CN101613395B - 一种改进的速效胰岛素前体的基因构建方法和性质测定 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于增加胰岛素前体聚合性质的小肽，在胰岛素B链的羧基末端添加该小肽后再与胰岛素A链连接，所形成的胰岛素前体具有良好的聚合性质，表达量显著提高。本发明还公开了利用所述的胰岛素前体制备胰岛素的方法。

Description

一种改进的速效胰岛素前体的基因构建方法和性质测定

技术领域

本发明涉及生物技术和药学领域；更具体地，本发明涉及一种用于增加胰岛素前体聚合性质的小肽，含有该小肽的胰岛素前体及其编码基因，以及它们在胰岛素制备中的应用。

背景技术

近年来，糖尿病的发病率急剧上升，成为继心脑血管疾病和肿瘤之后威胁人类健康的重大疾病。现在全球糖尿病患者约有二亿三千三百万，预计2025年将达到三亿，其中75％在印度、中国等发展中国家。

胰岛素从20世纪20年代用于治疗糖尿病以来，一直是无可替代的特效药。但是，正常人体内胰岛素的分泌是受到血糖浓度调控的，一般是在进餐后30～60分钟血胰岛素浓度达到峰值，4～5小时后恢复到基础浓度，这样能够保证血糖浓度不因进餐而有大的波动。而常规胰岛素制剂在临床给药中不能模仿生理胰岛素分泌的时效性，很难有效的控制饭后的血糖升高，还有给患者带来低血糖的危险(Brange J.和Volund A.Insulin analogs with improved pharmacokineticprofiles.Adv Drug Deliv Rev 1999，35：307-335)，无论是在餐后立即注射胰岛素，还是在餐前半小时注射胰岛素，都不能有效的模拟生理胰岛素的分泌曲线。这是因为在中性溶液中，浓度高于100nmol/L时胰岛素以二聚体、六聚体的形式存在，而其必须解离成单体后结合专一受体发挥生理功能。这种分子间的聚合提高了胰岛素的稳定性，利于贮存和调节活性，确保能够精细、灵活地调控血糖，但给胰岛素的吸收造成很大的障碍。胰岛素制剂常以六聚体形式存在，注射后经过高倍的稀释由六聚体转为二聚体再转为单体胰岛素方能被吸收进入血液循环。胰岛素在浓度为10^-3mol/L时是六聚体，在10^-5mol/L时为二聚体，只有浓度为10^-8mol/L时才变成单体可以被皮下组织吸收，在肌肉或皮下这种高倍的稀释是一个慢而长的过程，24小时只有50％的胰岛素被吸收。皮下注射胰岛素制剂后，90～120分钟后血胰岛素达到比较低的峰值，之后又不能快速降低(Dodson G.和Steiner D.The role of assembly in insulin’s biosynthesis.Curr OpinStruct Biol 1998，8：189-194.Brange J.Stability of Insulin.Kluwer AcademicPubs，1994)。

在中性溶液中，蛋白质浓度高于0.6mmol/L时仍然保持单体性质的胰岛素类似物称为单体胰岛素。单体胰岛素在注射浓度为10^-3mol/L时进入血液可以直接被皮下组织吸收。单体胰岛素是胰岛素发挥生物活性的功能单位，在给药处无须经过高倍稀释即可被迅速吸收，且缩短了给药后药物作用的时程，故而获得可用于临床的单体速效胰岛素是开发新一代治疗糖尿病药物的主要目标之一。

虽然单体胰岛素具有很大的优越性，但是其前体在酵母或原核表达系统中的表达量却很低。因此，本领域迫切需要开发新的单体胰岛素前体，使其在酵母或原核表达系统中的表达量有大的提高，使得单体速效胰岛素更加具有产业化的前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于增加胰岛素前体聚合性质的小肽。

本发明的另一目的在于提供含有该小肽的胰岛素前体。

本发明的另一目的在于提供一种制备胰岛素(特别是单体胰岛素)的方法。

在本发明的第一方面，提供一种用于增加胰岛素前体聚合性质的小肽，所述的小肽具有式(I)所示的氨基酸序列：

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃    (I)

其中，X₁或X₁₃独立地选自Lys或Arg；

X₂或X₅独立地选自Gly，Pro或Ala(优选Gly或Ala)；

X₃选自Glu或Asp；

X₄选自Arg，Lys，Gln或Asn(优选Arg或Lys)；

X₆或X₇独立地选自Phe，Leu，Val，Ile，Trp或Tyr(优选Phe或Leu)；

X₈选自Tyr，Trp，Phe，Thr或Ser(优选Tyr或Phe)；

X₉选自Thr或Ser；

X₁₀选自Pro或Ala；

X₁₁或X₁₂不存在或独立地选自Ala，Val，Leu，Ile，Glu或Asp(优选Ala或Val)。

在另一优选例中，X₁是Lys；X₂是Gly；X₃是Glu；X₄是Arg；X₅是Gly；X₆是Phe；X₇是Phe；X₈是Tyr；X₉是Thr；X₁₀是Pro；或者

X₁₁是Ala；X₁₂是Ala；X₁₃是Lys。

在本发明的第二方面，提供一种胰岛素前体，从氨基端至羧基端具有如下氨基酸序列：胰岛素B链序列(SEQ ID NO：8)-本发明所述的小肽序列-胰岛素A链序列(SEQ ID NO：7)。

在另一优选例中，所述的胰岛素是单体胰岛素。

较佳的，所述的胰岛素选自：B链羧基端(C端)去六肽胰岛素；B链羧基端去五肽胰岛素；B链羧基端去四肽胰岛素；B链羧基端去三肽胰岛素；B链羧基端去二肽胰岛素；B链羧基端去一肽胰岛素或全长胰岛素。

较佳的，所述的胰岛素选自：B链羧基端去五肽胰岛素；B链羧基端去四肽胰岛素；B链羧基端去三肽胰岛素。

较佳的，所述的胰岛素是B链羧基端去四肽胰岛素。

在另一优选例中，所述的胰岛素前体的结构如下：

其中，X₁-X₁₃的定义同前。

在本发明的第三方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的小肽，或编码所述的胰岛素前体。

在本发明的第四方面，提供一种表达载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供一种宿主细胞，它含有所述的表达载体。

在本发明的第六方面，提供一种制备胰岛素的方法，包括以下步骤：

(a)在表达条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码所述的胰岛素前体的多核苷酸，从而表达出所述的胰岛素前体；

(b)分离出所述的胰岛素前体；

(c)从所述的胰岛素前体切除所述的小肽，形成由胰岛素A链和胰岛素B链构成的胰岛素；

(d)分离出胰岛素。

在另一优选例中，在步骤(c)中，包括：

(1)采用胰蛋白酶切割所述的胰岛素前体，获得去除X₂-X₁₃肽段的切割产物；

(2)采用羧肽酶B切割(1)获得的切割产物，获得由胰岛素A链和胰岛素B链构成的胰岛素。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1，pPIC9K与GEMIP连接后PCR鉴定阳性克隆图，以α-Factor位点引物和3 AOX1位点引物进行PCR鉴定，Marker为DL2000，分子量从上到下分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp。经鉴定泳道1-7均为阳性克隆。

图2，MIP，PIP，GEMIP试管表达量比较电泳图(pH 8.3聚丙烯酰胺凝胶电泳)，泳道1：MIP；泳道2：PIP；泳道3：GEMIP；样品上样量均为100μl；泳道4：Marker从上到下分别为PIP和INS；Marker浓度3mg/ml，上样量5μl。

图3，MIP、PIP、GEMIP试管表达量的比较图。

图4，GEMIP纯化鉴定电泳图，其中，泳道1：XAD-7疏水层析分离产物的鉴定；泳道2：分子筛G25分离产物鉴定；泳道3：HPLC纯化产物的鉴定；泳道4：Marker从上到下为PIP，INS。

图5，GEMIP胰蛋白酶酶切鉴定电泳图，泳道1：Marker从上到下为PIP，INS；泳道2：GEMIP；泳道3，4，5，6分别为GEMIP被酶切0.5h，1h，1.5h，2h的鉴定结果。

