CN101600790B - 新型选择性标记基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在本文称作DSM‑2的新基因。这种基因是在天蓝色链霉菌A3中鉴定的。DSM‑2蛋白与PAT和BAR的关系较远。主题的发明还提供按植物优化的编码DSM‑2蛋白的基因。DSM‑2可以用作转基因性状以在植物和植物细胞中赋予对除草剂草铵膦和双丙氨酰膦的耐受。主题的基因的一种优选用途是作为选择性标记。在细菌系统中使用这种基因作为选择性标记能够增加植物转化的效率。使用DSM‑2作为单一的选择标记消除了在克隆过程中对额外的药用抗生素标记(例如氨苄青霉素抗性)的需求。按照主题的发明还可以有多种其它用途。

Description

新型选择性标记基因

发明背景

选择性标记是一种可以检测的遗传性状或能够被鉴定和追踪的DNA区段(segment)。标记基因通常充当另一基因(有时称为靶基因)的标志(flag)。标记基因通常与用于转化靶细胞的靶基因一起使用。以可遗传的方式接纳靶基因的靶细胞能够通过选择也表达标记基因的细胞来鉴定。标记基因与靶基因足够接近，因而所述两个基因(标记基因和靶基因)在遗传上连锁并且通常一起遗传。目前选择性标记的标准是“pat”基因，其编码称为膦丝菌素乙酰转移酶的酶。

谷氨酰胺合成酶(“GS”)在许多植物中是植物细胞发育和生活的关键酶。GS将谷氨酸转化成谷氨酰胺。GS还参与氨同化和氮代谢。GS参与了在大多数植物中用于解毒由硝酸还原释放的氨的途径中。因此，GS的强力抑制剂对于植物细胞的毒性非常大。分解或修饰植物内的除草剂能够导致抗性。

基于植物中因抑制GS而产生的毒性作用，开发了一类特殊的除草剂。双丙氨酰膦(Bialaphos)和膦丝菌素是两个这样的作用于GS的抑制剂并且拥有出色的除草性质。这两种除草剂是非选择性的；它们抑制土壤上存在的全部不同种类植物的生长，因此引起对它们的整体破坏。

双丙氨酰膦也是一种广谱除草剂。双丙氨酰膦由膦丝菌素(PPT或PTC；2-氨基-4-甲基膦基丁酸)、L-谷氨酸类似物和两个L-丙氨酸残基组成。因此PPT和双丙氨酰膦之间的结构差异在于PPT缺少两个丙氨酸氨基酸。通过胞内肽酶将双丙氨酰膦的L-丙氨酸残基去除的情况下，则释放PPT。PPT是GS的有利抑制剂。在植物中通过PPT对GS的抑制引起氨的迅速积累和植物细胞的死亡。

双丙氨酰膦最初被披露具有抗生素特性，这使得它能够用作杀虫剂或杀真菌剂。美国专利第3,832,394号涉及培养吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)，和从它的培养基回收双丙氨酰膦。然而，其它菌株，例如绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)，也产生这种化合物。其它含有PPT模块(moiety)的三肽抗生素也已知存在于自然界中，例如磷丙氨菌素(phosalacin)。PPT也是通过化学合成获得的并且进行商业销售。

产双丙氨酰膦的吸水链霉菌和绿色产生链霉菌受到具有膦丝菌素乙酰转移酶活性的酶的保护而不受PPT毒性影响。Plant Physiol，April 2001，Vol.125，pp.1585-1590(“Expression of bar in the Plastid Genome Confers HerbicideResistance，”Lutz等)。产生这些抗生素的链霉菌属菌种(Streptomyces species)本身会受到破坏，如果它们不具有针对这些抗生素的自我防御机制。已经发现这种自我防御机制在多种情况下包含能够抑制抗生素作用的酶。

膦丝菌素乙酰转移酶由bar(双丙氨酰膦抗性；Thompson等，1987)或pat(膦丝菌素乙酰转移酶；Strauch等，1988)基因编码，并且通过乙酰化PPT的游离氨基来解毒PPT。由这两种基因编码的酶功能上相同并且在氨基酸水平显示85％同一性(Wohlleben等，1988；Wehrmann等，1996)。已经通过自核基因在胞质中表达嵌合的bar或pat基因获得了PPT抗性作物。已经通过在烟草(烟草栽培种Petit Havana(Nicotiana tabacum cv PetitHavana))、马铃薯、欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)(De Block等，1987；De Block等，1989)、玉米(Spencer等，1990)和稻(Cao等，1992)中直接选择PPT抗性获得了除草剂抗性品系。

在天蓝色链霉菌A3(Streptomyces coelicolor A3)中鉴定了与hrdDσ因子基因相邻的一个基因(bar)。预测的bar产物与产生双丙氨酰膦的绿色产色链霉菌和吸水链霉菌的pat和bar基因的产物分别显示了32.2％和30.4％的同一性。当处于高拷贝数载体上克隆入天蓝色链霉菌中时，天蓝色链霉菌bar基因赋予对双丙氨酰膦的抗性。Bedford等，Gene，1991 Jul 31；104(1)：39-45，“Characterization of a gene conferring bialaphosresistance in Streptomycescoelicolor A3(2).”。在其它微生物中异源表达这种基因，或将这种基因转化入植物，迄今为止尚无报导。

除草剂抗性性状的用途参见DE 3642829A和美国专利第5,879,903号(以及5,637,489；5,276,268；和5,273,894)，其中pat基因分离自绿色产色链霉菌。WO 87/05629和美国专利第5,648,477号(以及5,646,024和5,561,236)涉及使用来自吸水链霉菌的bar基因用于保护植物细胞和植物免于谷氨酰胺合成酶抑制剂(例如PPT)的用途和植物中除草剂抗性的开发。将编码对除草剂BASTA(Hoechst膦丝菌素)或Herbiace(Meiji Seika双丙氨酰膦)的抗性的基因通过农杆菌感染导入烟草(烟草栽培种Petit Havan SR1)、马铃薯(马铃薯栽培种Benolima(Solanum tuberosum cv Benolima))和番茄(番茄(Lycopersicumesculentum))植物中，并且赋予了除草剂抗性。

发明内容

主题的发明涉及在此称为DSM-2的新基因。这种基因是在天蓝色链霉菌(A3)中鉴定的。DSM-2蛋白与PAT和BAR的关系较远。主题的发明还提供按植物优化的编码DSM-2蛋白的基因。DSM-2可以用作转基因性状以在微生物、植物细胞和植物中赋予对除草分子和抗菌分子、草铵膦(glufosinate)、膦丝菌素和/或双丙氨酰膦的耐受。

转化入拟南芥(Arabidopsis)允许以高比例回收草铵膦。一旦导入，DSM-2基因能够提供有效的选择(significant selection)和整株植物抗性。

主题的基因仅作为用于生物技术工程的选择性标记就具有高固有价值。在一些优选的实施方案中，主题的基因可以用作标记用于选择培养物中成功转化的细胞，和温室及田地中成功转化的整株植物。这种基因和相似的同源物可以代替pat和/或bar使用。

在细菌转化系统中使用这种基因作为选择性标记能够增加对所有植物的转化的效率。使用DSM-2作为单一的选择标记消除了克隆过程中对额外的药用抗生素标记(例如氨苄青霉素抗性)的需求。

根据主题的发明还可能有多种其它用途。DSM-2可用作转基因性状以赋予植物对除草剂草铵膦和双丙氨酰膦的耐受。

这种基因也可以连同经修饰的农杆菌属菌株(Agrobacterium strain)用作一种新型植物转化系统的基础。用于蛋白质产生并且纳入了非药用抗生素抗性标记基因的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的新菌株或其它的微生物菌株也可以按照主题的发明产生。通过免去片段纯化远离药用抗生素抗性元件来改进克隆和转化的方法及效率也可能是一个好处。

除了除草剂耐受作物(HTC)性状，使用除草剂用于控制杂草的方法也在主题的发明的范围之内，其中对于该除草剂已通过主题的基因在转基因作物中产生了耐受。主题的HTC性状的组合在与其它HTC性状(包括但不限于草甘膦耐受和2，4-D耐受)组合时也是有益的，特别是用于控制新近获得除草剂(例如草甘膦)抗性或对除草剂(例如草甘膦)固有耐受的物种。另外，当将草甘膦耐受作物(其在全世界变得越来越流行)与另外的草甘膦耐受作物轮种时，控制草甘膦抗性的自生作物(volunteer)可能是困难的。因此，使用叠加的或单独转化入作物的这些转基因性状可以提供一种对其它HTC自生作物进行控制的工具。

附图简述

图1：显示通过由DSM2介导的N-乙酰化使草铵膦失活。

序列简述

SEQ ID NO：1是天然DSM-2序列。

SEQ ID NO：2是天然蛋白质序列。

SEQ ID NO：3是Hemicot DSM-2(v2)序列。

SEQ ID NO：4是重建的(Rebuilt)蛋白质序列。

SEQ ID NO：5是Pat PTU引物(MAS123)。

SEQ ID NO：6是Pat PTU引物(Per 5-4)。

SEQ ID NO：7是Pat编码区引物

SEQ ID NO：8是Pat编码区引物

SEQ ID NO：9是DSM-2(v2)编码区引物

SEQ ID NO：10是DSM-2(v2)编码区引物

发明详述

主题的发明涉及在此称作DSM-2的新基因。这种基因是在天蓝色链霉菌(A3)中鉴定的。DSM-2蛋白与PAT和BAR的关系较远(分别具有30和28％氨基酸同一性)。主题的发明还提供按植物优化的编码DSM-2蛋白的基因，例如具有hemicot偏好(hemicot bias)。DSM-2可以用作转基因性状以在植物和植物细胞中赋予对除草剂草铵膦、膦丝菌素和/或双丙氨酰膦的耐受。

主题的基因仅作为用于生物技术工程的选择性标记就具有高固有价值。然而，按照主题的发明还可以有多种其它用途。

DSM-2可以用作转基因性状以赋予植物对除草剂草铵膦、膦丝菌素和/或双丙氨酰膦的耐受。

在一些优选的实施方案中，(与除草剂耐受作物-HTC不同(separatefrom)或在除草剂耐受作物-HTC之外)，作为选择性标记用于在培养物、温室和田地中选择成功转化的细胞和整株植物。这种基因和相似的同源物可以代替pat和/或bar使用。此处例举的一个实施方案是在NT-1烟草细胞中使用DSM-2作为选择性标记。主题的基因也可以在其它植物系统例如玉米(corn)和稻中用作选择性标记。

