CN101623325A - 芳香新塔花总黄酮提取物及其生产方法和心血管药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种芳香新塔花总黄酮提取物及其生产方法和心血管药物的应用,该芳香新塔花总黄酮提取物按下述方法得到:将芳香新塔花干药材经过水或乙醇提取、大孔吸附树脂柱吸附、减压浓缩并干燥得到干燥黄色至棕黄色粉末状的芳香新塔花黄酮类提取物。本发明所得芳香新塔花的各提取物都能在制备心血管药物方面得到应用,并使收率降低(服用剂量降低,即达到同样的药效所使用的药材量降低),在提高疗效的同时,大大节约了芳香新塔花资源、降低了成本。
Description
一、技术领域
本发明涉及医药技术领域,是一种芳香新塔花总黄酮提取物及其生产方法和心血管药物的应用。
二、背景技术
芳香新塔花(Ziziphora clinopodioides Lam.),又名唇香草、小叶薄荷,为唇形科新塔花属植物。生于砾石坡地及半荒漠草滩上。我国分布于新疆,国外前苏联、蒙古亦有分布。史料记载,芳香新塔花全草入药,味辛性寒,具有疏散风热,清利头目,宁心安神,利水清热,壮骨强身,清胃消食等功效。我们前期系统研究了芳香新塔花的化学成分,表明芳香新塔花含大量黄酮类化合物,而黄酮类化合物具有广泛的药理活性,目前,黄酮类化合物在心血管疾病方面的作用已为人们所广泛接受。
黄酮类化合物是一类天然有机化合物,广泛存在于植物界,生物学和医药学界的研究结果显示,某些黄酮类化合物有着显著的活性:可维护血管正常的渗透压,防止血管硬化,降低血脂,降低胆固醇,抑制血栓形成,抗菌消炎,抑制肿瘤细胞增殖等。银杏、山楂、大豆等多种植物中的黄酮类化合物在医药和食品方面得到广泛研究和应用。
近年来研究发现,心血管等多种疾病的产生和发展与体内多余自由基对组织细胞的损伤有密切关系。现代药理学研究表明,酚酸、黄酮类化合物因其结构特点而具有很强的清除体内自由基作用,表现出多方面的生物活性:舒张血管、抗癌、抗病毒、抗菌消炎、抗过敏等活性。因此对该类成分的研究已成为天然药物领域的热点之一,尤其是在抗氧化作用、抗肿瘤及治疗心血管疾病等方面,引起了医药界的极大关注。
目前中国还没有与芳香新塔花总黄酮提取物有关的专利文献公开。与芳香新塔花有关的文献报道也较少,主要涉及其植物全草挥发油化学成分分析、植化成分等,例如,杨小菊等《芳香新塔花化学成分的分离与鉴定》(沈阳药科大学学报[J]2008,25(6)456~458);杨伟俊等《芳香新塔花挥发油的化学成分分析》(新疆中医药[J],2009,27(1):23-24)等文献。
上述已经公开的各种研究对其药理及药理活性基础方面的研究不够深入。没有涉及黄酮类成分的制备方法及其药理作用,已有文献仅针对水提取物的抗心肌缺血作用,给药量大,成分复杂,不仅造成资源浪费,还存在临床安全隐患。所以,芳香新塔花这一丰富的自然资源仍有待于深入研究和开发利用。
三、发明内容
本发明提供了一种芳香新塔花总黄酮提取物及其生产方法和心血管药物的应用,其克服了上述现有技术之不足,解决了芳香新塔花被充分利用的问题,提高了芳香新塔花资源的利用率,特别是本发明芳香新塔花总黄酮提取物在用于制备心血管药物方面的应用。
本发明的技术方案之一是通过以下方式得到的:一种芳香新塔花总黄酮提取物,其按下述方法得到:将芳香新塔花干药材,粉碎并过10目筛至50目筛,加入6倍重量份至12倍重量份的水或30%至90%乙醇水溶液,浸泡至透心,加热至微沸回流提取1次至4次,每次0.5小时至2.5小时,合并提取液,放置室温,过滤,滤液减压浓缩至干药材的1倍重量份至3倍重量份,浓缩液通过大孔吸附树脂柱,随后,在常温下依次以6倍重量份至12倍重量份的水、6倍重量份至12倍重量份的30%乙醇水溶液、6倍重量份至12倍重量份的50%乙醇水溶液、6倍重量份至12倍重量份的70%乙醇水溶液洗脱,洗脱流速为300ml/h至1000ml/h;收集上述乙醇水溶液洗脱液,减压浓缩并干燥得到干燥黄色至棕黄色粉末状的芳香新塔花黄酮类提取物。
