CN101603046A - 一种重组甲型h1n1流感病毒非结构蛋白ns1的原核表达、纯化及其检测方法的建立 - Google Patents

Abstract

本发明属于人畜共患病研究领域，涉及一种人畜共患病的鉴别诊断方法。选择了公开的甲型H1N1加利福尼亚病毒株(A/California/08/2009(H1N1))cDNA序列中非结构蛋白NS1基因为研究内容，利用通过基因合成方法获得基因片段构建原核表达载体pGEX－6P－1－NS1；将阳性重组质粒转化到大肠杆菌中得到重组菌株(Escherichia coli BL21 rosseta/pGEX－6P－1－NS1)；通过多种层析方法获得纯化后的H1N1的非结构蛋白NS1，并利用所述的表达蛋白通过免疫宿主动物获得特异性针对H1N1非结构蛋白NS1的多克隆或单克隆抗体，建立酶联免疫吸附试验鉴别诊断方法，用于区分甲型H1N1流感病毒感染与其他流感病毒感染的病人。

Description

一种重组甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1的原核表达、纯化及其检测方法的建立

技术领域

本发明属于人畜共患病研究领域，涉及一种人畜共患病的鉴别诊断方法。选择了公开的甲型H1N1加利福尼亚病毒株(A/California/08/2009(H1N1))cDNA序列中非结构蛋白NS1基因为研究内容，利用通过基因合成方法获得基因片段构建原核表达载体pGEX-6P-1-NS1；将阳性重组质粒转化到大肠杆菌中得到重组菌株(Escherichia coli BL21 rosseta/pGEX-6P-1-NS1)；通过多种层析方法获得纯化后的H1N1的非结构蛋白NS1，并利用所述的表达蛋白通过免疫宿主动物获得特异性针对H1N1非结构蛋白NS1的多克隆或单克隆抗体，建立酶联免疫吸附试验鉴别诊断方法，用于区分甲型H1N1流感病毒感染与其他流感病毒感染的病人。

背景技术

H1N1是一种病毒，是Orthomyxoviridae系列的一种病毒。它的宿主是鸟类和一些哺乳动物。有些H1N1病毒引起严重的疾病大多发生于家禽方面，而人类却很少出现。但经过鸟类和哺乳动物的传播和变异，这可能导致疫情或人类流感大面积传播。

H1N1的A型流感病毒于1918-1919年造成西班牙流感流行，导致2000万-4000万人死亡。1977年，H1N1与H3N2亚型病毒共同在人类流行，如果抗原变异或与其他流感病毒亚型发生基因重排产生新的病毒株，则极可能引起大流行。

研究表明，NS1蛋白仅在流感病毒感染的细胞中大量表达，而在正常病毒粒子中不存在，同时经灭活疫苗免疫的动物也不会产生，因此，针对NS1蛋白的抗体可能只在流感病毒的宿主中存在，据此可以区分灭活疫苗免疫动物与活病毒感染动物。已有研究表明，非结构蛋白及其抗体可以作为病毒感染的一个重要标记。上述特点使NS1蛋白在流感病毒的监测和抗病毒研究中有着广阔的应用前景。

发明内容

本发明目的之一是提供一种重组甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1的原核表达与纯化的方法，为其抗体的制备提供高纯度抗原。

其中所述的重组蛋白的制备方法，它包括下列步骤：

(1)公开的甲型H1N1加利福尼亚病毒(A/California/08/2009(H1N1))cDNA序列中非结构蛋白NS1基因为目的基因，通过基因合成的方法获得基因片段；

(2)在原核表达载体pGEX-6P-1多克隆位点中定向插入甲型H1N1流感病毒非结构蛋白基因NS1的DNA序列，构建得到原核表达载体质粒pGEX-6P-1-NS1；

