CN101625360A - 一种肺癌早期特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种肺癌早期特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种肺癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒。由固相载体和包被在其表面的含有肺癌抗原肽I、肺癌抗原肽II、肺癌抗原肽III、肺癌抗原肽IV、肺癌抗原肽V和肺癌抗原肽VI的六个重组噬菌体液各100－200μl，等量分别包被到固相载体上不同的酶标孔中所组成。所述重组肺癌特异抗原肽是利用T7噬菌体将肺癌cDNA文库展示到噬菌体表面，并经亲和筛选和血清学分析从中筛选出的，它具有检测肺癌病人血清中由于肿瘤刺激所产生的自身抗体的能力，为早期肺癌患者提供了有效的检测手段，有较大的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医用检测试剂技术领域，具体涉及一种肺癌早期特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
肺癌是常见的恶性肿瘤，也是威胁人类生命健康最为严重的恶性肿瘤，不同种族发病率有所不同，根据中国国家卫生局卫生信息中心数据表明，2004年-2005年肺癌病死率为30.61/10万，均居男女恶性肿瘤的第1位。肺癌早期诊断和及时治疗是延长5年存活期的关键，但由于早期症状不明显，超过50％的肺癌在明确诊断时已经处于中晚期，甚至发生转移，失去了手术机会，因此探索肺癌早期诊断和筛查方法非常重要。目前用于肺癌早期诊断的方法主要依靠影像学检查，如X线检查、CT、支气管镜等方法，但是这些方法只能在肺癌组织足够大的情况下，依赖于相应设备完成，成本高，且给患者造成痛苦，难以用于普查。应用血清学进行肺癌检测的方法主要还依靠癌胚抗原(CEA)、NSE、CA199，CA125等单一指标，缺乏敏感性和特异性，不能对多种组织类型肺癌进行早期诊断。因此寻找新的流行病学早期筛查生物学标志，建立能适应多种组织类型肺癌的高通量特异检查方法是当务之急。
当肿瘤发生后，肿瘤细胞表面或分泌的特征抗原刺激机体产生抗体，而自身抗体存在于尚无症状的早期肿瘤患者血清中。通过寻找肺癌特征抗原，利用它来检测患者血清中的特异性自身抗体，从而做为分子标志，可以早期发现肺癌，与现行的其他方法相比，具有微创、简单、经济、敏感度及特异度高等特点，方便用于社区人群的筛查，从而达到早期检测肺癌的目的。
发明内容
本发明的目的在于通过寻找肺癌特征抗原，利用它来检测患者血清中的特异性自身抗体，可以早期发现肺癌。
本发明提供一种肺癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒。
本发明的肺癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒，由固相载体和含有肺癌抗原肽I(SMMU-EPII)、肺癌抗原肽II(SMMU-EPIII)、肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)、肺癌抗原肽IV(SMMU-EPIIV)、肺癌抗原肽V(SMMU-EPIV)和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)的六个重组噬菌体液各100-200μl(滴度为108--1015pfu/L，用0.5％-2％BSA按1∶2--1∶8稀释)，2℃--6℃摇床2h-4h，等量分别包被到固相载体上不同的酶标孔中所组成。
所述重组肺癌特异抗原肽是利用T7噬菌体将肺癌cDNA文库展示到噬菌体表面，并经亲和筛选和血清学分析从中筛选出的，它具有检测肺癌病人血清中由于肿瘤刺激所产生的自身抗体的能力。将筛选出的多个抗原肽经过并联，从而达到早期检测和筛选肺癌病人的目的。
所述特异性抗原肽为：肺癌抗原肽I(SMMU-EPII)、肺癌抗原肽II(SMMU-EPIII)、肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)、肺癌抗原肽IV(SMMU-EPIIV)、肺癌抗原肽V(SMMU-EPIV)和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)，它们的编码核苷酸序列和氨基酸序列分别见本发明说明书的核苷酸及其对应氨基酸序列表。
本发明的另一目的在于提供上述肺癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒的制备方法。
一、制备重组肺癌特异抗原肽：
1)构建肺癌噬菌体展示肽库