在细菌系统中使用这种基因作为选择性标记能够增加对所有植物的转化的效率。使用DSM-2作为单一的选择标记消除了克隆过程中对额外的药用抗生素标记(例如氨苄青霉素抗性)的需求。

实验证明了大肠杆菌细胞系BL21-Star(DE3)(Invitrogen目录号#C6010-03)在含有浓度为100μg/ml的草铵膦铵(Basta)的基本培养基上受到抑制。DSM-2在BL21Star细胞系中的表达补足了在含有400μg/ml草铵膦的基本培养基上的抗性。这些实验说明DSM-2的表达可以用作非药用抗生素选择性标记在受草铵膦抑制的细菌中用于克隆应用。

进一步的实验证实植物启动子拟南芥(Arabidopsis thaliana)PolyUbiquitin10(At Ubi10)和病毒启动子木薯叶脉花叶病毒(Cassava VeinMosaic Virus(CsVMV))在大肠杆菌菌株BL21-Star(DE3)中有功能。两种启动子均表达充足的DSM-2蛋白以提供对含200μg/ml草铵膦的基本培养基的抗性。这些植物启动子可以用于在大肠杆菌中驱动DSM-2作为非药用抗性选择性标记的表达。单一植物启动子在细菌和植物二者中的功能性消除了针对每个物种需要单独的选择性标记的需求。

这种基因也可以连同经修饰的农杆菌属菌株用作新型植物转化系统的基础。使用非药用抗生素抗性标记基因用于蛋白质产生的荧光假单胞菌新菌株或其它的微生物菌株也可以按照主题的发明产生。通过免去片段纯化、远离药用抗生素抗性元件来改进克隆和转化的方法及效率也可能是一个好处。

除了HTC性状，使用除草剂用于控制杂草的方法也在主题的发明的范围之内，其中对于该除草剂已通过主题的基因在转基因作物中产生了耐受。主题的HTC性状的组合在与其它HTC性状(包括但不限于草甘膦耐受和2，4-D耐受)组合时也是有益的，特别是用于控制新近获得除草剂(例如草甘膦)抗性或对除草剂(例如草甘膦)固有耐受的物种。另外，当将草甘膦耐受作物(其在全世界变得越来越流行)与另外的草甘膦耐受作物轮种时，控制草甘膦抗性的自生作物(volunteer)可能是困难的。因此，使用叠加的或单独转化入作物的这些转基因性状可以提供一种对其它HTC自生作物进行控制的工具。

主题的发明的蛋白质(和来源分离株(source isolate))。本发明提供功能性蛋白质。“功能性活性”(或“活性的”)在此是指用于主题的发明的用途的蛋白质/酶具有降解或减少除草剂活性的能力(单独或与其它蛋白质组合)。产生主题的发明的蛋白质的植物将优选产生“有效量”的所述蛋白质，从而当用除草剂处理该植物时，蛋白质表达的水平足以使植物完全或部分地抗所述除草剂(除非另行指定，否则按照典型的比率(rate)；例如，典型施用率(applicationrate)可以在公知的除草剂手册(Weed Science Society ofAmerica，EighthEdition，2002)中找到)或对所述除草剂耐受。所述除草剂可以按照一般将会杀死目标植物的频率，按照普通田间使用频率和浓度施用。(由于主题的发明，水平和/或浓度可以任选地高于先前使用的那些。)优选地，主题的发明的植物细胞和植物受到针对由除草剂处理引起的生长抑制或损伤的保护。如本文所讨论的，优选地使主题的发明的经转化的植物和植物细胞对除草剂有抗性或耐受，意味着所述经转化的植物和植物细胞能够在有效量的本文所讨论的一种或多种除草剂存在下生长。主题的发明的优选的蛋白质具有代谢一种或多种芳氧基链烷酸酯/盐(aryloxyalkanoate)化合物的催化活性。无法简单地讨论术语“抗性”，也不能使用动词“耐受”或形容词“耐受的”。工业上花费了无法计数的时间来争论除草剂耐受作物(HTC)与除草剂抗性作物(HRC)。HTC是工业上优选的术语。然而，官方的Weed Science Society of America对抗性的定义是“在曝露于一般为野生型致死剂量的除草剂之后，植物能够存活并繁殖的遗传性能力。在植物中，抗性可以是天然存在的或是通过如遗传工程或对组织培养或诱变产生的变体进行选择等技术来诱导的。”用于本文除非另有说明，除草剂“抗性”是可遗传的，并且使得植物能够在用针对给定植物的除草剂进行的典型有效除草处理(如主题的公开提交时通用的除草剂手册版本所建议的)存在下生长。如本领域技术人员所公认的，即使因曝露于除草剂而有的某种程度的植物损伤是表观的，植物仍然可以被认为是“抗性的”。如本文所使用，术语“耐受”比术语“抗性”更宽，并且包括如本文所定义的“抗性”，以及特定植物改进的经受住不同程度除草剂诱导的损伤的能力，所述不同程度的损伤是在相同除草剂剂量下在相同基因型的野生型植物中产生的。

将功能性活性转给植物或细菌系统可以包括核酸序列，其编码主题的发明的蛋白质的氨基酸序列，所述核酸序列整合在蛋白质表达载体中，所述蛋白质表达载体适合于该载体将存在于其中的宿主。获得编码具有功能性活性的蛋白质的核酸序列的一种方法是，如本文所公开的，利用从蛋白质的氨基酸序列推定的信息，从产生感兴趣的蛋白质的细菌菌种分离天然的遗传物质。可以将天然序列针对在植物中的表达进行优化，例如，如下文将更详细讨论的。也可以基于蛋白质序列设计优化的多核苷酸。

表征这些蛋白质种类和编码它们的多核苷酸的一种方法是如下限定多核苷酸，通过所述多核苷酸在指定条件范围内与示例核苷酸序列(其补体和/或源自任一链的一个或多个探针)杂交的能力，和/或通过所述多核苷酸藉由使用源自示例序列的引物进行的PCR来扩增的能力。

有多种方法用于获得按照主题的发明使用的蛋白质。例如，可以使用本文公开的蛋白质的抗体从蛋白质的混合物鉴定和分离其它的蛋白质。具体而言，抗体可以针对蛋白质中最保守或与其它相关蛋白相比差别最大的部分来产生。然后可以通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定法(ELISA)或免疫印迹将这些抗体用于特异性地鉴定具有特征活性的等效蛋白质。针对本文公开的蛋白质或针对等效蛋白质或针对这些蛋白质的片段的抗体可以使用标准流程容易地制备。这些抗体是主题的发明的一个方面。主题的发明的抗体包括单克隆和多克隆抗体，优选是响应于示例的或建议的蛋白质产生的。

得益于主题的公开，主题的发明的蛋白质和基因可以从多种来源获得，包括例如多种微生物，例如重组的和/或野生型细菌。

细菌分离株的突变体可以通过本领域公知的流程制备。例如，不产芽孢的(asporogenous)突变体能够通过对分离株进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变来获得。突变体可以使用紫外线和亚硝基胍通过本领域公知的流程来制备。

“来自”或“获得自”本文涉及或建议的任何分离株的蛋白质是指所述蛋白质(或类似蛋白质)可以从主题的分离株或一些其它来源获得，例如另一细菌菌株或植物。“源自”也有这种含义，并且包括例如能够从给定的为了在植物中表达而修饰的细菌类型获得的蛋白质。本领域技术人员将容易地认识到，假设披露了细菌基因和蛋白质，就能够工程改造植物使其产生所述蛋白质。抗体制备物、核酸探针(例如DNA、RNA或PNA)等可以使用本文公开的多核苷酸和/或氨基酸制备，并且用于从其它(天然)来源筛选和回收其它相关基因。

可以使用标准分子生物学技术来克隆并测序本文描述的蛋白质和基因。额外的信息可以在Sambrook等，1989中找到，将其通过引用并入本文。

多核苷酸和探针。主题的发明还提供编码按照主题的发明使用的蛋白质的核酸。主题的发明还提供鉴定和表征基因的方法，所述基因编码具有期望的除草剂活性的蛋白质。在一个实施方案中，主题的发明提供独特的核苷酸序列，其可用作杂交探针和/或用于PCR技术的引物。引物产生的特征性基因片段可以在感兴趣的特定基因的鉴定、表征和/或分离中使用。主题的发明的核苷酸序列编码的蛋白质不同于先前描述的蛋白质。

主题的发明的多核苷酸可以用于形成在期望的宿主细胞中编码蛋白质或肽的完整“基因”。例如，如本领域技术人员将轻易认识到的，在感兴趣的宿主中可以适当地将主题的多核苷酸置于启动子的调控下，如本领域中容易知晓的。基因表达和/或时间/组织特异性表达的水平能够大大影响本发明的应用。通常，更高的降解基因蛋白质表达水平将导致更快和更完整的底物降解(在这种情况下，底物是目标除草剂)。启动子以高水平表达靶基因将是理想的，除非高表达对植物健康有因此产生的负面影响。通常，人们会希望DSM-2基因在全部组织中组成型表达来对全部生长阶段的植物进行完全保护。但是，人们可以代替地使用营养型表达的抗性基因；这将允许在耕种中使用目标除草剂用于杂草控制并且随后将通过在开花阶段中施用来控制目标作物的有性生殖。

如本领域技术人员所知，DNA通常以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。若DNA在某植物中复制(例如)，则产生额外的DNA互补链。“编码链”在本领域中通常用于指与反义链结合的链。mRNA从DNA的“反义”链转录。“有义”或“编码”链具有可以作为可读框(ORF)阅读的一系列密码子(一个密码子是三个核苷酸，其能够被读作指定特定氨基酸的一个三个残基的单元)，以形成感兴趣的蛋白质或肽。为了在体内产生蛋白质，DNA链通常转录成mRNA的互补链，其作为蛋白质的模板使用。因此，主题的发明包括随附的序列表中所示的示例多核苷酸和/或包括互补链的等效物的用途。将功能上与示例DNA分子等效的RNA和PNA(肽核酸)包括在主题的发明中。

在主题的发明的一个实施方案中，可以将细菌分离株培养在导致微生物高繁殖的条件下。在处理微生物以提供单链基因组核酸之后，可以将DNA与主题的发明的引物接触并且进行PCR扩增。感兴趣的基因的特征性片段将通过所述方法得到扩增，由此鉴定感兴趣的基因的存在。