本发明的技术方案之二是通过以下方式得到的:将芳香新塔花干药材,粉碎并过10目筛至50目筛,加入6倍重量份至12倍重量份的水或30%至90%乙醇水溶液,浸泡至透心,加热至微沸回流提取1次至4次,每次0.5小时至2.5小时,合并提取液,放置室温,过滤,滤液减压浓缩至干药材的1倍重量份至3倍重量份,浓缩液通过大孔吸附树脂柱,随后,在常温下依次以6倍重量份至12倍重量份的水、6倍重量份至12倍重量份的30%乙醇水溶液、6倍重量份至12倍重量份的50%乙醇水溶液、6倍重量份至12倍重量份的70%乙醇水溶液洗脱,洗脱流速为300ml/h至1000ml/h;收集上述乙醇水溶液洗脱液,减压浓缩并干燥得到干燥黄色至棕黄色粉末状的芳香新塔花黄酮类提取物。
下面是对上述技术方案的进一步优化和/或选择:
上述减压回收乙醇并浓缩是在40℃至80℃、-0.07Mpa至-0.1Mpa下进行的。
上述干燥是在50℃至80℃下的鼓风干燥箱内进行的或者干燥是在风温度130℃至190℃、出风温度30℃至90℃的喷雾干燥下进行的或者干燥是在冷冻干燥12小时至72小时进行的。
上述大孔吸附树脂柱采用下述型号:AB-8或SA-1,SA-3,FL-1,FL-3,DM-130,DM-B1,ADS-7,ADS-17,HPD-300,HPD-600,HP-20。
本发明的技术方案之三是通过以下方式得到的:上述的芳香新塔花总黄酮提取物在制备心血管药物方面的应用。
除另有说明外,本说明书的部分术语定义如下:
黄酮类化合物:指化学结构上属于黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类、黄烷醇类、双苯吡酮类、异黄酮类、查尔酮类、二氢查尔酮类、橙酮类、高异黄酮类等的化合物,以及它与单糖或寡糖形成的糖甙或其它形式的衍生物。
本发明所得芳香新塔花的各提取物都能在制备心血管药物方面得到应用,并使收率降低(服用剂量降低,即达到同样的药效所使用的药材量降低),在提高疗效的同时,大大节约了芳香新塔花资源、降低了成本。
四、附图说明
附图1为芳香新塔花总黄酮部位对离体血管环张力的影响,其中:横坐标刻度分别代表阳性对照药普奈洛尔的5个浓度级别(即1-5分别代表为0.001-0.10g/l 5个浓度级别),及受试药5个浓度级别(即1-5分别代表为0.03-3.0g/l 5个浓度级别)。
附图2为芳香新塔花总黄酮提取物不同浓度对DPPH·清除率。
五、具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制,可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
1、芳香新塔花总黄酮提取物的提取
1.1提取
将芳香新塔花干药材,粉碎并过10目筛至50目筛,加入6倍重量份至12倍重量份的水或30%至90%乙醇水溶液,浸泡至透心,加热至微沸回流提取1次至4次,每次0.5小时至2.5小时,合并提取液,放置室温,过滤,滤液减压浓缩至干药材的1倍重量份至3倍重量份,浓缩液通过大孔吸附树脂柱,随后,在常温下依次以6倍重量份至12倍重量份的水、6倍重量份至12倍重量份的30%乙醇水溶液、6倍重量份至12倍重量份的50%乙醇水溶液、6倍重量份至12倍重量份的70%乙醇水溶液洗脱,洗脱流速为300ml/h至1000ml/h;收集上述乙醇水溶液洗脱液,并减压浓缩并干燥得到干燥黄色至棕黄色粉末状的芳香新塔花总黄酮提取物。