抽提30例新鲜肺癌组织总RNA，等量混合成1mg后抽提mRNA，应用随机引物反转录为cDNA，将cDNA末端进行平齐，加Ecol I/Hind III接头，用Ecol I和HindIII两种限制性内切酶依次进行酶切反应后，去除小片断，接入T7噬菌体双臂，进行体外包装，从而构建成肺癌噬菌体展示肽库(见图1)，并测定构建的噬菌体展示肽库库容量为3×106pfu，重组率为60％，符合筛选后期试验要求；
2)亲和筛选肺癌特异抗原肽
为了富集可以和肺癌自身抗体结合的特异展示肽，进行了正反向的5轮亲和筛选(见图2)，取10μl A/G的琼脂糖珠于一1.5ml离心管中，PBS(PH7.4)500μl洗2次，1％BSA 4℃封闭1h。琼脂糖珠分别与15μl肺癌患者及对照患者的血浆4℃孵育过夜。PBS 500μl洗涤3次后，用10μl PBS溶解富集到的抗体。10管肺癌的抗体及10管非肺癌的抗体各自合并成一管。取噬菌体库扩增液20μl，先与20μl的非肺癌抗体孵育1h，未结合的上清再与20μl肺癌抗体结合，保留结合到琼脂糖珠上的噬菌体，并100μl％SDS洗脱，将其转染细菌至扩增，此为一轮筛选，如此反复5轮；
3)血清学筛选肺癌早期检测分子标志
①混合血样初筛
筛选后的肽库用LB液体培养基1∶108稀释后，取100μl噬菌体液、250μl新摇好的BLT5403细菌，3ml保温55℃的顶层琼脂，混匀后立刻倒入铺有LB的平皿中，冷却后，37℃温箱孵育4小时。可见有单个的噬菌体形成。每1个1.5ml离心管中，加入新摇好的细菌BLT5403 1ml，用消毒的牙签随机挑取1个单个的、边界清晰的噬菌体于1个1.5ml离心管中，并按顺序编号。挑好的噬菌体置37℃恒温振荡器摇4小时以上，直至每一管液体均变澄清为止。共随机挑选噬菌体5000个，挑选好的噬菌体置4℃保存。用T7引物进行PCR反应，扩增所挑选噬菌体的插入片段，挑取扩增片段200bp以上的噬菌体进行ELISA实验进一步筛选(见图3)，
将T7tailer fiber抗体(NOVAGEN)，用PBS(PH7.4)按1∶1000来稀释，取100μl包被于96孔酶标板，4℃摇床轻摇过夜。用洗涤液(上海科华生物技术公司)洗板，每孔150μl，洗四次，每次约1分钟，拍干。200μl 2％BSA/PBS室温(24℃)封闭2小时。)洗板同前，加入用1％BSA 1∶5稀释的噬菌体100μl，每个标本加4孔。每次试验均加入没有插入片段的50号空噬菌体作为阴性对照4孔和空白对照2孔。室温孵育2小时。弃去孔内液体，拍干。每个噬菌体标本加入100μl1％BSA 1∶500稀释的肺癌组混合血浆、对照组混合血浆各2孔。所用肺癌组、对照组的混合血浆的患者信息同亲和筛选所用的患者。例如：某待测的噬菌体包被六孔，其中两孔加肺癌患者混合血清，两孔加对照混合血清，两孔不加任何血清作空白对照。同时包被空噬菌体四孔，每两孔分别加肺癌患者混合血清和对照混合血清，作前面四孔相应的阴性对照。室温孵育1小时。洗板后每孔加入1∶10000稀释的HRP(辣根过氧化物酶)耦联的山羊抗人IgG，室温孵育1小时，洗板后每孔加入温度至室温的显色剂A和显色剂B(上海科华生物技术公司)各1滴，混匀后，37℃孵育20分钟，加入终止液25μl，
立刻用酶标仪检测，取波长450nm，先用空白对照调零，然后读取各孔的OD值，并记录结果。每次进行ELISA按下列公式计算并判断结果：用空白孔调零后，样品平均OD值/阴性对照平均OD值，比值≥2.0，判断为阳性结果；样品OD值/阴性对照平均OD值，比值＜2.0，判断为阴性结果。找出与肺癌混合血清反应为阳性，而与对照混合血清反应为阴性的噬菌体，作为可能有筛选意义的克隆进行后续研究，共筛选出22个有意义克隆，其PCR产物经天根公司进行测序，得到了其核酸序列，其中有相同序列，共13个不同克隆，将其13个序列与NCBI库进行比对。
这些噬菌体克隆表面所展示的抗原具有诊断肺癌的潜能，后将应用其对肺癌病人和对照血清进行ELISA试验筛选，以确定其在临床中检测早期肺癌的可行性。
②独立血样筛选
将初筛后的有意义噬菌体应用30例肺癌病人血清单独进行ELISA，方法同前，不同在于筛选所有的血清为独立的，而不是混合血清。实验方法为，包被某待测噬菌体四孔，两孔加入某例肺癌病人的血清，两孔不加血清作空白对照，另包被空噬菌体两孔，同样加前肺癌病人血清作阴性对照，其他实验方法同上。用空白孔调零后，样品平均OD值/阴性对照平均OD值，比值≥2.0，判断为阳性；统计这13个噬菌体将肺癌患者血清正确判断为阳性的能力，见下表。
表一噬菌体筛选阳性率汇总表
从中挑选出7个阳性率偏高的噬菌体：72、91、96、252、286/306、290/354/379/2065、357来进行血清学验证。
③血清学验证