主题的发明另外的方面包括使用本文公开的方法和核苷酸序列鉴定的基因和分离株。由此鉴定的基因能够编码主题的发明的除草剂抗性蛋白质。

例如，按照主题的发明使用的蛋白质和基因可以通过使用寡核苷酸探针鉴定和获得。这些探针是可检测的核苷酸序列，其能够依靠适当的标记来检测或可以使其成为固有发荧光的，如国际申请第WO 93/16094号中所述。探针(和主题的发明的多核苷酸)可以是DNA、RNA或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U；用于RNA分子)，主题的发明的合成探针(和多核苷酸)也可以具有肌苷(一种能够与全部四种碱基配对的中性碱基；在合成探针中有时用来代替全部四种碱基的混合物)和/或其它合成(非天然)碱基。因此，在本文提及合成的、简并寡核苷酸，并且统称使用“N”或“n”的情况下，“N”或“n”可以是G、A、T、C或肌苷。本文使用的多义密码(ambiguity code)符合主题的申请提交时的标准IUPAC命名规定(例如，R是指A或G，Y是指C或T等)。

如本领域所公知的，如果探针分子与核酸样品杂交，那么能够合理地假设所述探针和样品具有实质上的(substantial)同源性/相似性/同一性。优选地，首先进行多核苷酸的杂交，其后在低、中或高严紧性条件下通过本领域公知的技术洗涤，例如，如Keller，G.H.，M.M.Manak(1987)DNA Probes，StocktonPress，New York，NY，pp.169-170中所述。例如，如该文献中所述，低严紧性条件可以通过首先用2x SSC(标准柠檬酸盐水(StandardSaline Citrate))/0.1％SDS(十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate))在室温洗涤15分钟来实现。通常进行两次洗涤。然后可以通过降低盐浓度和/或提高温度来实现较高的严紧性。例如，上述洗涤之后可以进行两次洗涤，每次在室温使用0.1xSSC/0.1％SDS进行15分钟，然后再进行多次洗涤，每次在55℃用0.1xSSC/0.1％SDS进行30分钟。这些温度可以用于本文所述的其它杂交和洗涤方案，并且如本领域技术人员将会知道的(例如，SSPE可以用作盐代替SSC)。2x SSC/0.1％SDS可以通过向445ml水加入50ml的20xSSC和5ml的10％SDS来制备。20xSSC可以通过混合NaCl(175.3g/0.150M)、柠檬酸钠(88.2g/0.015M)和水，用10NNaOH将pH调节至7.0，然后将体积调节至1升来制备。10％SDS可以通过将10g SDS溶解到50ml高压灭菌水中，然后稀释到100ml来制备。

探针的检测提供了一种以已知方式测定杂交是否得到保持的手段。这样的探针分析提供了一种鉴定主题的发明的基因的快速方法。用作本发明的探针的核苷酸区段可以使用DNA合成仪和标准流程来合成。这些核苷酸序列也可以用作PCR引物来扩增主题的发明的基因。

分子的杂交特征可以用于鉴定主题的发明的多核苷酸。因此主题的发明包括与本文示例的多核苷酸杂交的多核苷酸(和/或它们的补体，优选它们的完整补体)。也就是说，例如，一种定义基因(和它编码的蛋白质)的方法是通过它与已知的或具体示例的基因杂交的能力(在任何本文具体公开的条件下)。

如用于本文，用于杂交的“严紧”条件是指实现与目前的申请人所采用的条件所实现的杂交特异性程度相同或大约相同的条件。具体而言，可以通过标准方法将Southern印迹上固定化的DNA与³²P-标记的基因特异性探针杂交(参见，例如，Maniatis等1982)。概括而言，杂交和后续的洗涤可以在允许对靶序列进行检测的条件下进行。对于双链DNA基因探针，杂交可以在低于DNA杂合体解链温度(Tm)20-25℃的温度下在6x SSPE、5xDenhardt’s溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中过夜进行。解链温度通过以下公式描述(Beltz等1983)：

Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/以碱基对计算的双链体长度

洗涤通常如下进行：

(1)在1x SSPE、0.1％SDS中在室温进行两次各15分钟(低严紧性洗涤)。

(2)在0.2x SSPE、0.1％SDS中在Tm-20℃进行一次15分钟(中严紧性洗涤)。

对于寡核苷酸探针，杂交可以在6x SSPE、5x Denhardt’s溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中在低于杂合体解链温度10-20°的温度过夜进行。寡核苷酸探针的Tm可以通过以下公式决定：

Tm(℃)＝2(T/A碱基对数目)+4(G/C碱基对数目)

(Suggs等，1981)。

洗涤通常可以如下进行：

(1)在1x SSPE、0.1％SDS中在室温进行两次各15分钟(低严紧性洗涤)。

(2)在1x SSPE、0.1％SDS中在杂交温度进行一次15分钟(中严紧性洗涤)。

概括而言，可以改变盐和/或温度来改变严紧性。对于长度＞70左右的标记DNA片段，可以使用以下条件：

低：1或2x SSPE，室温

低：1或2x SSPE，42℃

中：0.2x或1x SSPE，65℃

高：0.1x SSPE，65℃

双链体的形成和稳定性依赖于杂合体两条链之间实质上的互补性，并且，如上所述，可以容许某种程度的错配。因此，主题的发明的探针序列包括对所述序列的突变(一个和多个两种)、缺失、插入，和它们的组合，其中所述突变、插入和缺失允许与感兴趣的靶多核苷酸形成稳定杂合体。突变、插入和缺失可以在给定的多核苷酸序列中以多种方式产生，并且这些方法是本领域普通技术人员已知的。其它方法可能在未来逐渐为人所知。

PCR技术。聚合酶链式反应(PCR)是一种重复性、酶促、引物引导的核酸序列合成。这种方法是公知的，并且是本领域技术人员普遍使用的(参见Mullis，美国专利第4,683,195、4,683,202和4,800,159号；Saiki等，1985)。PCR基于对感兴趣的DNA片段的酶促扩增，所述DNA片段由两个寡核苷酸引物在侧翼包围(flanked)，所述引物与靶序列的两个相对序列杂交。优选地所述引物的方向为3′端彼此相对。模板热变性、将引物与它们的互补序列退火和使用DNA聚合酶延伸退火的引物的重复循环导致由PCR引物5′端限定的区段的扩增。每个引物的延伸产物可以充当模板用于另一引物，所以每个循环基本上使前一循环中产生的DNA片段的量翻倍。这导致特定靶片段以指数积累，在数小时中高达几百万倍。通过使用热稳定性DNA聚合酶例如Taq聚合酶(其分离自嗜热细菌水生栖热菌(Thermus aquaticus))，可以使扩增过程完全自动化。可以使用的其它酶是本领域技术人员已知的。

示例性的DNA序列，或它的区段，可以用作引物用于PCR扩增。在PCR扩增的进行中，可以容许引物和模板之间某种程度的错配。因此，对示例引物的突变、缺失和插入(特别是向5′端添加核苷酸)落入主题的发明的范围之内。可以通过本领域普通技术人员已知的方法在给定的引物中产生突变、插入和缺失。

基因和蛋白质的修饰。主题的基因和蛋白质可以与其它基因和蛋白质融合以产生嵌合的或融合的蛋白质。根据主题的发明有用的基因和蛋白质不仅包括具体示例的全长序列，还包括这些序列的部分、区段(segment)和/或片段(包括连续的片段和相较于全长分子的中部和/或末端缺失)，它们的变体、突变体、嵌合体和融合物。主题的发明的蛋白质可以具有经取代的氨基酸，只要它们保留了期望的功能性活性。“变体”基因具有编码与示例蛋白质具有等效或相似活性的相同蛋白质或等效蛋白质的核苷酸序列。术语“变体蛋白质”和“等效蛋白质”是指这样的蛋白质，其与示例蛋白质具有相同或基本上相同的针对目标底物的生物学/功能性活性和等效序列。如用于本文，提及的“等效”序列是指具有氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列，所述取代、缺失、添加或插入使活性改进或对活性没有程度显著的负面影响。保有活性的片段也包括在这个定义中。与示例蛋白质的相应片段保留相同或相似功能或活性的片段或其他等效物也在主题的发明的范围内。以氨基酸取代或添加为例的变化可以出于多种目的来进行，例如增加(或减少)蛋白质的蛋白酶稳定性(在实质上/本质上未减少该蛋白质的功能性活性)，去除或添加限制位点，等等。基因的变异可以使用例如制造点突变的标准技术容易地构建。

此外，美国专利第5,605,793号，例如，描述了通过在随机或聚焦片段化(focusedfragmentation)之后使用DNA再装配来生成额外的分子多样性的方法。这可以称作基因“改组”，其通常包括混合两种或多种不同DNA分子的(期望大小的)片段，然后是重复的变性循环。这能够改进由初始基因编码的蛋白质的活性。结果是具有改进的活性、改变的底物特异性、增加的酶稳定性、改变的立体特异性(stereospecificity)或其它特征的嵌合蛋白。

“改组”可以在获得和检验了感兴趣的蛋白质的原子3D(三维)坐标和晶体结构之后设计并指定目标(target)。由此，“聚焦改组”可以定向于某些对于修饰而言理想的蛋白质区段，例如表面暴露的区段，并且优选不是参与蛋白质折叠和关键3D结构完整性的内部区段。

可以使用变体基因来产生变体蛋白；重组宿主能够用于产生变体蛋白质。使用“基因改组”和其它技术，能够构建等效基因和蛋白质，其包含具有本文示例的任何序列的某些连续残基(氨基酸或核苷酸)的某些区段。这样的技术可以进行调整以获得等效的/功能上有活性的蛋白质，所述蛋白质具有，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169和170个对应于任何示例的或建议的序列中(相同大小的)区段的连续氨基酸残基。编码这些区段的多核苷酸，特别是对于感兴趣的区域，也包括在主题的发明中，并且能够用作探针和/或引物，特别是用于保守区域。

全长基因的片段可以按照标准流程使用可以通过商业途径获得的核酸外切酶或核酸内切酶制备。例如，酶如Bal31或定点诱变可以用于系统性地从这些基因的末端切割核苷酸。同样，编码活性片段的基因可以使用多种限制酶来获得。可以使用蛋白酶来直接获得这些蛋白质的活性片段。