(3)将步骤(2)所说的原核表达载体质粒pGEX-6P-1-NS1转化至大肠杆菌BL21 rosseta感受态细胞，用氨苄霉素抗性筛选单个重组菌。

(4)所述纯化具体是：pGEX-6P-1-NS1在大肠杆菌Rosetta中表达，克隆接种至3ml含有100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37℃，过夜，220rpm；将过夜培养物1∶100稀释至1L含有100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37℃，220rpm，培养5h；加入终浓度为0.1mM的IPTG，22℃，180rpm，继续培养22h；以8000g，15min，4℃离心收菌；菌体用50mM Tris-c1，200mM NaCl pH8.0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，0.5h；用超声破碎仪超声至溶液澄清，12000rpm，20min离心3次；将上清液使用GE healthcare的Glutathione-Sepharose4B柱料纯化，得到纯化融合蛋白。PSP酶切GST标签，柱料纯化，得到除去标签的NS1蛋白。

实验证明，纯化后NS1可溶性极高，一年内未有聚合物出现。

本发明提供的利用Pgex-6P-1系统融合表达再经酶切处理去掉标签制得的NS1蛋白，可以在大肠杆菌中成功表达，表达量与前人的结果类似，相对于真核表达，原核表达制备工程化抗体技术相对简单，成本更低；

本发明目的之二是提供一种基于特异性检测甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1的免疫学方法的H1N1检测试剂盒。

将纯化后重组NS1蛋白作为抗原分别免疫家兔和小鼠，获得高特异性针对NS1蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体；

6)利用获得的抗体及高纯度的重组NS1蛋白，利用包括但不限于双夹心ELISA法、免疫比浊法等方法检测人体液中的NS1的含量；

所述鉴定的具体过程是包括但不限于用该蛋白包被ELISA酶标板制备ELISA抗原酶标板。用空白对照菌(Escherichia coli BL21 rosseta/pGEX-6T-1)诱导产物制备血清稀释液，按照普通ELISA方法检测待检血清。根据反应后的吸光值确定阴性、可疑、阳性的判断临界值。

按照如下的配方制备包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物液、终止液：

包被液(25mmol碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃ 2.322g，NaHCO₃ 2.352g，ddH₂O加至1000mL(pH9.6)。

1倍洗涤液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.63g，KH₂PO₄ 0.44g，双蒸水加至1000mL(pH7.4)。

封闭液：2g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗涤液。

稀释液：1g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗涤液。

底物液：购买自天健生物制药(天津)有限公司。

终止液：2N H₂SO₄

将NS1抗原酶标板、洗涤液(25倍)、稀释液、HRP标记的抗人IgG抗体、底物缓冲液、终止液组装成NS1-ELISA鉴别诊断试剂盒。

本发明的有益效果是：

1、本发明的有益效果之一是生物安全性高。本发明所涉及到的原核表达载体pGEX-6P-1是分子生物学中常用的原核表达载体，没有生物危险性，在此基础上构建的原核表达载体pGEX-6P-1-NS1也没有任何生物危险性。重组大肠杆菌BL21Rosseta/pGEX-6P-1-NS1是将原核表达载体pGEX-6P-1-NS1转化至分子生物学中常用的大肠杆菌BL21Rosseta感受态细胞后经氨苄霉素抗性筛选获得，也不具生物危险性。本发明所用的抗原酶标板是用甲型H1N1流感病毒的非结构蛋白制备的，制备过程中不涉及活病毒，因此没有活病毒逃逸、扩散的潜在危险。

2、本发明的有益效果之二是生产成本低。本发明所提供的甲型H1N1流感鉴别诊断方法和诊断试剂盒所需抗原是甲型H1N1流感病毒的非结构蛋白。该蛋白可以通过重组大肠杆菌BL21Rosseta/pGEX-6P-1-NS1在体外得到大量的表达，适合大规模的生产。

3、本发明的有益效果之三是提供的鉴别诊断试剂盒使用方便。本发明在提供了鉴别诊断方法的基础上，还将该方法所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，非常适合临床大规模检测。

附图说明

图1显示Pgex-6P-1载体图谱。

图2NS1融和蛋白小量表达鉴定SDS-PAGE电泳图。其中1为未诱导菌株，M为蛋白分子量标准，从上到下依次为115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18.4KD、14.4KD，2为1号诱导后菌株，3为2号诱导后菌株，4为3号诱导后菌株，5为4号诱导后菌株，6为5号诱导后菌株，7为6号诱导后菌株，8为7号诱导后菌株，9为8号诱导后菌株；