将这七个噬菌体分别与49例肺癌患者血清和35例对照血清进行反应，方法同独立样本筛选。根据得出的样品孔OD值/对应的阴性对照OD值的比值，绘制ROC曲线。由于357号噬菌体ROC曲线图中，曲线下面积较小，为0.690筛选效果不佳，将其舍去。为使得整个试剂盒具有较高的敏感度和特异度，在确定单个克隆恰当的cut-off值时保证特异度高于80％，而适当放低敏感度，再通过不同克隆并联检测，提高敏感度。确定的cut-off值见下表，其ROG曲线(见图4-图9)。
表二检测用噬菌体cut-off值汇总表
二、制备试剂盒
应用筛选出的带有肺癌抗原肽I(SMMU-EPII)、肺癌抗原肽II(SMMU-EPIII)、肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)、肺癌抗原肽IV(SMMU-EPIIV)、肺癌抗原肽V(SMMU-EPIV)和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)的六个重组噬菌体液各100-200μl(滴度为108--1015pfu/L，用0.5％-2％BSA按1∶2--1∶8稀释)，2℃--6℃摇床2h-4h，等量分别包被到固相载体上不同的酶标孔中。
所述固相载体为96孔聚苯乙烯酶标板。
所述肺癌抗原肽I(SMMU-EPI I)、肺癌抗原肽II(SMMU-EPI II)、肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)、肺癌抗原肽IV(SMMU-EPIIV)、肺癌抗原肽V(SMMU-EPIV)和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)这六个重组噬菌体根据其cut-off值来并联检测，只要一种一个噬菌体判断为阳性，则该结果为阳性。从而判断49例肺癌患者血清和35例对照血清结果汇总如下：
ELISA检测结果汇总表
由此计算该ELISA检测方法的敏感度为85.7％、特异度为80％、正确率为83.3％，Kappa指数为65.7％，这6个噬菌体克隆并联检测肺癌患者血清为早期肺癌患者提供了有效的检测手段。
附图说明
图1：肺癌噬菌体展示肽库原始库。
图2：亲和筛选的原理。
图3：随机挑选噬菌斑PCR扩增。
图4：SMMU-EPII噬菌体ROC曲线图。
图5：SMMU-EPIII噬菌体ROC曲线图。
图6：SMMU-EPIIII噬菌体ROC曲线图。
图7：SMMU-EPIIV噬菌体ROC曲线图。
图8：SMMU-EPIV噬菌体ROC曲线图。
图9：SMMU-EPIVI噬菌体ROC曲线图。
具体实施方式
试剂盒的组成：
实施例1
将T7 tail fiber抗体，按1∶1000稀释度，每孔用100μl PBS(PH7.4)包被于96孔酶标板，4℃摇床轻摇过夜。每孔150μl洗液，洗四次，每次约1分钟，拍干。2％BSA/PBS 200ul室温(24℃)封闭2小时。)每孔加150μl洗液，洗四次，每次约1分钟，拍干。共设置12孔，每两孔重复，设置为副孔，第一孔和第二孔加入1％BSA 1∶5稀释的肺癌抗原肽I(SMMU-EPII)100μl、第三孔和第四孔加入1％BSA 1∶5稀释的肺癌抗原肽II(SMMU-EPIII)100μl、肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)、肺癌抗原肽IV(SMMU-EPIIV)、肺癌抗原肽V(SMMU-EPIV)和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)各100μl也同理依次加入剩下8孔，另加入没有插入片段的50号噬菌体作为阴性对照和空白对照各2孔，共16孔。室温孵育2小时。弃去孔内液体，拍干。此时肿瘤特异抗原从而由于抗原抗体反应而成功的固定在酶标板上。
实施例2
将T7 tail fiber抗体，按1∶1000稀释度，每孔用100μl PBS(PH7.4)包被于96孔酶标板，4℃摇床轻摇过夜，每孔加150μl洗液，洗四次，每次约1分钟，拍干。2％BSA/PBS 200ul室温(24℃)封闭2小时。)
每孔加150μl洗液，洗四次，每次约1分钟，拍干。共设置12孔，每两孔重复，设置为副孔，第一孔和第二孔加入1％BSA 1∶4稀释的肺癌抗原肽I(SMMU-EPII)100μl、第三孔和第四孔加入1％BSA 1∶5稀释的肺癌抗原肽II(SMMU-EPIII)100μl、肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)、肺癌抗原肽IV(SMMU-EPIIV)、肺癌抗原肽V(SMMU-EPIV)和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)各200μl也同理依次加入剩下8孔，另加入没有插入片段的50号噬菌体作为阴性对照和空白对照各2孔，共16孔。室温孵育2小时。弃去孔内液体，拍干。此时肿瘤特异抗原从而由于抗原抗体反应而成功的固定在酶标板上.