如本文所公开的，能够被截短并且仍然保留功能性活性的蛋白质在本发明的范围内。“截短的蛋白质”是指可以将蛋白质的一部分切下，同时剩余的截短的蛋白质在切割之后保留并且展现期望的活性。切割可以通过多种蛋白酶来实现。另外，有效切割的蛋白质可以使用分子生物学技术来产生，其中通过用限制性内切核酸酶消化或本领域技术人员可用的其它技术将编码所述蛋白质的DNA碱基去除。截短之后，可以将所述蛋白质在异源系统例如大肠杆菌、杆状病毒、基于植物的病毒系统、酵母等中表达，并且再如本文所述置于昆虫测定法中来测定活性。本领域公知能够成功地产生截短的蛋白质，如此它们保留功能性活性，同时小于完整的全长序列。例如，B.t蛋白可以以阶段的(核心蛋白)形式使用(参见，例如，

等(1989)，和Adang等(1985))。如本文所使用，术语“蛋白质”可以包括功能上有活性的截短物(truncation)。

在一些情况下，特别是对于在植物中的表达，使用表达截短的蛋白质的截短的基因可能是有利的。优选的截短的基因将通常编码全长蛋白质的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。

主题的发明的某些蛋白质已经在本发明具体示例。由于这些蛋白进食对主题的发明的蛋白质的示例，应该很容易明白主题的发明包含具有与示例蛋白质相同或相似的活性的变体或等效蛋白质(和编码其等效物的核苷酸序列)。等效蛋白质将于示例蛋白质具有氨基酸相似性(和/或同源性)。氨基酸同一性将通常是至少60％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，并且可以是至少95％。主题的发明的优选的蛋白质也可以按照更具体的同一性和/或相似性范围来限定。例如，如与本文示例的或建议的序列相比，同一性和/或相似性可以是49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。以上所列的任何数字可以用于限定上限和下限。

除非另有指定，如用于本文，两个核酸的百分比序列同一性和/或相似性的测定使用Karlin和Altschul，1990的算法，如Karlin和Altschul 1993中进行修改。这样的算法被纳入了Altschul等，1990的NBLAST和XBLAST程序。BLAST核苷酸检索使用NBLAST程序进行，得分(score)＝100，字长(wordlength)＝12。缺口BLAST(Gapped BLAST)可以如Altschul等，1997中所述来使用。当应用BLAST和缺口BLAST程序时，使用各程序(NBLAST和XBLAST)的缺省参数。参见NCBI/NIH网站。为了获得缺口比对来用于比较的目的，采用缺省参数使用了Vector NTI Suite 8(InforMax，Inc.，NorthBethesda，MD，U.S.A.)的AlignX功能。这些为：15的缺口产生罚分(Gapopening penalty)，6.66的缺口延伸罚分(Gap extensionpenalty)和8的缺口分隔罚分范围(Gap separation penalty range)。

也可以改变蛋白质的多种性质和三维特性而不负面影响蛋白质的活性/功能性。不负面影响分子的活性和/或三维构型的保守氨基酸取代是可以容忍/进行。氨基酸可以归为以下类别：非极性、不带电的极性、碱性和酸性。将一种类别的一个氨基酸用同种类型的另一氨基酸替代的保守取代属于主题的发明的范围，只要所述取代不会不利于化合物的生物学活性。表2提供的是属于各个类别的氨基酸的实例列表。

在一些情况下，也可以进行非保守取代。然而，优选的取代不显著减损蛋白质的功能性/生物学活性。

如本文所使用，提及“分离的”多核苷酸和/或“纯化的”蛋白质是指这些分子处于这样一种状态时，所述状态不同于将在自然界中找到的所述分子的状态。因此，提及“分离的”和/或“纯化的”强调如本文所述的“人工”参与。例如，导入植物进行表达的主题的发明的细菌“基因”是“分离的多核苷酸”。同样，源自细菌蛋白并且由植物产生的蛋白质是“分离的蛋白质”。

由于遗传密码的简并性/冗余性，多种不同的DNA序列能够编码本文公开的氨基酸序列。创建编码相同的或基本上相同的蛋白质的可选DNA序列完全在本领域经过训练的人员的技术之内。这些变体DNA序列属于主题的发明的范围。这还将在下文题为“优化用于在植物中表达的序列”的部分中更详细地讨论。

优化用于在植物中表达的序列。为了获得异源基因在植物中的高表达，通常优选重新改造所述基因，从而使它们在植物细胞(的胞质)中更有效地表达。玉米是一个这样的植物，其中可能优选在转化之前重新设计异源基因以增加其在所述的植物中的表达水平。因此，在编码细菌蛋白的基因的设计中的额外步骤是为了最佳表达而重新改造异源基因，其使用与目标植物序列(无论是双子叶植物或单子叶植物物种)排列更接近的密码子偏倚。在本文其它地方所讨论的任何更具体的植物类型中也可以为了表达而优化序列。

转基因宿主。可以将主题的发明的编码蛋白质的基因导入很多种微生物或植物宿主。主题的发明包括转基因植物细胞和转基因植物。优选的植物(和植物细胞)是玉米、拟南芥(Arabidopsis)、烟草、大豆、棉花、油菜、稻、小麦、草皮草和牧草(turf and pasturegrasses)等等。转基因植物的其它类型也可以根据主题的发明制备，例如水果、蔬菜、观赏植物和树。更概括地，双子叶植物和/或单子叶植物可以在主题的发明的多种方面中使用。

因此，主题的发明可以进行修改以适用于维管和非维管植物，包括单子叶植物和双子叶植物，针叶树(conifer)，苔藓植物(bryophyte)，藻类，真菌和细菌。动物细胞和动物细胞培养物也是一种可能。

在优选的实施方案中，基因表达直接或间接地导致感兴趣的蛋白质的胞内产生(和保持)。以这种方式能够使植物成为除草剂抗性的。这样的宿主可以称作转基因的、重组的、转化的和/或转染的宿主和/或细胞。在本发明的一些方面中(例如，在克隆和制备感兴趣的基因时)，得益于主题的发明的内容，可以按照标准技术产生并使用微生物(优选细菌)细胞。

用主题的发明的多核苷酸转染的植物细胞可以再生成整株植物。主题的发明包括细胞培养物，包括组织细胞培养物、液体培养物和平板培养物。由主题的发明的植物产生和/或用于生成主题的发明的植物的种子也包括在主题的发明的范围内。其它植物组织和部分也包括在主题的发明中。主题的发明同样包括产生包含主题的发明的多核苷酸的植物或细胞的方法。一种产生这样的植物的优选方法是通过栽培主题的发明的种子。

插入基因以形成转基因宿主。主题的发明的一个方面是用表达主题的发明的蛋白质的主题的发明的多核苷酸转化/转染植物、植物细胞和其它宿主细胞。以这种方式转化的植物能够产生对作用模式不同的多种除草剂的抗性。

许多种方法可以用于在允许稳定保持和表达基因的条件下将编码期望的蛋白质的基因导入目标宿主。这些方法是本领域技术人员公知的，并且在例如美国专利第5,135,867号中描述。

包含DSM-2多核苷酸的载体包括在主题的发明的范围内。例如，大量包含大肠杆菌中的复制系统和允许对转化细胞进行选择的标记的克隆载体可用于制备外源基因向高等植物的插入。例如，所述载体包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，可以将编码蛋白质的序列插入载体中合适的限制位点处。将所得质粒用于转化入大肠杆菌。将所述大肠杆菌细胞培养在合适的营养培养基中，然后收获并裂解。通过从基因组DNA中纯化来回收质粒。通常进行序列分析、限制酶分析、电泳和其它生物化学-分子生物学方法作为分析的方法。在每种操作之后，可以对使用的DNA序列进行限制酶消化并且与接下来的DNA序列连接。可以将每种质粒序列克隆入相同的或其它的质粒中。依赖于将期望的基因插入植物的方法，其它的DNA序列可能是必要的。如果，例如，使用Ti或Ri质粒用于转化植物细胞，那么至少Ti或Ri质粒T-DNA的右边界，但通常为右边界和左边界，必需作为待插入的基因的侧翼区域加入。已经深入研究了使用T-DNA用于转化植物细胞，并且在EP 120 516；Hoekema(1985)；Fraley等(1986)；和An等(1985)中描述。

大量技术可用于将DNA插入植物宿主细胞。那些技术包括使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂以T-DNA转化，融合，注射，生物弹射(微粒轰击)，碳化硅晶须(silicon carbide whisker)，气溶胶发射(aerosol beaming)，PEG或电穿孔以及其它可能的方法。如果使用农杆菌(Agrobacteria)用于转化，那么必需将待插入的DNA克隆入特殊的质粒，即克隆入中间载体(intermediate vector)或二元载体(binary vector)。中间载体可以依靠与T-DNA中序列同源的序列通过同源重组整合入Ti或Ri质粒。Ti或Ri质粒还包含T-DNA转移所必需的vir区。中间载体本身无法在农杆菌中复制。可以将中间载体依靠辅助质粒(接合)转入根癌农杆菌。二元载体本身能够在大肠杆菌和农杆菌二者中复制。它们包含由左右T-DNA边界区框住的选择标记基因和接头或多聚接头。可以将它们直接转化入农杆菌(Holsters，1978)。用作宿主细胞的农杆菌包含携带vir区域的质粒。vir区域是将T-DNA转入植物细胞所必需的。可以含有额外的T-DNA。将如此转化的细菌用于转化植物细胞。可以将植物外植体有利地与根癌农杆菌或发根农杆菌一起培养来将DNA转入植物细胞。然后可以在合适的培养基中从感染的植物材料(例如，叶片，茎段，根，还有原生质体或悬浮培养的细胞)再生整株植物，所述培养基可以含有抗生素或杀生物剂用于选择。然后可以测试如此获得的植物中插入的DNA的存在。在注射和电穿孔的情况下对质粒没有特殊要求。可以使用普通质粒，诸如，例如，pUC衍生物。

以常规方法使转化的细胞在植物内生长。它们能够形成生殖细胞，并且将转化的性状传给子代植物。这样的植物可以以普通方式培养，并且与具有相同的转化的遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得杂交个体具有相应的表型特性。

在本发明的一些优选实施方案中，编码细菌蛋白的基因是从插入植物基因组中的转录单位表达的。优选地，所述转录单位是能够稳定整合入植物基因组并且使得对表达编码蛋白质的mRNA的转化植物品系能够进行选择的重组载体。

