除体积较大的藻类或原生动物(如纤毛虫、鞭毛虫等)；

d)进一步以10000rpm离心收集菌体，倒掉上层海水后，用400微升的灭菌海水悬浮菌体；这样浓缩后获得菌浓度为2.7×10⁸个/ml的菌液。

2)微生物的包埋：

a)用生理盐水配制浓度为2％低凝固点琼脂糖(凝固点：27～29℃)溶液，115℃灭菌30分钟；

b)取100微升的浓缩后菌液，加到500微升的低凝固点琼脂糖溶液中，充分混匀，37℃孵育(保证琼脂糖不凝胶)。(500微升低凝固点琼脂糖溶液可以制备平均粒径为60微米的微球约10⁸个，这样加入100微升10⁸个/ml的菌液，即可使微生物和微球的比值为1∶10)；

c)将混合均匀的混合物溶液加入20毫升含1％司盘80的石蜡油中混合，搅拌片刻后，将其倒入膜乳化装置中，抽滤，使溶液透过孔径均一的微孔膜，在膜另一侧形成乳化微滴，从而形成包含均一粒径微滴的乳浊液；

d)将收集到的乳浊液置于冰浴中15分钟，固化形成稳定的微球。离心收集微球，并用灭菌海水充分离心洗涤，将石蜡油完全洗去，获得粒径在30～70微米之间的包埋有海洋微生物的单分散微球。

3)包埋海洋微生物的近自然条件培养：

包埋海洋微生物在模拟模拟海洋环境条件的微生物培养装置中进行培养。模拟的原位生长环境是指：在培养过程中，尽管每个海洋微生物细胞被单独包埋，但是来自海洋环境的所有被包埋的微生物都在一起培养，保证不同微生物之间信号的交流，在一定程度上模拟了微生物生长的原位环境；包埋海洋微生物是在一个开放的、连续补充海水作为培养基的系统中，模拟了海洋开放环境；海水培养基取自微生物生长的原位环境也模拟自然环境。

微生物培养的具体工艺是：

a)将包埋有海洋微生物的微球装入层析柱中，层析柱出口端覆以25微米筛绢，防止微球冲出，且能使长出微球的海洋微生物随培养液排出层析柱；

b)将层析柱放入温控培养箱中，装入培养基瓶的灭菌海水从层析柱进口端通入，做为海洋微生物生长所需的培养基；

c)在16℃下连续培养5周，定期取样观察微球内微生物的生长状况，微球内有单克隆菌落形成后，进行分选。

4)长有单克隆菌落微球的流式分选和加富培养：

a)用LIVE/DEAD试剂盒中的SYTO-9染色将长有克隆的微球经行染色后，用流式细胞仪进行分选，将长有克隆的微球分选到96孔板中；

b)96孔板中加入150微升的海水R2A培养基，使单克隆进一步生长，获得大量的微生物纯培养。

实施例2

以海藻酸钠为材料配制无菌包埋材料溶液，包埋土壤样品为例详细说明本方法的具体步骤。

1)微生物的采集和浓缩：

a)称取4g环境样品土壤浸泡在200毫升灭菌的生理盐水中，充分震荡搅拌使泥样中的微生物分散到盐水中；

b)用滤纸粗滤对浸提液进行过滤，去除样品中较大的土壤颗粒；

c)10000rpm离心粗滤过的浸提液收集菌体，用10毫升的灭菌生理盐水重新悬浮，用5微米的滤膜粗虑，去除较小颗粒杂质；

d)以10000rpm离心收集菌体，倒掉上清后，用200微升的灭菌生理盐水悬浮菌体。

获得土壤微生物的浓度约为10⁷个/ml。

2)微生物的包埋：

a)用生理盐水配制浓度为3％的海藻酸钠溶液，115℃灭菌30分钟；

b)取100微升的浓缩后菌液，加到500微升的海藻酸钠溶液中，充分混匀(500微升海藻酸钠溶液可以制备平均粒径为60微米的微球约10⁸个，这样加入100微升10⁷个/ml的菌液，即可使微生物和微球的比值为1∶100)；

c)将混合均匀的混合物溶液加入20毫升含0.08％司盘80的植物油中，搅拌均匀后倒入膜乳化装置中，抽滤，使溶液透过孔径均一的微孔膜，在膜另一侧形成乳化微滴，从膜表面剥离后形成粒径均一的乳浊液；

d)乳浊液(含海藻酸钠微滴的石蜡油)经1％的氯化钙溶液固化2小时后，形成稳定的微球。离心收集微球，用生理盐水充分离心洗涤，直至将油完全洗去，获得包埋有土壤微生物的微球。