ELISA检测肺癌病人
实施例3
每个噬菌体标本加入100μl1％BSA 1∶500稀释的肺癌病人血浆，室温孵育1小时。洗液洗板，每孔150μl，洗四次，每次约1分钟，拍干。每孔加入100μl 1∶10000稀释的HRP耦联的山羊抗人IgG，室温孵育1小时。洗液洗板，每孔150μL，洗四次，每次约1分钟，拍干。每孔加入温度平衡至室温的显色剂A、B各1滴，混匀后，37℃孵育20分钟，加入终止液25μl。立刻用酶标仪检测，取波长450nm，先用空白孔调零，然后读取各孔的OD值，并记录结果。
结果判断
每次进行ELISA按下列公式计算并判断结果：用空白孔调零后，样品OD值/阴性对照平均OD值，比值≥cut-off值，判断为阳性结果；样品OD值/阴性对照平均OD值，比值＜2.0，判断为阴性结果。
6个噬菌体中任何一个噬菌体为阳性，则将其结果判断为阳性。该试剂盒则将待测血清判断可能为肺癌早期患者血清。
核苷酸及其对应氨基酸序列表
<110>第二军医大学
<120>一种肺癌早期特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒
<160>6
<210>1
<211>267
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽I(SMMU-EPII)重组T7噬菌体
<220>
<221>gene
<222>(6)...(262)
<223>来源于人类基因组中的HLA-B基因的CDS
<400>1
aat tca agc gct tga attctcctgc agggatatcc cgggagctcg tcgacaagct tggctgtcct 65
Asn Ser Ser Ala
1 4
agcagttgtg gtcatcggag ctgtggtcgc tgctgtg atg tgt agg agg aag agt 120
Met Cys Arg Arg Lys Ser
1 5
tca ggt gga aaa gga ggg agc tac tct cag gct gcg tgc agc gac 165
Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Cys Ser Asp
10 15 20
agt gcc cag ggc tct gat gtg tct ctc aca gct tga aaagcctgag 211
Ser Ala Gln Gly SerAsp Val Ser Leu Thr Ala
25 30 31
acagctgtct tgtgagggac tgag atg cag gat ttc ttc acg cct ccc ctc aag ct 267
Met Gln Asp Phe Phe Thr Pro Pro Leu Lys
1 5 9
<210>2
<211>420
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽II(SMMU-EPIII)重组T7噬菌体
<400>2
aat tca agc gtc cca gct act cgg gag gct gag gca gga gaa tgg 45
Asn Ser Ser Val Pro Ala Thr Arg Glu Ala Glu Ala Gly Glu Trp
1 5 15
tgt gaa cct ggg agg cgg agc ttg tag tgagccgaga tcgcaccact gaactcgagc 102
Cys Glu Pro Gly Arg Arg Ser Leu
20 23
ctgggtgaca gagcgagact ccatctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaactt ggggcccccc 162
cccaataaat tatttacccc ctggggcccc caaagggggc tgggagggta aaaaagtacc 222
gggggggggc cgcgtttttt tttttttttt tttttagaga gggactctct ctctcacagg gggggg 288
atg ggg ggg aga tat agc gct cgt ctc cgg gcc cca ctt ctc tgt gcc 333
Met Gly Gly Arg Tyr Ser Ala Arg Leu Arg Ala Pro Leu Leu Cys Ala
1 5 15
ccc cct ctt tgg ggg ggg ggg aga aag ggg gtg ttt ttt ccc ccc 378
Pro Pro Leu Trp Gly Gly Gly Arg Lys Gly Val Phe Phe Pro Pro
20 25 30
ccc ccc ccc ccc caa aaa aaa caa caa aca caa aca gat 420
Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Gln Gln Thr Gln Thr Asp
35 40 43
<210>3
<211>342
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)重组T7噬菌体
<220>
<221>rRNA
<222>(6)...(337)
<223>来源于核糖体RNA的28S
<400>3
aat tca agc gct tga attcaagcct ctcgcagacc cgacgcaccc ccgccacgca 55
Asn Ser Ser Ala
1 4
gttttatccg gtaaagcga atg att aga ggt ctt ggg gcc gaa acg atc tca 107
Met Ile Arg Gly Leu Gly Ala Glu Thr Ile Ser
1 5 10
acc tat tct caa act tta aat ggg taa gaagcccggc tcgctggcgt ggagccgggc 164
Thr Tyr Ser Gln Thr Leu Asn Gly
1 5 18
