CN101624623A - 一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒 - Google Patents
一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101624623A CN101624623A CN200810116604A CN200810116604A CN101624623A CN 101624623 A CN101624623 A CN 101624623A CN 200810116604 A CN200810116604 A CN 200810116604A CN 200810116604 A CN200810116604 A CN 200810116604A CN 101624623 A CN101624623 A CN 101624623A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- abl
- sequence
- internal control
- test kit
- time quantitative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒。该试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品和内参基因实时定量PCR体系。本发明的试剂盒可以准确、快速、定量测定ABL mRNA水平。在各种白血病融合基因检测中，可以ABL为内参基因，用本发明的试剂盒进行内参基因的定量，以实现各种白血病融合基因的准确、快速、定量，进而准确、快速地进行白血病的分子诊断和微小残留病的监测，为临床疾病确诊、治疗方案的确定、疗效评价及预后提供重要的分子依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒。
背景技术
近几年发明的实时定量PCR技术(RQ-PCR)实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃。与普通PCR相比，RQ-PCR除了能够定量之外还具有以下优点：(1)通过在PCR反应体系中加入探针或通过制作熔解曲线，使特异性增强、灵敏度提高；(2)扩增过程中闭管操作，实时收集数据，降低了污染机会，减少假阳性结果；(3)无需电泳，缩短了操作时间；(4)通过定量内参基因来评价样本质量，减少了假阴性结果。基于TaqMan探针的RQ-PCR技术关键之处在于：PCR反应体系中除了上、下游引物外还加入了TaqMan探针，该探针的5′端和3′端分别标有荧光报告基团(如FAM或TET)和荧光淬灭基团(如TAMRA)。PCR反应前，探针完整，荧光报告基团发射的荧光信号被荧光淬灭基团淬灭；随着PCR反应的进行，Taq酶发挥5’→3’的外切活性，使切下来的荧光报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号，荧光信号的强度与初始模板DNA的量成正比，当荧光信号强度大于阈值(基线以上10个SD)时，即可被荧光探测器定期实时监测，每个样本的CT值(PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数)与起始模板量的对数值成正比，可以根据CT值利用标准曲线分别计算出目的基因及内参基因的量，二者相除的比值即为目的基因的相对水平。
要计算出起始模板的量必须利用标准曲线，标准曲线的制作是采用经过系列稀释的已知起始量的标准品进行RQ-PCR，标准品可以是已知质量的cDNA或已知拷贝数的质粒，前者制作比较简单，但是得到的未知样品结果不直观，较难理解；而质粒标准品尽管制备比较繁琐，但是利用它可以计算出未知样品的拷贝数，且结果直观，是目前应用最广泛的标准品类型。
内参基因选择的目的是为了消除不同样本之间mRNA质量、数量以及逆转录效率等方面的差异，内参基因的选择有以下三大要求：(1)在所有有核细胞中均稳定表达，与分化系列及分化阶段无关，不受实验处理的影响；(2)不存在假基因；(3)表达水平及降解水平与目的基因一致。
因此，通过构建ABL质粒标准品并实现对内参基因的绝对定量，是实时定量PCR的前提和基础，有利于检测技术标准化和临床推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒。
本发明所提供的定量检测ABL mRNA水平的试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品、内参基因实时定量PCR体系；
所述内参基因优选为ABL基因，以ABL基因作为内参基因时，所述内参基因实时定量PCR体系包括上游引物、下游引物和TaqMan探针，所述内参基因实时定量PCR体系的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
上述内参基因实时定量PCR体系中还包括荧光PCR的Master Mix。
本发明中，上述内参基因实时定量PCR体系中的TaqMan探针的3′端连接有荧光淬灭基团TAMRA，5′端连接有荧光报告基团FAM。
上述定量检测ABL mRNA水平的试剂盒中的标准品为含有ABL基因的质粒标准品，所述ABL基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
为了方便使用，上述定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒还包括阴性对照质粒。