一旦已经将插入DNA整合入基因组，就相对稳定(并且不会再次出来)。它通常含有赋予转化的植物细胞对杀生物剂或抗生素的抗性的选择标记，所述抗生素例如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或氯霉素等。植物选择性标记通常也能提供对多种除草剂的抗性，所述除草剂如草铵膦、(PAT)、草甘膦(EPSPS)、咪草烟(imazethyapyr)(AHAS)以及许多其它除草剂。因此单独采用的标记物应该允许选择转化的细胞而非不含插入DNA的细胞。感兴趣的基因优选在植物细胞中通过组成型或诱导型启动子表达。一旦表达，mRNA翻译成蛋白质，其中在蛋白质中纳入了感兴趣的氨基酸。在植物中表达的编码蛋白质的基因可以在组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子的调控下。

存在几种技术用于将外源重组载体导入植物细胞和用于获得稳定保有并表达导入的基因的植物。这些技术包括将涂覆在微粒上的遗传材料直接导入细胞(Cornell的美国专利第4,945,050号和DowElanco(现为DowAgroSciences，LLC)的美国专利第5,141,131号)。此外，植物可以使用农杆菌技术转化，参见University of Toledo的美国专利第5,177,010号；Texas A&M的美国专利第5,104,310号；欧洲专利申请0131624B1；Schilperoot的欧洲专利申请120516、159418B1和176,112；Schilperoot的美国专利第5,149,645、5,469,976、5,464,763和4,940,838和4,693,976号；欧洲专利申请116718、290799、320500，均属于Max Planck；欧洲专利申请604662及627752，和美国专利第5,591,616号，属于JapanTobacco；欧洲专利申请0267159及0292435，和美国专利第5,231,019号，全部属于CibaGeigy，现为Syngenta；美国专利第5,463,174和4,762,785号，均属于Calgene；和美国专利第5,004,863和5,159,135号，均属于Agracetus。其它转化技术包括晶须(whiskers)技术。参见美国专利第5,302,523和5,464,765号，均属于Zeneca，现为Syngenta。其它直接的DNA递送转化技术包括气溶胶发射技术。参见美国专利第6,809,232号。电穿孔技术也已经用于转化植物。参见Boyce ThompsonInstitute的WO 87/06614；美国专利第5,472,869和5,384,253号，均属于Dekalb；和WO 92/09696和WO 93/21335，均属于Plant Genetic Systems。此外，病毒载体也可以用于产生表达感兴趣的蛋白质的转基因植物。例如，单子叶植物可以使用属于Mycogen Plant Science和Ciba-Geigy(现为Syngenta)的美国专利第5,569,597号，以及属于现为Large Scale Biology的Biosource的美国专利第5,589,367和5,316,931号中描述的方法用病毒载体来转化。

如先前提及的，将DNA构建体导入植物宿主的方式不是本发明的关键。可以采用任何提供有效转化的方法。例如，在本文描述了多种用于植物细胞转化的方法，并且包括使用Ti或Ri质粒等进行农杆菌介导的转化。在许多情况下，用于转化的构建体在一侧或两侧的边界上为T-DNA边界将是理想的，更具体而言为右边界。这在构建体使用根癌农杆菌或发根农杆菌作为转化模式时尤其有用，尽管T-DNA边界可能在其它转化模式中也有用。在使用农杆菌进行植物细胞转化的情况下，可以使用载体，可以将所述载体导入宿主用于与宿主中存在的T-DNA或Ti或Ri质粒的同源重组。载体的导入可以藉由电穿孔、三亲杂交和本领域技术人员已知的用于转化革兰氏阴性细菌的其它技术来进行。将载体转化入农杆菌宿主的方式不是本发明的关键。含有用于重组的T-DNA的Ti或Ri质粒可以是能够或不能引起菌瘿(gall)形成的，并且不是所述发明的关键，只要vir基因存在于所述的宿主中。

在一些将农杆菌用于转化的情况下，T-DNA边界内的表达构建体将被插入广谱载体例如pRK2或其衍生物中，如Ditta等(1980)和EPO 0120515中所述。在表达构建体和T-DNA内将包括一个或多个如本文所述的标记物，其允许对转化的农杆菌和转化的植物细胞的选择。采用的特定标记物不是本发明的关键，优选的标记物依赖于使用的宿主和构建。

对于使用农杆菌的植物细胞转化，可以将外植体与转化的农杆菌组合并且一起温育足够的时间以允许其转化。转化之后，通过用合适的抗生素选择来杀死农杆菌，并且将植物细胞用适合的选择培养基培养。一旦形成愈伤组织，可以按照植物组织培养和植物再生领域中公知的方法通过采用适合的植物激素来促进芽形成。然而，愈伤组织中间阶段不一定是必需的。在芽形成之后，可以将所述的植物细胞转移至促进根形成的培养基，由此完成植物再生。然后可以将植物培育成种子，并且可以使用所述种子来建立未来的世代。不考虑转化技术，优选将编码细菌蛋白的基因并入基因转移载体，所述载体通过在载体中包括植物启动子调节元件，以及3′非翻译转录终止区例如Nos等而适合于在植物细胞中表达所述基因。

除了用于转化植物的众多技术，与外源基因接触的组织的类型也可以不同。这样的组织将包括但不限于胚发生组织，I、II和III型愈伤组织，下胚轴，分生组织，根组织，用于在韧皮部中表达的组织等等。几乎所有植物组织均可使用本发明描述的适合技术在去分化过程中转化。

除了选择性标记，可能期望使用报道基因。在一些情况下，报道基因可以与或不与选择性标记一起使用。报道基因是通常不存在于受体生物或组织中的基因，并且通常编码导致某些表型变化或酶特性的蛋白质。这样的基因的实例在Weising等，1988中提供。优选的报道基因包括大肠杆菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，来自大肠杆菌Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因，来自生物发光的水母维多利亚水母(Aequorea Victoria)的绿色荧光蛋白，和来自萤火虫北美萤火虫(Photinus pyralis)的萤光素酶基因。然后在所述基因导入了受体细胞之后，可以在合适的时间进行用于检测报道基因表达的测定。优选的这样的测定需要使用如Jefferson等，(1987)所述的编码大肠杆菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因以鉴定转化的细胞。

除了植物启动子调节元件，在植物细胞中可以有效地使用来自多种来源的启动子调节元件以表达外源基因。例如，可以使用细菌来源的启动子调节元件，例如章鱼碱合酶启动子、胭脂氨酸合成酶启动子、甘露氨酸合酶启动子；病毒来源的启动子，例如花椰菜花叶病毒(35S和19S)，35T(其是重新改造的35S启动子，参见美国专利第6,166,302号，特别是实施例7E)等。植物启动子调节元件包括但不限于核酮糖-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)，β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)启动子，β-菜豆蛋白启动子，ADH启动子，热激启动子和组织特异性启动子。其它元件例如基质附着区、支架附着区、内含子、增强子、聚腺苷酸化序列等可以存在并且由此可以改进转录效率或DNA整合。这样的元件对于DNA功能可能是必需的或可能不是，尽管它们通过影响转录、mRNA稳定性等来提供更好的DNA表达或功能。这样的元件可以按照期望包括在DNA中以获得转化DNA在植物中的最佳性能。典型的元件包括但不限于Adh-内含子1、Adh-内含子6、苜蓿花叶病毒外壳蛋白前导序列、渗透蛋白UTR序列、玉米条纹毒病病毒外壳蛋白前导序列、以及其它本领域技术人员可用的元件。也可以使用组成型启动子调节元件，由此在全部细胞类型中和全部时间指导连续的基因表达(例如，肌动蛋白、泛素、CaMV 35S等)。组织特异性的启动子调节元件负责在特定细胞或组织类型中，例如叶或种子中的基因表达(例如，玉米醇溶蛋白、油质蛋白、油菜籽蛋白、ACP、球蛋白等)，并且这些也可以使用。

启动子调节元件也可以是在植物发育的某个阶段中是活性的(或无活性的)以及在植物组织和器官中是活性的。这样的实例包括但不限于花粉特异性、胚特异性、玉米须特异性(corn-silk-specific)、棉花纤维特异性、根特异性、种子胚乳特异性或营养阶段特异性的启动子调节元件等。在某些情况下，使用诱导型启动子调节元件可能是理想的，所述诱导型启动子调节元件负责基因响应于特定信号表达，例如：物理刺激物(热激基因)、光(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代谢物、化学药物(四环素应答型)和应激。可以使用其它在植物中发挥功能的理想的转录和翻译元件。多种植物特异性基因转移载体是本领域已知的。

基于植物RNA病毒的系统也可以用于表达细菌蛋白。在这样的操作中，可以将编码蛋白质的基因插入将感染感兴趣的宿主植物的合适植物病毒的外壳启动子区。然后可以表达所述蛋白质，由此为植物提供免于除草剂损害的保护。基于植物RNA病毒的系统在Mycogen Plant Sciences，Inc.的美国专利第5,500,360号和Biosource(现为Large ScaleBiology)的美国专利第5,316,931和5,589,367号中描述。

选择剂。除了草铵膦和双丙氨酰膦，能够按照主题的发明使用的选择剂包括全部合成的和天然的类似物，所述类似物可以通过由主题的发明的DSM-2基因介导的乙酰转移酶机制失活。参见例如图1。

除非具体说明或暗示，如本文使用的术语“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”表示“至少一个”。

将本文涉及的或引用的全部专利、专利申请、临时申请和公开文献通过引用以不与本说明书的清楚教导相冲突的程度整体并入。

以下是说明实践本发明的流程的实施例。这些实施例不应理解为限制。全部百分比均按重量计，且全部溶剂混合物比例均按体积计，除非另有注释。

实施例1.用于鉴定在植物中赋予草铵膦抗性的基因的方法

作为一种鉴定在植物中(in planta)拥有除草剂降解活性的基因的方法，可以在目前的公共数据库例如NCBI(National Center for BiotechnologyInformation(国家生物技术信息中心))中挖掘。为了开始所述过程，必须具有已经鉴定的编码具有期望特征的蛋白质(即，膦丝菌素乙酰转移酶)的功能性基因序列。然后使用这种蛋白质序列作为BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)(Altschul等，1997)算法的输入信息以针对保存的可用NCBI蛋白质序列进行比较。使用缺省设定，这种搜索返回了超过100个不同水平的同源蛋白质序列。这些在氨基酸水平从高度相同(85-98％)到非常低同一性(23-32％)。传统上会预期只有具有高同源性的序列保有与输入序列相似的特性。在这种情况下，只选择≤50％同源性的所得序列。如本文所示例的，克隆并重组表达只有30％氨基酸保守性的同源物(相对于来自吸水链霉菌的pat)可以用于将转化的植物细胞培养物从未转化的中选出。