gtgga atg cga gtg cct agt ggg cca ctt ttg gta agc aga act ggc gct gcg 217
Met Arg Val Pro Ser Gly Pro Leu Leu Val Ser Arg Thr Gly Ala Ala
1 5 15
gga tga accgaacgcc gggttaaggc gcccg 248
Gly
16
atg ccg acg ctc atc aga ccc cag aaa agg tgt tgg ttg ata tag acagcaggac 303
Met Pro Thr Lu Ile Arg Pro Gln Lys Arg Cys Trp Leu Ile
1 5 10 13
ggtggcc atg gaa gtc gga atc cgc taa ggagtgaagc t 342
Met Glu Val Gly Ile Arg
1 5
<210>4
<211>54
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽IV(SMMU-EPIIV)重组T7噬菌体
<220>
<221>gene
<222>(6)...(49)
<223>来源于人类基因组中的WDR66基因
<400>4
Aat tca agc gct tga attctcctgc agggatatcc cgggagctcg tcgacaagc 54
Asn Ser Ser Ala
1 4
<210>5
<211>79
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽V(SMMU-EPIV)重组T7噬菌体
<400>5
aat tca agc gct tga attcaagcaa ggactgagct tagatatctg g 46
Asn Ser Ser Ala
1 4
atg ctg atg aaa gac agc ttg ttt aac caa gct 79
Met Leu Met Lys Asp Ser Leu Phe Asn Gln Ala
1 5 10
<210>6
<211>266
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)重组T7噬菌体
<220>
<221>gene
<222>(6)...(261)
<223>来源于人类基因组中的OLFM1基因
<400>6
aat tca agc ctc aat cca tag aggtcttgga caggcggacc cagagagact tgcagtacgt 61
Asn Ser Ser Leu Asn Pro
1 5 6
ggagaag atg gaa gag aca tgt tct gca cct tct cca gta gct gcc tca gct gtt 116
Met Glu Glu Thr Cys Ser Ala Pro Ser Pro Val Ala Ala Ser Ala Val
1 5 15
ttg tgc ggg cat ccc gtg aac aca tgg tct gct gtg ggg cga cca 161
Leu Cys Gly His Pro Val Asn Thr Trp Ser Ala Val Gly Arg Pro
20 25 30
ctg tgc aga tac acc tgc cct cgc tgt cct ggg cag agc tgt aca 206
Leu Cys Arg Tyr Thr Cys Pro Arg Cys Pro Gly Gln Ser Cys Thr
35 40 45
cct gcc agc tct cct cag ggt tgg tgg gca gca cgc cgg tgc tgc 251
Pro Ala Ser Ser Pro Gln Gly Trp Trp Ala Ala Arg Arg Cys Cys
50 55 60
ggt cgc aac aaa gct 266
Gly Arg Asn Lys Ala
65
纯氨基酸序列表
<110>第二军医大学
<120>一种肺癌早期特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒
<160>12
<210>1
<211>4
<212>PRT
<213>肺癌抗原肽I(SMMU-EPII)、肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)和肺癌
抗原肽IV(SMMU-EPIIV)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列羧基端
<400>1
Asn Ser Ser Ala
1 4
<210>2
<211>32
<212>PRT
<213>肺癌抗原肽I(SMMU-EPII)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列氨基端
<400>2
Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln
1 5 15
Ala Ala Cys Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala
20 25 30 31
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>肺癌抗原肽I(SMMU-EPII)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列氨基端
<400>3
Met Gln Asp Phe Phe Thr Pro Pro Leu Lys
1 5 9
<210>4
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<212>PRT
<213>肺癌抗原肽II(SMMU-EPIII)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列羧基端
<400>4
Asn Ser Ser Val Pro Ala Thr Arg Glu Ala Glu Ala Gly Glu Trp Cys