3)包埋土壤微生物的近自然条件培养：

包埋微生物在模拟土壤环境条件的培养箱中进行培养。模拟的土壤原位生长环境是指：在培养过程中，尽管每个土壤微生物细胞被单独包埋，但是来自土壤环境的所有被包埋的微生物都在一起培养，保证不同微生物之间信号的交流，在一定程度上模拟了微生物生长的原位环境；包埋土壤微生物是在一个开放的、连续补充土壤浸提液作为培养基的系统中，模拟了土壤开放环境；土壤浸提液取自微生物生长的原位环境也模拟自然环境。

微生物培养的具体工艺是：

a)将收集的包埋有土壤微生物的微球装入层析柱中，层析柱出口端覆以25微米滤膜，防止微球冲出，且能使长出微球的微生物随培养液排出层析柱；

b)将层析柱放入温控培养箱中，装入培养基瓶的灭菌土壤浸提液从层析柱进口端通入，做为土壤微生物生长所需的培养基；

c)在28℃下连续培养4周，定期取样观察微球内微生物的生长状况，微球内有单克隆菌落形成后，进行分选。

4)长有单克隆菌落微球的人工分选和加富培养：

a)将近自然条件培养后的微球稀释至10⁴个/ml，使吸取10微升的稀释液时，含有100个微球，但其中仅含一个长有单克隆的微球；用排枪将上述稀释液加到96孔板中；

b)96孔板中加入150微升的R2A培养基，使单克隆进一步生长，获得大量微生物纯培养。

实施例3

以结冷胶为材料配制无菌包埋材料溶液，以包埋淡水样品为例详细说明本方法的具体步骤。

1)微生物的采集和浓缩：

a)采集淡水湖环境样品后，首先对微生物进行计数，获得其初始浓度为10⁴个/ml；

b)用滤纸粗滤对水样进行预处理，去除样品中较大的固体颗粒；

c)取500毫升粗滤过的水样10000rpm离心收集菌体，用10毫升的灭菌湖水重新悬浮，用5微米的滤膜粗虑，去除体积较大的藻类或原生动物(如纤毛虫、鞭毛虫等)；

d)进一步以10000rpm离心收集菌体，倒掉上层水后，用100微升的灭菌海水悬浮菌体；

这样浓缩后获得微生物浓度为5×10⁷个/ml的微生物菌液。

2)微生物的包埋：

a)用含0.08％氯化钙的蒸馏水配制浓度为1％结冷胶溶液，115℃灭菌30分钟；

b)取100微升的浓缩后菌液，加到500微升的结冷胶溶液中，充分混匀，37℃孵育(保证结冷胶不凝胶)。(500微升结冷胶溶液可以制备平均粒径为60微米的微球约108个，这样加入100微升5×107个/ml的菌液，即可使微生物和微球的比值为1∶50)；

c)将混合均匀的混合物溶液加入20毫升含0.05％司盘80的石蜡油中混合，搅拌片刻后，将其倒入膜乳化装置中，抽滤，使溶液透过孔径均一的微孔膜，在膜另一侧形成乳化微滴，从而形成包含均一粒径微滴的乳浊液；

d)将收集到的乳浊液置于冰浴中15分钟，固化形成稳定的微球。离心收集微球，并用灭菌湖水充分离心洗涤，将石蜡油完全洗去，获得粒径在30-70微米之间的包埋有淡水微生物的单分散微球。

3)包埋淡水微生物的近自然条件培养：

包埋淡水微生物在模拟淡水湖环境条件的培养装置中进行培养。模拟的原位生长环境是指：在培养过程中，尽管每个淡水微生物细胞被单独包埋，但是来自环境的所有被包埋的微生物都在一起培养，保证不同微生物之间信号的交流，在一定程度上模拟了微生物生长的原位环境；包埋淡水微生物是在一个开放的、连续补充淡水作为培养基的系统中，模拟了淡水湖开放环境；淡水培养基取自微生物生长的原位环境也模拟自然环境。