图6，GEMIP经胰蛋白酶酶切处理后的产物用羧肽酶B酶切鉴定，泳道1：GEMIP经胰蛋白酶酶切处理的产物；泳道2，3分别为羧肽酶B处理2h，3h的鉴定结果；泳道4：Marker从上到下分别为PIP，INS，DTI。

图7，GEMIP的电喷雾质谱分析(MATLCQ ESI-MS)，电喷电压为4.25KV，毛细管温度为200℃。理论分子量为6812.0Da，实测分子量为6811.8，误差为0.003％。

图8，蛋白质浓度对胰岛素前体PIP(A)，单体胰岛素DTI前体MIP(B)和新的前体GEMIP(C)的凝胶层析的影响，Superdex 75(HR 10/30)，柱流动相为pH7.4的磷酸盐缓冲液，流速为0.5ml/min，上样量为0.04ml，室温，230nm检测。蛋白质浓度从高到低分别为：600μmol/L，300μmol/L，150μmol/L和75μmol/L。横坐标为流出时间，纵坐标为A230nm。

图9，蛋白质浓度对保留时间的影响，横坐标为蛋白质浓度(μmol/L)，纵坐标K_D为保留因子。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现胰岛素(特别是单体胰岛素)前体表达量主要取决于其聚合性质；并且意外地发现在胰岛素B链的羧基末端添加一段小肽后再与胰岛素A链连接，所形成的胰岛素前体具有良好的聚合性质。在酵母系统或原核系统中，利用该胰岛素前体的编码基因进行表达，胰岛素前体蛋白的表达量显著高于不含该小肽的胰岛素前体。

如本文所用，“胰岛素”包括了全长胰岛素，或B链羧基端去六肽胰岛素，B链羧基端去五肽胰岛素，B链羧基端去四肽胰岛素(“DTI”)，B链羧基端去三肽胰岛素，B链羧基端去二肽胰岛素，B链羧基端去一肽胰岛素。其中，B链羧基端去四肽胰岛素、B链羧基端去三肽胰岛素或B链羧基端去五肽胰岛素等也被称为具有生物活力的“单体胰岛素”，所述的单体胰岛素通常在中性溶液中，蛋白质浓度高于0.6mmol/L时仍然保持单体性质。本发明中，优选的胰岛素是B链羧基端去五肽胰岛素，B链羧基端去四肽胰岛素或B链羧基端去三肽胰岛素；更优选的是B链羧基端去四肽胰岛素。

如本文所用，“胰岛素前体”是指一种含有胰岛素A链和B链全部或部分结构(如B链的羧基端去四肽)的多肽经一段短肽将其A链和B链连接起来的结构，前体没有生物活力，当对其进行适当处理后，可以被加工成具有生物活力的胰岛素。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由构成”、“基本上由构成”、和“由构成”；“主要由构成”、“基本上由构成”和“由构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

小肽

本发明提供一种用于增加胰岛素前体聚合性质的小肽，所述的小肽具有式(I)所示的氨基酸序列：

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃    (I)

其中，X₁-X₁₃的定义同前。

式(I)中，X₁、X₁₃独立地选自Lys或Arg；从而当该小肽被与胰岛素A链和B链连接构成胰岛素前体后，可被胰蛋白酶特异性地从X₁和X₁₃的羧基侧切下，使得小肽的X₂-X₁₃段从与胰岛素A链和B链分离。而剩余的X₁氨基酸，可被羧肽酶B从胰岛素B链上切下，从而可实现小肽与胰岛素A链和B链的完全分离。

式(I)中，氨基酸X₂-X₅选自一类具有酸碱特性的氨基酸，可增加多肽的折叠效果；而X₆-X₁₂选自一类具有疏水作用的氨基酸，从而有利于促进胰岛素前体的聚合性质，增加胰岛素前体的表达量，特别是在酵母表达系统或原核表达系统中的表达量。

所述的小肽具有适当的长度和合适的氨基酸，可以增加胰岛素(特别是单体胰岛素)表达前体的折叠聚合性质。并且，当胰岛素前体被表达后，可增加胰岛素前体的聚合性质，使其易于穿过细胞膜分泌到胞外，或使其不易于被细胞内的其它成分所降解。