1 5 15
Glu Pro Gly Arg Arg Ser Leu
20 23
<210>5
<211>44
<212>PRT
<213>肺癌抗原肽II(SMMU-EPIII)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列氨基端
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Met Gly Gly Arg Tyr Ser Ala Arg Leu Arg Ala Pro Leu Leu Cys Ala
1 5 15
Pro Pro Leu Trp Gly Gly Gly Arg Lys Gly Val Phe Phe Pro Pro Pro
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<211>19
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<213>肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列
<400>6
Met Ile Arg Gly Leu Gly Ala Glu Thr Ile Ser Thr Tyr Ser Gln Thr
1 5 10 15
Leu Asn Gly
18
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<213>肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列
<400>7
Met Arg Val Pro Ser Gly Pro Leu Leu Val Ser Arg Thr Gly Ala Ala
1 5 15
Gly
16
<210>8
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<212>PRT
<213>肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列
<400>8
Met Pro Thr Lu Ile Arg Pro Gln Lys Arg Cys Trp Leu Ile
1 5 10 13
<210>9
<211>6
<212>PRT
<213>肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列氨基端
<400>9
Met Glu Val Gly Ile Arg
1 5
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>肺癌抗原肽V(SMMU-EPIV)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列氨基端
<400>10
Met Leu Met Lys Asp Ser Leu Phe Asn Gln Ala
1 5 10
<210>11
<211>6
<212>PRT
<213>肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列羧基端
<400>11
Asn Ser Ser Leu Asn Pro
1 5 6
<210>12
<211>66
<212>PRT
<213>肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)重组T7噬菌体人工序列
<220>
<223>根据载体的开放性读码框，而读出来的多肽序列氨基端
<400>12
Met Glu Glu Thr Cys Ser Ala Pro Ser Pro Val Ala Ala Ser Ala Val
1 5 15
Leu Cys Gly His Pro Val Asn Thr Trp Ser Ala Val Gly Arg Pro Leu
20 25 30
Cys Arg Tyr Thr Cys Pro Arg Cys Pro Gly Gln Ser Cys Thr Pro Ala
35 40 45
Ser Ser Pro Gln Gly Trp Trp Ala Ala Arg Arg Cys Cys Gly Arg Asn
50 55 60
Lys Ala
Claims (3)
1、一种肺癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒由固相载体和含有重组肺癌特异性抗原肽：肺癌抗原肽I、肺癌抗原肽II、肺癌抗原肽III、肺癌抗原肽IV、肺癌抗原肽V和肺癌抗原肽VI的六个重组噬菌体液各100-200μl，滴度为108--1015pfu/L，用0.5％-2％BSA按1∶2--1∶8稀释，2℃--6℃摇床2h-4h，等量分别包被到固相载体上不同的酶标孔中所组成。
2、根据权利要求1的试剂盒，其特征在于所述肺癌抗原肽I、肺癌抗原肽II、肺癌抗原肽III、肺癌抗原肽IV、肺癌抗原肽V和肺癌抗原肽VI的核苷酸序列及其氨基酸序列分别为以下1、2、3、4、5、6个序列：
<210>1
<211>267
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽I(SMMU-EPI I)重组T7噬菌体
<220>
<221>gene
<222>(6)…(262)
<223>来源于人类基因组中的HLA-B基因的CDS
<400>1
aat tca agc gct tga attctcctgc agggatatcc cgggagctcg tcgacaagct tggctgtcct 65
Asn Ser Ser Ala
14
agcagttgtg gtcatcggag ctgtggtcgc tgctgtg atg tgt agg agg aag agt 120
Met Cys Arg Arg Lys Ser
15
tca ggt gga aaa gga ggg agc tac tct cag gct gcg tgc agc gac 165
Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Cys Ser Asp
10 15 20