上述减压回收乙醇并浓缩是在40℃至80℃、-0.07Mpa至-0.1Mpa下进行的。
上述干燥是在50℃至80℃下的鼓风干燥箱内进行的或者干燥是在风温度130℃至190℃、出风温度30℃至90℃的喷雾干燥下进行的或者干燥是在冷冻干燥12小时至72小时进行的。
上述大孔吸附树脂柱采用下述型号:AB-8或SA-1,SA-3,FL-1,FL-3,DM-130,DM-B1,ADS-7,ADS-17,HPD-300,HPD-600,HP-20。
本发明首次发现上述提取物具有抗氧化活性和抗心肌缺血作用。因此,本发明提供的所述提取物能够用于制备治疗和/或预防心血管药物方面的应用,如:心绞痛、冠脉粥样硬化、心肌缺血等病症;以及其它相关病症。本发明所述提取物与药学上可接受的载体组成治疗和/或预防某些心血管疾病的心血管药物,并以适合药用的制剂形式存在,这些制剂形式可以是片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等。
1.2总黄酮含量测定
紫外分光光度法测定条件如下:
对照品溶液:取芦丁为对照品,用95%乙醇水溶液制成每1ml含0.2mg的溶液;
供试品溶液:取新塔花总黄酮提取物,加95%乙醇水溶液,制成每1ml含0.4mg的溶液。
测定法:取对照品溶液及供试品溶液,按分光光度法(中国药典2005版一部附录IV A),在510nm处测定吸收度,总黄酮物质含量为20%~80%。
2、芳香新塔花总黄酮提取物清除DPPH自由基活性实验
心血管等多种疾病的产生和发展与体内多余自由基对组织细胞的损伤密切关系,同时大量的研究已经证实,自由基连锁反应是心肌缺血的核心病理环节,在心肌缺血时产生的自由基可引起心律失常、心肌顿抑及不可逆的心肌细胞凋亡,因此抗自由基活性对于防治心肌缺血损伤有重要的意义。故本实验考察所得芳香新塔花总黄酮的自由基捕获清除能力。
实验方法:抗氧化活性以清除DPPH自由基能力大小表示。根据预实验确定的实验条件,测定芳香新塔花总黄酮清除DPPH自由基的活性。精确吸取芳香新塔花总黄酮贮备液,用乙醇稀释为0.01mg/ml、0.0125mg/ml、0.0167mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml,取各浓度样品2ml,加入2ml 2×10-4mol/L DPPH·,摇匀,反应30min后,立即测517nm吸收值,测得的吸光度为A样品。用2ml无水乙醇加入2ml 2×10-4mol/L DPPH·溶液为空白对照,摇匀,反应30min测得的吸光度为A空白对照,
同上法,测定维生素C(VC)不同浓度溶液的A样品vc,A空白对照vc。
计算公式为:
DPPH·清除率(%)=[1-A样品/A空白对照]×100%
实验结果:通过公式计算,以DPPH清除率对样品浓度作图(图2),通过线性回归方程,求得总黄酮提取物半数清除率浓度(IC50)为0.017mg/ml,VC半数清除率浓度(IC50)为0.01mg/ml。
图2直观地表示了DPPH自由基清除率随着芳香新塔花总黄酮浓度的增大而增大,提示芳香新塔花总黄酮具有良好的抗DPPH自由基的活性,其浓度与DPPH自由基清除率有较好的量效关系,大量研究证明心肌组织细胞的损伤与体内自由基有着密切的关系,因此此实验初步推测其可能具有较好的保护心肌活性。
3、芳香新塔花总黄酮提取物对大鼠离体胸主动脉舒张作用实验