本发明的定量检测ABL mRNA水平的试剂盒具有以下特点：
1、覆盖面广：可用于以ABL为内参基因的多种白血病融合基因的实时定量PCR检测中。
2、敏感度高：可重复敏感度为5个拷贝。
3、成本低：实验体系仅为10μl，各成分用量均减少一半以上，从而使成本明显降低。
4、实用性强：本试剂盒同时包括内参基因实时定量PCR体系及质粒标准品，可定量出未知样本的ABL拷贝数，有利于判断样本的RNA质量和检测敏感度。
5、使用简便：使用时只需加入待测样品的cDNA即可开始PCR反应。
6、储存期长：-20℃条件下可以长期保存(＞1.5年)，且不影响检测效果。
本发明的试剂盒可以准确、快速、定量测定ABL mRNA水平。在各种白血病融合基因检测中，可以ABL为内参基因，用本发明的试剂盒进行内参基因的定量，以实现各种白血病融合基因的准确、快速、定量，进而准确、快速地进行白血病的分子诊断和微小残留病的监测，为临床疾病确诊、治疗方案的确定、疗效评价及预后提供重要的分子依据。
附图说明
图1为利用内参基因实时定量PCR体系扩增1×106-1×102拷贝的ABL质粒标准品制备的标准曲线
具体实施方式
如果两种基因的PCR扩增效率一致，那么分别利用它们的质粒标准品制作的两条标准曲线也是一样的，即标准曲线的斜率及纵截距与基因类型无关。因此实验中在验证目的基因和内参基因ABL的PCR扩增效率一致后，即可采用一条标准曲线同时定量目的基因和内参基因的拷贝数，这样不仅简便经济，更可以消除质粒定量带来的差异，提高RQ-PCR的准确度。
实施例1、定量检测ABL mRNA水平的试剂盒的制备
一、定量检测ABL mRNA水平的试剂盒中引物和探针的设计
实时定量PCR体系组成如下：
(1)上游引物(位于ABL外显子2)：
5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’(序列表中序列1)，终浓度为0.3μM；
(2)下游引物(位于ABL外显子3)：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’(序列表中序列2)，终浓度为0.3μM；
(3)TaqMan探针(位于ABL外显子3)：5’-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-3’(序列表中序列3)，终浓度为0.2μM；
(4)荧光PCR的Master Mix(购自美国ABI公司)。
上述内参基因实时定量PCR体系中的TaqMan探针的3′端连接有荧光淬灭基团TAMRA，5′端连接有荧光报告基团FAM。
二、ABL质粒标准品的制备
ABL质粒标准品包括1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL和1×102拷贝/μL五个浓度的质粒标准品，其具体制备方法如下：
依据标准品序列覆盖并大于RQ-PCR扩增产物的原则设计PCR扩增ABL质粒标准品的引物，具体序列为：上游引物5’-CCTTCAGCGGCCAGTAGC-3’，下游引物5，-GGACACAGGCCCATGGTAC-3’。提取正常人离体外周血单个核细胞的总RNA，将其反转录成cDNA并以该cDNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测、回收、纯化，将纯化后的产物连接到pGEM-T Easy载体上，并转染TOP10大肠杆菌感受态细胞，利用蓝白斑筛选阳性克隆。提取阳性克隆进行质粒小提并测序，测序结果表明，连接到pGEM-T Easy载体上的ABL基因的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。其中，自5’末端第142位-第172位为上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系的上游引物，自5’末端第210位-第237位为上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系的TaqMan探针序列，自5’末端第245位-第265位为上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系的下游引物。
将上述测序结果正确的阳性克隆进行质粒中提，并测定质粒浓度、计算质粒拷贝数、进行10倍系列稀释，最后分装成1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL、1×101拷贝/μL，置-80℃冻存备用。
三、阴性对照质粒-WT1的制备
提取1例已经确诊为急性早幼粒细胞白血病患者骨髓单个核细胞的总RNA，将其反转录成cDNA，以该cDNA为模板，以5’-ccacagcacagggtacgaga-3’和5’-ctcagatgccgaccgtacaa-3’为引物PCR扩增WT1基因。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收、纯化后的产物连接到pGEM-T Easy载体上，并转染TOP10大肠杆菌感受态细胞，利用蓝白斑筛选阳性克隆。提取阳性克隆进行质粒小提并测序，测序结果表明，连接到pGEM-T Easy载体上的WT1基因的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5所示。得到的测序结果正确的质粒即为阴性对照质粒-WT1。
四、使用方法
所有待测样品均需扩增内参基因ABL，计算ABL的拷贝数并确定待测样品的质量。具体使用方法如下：