agt gcc cag ggc tct gat gtg tct ctc aca gct tga aaagcctgag 211
Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala
25 30 31
acagctgtct tgtgagggac tgag atg cag gat ttc ttc acg cct ccc ctc aag ct 267
Met Gln Asp Phe Phe Thr Pro Pro Leu Lys
1 5 9
<210>2
<211>420
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽II(SMMU-EPI II)重组T7噬菌体
<400>2
aat tca agc gtc cca gct act cgg gag gct gag gca gga gaa tgg 45
Asn Ser Ser Val Pro Ala Thr Arg Glu Ala Glu Ala Gly Glu Trp
1 5 15
tgt gaa cct ggg agg cgg agc ttg tag tgagccgaga tcgcaccact gaactcgagc 102
Cys Glu Pro Gly Arg Arg Ser Leu
20 23
ctgggtgaca gagcgagact ccatctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaactt ggggcccccc 162
cccaataaat tatttacccc ctggggcccc caaagggggc tgggagggta aaaaagtacc 222
gggggggggc cgcgtttttt tttttttttt tttttagaga gggactctct ctctcacagg gggggg 288
atg ggg ggg aga tat agc gct cgt ctc cgg gcc cca ctt ctc tgt gcc 333
Met Gly Gly Arg Tyr Ser Ala Arg Leu Arg Ala Pro Leu Leu Cys Ala
1 5 15
ccc cct ctt tgg ggg ggg ggg aga aag ggg gtg ttt ttt ccc ccc 378
Pro Pro Leu Trp Gly Gly Gly Arg Lys Gly Val Phe Phe Pro Pro
20 25 30
ccc ccc ccc ccc caa aaa aaa caa caa aca caa aca gat 420
Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Gln Gln Thr Gln Thr Asp
35 40 43
<210>3
<211>342
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽III(SMMU-EPI III)重组T7噬菌体
<220>
<221>rRNA
<222>(6)…(337)
<223>来源于核糖体RNA的28S
<400>3
aat tca agc gct tga attcaagcct ctcgcagacc cgacgcaccc ccgccacgca 55
Asn Ser Ser Ala
1 4
gttttatccg gtaaagcga atg att aga ggt ctt ggg gcc gaa acg atc tca 107
Met Ile Arg Gly Leu Gly Ala Glu Thr Ile Ser
1 5 10
acc tat tct caa act tta aat ggg taa gaagcccggc tcgctggcgt ggagccgggc 164
Thr Tyr Ser Gln Thr Leu Asn Gly
1 5 18
gtgga atg cga gtg cct agt ggg cca ctt ttg gta agc aga act ggc gct gcg 217
Met Arg Val Pro Ser Gly Pro Leu Leu Val Ser Arg Thr Gly Ala Ala
1 5 15
gga tga accgaacgcc gggttaaggc gcccg 248
Gly
16
atg ccg acg ctc atc aga ccc cag aaa agg tgttgg ttg ata tag acagcaggac 303
Met Pro Thr Lu Ile Arg Pro Gln Lys Arg Cys Trp Leu Ile
1 5 10 13
ggtggcc atg gaa gtc gga atc cgc taa ggagtgaagc t 342
Met Glu Val Gly Ile Arg
1 5
<210>4
<211>54
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽IV(SMMU-EPIIV)重组T7噬菌体
<220>
<221>gene
<222>(6)…(49)
<223>来源于人类基因组中的WDR66基因
<400>4
Aattca agc gct tga attctcctgc agggatatcc cgggagctcg tcgacaagc 54
Asn Ser Ser Ala
1 4
<210>5
<211>79
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽V(SMMU-EPlV)重组T7噬菌体
<400>5
aat tca agc gct tga attcaagcaa ggactgagct tagatatctg g 46
Asn Ser Ser Ala
1 4
atg ctg atg aaa gac agc ttg ttt aac caa gct 79
Met Leu Met Lys Asp Ser Leu Phe Asn Gln Ala
1 5 10
<210>6
<211>266
<212>DNA
<213>肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)重组T7噬菌体