冠心病又称缺血性心脏病,是由于冠状动脉功能性或器质性病变导致冠脉供血和心肌需求之间不平衡所致的心肌损害,其实质是心肌缺血。而通过药物舒张血管,从而增加血流量是改善心肌供血的主要途径之一,本试验采用离体血管张力记录法观察芳香新塔花提取物对大鼠胸主动脉血管反应性的影响,提示芳香新塔花提取物对血管有明显舒张作用。
本试验的原理在于:血管平滑肌细胞内钙离子(Ca2+)浓度增高是血管收缩的必要条件,平滑肌细胞兴奋有两条钙通道参与钙离子内流:电压依赖性钙通道(VDC)和受体操纵性钙通道(ROC)。KCl可使细胞膜去极化,开放VDC,导致细胞外Ca2+内流,平滑肌收缩。血管环在预加入高浓度K+的无钙K-H液中孵育后,细胞膜处于去极化状态,电压依赖性钙通道处于活化状态,此时所引起的血管环收缩主要是细胞外Ca2+通过钙通道流入细胞内所引起。此实验考察芳香新塔花不同提取部位对KCl所刺激的血管收缩的舒张作用。
实验材料:(1)药品与试剂芳 香新塔花总黄酮提取物,由实验室制备;普萘洛尔,山西云鹏制药有限公司,国药准字H14020768;NaCl、KCl、CaCl2、KH2PO4、MgSO4、NaHCO3、葡萄糖、乙二胺四乙酸,均由上海冠戈实业有限公司生产。K-H生理液配方:NaCl 6.92g,KCl 0.35g,CaCl20.28g,KH2PO4 0.16g、MgSO4 0.29g、NaHCO3 2.1g、葡萄糖2.0g,溶于1L双蒸水中,pH=7.4。
(2)器材 BL-410生物机能实验系统、FT-100生物张力传感器,均由成都泰盟科技有限公司生产;DL-501型超级恒温器,上海试验设备厂制造;混合气体(95%O2+5%CO2),乌鲁木齐西明特种气体有限公司提供。
(3)动物 Wistar大鼠,雄性250±26.3g,由新疆医科大学动物实验中心提供,动物合格证号:新医动字SYXK(新)2003-0001。
实验方法:Wistar大鼠,雄性250±26.3g。断头处死,开胸迅速取出胸主动脉,置于预先混合气体饱和4℃的K-H液,小心去除外周的结缔组织,并剪成2~3mm长的血管环,将血管环置于盛有15mlK-H液(37℃恒温,并持续通入95%O2和5%CO2的混和气体,pH=7.4)的恒温套瓶中,每一个血管环用两个L型挂钩贯穿血管环管腔,一端固定,另一端连接于张力传感器,张力变化由BL-410生物机能实验系统采集并记录。血管环加静息张力2g,稳定90min,期间每15min用预温至37℃的K-H液更换液体。待血管环完全稳定后,用60mmol/L的KCl重复刺激3次,诱发血管的最大收缩幅度,连续3次同样的刺激所引起的收缩幅度差别<10%时,正式实验,并以此做为100%收缩张力。按浓度梯度加入芳香新塔花总黄酮提取物(终浓度为0.03,0.10,0.30,1.00,3.00g/L)、普萘洛尔阳性对照药(终浓度为0.001,0.003,0.01,0.03,0.10g/L),生理盐水组给予同体积的生理盐水,记录加入药物10分钟张力变化。本试验用舒张率表示。舒张率越大,表明作用越显著。
舒张率=[(加受试药前张力-加受试药后张力)/(药物刺激后张力-药物刺激前张力)]×100%
结果见表1和图1。
从表1可见,与生理盐水组相比较,阳性对照药普萘洛尔在终浓度0.1g/L的最大舒张率为122.00%;芳香新塔花总黄酮提取物在终浓度3g/L时,对KCl刺激血管收缩均有一定的舒张作用,其最大舒张率可达到90.34%。