1、取离体的待检测病人骨髓或外周血单个核细胞，提取其总RNA，并将其反转录成cDNA。
2、在9μL上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系中加入1μL步骤1的待测样品的cDNA，进行实时定量PCR反应，然后计算ABL的拷贝数并确定待测样品的质量。
上述实时定量PCR反应的条件为：先50℃ 2min 1个循环；然后95℃ 10min 1个循环；再95℃ 15s，62℃ 1min，40个循环。
3、标准曲线的制作：在9μL上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系中分别加入1μL上述步骤二制备的拷贝数为1×106、1×105、1×104、1×103及1×102五个浓度的ABL质粒标准品，先50℃ 2min 1个循环；然后95℃ 10min 1个循环；再95℃ 15s，62℃ 1min，40个循环。制作标准曲线，其中1×102拷贝的ABL质粒标准品同时做两管平行管，其余各拷贝的ABL质粒标准品分别扩增一管。
利用上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系扩增1×106-1×102拷贝的ABL质粒标准品制备的标准曲线如图1所示。
4、每批RQ-PCR反应还需同时扩增阴性对照质粒。在9μL上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系中加入1μL上述步骤三制备的WT1质粒，进行实时定量PCR反应。
本发明的定量检测ABL mRNA水平的试剂盒的储存条件为：4℃避光储存至少2个月或-20℃避光储存1.5年。
五、本发明的定量检测ABL mRNA水平的试剂盒的敏感度、特异性和稳定性测定
1、敏感度：可重复敏感度为5个拷贝
将按照上述步骤二的方法制备的5个拷贝的ABL质粒标准品各5份，分别利用上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系进行5次重复实验，结果每次实验中均有扩增曲线，因此本发明的内参基因实时定量PCR体系的可重复敏感度为5个拷贝。
2、特异性
因为人类有核的造血细胞均含有ABL基因，利用上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系检测了不含ABL基因的WT1质粒，未出现扩增曲线，证实ABL检测具有特异性。
3、稳定性
以下稳定性实验中所用的标本均来自人民医院，为自愿供体的离体骨髓单个核细胞。
(1)日间差分析
提取标本G717的总RNA，将其反转录成cDNA，并以该cDNA为模板，利用上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系进行RQ-PCR反应，共进行5批次实验，结果如下表所示，从表中数据可知，日间差变异系数(CV)为1.83％。
| 样本编号 | CT值 | 检测时间 |
| 1 | 22.44 | 06-6-10AM |
| 2 | 22.91 | 05-6-17PM |
| 3 | 22.84 | 05-7-1PM |
| 4 | 23.35 | 05-7-8AM |
| 5 | 22.3 | 05-7-15AM |
(2)日内差分析
提取标本H236的总RNA，将其反转录成cDNA，并以该cDNA为模板，利用上述步骤一的内参基因实时定量PCR体系进行RQ-PCR反应，在同一批次进行了5个平行孔的RQ-PCR反应，结果如下表所示，从表中数据可知，日内差变异系数(CV)为1.35％。
| 样本编号 | CT值 | 检测时间 |
| 1 | 22.02 | 05-9-30AM |
| 2 | 22.2 | 05-9-30AM |
| 3 | 22.21 | 05-9-30AM |
| 4 | 21.83 | 05-9-30AM |
| 5 | 22.64 | 05-9-30AM |
4、以不同拷贝数的ABL质粒标准品为例检测试剂盒的储存温度和储存时间对实验结果的影响
利用本发明试剂盒检测1×103及1×107拷贝的ABL质粒标准品室温避光储存1周、4℃避光储存3周、6周、9周及12周、-20℃避光储存18个月时的检测结果，检测结果用CT值表示，具体结果如下面两表所示，从表中数据可以看出，随着储存温度和储存时间的变化，CT值无明显变化，表明试剂盒仍很稳定。
103拷贝的ABL质粒标准品不同储存温度及时间下的CT值变化
| 编号 | 储存温度(℃) | CT值 | 储存时间 |
| 1 | 室温 | 31.39 | 1周 |
| 2 | 4 | 31.3 | 3周 |
| 3 | 4 | 30.92 | 6周 |
| 4 | 4 | 31.18 | 9周 |
| 5 | 4 | 30.34 | 12周 |
| 6 | -20 | 31.89 | 18月 |
107拷贝的ABL质粒标准品不同储存温度及时间下的CT值变化
| 编号 | 储存温度(℃) | CT值 | 储存时间 |
| 1 | 室温 | 17.41 | 1周 |
| 2 | 4 | 17.66 | 3周 |
| 3 | 4 | 16.87 | 6周 |
| 4 | 4 | 16.65 | 9周 |
| 5 | 4 | 16.24 | 12周 |
| 6 | -20 | 17.82 | 18月 |
序列表
<160>5
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tggagataac actctaagca taactaaagg t 31