DSM-2是作为与pat仅有30％氨基酸同一性且与bar仅有28％氨基酸同一性的同源物从NCBI数据库(参见ncbi.nlm.nih.gov网站；登录号AAA26705)中鉴定的。百分比同一性是通过首先将数据库中保存的核苷酸序列翻译成蛋白质，然后使用VectorNTI软件包中的ClustalW进行多重序列比对来测定的。

实施例2.优化用于在植物和细菌中表达的序列

2.1-背景

为了获得异源基因在植物中更高水平的表达，可以优选重新改造所述基因的蛋白质编码序列从而使它们在植物细胞中更有效地表达。玉米是一个这样的植物，其中可以优选在转化之前重新设计异源蛋白质编码区以增加植物中基因的表达水平和编码的蛋白质水平。因此，在编码细菌蛋白的基因的设计中一个额外的步骤是为了最优表达而重新改造异源基因。参见例如Kawabe等(2003)，“Patterns of Codon Usage Bias in Three Dicotand FourMonocot Plant Species，”Genes Genet.Syst.，pp.343-352；和Ikemura等(1993)，“Plant Molecular Biology Labfax”，Croy，ed.，Bios Scientific PublishersLtd.，p.3748)，和本文引用的所有相关的参考文献。

例如，为了在玉米中的表达而重新改造细菌蛋白的一个理由是由于天然基因的非最优G+C含量。例如，许多天然细菌基因非常低的G+C含量(并且因此倾向于高A+T含量)导致生成模仿或复制已知高度富含A+T的植物基因调控序列的序列。在导入植物的基因的DNA内一些富含A+T的序列(例如，通常存在于基因启动子中的TATA框区)的存在可能导致基因的异常转录。另一方面，位于转录的mRNA中的其它调节序列的存在(例如，聚腺苷酸化信号序列(AAUAAA)，或前mRNA剪接中涉及的与核内小RNA互补的序列)可能导致RNA不稳定。因此，在用于玉米表达的编码细菌蛋白的基因(更优选地称作按植物优化的基因)的设计中一个目的，是生成具有较高G+C含量的DNA序列，并且优选接近编码代谢酶的玉米基因的G+C含量。在编码细菌蛋白的按植物优化的基因的设计中的另一个目的是生成其中序列修饰不阻碍翻译的DNA序列。

表3列举了玉米中的G+C含量如何的高。对于表3中的数据，基因编码区提取自GenBank(Release 71)条目，且碱基组成是使用MacVectorTM程序(Accelerys，San Diego，California)计算的。在所述计算中忽略内含子序列。

^a圆括号中给出类别中的基因数。

^b圆括号中给出标准差。

^c在平均值计算中忽略组合的组的平均值(Combined groups meanignored inmean calculation)。

由于遗传密码的冗余性和简并性给予的可塑性(即，一些氨基酸由多于一个密码子指定)，不同生物或生物类别中的基因组进化导致了有差别的冗余密码子使用。这种“密码子偏倚”(codon bias)反映在蛋白质编码区的平均碱基组成中。例如，具有相对低G+C含量的生物在冗余密码子的第三个位置利用具有A或T的密码子，而那些具有较高G+C含量的生物利用在第三个位置具有G或C的密码子。认为mRNA内“少数”密码子(“minor”codons)的存在可能降低了mRNA的绝对翻译率，特别是当对应于少数密码子的氨酰tRNA的相对丰度较低时。这种情况的延伸是单独的少数密码子的翻译率的降低将至少是多重少数密码子的加和。因此，少数密码子相对含量高的mRNA将相应地具有低翻译率。这种比率将由后续的编码蛋白的低水平来反映。

在对用于在玉米(玉米，或其它植物，例如棉花、大豆、小麦、芸苔属(Brassica)/油菜、稻；或更概括地油料作物，单子叶植物，双子叶植物和hemicot/植物，一般而言)中表达的编码细菌蛋白的基因的工程改造中，已经测定了植物的密码子偏倚。玉米的密码子偏倚是植物用来编码它的蛋白质的统计学密码子分布，而优选的密码子选择示于表4。在测定偏倚之后，测定感兴趣的基因中密码子的百分比频率。应该测定植物优选的主要密码子，以及当存在多种选择时优选密码子的第二、第三和第四种选择。然后可以设计新的DNA序列，其编码细菌蛋白的氨基酸序列，但是新的DNA序列因使用植物(第一优选、第二优选、第三优选或第四优选的)密码子进行的取代而不同于天然细菌DNA序列(编码所述蛋白的)，以指定蛋白质氨基酸序列内每个位置的氨基酸。然后分析所述新序列可能因修饰产生的限制酶位点。对鉴定的位点进一步修饰，通过用优选密码子的第一、第二、第三或第四种选择来代替所述密码子。序列中可能影响感兴趣的基因转录或翻译的其它位点是外显子：内含子连接(exon：intron junctions)(5′或3′)，多聚A添加信号，或RNA聚合酶终止信号。进一步分析并修饰所述序列以降低TA或GC双联体(doublet)的频率。除了双联体，具有多于约四个相同残基的G或C序列区组(block)能够影响序列的转录。因此，也通过将第一或第二种选择的密码子等用选择的次优选密码子代替来修饰这些区组。

优选编码细菌蛋白的按植物优化的基因含有约63％的首选密码子，约22％至约37％的第二选择密码子，和约15％至约0％的第三或第四选择密码子，其中总百分比是100％。最优选的是按植物优化的基因含有约63％的首选密码子，至少约22％的第二选择密码子，约7.5％的第三选择密码子，和约7.5％的第四选择密码子，其中总百分比为100％。上文描述的方法使得本领域技术人员能够修饰对于特定植物是外源的基因，从而使所述基因在植物中进行最优表达。所述方法在PCT申请WO 97/13402中进一步阐述。

因此，为了设计编码细菌蛋白的按植物优化的基因，利用从密码子偏倚表确立的冗余遗传编码设计编码所述蛋白质的氨基酸序列的DNA序列，所述密码子偏倚表汇编自特定的一种或多种植物的基因序列。所得DNA序列具有较高的密码子多样性程度，理想的碱基组成，可以含有按策略安排的限制酶识别位点，并且缺乏可能干扰基因转录或产物mRNA翻译的序列。由此，合成的基因在功能上等同于主题的发明的蛋白质/基因，可以使用所述合成基因转化宿主，包括植物。关于合成基因产生的其它指导可以在例如美国专利第5,380,831号中找到。

2.2.DSM-2植物重建分析。

对天然DSM-2编码区(SEQ ID NO：1)的DNA序列513个碱基对(bp)的广泛分析揭示了被认为对最优植物表达有害的几个序列基序的存在，以及非最优的密码子组成。由SEQID NO：1编码的蛋白质作为SEQ ID NO：2呈现。为了改进单子叶植物以及双子叶植物中重组蛋白的产生，开发了一种“按植物优化的”DNA序列DSM-2v2(SEQ ID NO：3)，其编码与SEQ IDNO：2所公开的天然序列相同的蛋白质。相反，编码区的天然的和按植物优化的DNA序列仅78.3％相同。表5显示了天然的(A和D栏)和按植物优化的序列(B和E栏)的密码子组成，并且允许与理论的按植物优化的序列(C和F栏)进行比较。

从表5的检查清楚了天然的和按植物优化的编码区，尽管编码相同的蛋白质，但是彼此本质上不同。按植物优化的版本(v1)精密地(closely)模仿了编码DSM-2蛋白质的理论的按植物优化编码区的密码子组成。

实施例3.克隆转化载体

3.1-构建含有DSM-2(v2)的二元质粒

将编码序列(DASPICO45)的DSM-2(v2)密码子优化基因用限制酶BbsI(NewEngland Biolabs，Inc.，Beverly MA，目录号R0539s)和SacI(New EnglandBiolabs，Inc.，目录号R0156s)切割。将所得片段连接入pDAB773中相应的限制位点NcoI(New EnglandBiolabs，目录号R0193s)和SacI处。藉由限制酶消化鉴定了阳性菌落。所得克隆含有Rb7MAR v3//At Ubi10启动子v2//感兴趣的基因//Atu Orf 13’UTR v3。将含有DSM-2(v2)作为感兴趣的基因的质粒标记为pDAB3774。

将Rb7 MAR v3//AtUbi10启动子v2//感兴趣的基因//Atu Orf1 3’UTRv3表达盒作为AgeI(New England Biolabs，Inc.，目录号R0552s)限制片段克隆至二元载体pDAB3736中。将这种表达盒克隆到所述二元质粒的左手和右手边界之间。藉由限制酶消化和测序反应鉴定了阳性菌落。将含有Rb7 MAR v3//AtUbi10启动子v2//DSM-2v2//Atu Orf1 3’UTRv3的构建体标记为pDAB3778。

通过从pDAB3736去除GateWay attR目的表达盒(destination cassette)完成了含有Rb7 MAR v3//AtUbi10启动子v2//PAT v3//Atu Orf1 3’UTR v3表达盒的对照构建体。将pDAB3736用PacI(New England Biolabs，Inc.，目录号R0547s)限制酶消化。PacI在pDAB3736中GateWay attR目的表达盒的两侧。将用PacI消化的质粒自连接并且转化入大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen，Carlsbad CA，目录号C4040-10)。藉由限制酶消化和测序反应鉴定了阳性菌落。将所得构建体标记为pDAB3779。

3.2-克隆额外的转化构建体

为转化至适合的植物物种中创建的全部其它构建体是使用如本文先前所述的相似流程和其它标准分子克隆方法(Maniatis等，1982)建立的。表6列出了全部具有适合的启动子和限定的特征的转化构建体，以及转化的作物。

实施例4.使用带有原核和真核启动子的DSM-2(V2)互补敏感大肠杆菌(BL-21)

4.1-构建含DSM-2(v2)的大肠杆菌表述质粒

将DSM-2(v2)密码子优化的序列用限制酶BbsI和SacI消化。将所得片段克隆入pDAB779中相应的NcoI和SacI限制位点处。pDAB779是pET28a(+)表达载体(Novagen，Madison WI，目录号69864-3)。藉由限制酶消化鉴定了含有DSM-2(v2)基因编码序列的阳性菌落。将所述DSM-2//pET28a(+)构建体标记为pDAB4412。