<220>
<221>gene
<222>(6)…(261)
<223>来源于人类基因组中的OLFM1基因
<400>6
aat tca agc ctc aat cca tag aggtcttgga caggcggacc cagagagact tgcagtacgt 61
Asn Ser Ser Leu Asn Pro
1 5 6
ggagaag atg gaa gag aca tgt tct gca cct tct cca gta gct gcc tca gct gtt 116
Met Glu Glu Thr Cys Ser Ala Pro Ser Pro Val Ala Ala Ser Ala Val
1 5 15
ttg tgc ggg cat ccc gtg aac aca tgg tct gct gtg ggg cga cca 161
Leu Cys Gly His Pro Val Asn Thr Trp Ser Ala Val Gly Arg Pro
20 25 30
ctg tgc aga tac acc tgc cct cgc tgt cct ggg cag agc tgt aca 206
Leu Cys Arg Tyr Thr Cys Pro Arg Cys Pro Gly Gln Ser Cys Thr
35 40 45
cct gcc agc tct cct cag ggt tgg tgg gca gca cgc cgg tgc tgc 251
Pro Ala Ser Ser Pro Gln Gly Trp Trp Ala Ala Arg Arg Cys Cys
50 55 60
ggt cgc aac aaa gct 266
Gly Arg Asn Lys Ala
65
。
3、一种如权利要求1所述肺癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
一、制备重组肺癌特异抗原肽：
1)构建肺癌噬菌体展示肽库
抽提30例新鲜肺癌组织总RNA，等量混合成1mg后抽提mRN A，应用随机引物反转录为cDN A，将cDN A末端进行平齐，加Ecol I/Hin d III接头，用Ecol I和Hin d III两种限制性内切酶依次进行酶切反应后，去除小片断后接入T7噬菌体双臂，进行体外包装，从而构建成肺癌噬菌体展示肽库，并测定构建的噬菌体展示肽库库容量为3×106pfu，重组率为60％，符合筛选后期试验要求；
2)亲和筛选肺癌特异抗原肽
为了富集可以和肺癌自身抗体结合的特异展示肽，进行了正反向的5轮亲和筛选，取10μl A/G的琼脂糖珠于一1.5ml离心管中，PBS PH7.4500μl洗2次，1％BSA 4℃封闭1h，琼脂糖珠分别与15μl肺癌患者及对照患者的血浆4℃孵育过夜；PBS 500μl洗涤3次后，用10μl P BS溶解富集到的抗体，10管肺癌的抗体及10管非肺癌的抗体各自合并成一管，取噬菌体库扩增液20μl，先与20μl的非肺癌抗体孵育1h，未结合的上清再与20μl肺癌抗体结合，保留结合到琼脂糖珠上的噬菌体，并100μl％SDS洗脱，将其转染细菌至扩增，此为一轮筛选，如此反复5轮；
3)血清学筛选肺癌早期检测分子标志
1)混合血样初筛
筛选后的肽库用LB液体培养基1∶108稀释后，取100μl噬菌体液、250μl新摇好的BLT 5403田菌，3ml保温55℃的顶层琼脂，混匀后立刻倒入铺有LB的平皿中，冷却后，37℃温箱孵育4小时，有单个的噬菌体形成，每1个1.5ml离心管中，加入新摇好的细菌BLT 5403 1ml，用消毒的牙签随机挑取1个单个的、边界清晰的噬菌体于1个1.5ml离心管中，并按顺序编号，挑好的噬菌体置37℃恒温振荡器摇4小时-12h，直至每一管液体均变澄清为止；共随机挑选噬菌体5000个，挑选好的噬菌体置4℃保存；用T7引物进行PCR反应，扩增所挑选噬菌体的插入片段，挑取扩增片段200BP以上的噬菌体进行ELISA实验进一步筛选；
将T7tailer fiber抗体(NOVAGE N)，用PBS PH7.4按1∶1000来稀释，取100μl包被于96孔酶标板，4℃摇床轻摇过夜，用洗液洗板，每孔150μl，洗四次，每次1分钟，拍干，200μl 2％BSA/PBS室温24℃封闭2小时；洗板同前，加入用1％BSA 1∶5稀释的噬菌体100μl，每个标本加4孔，每次试验均加入没有插入片段的50号空噬菌体作为阴性对照4孔和空白对照2孔，室温孵育2小时；弃去孔内液体，拍干；每个噬菌体标本加入100μl1％BSA 1∶500稀释的肺癌组混合血浆、对照组混合血浆各2孔；同时包被空噬菌体四孔，每两孔分别加肺癌患者混合血清和对照混合血清，作前面四孔相应的阴性对照，室温孵育1小时；洗板后每孔加入1∶10000稀释的HRP耦联的山羊抗人IgG，室温孵育1小时，洗板后每孔加入温度平衡至室温的显色剂A、B各1滴，混匀后，37℃孵育20分钟，加入终止液25μl，
立刻用酶标仪检测，取波长450nm，先用空白对照调零，然后读取各孔的OD值，并记录结果，每次进行ELISA按下列公式计算并判断结果：用空白孔调零后，样品平均OD值/阴性对照平均OD值，比值≥2.0，判断为阳性结果；样品OD值/阴性对照平均OD值，比值＜2.0，判断为阴性结果，找出与肺癌混合血清反应为阳性.；
2)独立血样筛选
将初筛后的有意义噬菌体应用30例肺癌病人血清单独进行ELI SA，方法同步骤1)，不同在于筛选所有的血清为独立的，而不是混合血清；实验方法为，包被某待测噬菌体四孔，两孔加入某例肺癌病人的血清，两孔不加血清作空白对照，另包被空噬菌体两孔，同样加步骤1)肺癌病人血清作阴性对照，其他实验方法同步骤1)；用空白孔调零后，样品平均OD值/阴性对照平均OD值，比值≥2.0，判断为阳性；
二、制备试剂盒
应用筛选出的带有肺癌抗原肽I、肺癌抗原肽II、肺癌抗原肽III、肺癌抗原肽IV、肺癌抗原肽V和肺癌抗原肽VI的六个重组噬菌体液各100-200μl，滴度为108--1015pfu/L，用0.5％-2％BSA按1∶2--1∶8稀释，2℃--6℃摇床2h-4h，等量分别包被到固相载体上不同的酶标孔中，制备试剂盒。
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