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gatgtagttg cttgggaccc a 21
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28
<210>4
<211>316
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ccttcagcgg ccagtagcat ctgactttga gcctcagggt ctgagtgaag ccgctcgttg 60
gaactccaag gaaaaccttc tcgctggacc cagtgaaaat gaccccaacc ttttcgttgc 120
actgtatgat tttgtggcca gtggagataa cactctaagc ataactaaag gtgaaaagct 180
ccgggtctta ggctataatc acaatgggga atggtgtgaa gcccaaacca aaaatggcca 240
aggctgggtc ccaagcaact acatcacgcc agtcaacagt ctggagaaac actcctggta 300
ccatgggcct gtgtcc 316
<210>5
<211>151
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ccacagcaca gggtacgaga gcgataacca cacaacgccc atcctctgcg gagcccaata 60
cagaatacac acgcacggtg tcttcagagg cattcaggat gtgcgacgtg tgcctggagt 120
agccccgact cttgtacggt cggcatctga g 151
Claims (6)
1、一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒，包括用于制作标准曲线的标准品和内参基因实时定量PCR体系；
所述内参基因实时定量PCR体系包括上游引物、下游引物和TaqMan探针；所述内参基因实时定量PCR体系的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述内参基因实时定量PCR体系中还包括荧光PCR的Master Mix。
3、根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述内参基因实时定量PCR体系中的TaqMan探针的3′端连接有荧光淬灭基团TAMRA，5′端连接有荧光报告基团FAM。
4、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述标准品为含有ABL基因的质粒标准品。
5、根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述ABL基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
6、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照质粒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200810116604A CN101624623A (zh) | 2008-07-11 | 2008-07-11 | 一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200810116604A CN101624623A (zh) | 2008-07-11 | 2008-07-11 | 一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101624623A true CN101624623A (zh) | 2010-01-13 |
Family
ID=41520615
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200810116604A Pending CN101624623A (zh) | 2008-07-11 | 2008-07-11 | 一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101624623A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101955991A (zh) * | 2010-03-31 | 2011-01-26 | 江苏迈迪基因生物科技有限公司 | 白血病相关的融合基因的联合检测方法及诊断试剂盒 |
| CN104178557A (zh) * | 2013-05-28 | 2014-12-03 | 上海生物芯片有限公司 | 白血病融合基因的检测方法及其引物、探针和基因芯片 |
| JP2018068140A (ja) * | 2016-10-25 | 2018-05-10 | アークレイ株式会社 | Ａｂｌ遺伝子増幅用プライマー、核酸増幅方法及び核酸増幅用キット |
-
2008
- 2008-07-11 CN CN200810116604A patent/CN101624623A/zh active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101955991A (zh) * | 2010-03-31 | 2011-01-26 | 江苏迈迪基因生物科技有限公司 | 白血病相关的融合基因的联合检测方法及诊断试剂盒 |