胰岛素前体

本发明还提供了一种胰岛素前体，从氨基端至羧基端具有如下氨基酸序列：胰岛素B链序列-所述的小肽序列-胰岛素A链序列。胰岛素B链和A链之间小肽的加入使得胰岛素前体的聚合性质更为理想，从而可获得显著更高的表达量。

作为本发明的一种优选方式，所述的胰岛素(B链羧基端去四肽胰岛素)前体的结构如下：

其中，一种较佳的X₁-X₁₃序列是：

Lys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Ala-Ala-Lys(KGERGFFYTPAAK)(SEQ ID NO：1)。

所述的胰岛素前体可以通过胰蛋白酶和羧肽酶B连续两步酶切将十肽完全去除，从而得到B链去四肽胰岛素，经验证其具有80％生物活力和单体性质(生理pH值、较高浓度时不聚合)。

本发明还包括编码所述胰岛素前体的核酸。所述的核酸通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。所述的重组法通常是将所述核酸克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

所述的编码所述胰岛素前体的核酸可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含所述多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的编码所述的胰岛素前体的核酸以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，酵母等。针对不同的宿主细胞，还可对所述的多核苷酸序列进行密码子优化，以获得改进的表达效果，密码子优化技术是本领域人员熟知的。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，以表达所述的胰岛素前体蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内表达、或分泌到细胞外。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

制备胰岛素的方法

本发明还提供了从所述胰岛素前体制备胰岛素的方法，包括：重组表达并分离所述的胰岛素前体；从所述的胰岛素前体切除所述的小肽，形成由胰岛素A链和胰岛素B链构成的胰岛素。

从所述的胰岛素前体切除所述的小肽可以用任何识别且切割Lys和/或Arg的酶。作为本发明的优选方式，采用胰蛋白酶和羧肽酶B从所述的胰岛素前体切除所述的小肽，采用的方法是：

(1)用胰蛋白酶切割所述的胰岛素前体，获得去除X₂-X₁₃肽段的切割产物；

(2)用羧肽酶B切割(1)获得的切割产物，获得由胰岛素A链和胰岛素B链构成的胰岛素。

切割流程示意如下：

胰蛋白酶(Trypsin)可特异性水解Arg、Lys的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。产物为羧基端Arg、Lys的肽链。胰蛋白酶作用的较佳温度范围为20-40℃；PH值为6-9。

羧肽酶B(Carboxypeptidase B，CPB)属于羧肽酶的一种，其能够选择性地水解羧基端残基为Arg和Lys的肽键。羧肽酶B作用的较佳温度范围为4-60℃；PH值为5-11。

经过上述的酶切后，可采用反向疏水层析等方法分离酶切产物，即可获得本发明的胰岛素。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的小肽可以显著增加单体胰岛素表达前体的聚合性质，从而提高其在重组表达载体中的表达量。

(2)本发明的小肽可以通过胰蛋白酶和羧肽酶B连续两步酶切从胰岛素B链和A链上被切除，从而得到不含有外源氨基酸的胰岛素。

(3)本发明中建立的单体胰岛素具有80％生物活力和较好的单体性质，并且是天然胰岛素的大片段，不会产生免疫反应等方面的问题。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

质粒pPIC9K/GEMIP的构建

用化学合成的方法合成胰岛素类似物基因片段GEMIP(Monomeric insulinprecursor)，依照甲醇酵母P.pastoris(菌株GS115，购自Invitrogen公司)的密码子偏好性，化学合成单体胰岛素前体(GEMIP)基因片段：

5-gaattcaagttcgtcaaccaacacttgtgtggttcccacttggtcgaggctttgtacttggtctgtggtgaaa

gaggtttcttctacaagggtgaaagaggtttcttctacacccctgctgctaagggtatcgtcgaacaatgttgta

cctccatctgctccttgtaccaattggagaactactgtaactaggcggccgc-3(SEQ ID NO：2)。

合适的prepro-leader有助于胰岛素前体在P.pastoris中的分泌表达，将化学合成的DNA片段克隆到pPIC9K质粒的EcoRI、NotI位点，形成α-Mating factorleader-EAEAYVEFK-GEMIP表达框架。其中富含EA的间隔肽有利于胰岛素前体的分泌，GEMIP为DTI前体，其结构为胰岛素B链^1-26-K²⁷GERGFFYTPAAK-A链^1-21，含有该GEMIP片段的pPIC9K质粒称为pPIC9K/GEMIP。