微生物培养的具体工艺是：

a)将包埋有淡水微生物的微球装入层析柱中，层析柱出口端覆以25微米筛绢，防止微球冲出，且能使长出微球的微生物随培养液排出层析柱；

b)将层析柱放入温控培养箱中，装入培养基瓶的灭菌湖水从层析柱进口端通入，做为微生物生长所需的培养基；

c)在28℃下连续培养5周，定期取样观察微球内微生物的生长状况，微球内有单克隆菌落形成后，进行分选。

4)长有单克隆菌落微球的人工分选和加富培养：

a)将近自然条件培养后的微球稀释至5×10³个/ml，使吸取10微升的稀释液时，含有50个微球，但其中仅含一个长有单克隆的微球；用排枪将上述稀释液加到96孔板中；

b)96孔板中加入150微升的R2A培养基，使单克隆进一步生长，获得大量微生物纯培养。

Claims (6)

1、一种微生物的高效培养装置，其特征在于包括用于维持微生物生长温度的温控培养箱(1)、其内的搁板(3)上有多个培养基瓶(2)，下搁板(7)上有相应个数的层析柱(6)，其间凭借作为输送培养基的管道的软管(4)连通，在软管(4)上设有控制培养基流速的流速控制器(5)，且层析柱(6)的出口端覆以25微米的筛绢(8)，并经由软管(4)接入废液收集瓶(9)上。

2、微生物的高效培养分选方法，其基本工艺如下：

1)微生物的采集和浓缩：运用离心和滤膜过滤相结合的方法将采于自然环境的微生物浓缩后，获得浓度至少为10⁶个/ml的微生物用于包埋；

2)微生物的包埋：将上述浓缩得到的微生物样品采用膜乳化法制备微球，以实现对单个微生物进行包埋；

3)包埋微生物的近自然条件培养：将上述微球包埋的单个微生物在模拟微生物原位生长环境的培养装置中进行培养，得到长有单克隆的微球；

4)长有单克隆微球的分选和加富培养：采用人工分选或流式细胞仪分选出上一步骤中培养得到的长有单克隆的微球，并进一步加富培养以获得大量微生物纯培养。

3、如权利要求2所述的微生物的高效培养分选方法，其特征在于微生物包埋的具体工艺步骤如下：

a)用生理盐水配制无菌天然高聚糖包埋材料溶液——1％至5％的海藻酸钠溶液或1％至5％的低凝固点琼脂糖溶液或0.5％至5％的结冷胶溶液；

b)将浓缩后的微生物加入上述包埋材料溶液中，且加入微生物的量为包埋材料所形成微球数量的1/10～1/100，混合均匀，得到微生物和聚合物混合溶液；

c)将微生物和聚合物混合溶液按小于1∶5比例加入含司盘80的石蜡油或植物油中，搅拌均匀，再用膜乳化法制备成包含粒径均一微滴的乳液；

d)再采用相应的固化方法，将上述乳液中的微滴固化成微球，用无菌盐水洗涤微球，直至将石蜡油或植物油中的油完全洗去，即得到包埋有单个微生物的微球。

4、如权利要求2所述的微生物的高效培养分选方法，其特征在于微球包埋的单个微生物近自然条件培养的具体工艺步骤是：

a)将得到的包埋有单个微生物的微球装入层析柱；

b)将层析柱放入温控箱中，培养基瓶内装入的无菌寡营养培养基从层析柱进口端通入，出口端覆以25微米滤膜以防止微球流出，并使长出微球的微生物随培养液排除层析柱；

c)在近自然寡营养条件培养直至包埋有单个微生物的微球内有单克隆形成。

5、如权利要求2所述的微生物的高效分选方法，其特征在于所述的长有单克隆微球的人工分选方法：

a)将近自然条件培养后的微球稀释至10³～10⁴个/ml，使吸取10微升的稀释液时，其中仅含一个长有单菌落的微球，用排枪将上述稀释液加到96孔板中；

b)96孔板中加入100～200微升的加富培养基，使单克隆进一步生长，获得大量微生物纯培养。

6、如权利要求2所述的微生物的高效分选方法，其特征在于所述的长有单克隆微球的流式细胞仪分选方法如下：

a)用LIVE/DEAD试剂盒中的SYTO-9染料将长有菌落的微球经行染色后，用流式细胞仪进行分选，将长有单克隆的微球分选到96孔板中；

b)96孔板中加入100～200微升的加富培养基，使单克隆进一步生长，获得大量的微生物纯培养。

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