将表达质粒pET(空载体对照)和pDAB4412使用标准方法转化入大肠杆菌T7表达菌株BL21-Star(DE3)(Invitrogen，Carlsbad CA，目录号C6010-03)。表达培养物以10-200个新鲜转化的菌落在含有50μg/ml抗生素和75μMIPTG(异丙基-α-D-硫代半乳吡喃糖苷(isopropyl-α-D-thiogalatopyranoside))的250mL LB培养基中起始。将培养物在28℃以180-200rpm培养24小时。通过在250ml Nalgene瓶中在4℃以3,400xg离心10分钟来回收细胞。将沉淀重悬在4-4.5mL Butterfield’s磷酸溶液中(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA；0.3mM磷酸钾pH 7.2)。将悬浮的细胞转移至50mL聚丙烯螺旋盖离心管，所述离心管含有1mL 0.1mm直径的玻璃珠(Biospec，Bartlesville，OK，目录号1107901)。将细胞-玻璃珠混合物在冰上冷却，然后通过在～20的输出以Branson Sonifier 250(Danbury CT)使用2mm探针(probe)以两次45秒的猝发脉冲(burst)通过超声处理来裂解细胞，在两次猝发脉冲之间是完全冷却的。将裂解物转移至2mL Eppendorf管并且在16,000xg离心5分钟。收集上清液并且测量蛋白质浓度。将Bio-Rad Protein Dye Assay Reagent(Bio-Rad蛋白质染料测定试剂)用H2O以1∶5稀释，并且将1mL加入10μL以1∶10稀释的每种样品中，和浓度为5、10、15、20和25μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)中。在Shimadzu UV160U分光光度计(Kyoto，JP)中以595nm波长测量光密度的分光光度计上读取样品。相对于BSA标准曲线计算每种样品中所含蛋白质的量，并且用磷酸盐缓冲液调整至3-6mg/mL之间。将裂解物在SDS蛋白质凝胶上运行以使表达的蛋白质显影。

4.2-评估普通克隆菌株对BASTA的敏感性

将选择的大肠杆菌和根癌农杆菌细胞系接种到含有渐增(incrementallyincreasing)浓度的草铵膦(BASTA)的基本培养基上。最初使细胞系；BL21-Star(DE3)，Top10，DH5α，根癌农杆菌C58和根癌农杆菌LBA4404在复合培养基上长起来。将大肠杆菌在LB中培养，并且将根癌农杆菌菌株在YEP中培养。将5微升的细胞培养物接种并均匀分散到含有不同浓度草铵膦的基本培养基平板上。所述浓度由0μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml和4000μg/ml的BASTA组成。此外，将细菌菌株接种到复合培养基的平板上作为对照——将根癌农杆菌菌株接种到YEP琼脂平板上，并且将大肠杆菌菌株接种到LB琼脂平板上。将含有大肠杆菌菌株的平板在37℃温育24小时。将含有根癌农杆菌菌株的平板在25℃温育48小时。在分配的温育时间之后，观察平板的细菌生长。表7示例了不同的菌株在含有草铵膦的基本培养基上生长的能力。仅一种菌株BL21-Star(DE3)细胞系本质上受到草铵膦的抑制。

将大肠杆菌在37C培养24小时。将农杆菌在25C培养48小时。+++＝大量菌苔生长//++＝少量菌苔生长//+＝斑块状菌苔生长//--＝无生长

4.3-重组表达DSM-2(v2)以补足大肠杆菌BL21-Star(DE3)的细胞生长

构建了含PAT(v3)的pET28a(+)表达质粒作为阳性对照。将PAT(v3)作为NcoI-SacI片段克隆至pDAB779的相应限制位点中。藉由限制酶消化验证了含PAT(v3)基因片段的阳性克隆。将此构建体标记为pDAB4434。

将质粒pDAB4434、pDAB4412和空pET载体(对照)转化至大肠杆菌BL21-Star(DE3)细菌细胞中。表达培养物以10-200个新鲜转化的菌落在含有50μg/ml抗生素和75μM IPTG(异丙基-α-D-硫代半乳吡喃糖苷)的250mLLB培养基中起始。将所述培养物在28℃以180-200rpm培养24小时。将5微升的所述培养物接种至复合培养基对照和含有渐增浓度的草铵膦和20μM IPTG的基本培养基上。将所述培养物均匀地分散到平板上并且在28℃温育2小时。在分配的温育时间之后，观察平板的细菌生长。这些结果在表8中示例。

将大肠杆菌在含20uM IPTG的培养基上在28C培养24小时。--＝无生长//+++＝分开的菌落生长(distinct colony growth)。

4.4-使用植物启动子在大肠杆菌BL21-Star(DE3)细胞中驱动DSM-2的重组表达

测定在病毒启动子CsVMV或植物启动子AtUbi10下表达DSM-2(v2)和PAT基因编码序列的质粒构建体对含草铵膦基本培养基的补足。将质粒3778(Rb7MARv3//AtUbi10启动子//DSM-2(v2)//Atu Orf 13’UTR)、3779(Rb7 MARv3//AtUbi10启动子//PAT//Atu Orf13’UTR)、3264(CsVMV启动子//DSM-2//Atu Orf24 3’UTR)、3037(CsVMV启动子//PAT//AtuOrf25/263’UTR)和770(含CsVMV启动子//GUS v3//Atu Orf24 3’UTR的对照质粒)转化入大肠杆菌BL21-Star(DE3)并且在复合培养基上生长起来。将5微升的所述培养物铺板在含有渐增浓度草铵膦的基本培养基上并且在37℃温育48小时。结果在表9中示例。这些数据表明植物和病毒启动子在细菌细胞内具有中等水平的功能性并且可以用于驱动选择性标记的表达。

将大肠杆菌在37C培养48小时。++++＝大量菌苔生长；+++＝菌苔生长；++＝大量分开的菌落；+＝分散的菌落生长

实施例5.为生物化学表征进行的DSM-2纯化和用于Western分析的抗体产生

5.1-重组表达

将在质粒pDAB4412中含密码子优化的DSM-2(v2)基因的大肠杆菌BL-21(DE3)Star细胞(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)用于接种补充有50μg/ml卡那霉素的3ml LB培养基，在37℃过夜用于种子制备。将大约2ml的种子培养物转移至2.8L带挡板的Erlenmeyer烧瓶中1L含有卡那霉素(50μg/ml)的新鲜LB中。将培养物于37℃在摇床(New BrunswickScientific，Model Innova 44)上以250RPM温育大约6小时以获得接近0.8-1.0的OD₆₀₀。向培养物中加入最终为75μM的异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)并且基序在18℃温育进行过夜诱导。通过于4℃在8,000RPM离心15分钟收获细胞，并且将细胞糊贮藏在-80℃或立即进行纯化。

将来自1L培养物的湿重大约5g的大肠杆菌细胞解冻并且重悬在300ml含有20mMTris-HCl，pH 8.0和0.3ml蛋白酶抑制剂混合物(ProteaseInhibitor Cocktail)(Sigma，目录号P8465)的提取缓冲液中，并且在冰上通过超声处理进行15分钟的破坏。将裂解物在4℃以24,000RPM离心20分钟，并且使上清液经过0.8μm和0.45μm膜过滤。全部后续的蛋白质分离使用Pharmacia AKTA Explorer 100进行并且在4℃进行操作。将滤出液以10ml/min应用于用20mM Tris-HCl，pH 8.0缓冲液平衡的QXL Sepharose FastFlow柱(Pharmacia HiPrep16/10，20ml bed size)。用这种缓冲液洗涤该柱直到洗脱液OD₂₈₀回到基线，用0.5L 0-0.4M线性梯度的NaCl以5ml/min的流速洗脱蛋白质，同时收集了5ml级分。汇集含有如通过SDS-PAGE测定具有明显的20kDa条带(预测的DSM-2分子量是19.3kDa)的DSM-2的级分，其也对应于草铵膦转化活性。将样品用4倍体积的20mM Tris-HCl，pH 7.5缓冲液稀释，所述缓冲液含有5mM DTT、0.5％Triton X-100、5％甘油，并且再次以4ml/min应用于Mono Q柱(Pharmacia10/100GL，8ml柱床大小(bed size))。用相同缓冲液中的0.1-0.3M NaCl梯度洗脱蛋白质。汇集含DSM-2的主峰，并且添加固体硫酸铵至最终1.0M，并且应用于在20mMTris-HCl，pH7.5中1.0M硫酸铵中平衡的Phenyl Fast Flow柱(PharmaciaHiTrap，5ml柱床大小)。将该柱用平衡缓冲液以4ml/min洗涤直到洗脱液的OD₂₈₀回到基线，然后在50min(3ml/min)内通过20mM Tris-HCl，pH 7.5中1.0M-0的硫酸铵线性梯度将蛋白质洗脱，并且收集了3ml级分。汇集在75mS/cm处洗脱的含有DSM-2的主峰级分，并使用MWCO 10kDa膜离心过滤装置(Millipore)浓缩成大约3mg/ml。然后将样品以1ml/min的流速应用于含有PBS缓冲液的Superdex 75凝胶过滤住(Pharmacia XK 16/60，110ml柱床大小)。汇集了含有纯DSM-2的峰级分并且贮藏于-80℃。通过Bradford测定法或总氨基酸分析使用牛血清白蛋白作为标准品测定了蛋白质浓度。基于膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)测定法的标准流程测量了纯化的DSM-2的活性。(Wehrmann等1996)

5.2-抗体产生

抗DSM-2的兔多克隆抗体使用Invitrogen Antibody Services提供的兔多克隆抗体-标准方案(South San Francisco，CA，目录号M0300)来制备。由大肠杆菌表达且纯化的DSM-2(参见前节)提供作为免疫原。简言之，为两只新西兰兔皮下(SQ)注射用0.25mg匙孔血蓝蛋白和弗氏不完全佐剂(IFA)乳化的1mg DSM-2蛋白。使兔休息2周，再用0.5mg在IFA中乳化的DSM-2蛋白进行三次皮下推注，两次之间为3周的休息期。最终推注之后两周，从每只兔收集了血清，并且在直接ELISA上测试了效价(数据未显示)。对针对特定抗体得出更好效价的2号兔进行了两次额外的推注和末端放血(terminalbleed)。

5.3-Western印迹分析

将大约100mg的愈伤组织置入含有3个不锈钢BB珠的2mL微量离心管中。加入250μL提取缓冲液(含有0.1％Triton X-100、10mM DTT和5μL/mL蛋白酶抑制剂混合物的磷酸盐缓冲盐水)，并且将所述试管扣紧在Geno/Grinder(Model 2000-115，Certiprep，Metuchen，NJ)中，并且用1x为500rpm的设定振荡6分钟。将试管在10,000xg离心十分钟并且将含有可溶性蛋白质的上清液用移液管吸入单独的试管并且在冰上贮藏。如上所述二次提取沉淀，并且将上清液与前一级分汇集并且测定。