从表1可见,用KCl刺激血管造成血管收缩模型后,给予生理盐水组对舒张血管的作用极其微弱,最大不超过1.5%,说明生理盐水不能有效舒张血管;阳性对照药普萘洛尔在终浓度0.1g/L的最大舒张率为122.00%,说明其舒张血管作用非常显著,作为临床广泛认可的治疗心血管疾病的化学药物,本试验以它做对照,具有说服力,其最大舒张率可达到90.34%。表明:芳香新塔花总黄酮提取物对KCl刺激的血管收缩具有显著的舒张作用。
图1(图1为对表1的直观表示)表示了实验组浓度(横坐标,g/L)与血管舒张率的关系示意图。从图可见,随着给药浓度的增加,除生理盐水组未变化外,总黄酮组的血管舒张率呈上升趋势,提示芳香新塔花总黄酮提取物改善血管供血能力与剂量呈正相关。
4、芳香新塔花总黄酮提取物对脑垂体后叶素致大鼠心肌缺血模型的影响
用垂体后叶素致大鼠心肌缺血动物模型,给予0.8U/Kg垂体后叶素后心电图主要表现为心率减慢、T波的高耸或倒置、各心肌酶谱异常,临床上主要以ST段异常来判定心肌缺血。由于大鼠ST段表现不明显,其变化用J点表示。本实验采用注射垂体后叶素复制大鼠心肌缺血模型,观察芳香新塔花总黄酮提取物对心肌缺血模型的影响。研究表明,注射大剂量垂体后叶素可诱发动物冠状动脉发生痉挛而引起急性心肌缺血,与临床上人的冠状动脉供血不足所致心绞痛相似,多年来被广泛用于抗心肌缺血药物的筛选研究。
本试验的原理是:动物反复给予试验药物后,再静脉注射脑垂体后叶素,导致心率减慢、T波的高耸或倒置、各心肌酶谱异常。计算试验组给予脑垂体后叶素后各时间段J点与正常J点差值,得到J点变化值,加和各时段变化值,得到总变化值,各时段变化值及总变化值与模型组相应各点比较。J的变化值越小,说明心肌损害的保护作用越强。因此本实验主要观察J点变化值,从而得到给药组各时段与模型组比较的统计学差异。
实验材料:(1)药品与试剂 芳香新塔花总黄酮提取物,由本实验室制备;普萘洛尔,山西云鹏制药有限公司,国药准字H14020768;脑垂体后叶素,上海第一生化药业有限公司,国药准字H31022259。
(2)器材 BL-410生物机能实验系统,由成都泰盟科技有限公司生产;超氧化歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)测试盒,均为100T,南京建成生物工程研究所。
(3)动物:Wistar大鼠,雄性198±23.2g,由新疆医科大学动物实验中心提供,动物合格证号:新医动字SYXK(新)2003-0001。所有大鼠均做心电图,将心电图异常大鼠剔除,选取正常心电图大鼠进入实验。
实验方法:将正常大鼠按体重、性别分为3组,分别为模型组,阳性对照药单硝酸异山梨酯组,总黄酮提取物组,每组10只,每日一次,连续7天;模型组给予同体积生理盐水,阳性对照药给予单硝酸异山梨酯10.1mg/kg,受试药组均给予0.3g/kg。造模前均记录II导联心电图,并于末次给药30min后,股静脉注射脑垂体后叶素0.8U/kg,做II导联心电图,记录5s、10s、30s、60s、180s、300s、600s心电图,观察各时间段的心率、J点变化。注射脑垂体后叶素45min后断颈取血,3500r/min离心取血清,按照试剂盒说明书测定SOD、LDH、MDA指标。
上述实验得到如下结果:
(1)从表2可见,与模型组比较,给药组在各时段J点变化值均有所降低,总变化值与模型组相比较有显著性差异,说明芳香新塔花总黄酮提取物对脑垂体后叶素所引起的心肌缺血J点变化有很好的保护作用,提示各提取物对心肌缺血具有改善作用,效果较阳性对照组(单硝酸异山梨酯组)相当。而单硝酸异山梨酯组作为临床公认的治疗心肌缺血的药物,本试验为芳香新塔花总黄酮提取物用于治疗心肌缺血提供了可靠证据。
(2)计算试验组给予脑垂体后叶素后各时间段心率与正常心率差值,得到心率变化值,各时段变化值与模型组相应各点比较。结果表明,给药组心率差值变化较小,提示给药组对脑垂体后叶素所引起的心肌缺血心率变化无影响(表3)。