图3显示的是纯化后的NS1融和蛋白SDS-PAGE电泳图。其中1为纯化后的融和蛋白1号管蛋白，2为纯化后的融和蛋白2号管蛋白，M为蛋白分子量标准，从上到下依次为115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18.4KD、14.4KD；图4酶切后除掉标签的NS1蛋白SDS-PAGE电泳图。其中1为酶切后不带标签的NS1蛋白，M为蛋白分子量标准，从上到下依次为115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18.4KD、14.4KD；

专利具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1基因原核表达载体的构建

BamHI及SalI酶切PUC57-NS1和载体pGEX-6P-1，回收NS1基因和载体pGEX-6P-1；然后用T4 DNA ligase连接，22度水浴1小时，转化大肠杆菌Rossetta感受态细胞，37℃培养，从中随机挑选多个单菌落，分别放入LB液体培养基中37℃培养5小时后，菌体OD值约0.6时加IPTG至终浓度1mM，经小量表达鉴定，挑取阳性克隆。。

实施例2甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1的大量诱导表达和蛋白纯化

pGEX-6P-1-NS1在大肠杆菌Rosetta中表达，克隆接种至3ml含有100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37℃，过夜，220rpm；将过夜培养物1∶100稀释至1L含有100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37℃，220rpm，培养5h；加入终浓度为0.1mM的IPTG，22℃，180rpm，继续培养22h；以8000g，15min，4℃离心收菌；菌体用50mM Tris-Cl，200mM NaCl pH8.0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，0.5h；用超声破碎仪超声至溶液澄清，12000rpm，20min离心3次；将上清液使用GE healthcare的Glutathione-Sepharose4B柱料纯化，得到纯化融合蛋白。PSP酶切GST标签，柱料纯化，得到除去标签的NS1蛋白。

实施例3甲型H1N1感病毒NS1-ELISA鉴别诊断试剂盒构成

1.1包被抗原的微孔板(8孔×12条×1块)

1.2HRP标记抗人IgG 1瓶(120ul/瓶)

1.325倍洗涤液浓缩液I瓶(20ml/瓶)

1.4稀释液2瓶(20ml/瓶)

1.5底物液1瓶(10ml/瓶)

1.6终止液1瓶(10ml/瓶)

实施例4甲型H1N1流感病毒NS1-ELISA操作步骤

(1)从4℃冰箱中取出试剂盒，平衡各组分至室温。

(2)取预包被的微孔条板(根据标本多少，可拆开分次使用)，除空白对照孔外，每孔加入以样品稀释液1∶40稀释的待检样品，每孔加100ul，同样1∶40稀释对照血清，设阳性对照2孔，阴性对照2孔，空白孔不加，轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37℃温育1小时。

(3)甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200ul/次，每次静置3分钟倒掉，最后一次拍干。

(4)每孔加酶标二抗100ul，置37℃温育30分钟。

(5)洗涤4次，200ul/次，每次静置3分钟倒掉，最后一次拍干。

(6)每孔加底物90ul，室温避光显色(30分钟以内)。

(7)每孔加终止液50ul，15分钟内测定结果。

Claims (6)

1、一种重组甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1的原核表达、纯化及其检测方法的建立。

2、根据权利要求1所述的原核表达，其特征是，使用装载有包含甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1基因的原核表达载体在原核宿主大肠杆菌中表达蛋白产物。

3、根据权利要求1所述的纯化，其特征是，将宿主表达出的带有标签的甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1蛋白利用亲和层析、分子筛、离子交换等方法提高重组蛋白纯度。

4、根据权利要求1所述的甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1，其特征是，与天然甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1具有相同或相似的免疫原性。

5、根据权利要求1所述的重组甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1，其特征是，该蛋白为加利福尼亚州发现甲型H1N1病毒株的非结构蛋白NS1。

6、根据权利要求1所述的检测方法，其特征是，使用重组甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1，通过免疫小鼠、家兔或通过噬菌体库，获得高特异性甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1的单抗、多抗、基因工程抗体，并通过获得的抗体及重组蛋白，基于免疫学方法建立包括但不限于免疫比浊法以及酶联免疫(ELISA)去的免疫学方法检测样品中人甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1浓度的方法。

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