插入到pPIC9K质粒的MIP的序列(含酶切点)是：

5-gaattcaagttcgtcaaccaacacttgtgtggttcccacttggtcgaggctttgtacttggtctgtggtgaaa

gaggtttcttctacaaggctgctaagggtatcgtcgaacaatgttgtacctccatctgctccttgtaccaattgga

gaactactgtaactaggcggccgc-3(SEQ ID NO：3)。

与GEMEM相比，其中不含有本发明的小肽编码序列，仅含有编码AAK的连接序列，构成的重组质粒称为pPIC9K/MIP。

插入到pPIC9K质粒的PIP(全长胰岛素)的序列(含酶切点)是：

5-gaattcaagttcgtcaaccaacacttgtgtggttcccacttggtcgaggctttgtacttggtctgtggtgaaa

gaggtttcttctacacccctaaggctgctaagggtatcgtcgaacaatgttgtacctccatctgctccttgtacca

attggagaactactgtaactaggcggccgc-3(SEQ ID NO：4)。

构成的重组质粒称为pPIC9K/PIP。

pPIC9K共9276个核苷酸；5′AOX1为转录启始位点；S和TT之间为多克隆位点，外源基因片段插入到EcoR I和Not I之间；TT为转录终止处。

将pPIC9K/GEMIP转化入大肠杆菌DH5α后，涂到含有氨苄的LB琼脂平板表面，37℃温箱内倒置培养过夜，用PCR鉴定阳性克隆，结果如图1所示，表明获得了阳性克隆。测序鉴定。

实施例2

甲醇酵母的电转化和高表达克隆筛选

pPIC9K/GEMIP、pPIC9K/MIP、pPIC9K/PIP质粒分别通过Bgl II酶切线性化，酶切反应液经过酚、氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于1mol/L山梨醇，待转化。线性化质粒进入酵母细胞后，部分重新环化而单点插入到染色体中，得到Mut⁺表型转化子，另一部分通过线性取代整合到染色体中，得到Mut^s表型转化子，在此过程中会自发形成多拷贝插入整合。

pPIC9K/GEMIP质粒带有抗G418基因，质粒拷贝数高低与转化子的G418(0～4mg/ml)抗性成正比。本发明人选取4mg/ml G418 YPD板上的克隆做表达实验。

实施例3

试管表达比较MIP，PIP，GEMIP的表达量结果

分别将含有3种目的前体的菌株接种到试管中培养，接到2ml YPD试管培养基里，30℃摇床260r/min培养2天后，4℃ 3000r/min离心5min，弃上清，用新鲜的2ml YP培养基(不含葡萄糖)将菌体重悬，转入新的试管中，每天加入20μl甲醇进行诱导，诱导72h，离心取上清浓缩10倍后上样进行native电泳鉴定，见图2。

根据电泳图用photoshop分析软件可以粗略地得到试管表达量MIP，PIP，GEMIP分别为39μg/ml，150μg/ml，80μg/ml，见图3。

实施例4

GEMIP的初步纯化

发酵液6000r/min离心10min，取上清。将发酵上清用XAD-7疏水层析分离，发酵液上清上柱后，先用5％醋酸和10％乙醇混合液洗去杂质，再用5％醋酸和45％乙醇混合液洗脱目的产物。洗脱液旋转蒸发减压浓缩去除乙醇，再用Sephadex G-25分子筛分离，以1mol/L醋酸为缓冲液，收取洗脱峰，冻干得含有GEMIP的粗品，该粗品可用HPLC进一步纯化。纯化结果见图4。

实施例5

粗品GEMIP的胰蛋白酶酶切鉴定和质谱鉴定

将GEMIP用胰蛋白酶酶切，酶切条件：底物浓度为1mg/ml时，反应温度为30℃，反应pH 7.6，酶和底物的比例为1∶1000(w/w)，每过30min取样中止反应，酶切鉴定结果见图5。