(3)大鼠血清测定LDH、SOD、MDA,所得数值与模型组比较,无统计学差异,提示给药组对脑垂体后叶素所引起的心肌酶的变化无影响(表4)。
Claims (10)
1、一种芳香新塔花总黄酮提取物,其特征在于按下述方法得到:将芳香新塔花干药材,粉碎并过10目筛至50目筛,加入6倍重量份至12倍重量份的水或30%至90%乙醇水溶液,浸泡至透心,加热至微沸回流提取1次至4次,每次0.5小时至2.5小时,合并提取液,放置室温,过滤,滤液减压浓缩至干药材的1倍重量份至3倍重量份,浓缩液通过大孔吸附树脂柱,随后,在常温下依次以6倍重量份至12倍重量份的水、6倍重量份至12倍重量份的30%乙醇水溶液、6倍重量份至12倍重量份的50%乙醇水溶液、6倍重量份至12倍重量份的70%乙醇水溶液洗脱,洗脱流速为300ml/h至1000ml/h;收集上述乙醇水溶液洗脱液,减压浓缩并干燥得到干燥黄色至棕黄色粉末状的芳香新塔花总黄酮提取物。
2、根据权利要求1所述的芳香新塔花总黄酮提取物,其特征在于减压回收乙醇并浓缩是在40℃至80℃、-0.07Mpa至-0.1Mpa下进行的。
3、根据权利要求1和2所述的芳香新塔花总黄酮提取物,其特征在于干燥是在50℃至80℃下的鼓风干燥箱内进行的或者干燥是在风温度130℃至190℃、出风温度30℃至90℃的喷雾干燥下进行的或者干燥是在冷冻干燥12小时至72小时进行的。
4、根据权利要求3所述的芳香新塔花总黄酮提取物,其特征在于大孔吸附树脂柱采用下述型号:AB-8或SA-1,SA-3,FL-1,FL-3,DM-130,DM-B1,ADS-7,ADS-17,HPD-300,HPD-600,HP-20。
5、一种芳香新塔花总黄酮提取物的生产方法,其特征在于按下述步骤得到:将芳香新塔花干药材,粉碎并过10目筛至50目筛,加入6倍重量份至12倍重量份的水或30%至90%乙醇水溶液,浸泡至透心,加热至微沸回流提取1次至4次,每次0.5小时至2.5小时,合并提取液,放置室温,过滤,滤液减压浓缩至干药材的1倍重量份至3倍重量份,浓缩液通过大孔吸附树脂柱,随后,在常温下依次以6倍重量份至12倍重量份的水、6倍重量份至12倍重量份的30%乙醇水溶液、6倍重量份至12倍重量份的50%乙醇水溶液、6倍重量份至12倍重量份的70%乙醇水溶液洗脱,洗脱流速为300ml/h至1000ml/h;收集上述乙醇水溶液洗脱液,减压浓缩并干燥得到干燥黄色至棕黄色粉末状的芳香新塔花总黄酮提取物。
6、根据权利要求5所述的芳香新塔花总黄酮提取物的生产方法,其特征在于减压回收乙醇并浓缩是在40℃至80℃、-0.07Mpa至-0.1Mpa下进行的。
7、根据权利要求5和6所述的芳香新塔花总黄酮提取物的生产方法,其特征在于干燥是在50℃至80℃下的鼓风干燥箱内进行的或者干燥是在风温度130℃至190℃、出风温度30℃至90℃的喷雾干燥下进行的或者干燥是在冷冻干燥12小时至72小时进行的。
8、根据权利要求7所述的芳香新塔花总黄酮提取物的生产方法,其特征在于大孔吸附树脂柱采用下述型号:AB-8或SA-1,SA-3,FL-1,FL-3,DM-130,DM-B1,ADS-7,ADS-17,HPD-300,HPD-600,HP-20。
9、一种根据权利要求1或2所述的芳香新塔花总黄酮提取物在制备心血管药物方面的应用。
10、一种根据权利要求3所述的芳香新塔花总黄酮提取物在制备心血管药物方面的应用。
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