| WO2011120398A1 (zh) * | 2010-03-31 | 2011-10-06 | 江苏迈迪基因生物科技有限公司 | 白血病融合基因的联合检测方法及其诊断试剂盒 |
| CN101955991B (zh) * | 2010-03-31 | 2014-05-28 | 江苏迈迪基因生物科技有限公司 | 白血病相关的融合基因的联合检测方法及诊断试剂盒 |
| CN104178557A (zh) * | 2013-05-28 | 2014-12-03 | 上海生物芯片有限公司 | 白血病融合基因的检测方法及其引物、探针和基因芯片 |
| CN104178557B (zh) * | 2013-05-28 | 2018-10-26 | 上海生物芯片有限公司 | 白血病融合基因的检测方法及其引物、探针和基因芯片 |
| JP2018068140A (ja) * | 2016-10-25 | 2018-05-10 | アークレイ株式会社 | Ａｂｌ遺伝子増幅用プライマー、核酸増幅方法及び核酸増幅用キット |
| JP7007796B2 (ja) | 2016-10-25 | 2022-02-10 | アークレイ株式会社 | Ａｂｌ遺伝子増幅用プライマー、核酸増幅方法及び核酸増幅用キット |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101624621B (zh) | 一种定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒 | |
| CN108315416A (zh) | 基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法 | |
| CN102816847B (zh) | 用于检测布鲁氏菌的lamp引物及含有该引物的试剂盒 | |
| CN112980997B (zh) | 侵袭性毛霉病病原菌的引物和探针及其实现方法、检测系统 | |
| CN103451268B (zh) | 一种检测线粒体a3243g杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法 | |
| CN103937888A (zh) | 鉴别胃癌的血浆microRNA标志物的筛选与应用 | |
| CN106636430A (zh) | 用于预测乳腺癌的生物标记物组合、试剂盒及使用方法 | |
| CN101624622A (zh) | 一种定量检测PML/RARα mRNA水平的试剂盒 | |
| CN104694623A (zh) | 一种用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物及应用 | |
| CN112708673B (zh) | Prdm9转座子融合作为先天性巨结肠疾病标志物的应用 | |
| CN101624623A (zh) | 一种定量检测ABL mRNA水平的试剂盒 | |
| CN103667453A (zh) | 检测11q23/MLL融合基因相对表达量的方法、引物和探针 | |
| CN101624620A (zh) | 一种定量检测AML1/ETO mRNA水平的试剂盒 | |
| US9528161B2 (en) | Materials and methods for quality-controlled two-color RT-QPCR diagnostic testing of formalin fixed embedded and/or fresh-frozen samples | |
| CN111500687A (zh) | 一种乳腺癌21基因检测试剂盒 | |
| CN103571945A (zh) | 筛查和鉴定bcr-abl非常见融合型别的方法、引物、探针和试剂盒 | |
| CN101298630A (zh) | 一种Solexa技术鉴定结肠癌病人血清中微小核糖核酸的方法 | |
| CN110396542A (zh) | 一种LncRNA标记物及其在糖尿病中的应用 | |
| US20230220483A1 (en) | Biomarkers for predicting a patient's response to bcg therapy, methods and uses based thereon | |
| CN102827935B (zh) | 定量检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂盒 | |
| CN107002124A (zh) | 用于确定患有胰腺癌的患者的存活预后的方法 | |
| CN112481379B (zh) | 一种检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合与试剂盒 | |
| CN108913774A (zh) | 一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN103725787B (zh) | 一种白血病融合基因荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN102899390A (zh) | 小细胞肺癌标志物及其检测 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20100113 |