实施例6

GEMIP经胰蛋白酶酶切后进一步用羧肽酶B酶切鉴定

羧肽酶B酶切条件：底物浓度为1mg/ml时，反应温度30℃，反应pH 7.6，酶和底物的比例为1∶200(w/w)，2小时和3小时取样电泳鉴定。酶切鉴定结果见图6，质谱鉴定结果见图7。

实施例7

PIP，MIP和GEMIP聚合性质的测定结果

检测在中压系统(FPLC，AKTA Purifier)上进行，Superdex 75(HR 10/30)柱(Pharmacia公司)，流动相为pH 7.4的磷酸盐缓冲液，流速为0.5ml/min，上样量为0.04ml，室温，230nm检测。通过将同一种样品按600μmol/L，300μmol/L，150μmol/L和75μmol/L不同浓度上样，观察其在分子筛柱中表现出的特性来判断其聚合性质，见图8(聚合性质与洗脱时间或吸收值的相关性是：聚合性质越高，分子量越大，洗脱出峰时间越早)。

用分配系数K_D描述混合物的平均分子量，见图9。K_D＝(Vr-V₀)/(Vc-V₀)，其中Vr为流出体积，V₀为外水体积，Vc为总的柱床体积。

从图8，9中可以看出三者的聚合性质为PIP＞GEMIP＞MIP，从实施例3中可以得到表达量比较结果为PIP＞GEMIP＞MIP，表达量与前体聚合性质成正比，增加表达前体的聚合性质可以提高前体的表达量。

实施例8

酿酒酵母的表达

根据酿酒酵母(S.cerevisiae)的偏好性(与甲醇酵母基本相似)，人工合成以下序列：

5-gaattcaagttcgtcaaccaacacttgtgtggttcccacttggtcgaggctttgtacttggtctgtggtgaaa

gaggtttcttctacaagggtgaaagaggttggtggtacacccctgctgctaagggtatcgtcgaacaatgttgt

acctccatctgctccttgtaccaattggagaactactgtaactaggcggccgc-3(SEQ ID NO：5)。

其编码的小肽为：K²⁷GERGWWYTPAAK(SEQ ID NO：6)。

将合成的DNA片段克隆到pPIC9K质粒的EcoRI、NotI位点，形成α-Matingfactor leader-EAEAYVEFK GEMIP’表达框架。GEMIP’结构为：胰岛素B链^1-26-K²⁷GERGWWYTPAAK-A链^1-21，含有该GEMIP’片段的pPIC9K质粒称为pPIC9K/GEMIP’。

如实施例2和3类似的方法，将pPIC9K/GEMIP’和pPIC9K/MIP分别转化酿酒酵母并表达；结果发现，pPIC9K/GEMIP’的表达量显著高于pPIC9K/MIP。

经验证，同样的技术路线还可用于其它的酵母表达系统或分泌型大肠杆菌表达系统来表达GEMIP，本发明的小肽可用于多种单体胰岛素的表达前体的构建，从而有效地提高单体速效胰岛素表达前体的表达量，具有良好的产业化前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本技术领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海南方模式生物科技发展有限公司

<120>一种改进的速效胰岛素前体的基因构建方法和性质测定

<130>081703

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>1

Lys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Lys

1                5                    10

<210>2

<211>200

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gaattcaagt tcgtcaacca acacttgtgt ggttcccact tggtcgaggc tttgtacttg     60

gtctgtggtg aaagaggttt cttctacaag ggtgaaagag gtttcttcta cacccctgct    120

gctaagggta tcgtcgaaca atgttgtacc tccatctgct ccttgtacca attggagaac    180

tactgtaact aggcggccgc                                                200

<210>3

<211>173

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>多核苷酸

<400>3

gaattcaagt tcgtcaacca acacttgtgt ggttcccact tggtcgaggc tttgtacttg     60

gtctgtggtg aaagaggttt cttctacaag gctgctaagg gtatcgtcga acaatgttgt    120

acctccatct gctccttgta ccaattggag aactactgta actaggcggc cgc           173

<210>4

<211>179

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>多核苷酸

<400>4

gaattcaagt tcgtcaacca acacttgtgt ggttcccact tggtcgaggc tttgtacttg     60

gtctgtggtg aaagaggttt cttctacacc cctaaggctg ctaagggtat cgtcgaacaa    120

tgttgtacct ccatctgctc cttgtaccaa ttggagaact actgtaacta ggcggccgc     179

<210>5

<211>200

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>多核苷酸

<400>5

gaattcaagt tcgtcaacca acacttgtgt ggttcccact tggtcgaggc tttgtacttg     60

gtctgtggtg aaagaggttt cttctacaag ggtgaaagag gttggtggta cacccctgct    120

gctaagggta tcgtcgaaca atgttgtacc tccatctgct ccttgtacca attggagaac    180

tactgtaact aggcggccgc                                                200

<210>6

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>6

Lys Gly Glu Arg Gly Trp Trp Tyr Thr Pro Ala Ala Lys

1                5                  10

<210>7

<211>21

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>7

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1                5                  10                   15

Glu Asn Tyr Cys Asn

             20

<210>8

<211>26

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>8

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1                5                  10                  15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr

            20                 25

Claims (14)

1.一种用于增加胰岛素前体聚合性质的小肽，其特征在于，所述的小肽的氨基酸序列如式(I)所示：

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃    (I)

其中，X₁选自Lys或Arg；

X₂选自Gly；

X₃选自Glu；

X₄选自Arg；

X₅选自Gly；

X₆选自Phe或Trp；

X₇选自Phe或Trp；

X₈选自Tyr；

X₉选自Thr或Ser；

X₁₀选自Pro；

X₁₁选自Ala；

X₁₂选自Ala；

X₁₃选自Lys或Arg。

2.如权利要求1所述的小肽，其特征在于，X₁是Lys；X₂是Gly；X₃是Glu；X₄是Arg；X₅是Gly；X₆是Phe；X₇是Phe；X₈是Tyr；X₉是Thr；X₁₀是Pro；或者

X₁₁是Ala；X₁₂是Ala；X₁₃是Lys。

3.如权利要求1所述的小肽，其特征在于，所述小肽的氨基酸序列为KGERGFFYTPAAK或KGERGWWYTPAAK。

4.一种胰岛素前体，其特征在于，所述胰岛素前体的从氨基端至羧基端的氨基酸序列为：胰岛素B链序列-权利要求1-3中任一所述的小肽序列-胰岛素A链序列。

5.如权利要求4所述的胰岛素前体，其特征在于，所述的胰岛素前体是单体胰岛素的前体。

6.如权利要求4所述的胰岛素前体，其特征在于，所述的胰岛素前体是选自下组的胰岛素的前体：B链羧基端去六肽胰岛素；B链羧基端去五肽胰岛素；B链羧基端去四肽胰岛素；B链羧基端去三肽胰岛素；B链羧基端去二肽胰岛素；B链羧基端去一肽胰岛素或全长胰岛素。

7.如权利要求4所述的胰岛素前体，其特征在于，所述的胰岛素前体是选自下组的胰岛素的前体：B链羧基端去五肽胰岛素；B链羧基端去四肽胰岛素；B链羧基端去三肽胰岛素。

8.如权利要求4所述的胰岛素前体，其特征在于，所述的胰岛素前体是B链羧基端去四肽胰岛素的前体。

9.如权利要求5所述的胰岛素前体，其特征在于，所述的胰岛素前体的结构如下：

10.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1-3中任一所述的小肽，或编码权利要求4-9任一所述的胰岛素前体。

11.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求10所述的多核苷酸。

12.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求11所述的表达载体。

13.一种制备胰岛素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)在表达条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码权利要求4-9任一所述的胰岛素前体的多核苷酸，从而表达出所述的胰岛素前体；

(b)分离出所述的胰岛素前体；

(c)从所述的胰岛素前体切除所述的小肽，形成由胰岛素A链和胰岛素B链构成的胰岛素；和

(d)分离出胰岛素。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，包括：

(1)采用胰蛋白酶切割所述的胰岛素前体，获得去除X₂-X₁₃肽段的切割产物；

(2)采用羧肽酶B切割(1)获得的切割产物，获得由胰岛素A链和胰岛素B链构成的胰岛素。

Images