将来自植物样品的提取蛋白质在Laemmli缓冲液中变性并且在95℃温育10分钟。将变性的蛋白质在Novex 8-16％Tris-甘氨酸预制凝胶(Invitrogen目录号EC60452BOX)上按照制造商的方案分离，其后使用标准方案转移至硝酸纤维素膜上。

全部Western印迹温育步骤均在室温下进行1小时。首先将印迹在含有4％牛奶的PBS(PBSM)中封闭，然后在用PBSM稀释了5000倍的DSM-2特异性兔多克隆抗体(参见前段)中温育。在三次在含有0.05％Tween-20的PBS(PBST)中进行的每次5分钟洗涤之后，在所述印迹上温育山羊抗兔抗体/辣根过氧化物酶缀合物。使用化学发光底物(PierceBiotechnology，Rockford，IL目录号32106)并且曝光于X射线胶片使受检测的蛋白质显影。

实施例6.向拟南芥中的转化和选择

6.1-拟南芥生长条件。

将野生型拟南芥种子悬浮在0.1％琼脂糖(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)溶液中。将悬浮的种子在4℃贮藏2天以完成休眠需求并且确保同步的种子萌发(分层现象(stratification))。

将Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)用五块蛭石覆盖，并且用霍格兰溶液从下方灌注(sub-irrigated)直到湿润。使土壤混合物进行24小时的排水。将分层的种子播种在蛭石上，并且用保湿盖(humidity dome)(KORD Products，Bramalea，Ontario，Canada)覆盖7天。

使种子萌发并且在Conviron(CMP4030和CMP3244型，ControlledEnvironmentsLimited，Winnipeg，Manitoba，Canada)中在长光照条件(16小时光照/8小时黑暗)下以120-150μmol/m²sec的光强度在恒温(22℃)恒湿(40-50％)下培养植物。最初用霍格兰溶液浇灌植物，然后用去离子水以保持土壤潮而不湿(moist but not wet)。

6.2-农杆菌转化

含红霉素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L)的LB+琼脂平板含有划线接种的DH5α菌落，使用所述平板提供菌落来接种4ml小量制备培养物(液体LB+红霉素)。将所述培养物在37℃伴随恒定的搅拌温育过夜。按照制造商的说明书进行Qiagen(Valencia，CA)Spin Mini Preps，用于纯化质粒DNA。

电感受态的根癌农杆菌(菌株Z707s、EHA101s和LBA4404s)细胞是使用来自Weigel和Glazebrook(2002)的方案制备的。使用修改自Weigel和Glazebrook(2002)的电穿孔方法转化感受态农杆菌细胞。将50μl感受态农杆菌细胞在冰上解冻并且向所述细胞添加10-25ng期望的质粒。将DNA和细胞混合物加入预冷的电穿孔槽(2mm)。使用Eppendorf电穿孔仪2510用以下条件进行转化，电压：2.4kV，脉冲长度：5毫秒。

电穿孔之后，向槽中加入1ml YEP培养液(每升：10g酵母提取物，10g细菌用蛋白胨(Bacto-peptone)，5g NaCl)，并且将细胞-YEP悬浮液转移至15ml培养管。将细胞在28℃水浴中伴随恒定的搅拌温育4小时。温育之后，将培养物铺板在含红霉素(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L)和链霉素(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)(250mg/L)的YEP+琼脂上。将平板在28℃温育2-4天。

选择菌落并且划线接种至新鲜的含红霉素(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L)和链霉素(250mg/L)的YEP+琼脂平板上，并且在28℃温育1-3天。选择菌落用于PCR分析以通过使用载体特异性引物验证基因插入物的存在。按照制造商的说明书进行Qiagen Spin MiniPreps用于从选择的农杆菌菌落纯化质粒DNA，除了以下例外：将15ml过夜小量制备培养物(液体YEP+红霉素(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L))和链霉素(250mg/L))的4ml等分试样用于DNA纯化。使用Qiagen Spin Mini Prep DNA的代替方式是在100℃将悬浮在10μl水中的转化的农杆菌细胞裂解5分钟。将来自农杆菌转化中使用的二元载体的质粒DNA包括作为对照。以0.5x浓度按照制造商的说明书使用Takara Mirus Bio Inc.(Madison，Wisconsin)的Taq DNA聚合酶完成PCR反应。PCR反应在MJ Research Peltier热循环仪上进行，程序设定为以下条件：1)94℃3分钟；29个循环的2)94℃45秒，3)55℃30秒，4)72℃1分钟；然后是1个循环的72℃10分钟。循环过后将反应保持在4℃。通过1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增并且通过溴化乙锭染色来显影。选择PCR产物与质粒对照相同的菌落。

6.3-拟南芥转化。

使用浸花法转化拟南芥。使用选择的菌落接种一份或多份15-30ml的YEP培养液的预培养基，其含有红霉素(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L)和链霉素(250mg/L)。将培养物在28℃伴随220rpm的恒定搅拌温育过夜。使用每份预培养物接种两个500ml含有红霉素(200mg/L)或壮观霉素(100mg/L)和链霉素(250mg/L)的YEP培养液的培养基，并且将培养物伴随恒定搅拌在28℃温育过夜。然后将细胞在室温以大约8700xg离心(pellet)10分钟，并且弃去所得上清液。将细胞沉淀轻柔地重悬在500ml浸润培养基(infiltration media)中，所述培养基含：1/2x Murashige和Skoog盐/Gamborg’sB5维生素，10％(w/v)蔗糖，0.044μM苄氨基嘌呤(10μl/L的DMSO中的1mg/ml贮液)和300μl/L Silwet L-77。将大约1个月大小的植物在培养基中浸渍15秒，确保浸没最新的花序。将植物侧躺平放并且盖住(透明或不透明)24小时，然后用水洗涤，再直立起来。使植物在22℃生长，光周期为16小时光照/8小时黑暗。浸渍之后大约4周，收获种子。

6.4-选择转化的植物

使新鲜收获的T₁种子[DSM-2(v2)基因]在室温干燥7天。将T₁种子播种在26.5×51-cm萌发托盘(T.O.Plastics Inc.，Clearwater，MN)上，每个接受200mg分层T₁种子的等分试样(～10,000个种子)，所述种子之前已经悬浮在40ml的0.1％琼脂糖溶液中并且在4℃贮藏了2天以完成休眠要求并确保同步的种子萌发。

将Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)用五块蛭石覆盖，并且用霍格兰溶液从下方灌注(sub-irrigated)直到湿润，然后允许重力排水。将各40ml的分层种子等分试样用移液管均匀播种在蛭石上并且用保湿盖(KORD Products，Bramalea，Ontario，Canada)覆盖4-5天。在使用2，4-D出土后喷雾(postemergence spray)进行初始转化体选择(选择共转化的AAD-12基因；参见USSN 60/731,044)之前1天将圆盖去除。

种植之后7天(7DAP)并且第二次为11DAP，用2，4-D除草剂(456g ae/L2，4-D Amine4，Dow AgroSciences LLC，Indianapolis，IN)的0.016％溶液以10ml/托盘(703L/ha)的喷雾体积使用DeVilbiss压缩空气喷头对T₁植物(分别为子叶和2-4叶阶段)喷雾，以递送每次施用50g ae/ha 2，4-D DMA的有效率。在最后一次喷雾之后4-7天鉴定出存活株(生长活跃的植物)，并且单独移植入准备有盆栽培养基(Metro Mix 360)的3英寸盆中。将移植的植物用保湿盖覆盖3-4天并且在到温室之前置于22℃培养箱(growth chamber)中或直接移入温室。其后将圆盖去除，并且将植物在温室(22±5℃，50±30％RH，14小时光照：10小时黑暗，最低500μE/m²s¹自然光+补充光)中培养至少1天，然后测试DSM-2(v2)提供草铵膦除草剂抗性的能力。

然后为T₁植物随机指定不同的草铵膦比率。对于拟南芥，140g ai/ha草铵膦是区别敏感植物与具有有意义抗性水平的植物的有效剂量。还应用了提高的比率以测定抗性的相对水平(280、560或1120g ai/ha)。表10显示与芳氧基链烷酸酯/盐除草剂抗性基因(AAD-12v1)进行的比较；参见USSN60/731,044。

全部草铵膦除草剂施用均通过轨道喷雾器(track sprayer)以187L/ha喷雾体积来施用。商业的Liberty^TM制剂(200g ai/L，Bayer Crop Science，ResearchTriangle Park，NC)。对于展现出草铵膦耐受的T₁植物在T₂代中进一步进行评估。

6.5-转化植物的选择结果

首先使用DSM-2(v2)(按植物优化的基因)进行了拟南芥转化。首先使用2，4-D DMA选择方案从未转化种子的背景中选择出T₁转化体。筛选了超过100,000个T₁种子，并且鉴定了2602，4-D抗性植物(AAD-12基因)，等于转化/选出率为0.26％，稍高于使用AAD-12+2，4-D进行选择时构建体的选出率范围。接着将以上选择的T₁植物移植到单独的盆中并且用不同比率的商用草铵膦除草剂进行喷雾。表10比较了DSM-2(v2)和对照基因为拟南芥T₁转化体赋予草铵膦抗性的响应(response)。响应按照％可见损伤2WAT来表现。将数据表示为展现非常小的损伤或无损伤的个体(＜20％)、展现中度损伤的个体(20-40％)或展现重度损伤的个体(＞40％)的柱状图。由于每个T₁是独立的转化事件(event)，可以预见在给定的比率内单独的T₁响应的显著变化。显示了每个处理的算数平均值和标准差。未转化-野生型拟南芥充当草铵膦敏感型对照。DSM-2(v2)基因为单独的T₁拟南芥植物赋予了除草剂抗性。在给定的处理中，植物响应的水平差异很大，并且可能归因于每株植物代表独立的转化事件这个事实。值得注意的是，在140g ai/ha草铵膦以上，存在不受影响的个体，而一些个体则受到严重影响。按照比率的整体种群损伤均值示于表10，仅为说明用DSM-2(v2)转化的植物与野生型或用AAD-12+PAT转化的对照之间的显著差异。许多DSM-2(v2)个体在1，120g ai/ha草铵膦存活，损伤非常小或无损伤。

6.6-DSM-2(v2)作为选择性标记。

如上所述用转化的拟南芥分析了在使用草铵膦作为选择剂时使用DSM-2(v2)作为选择性标记的能力。将大约100颗含有DSM-2(v2)的T₁代拟南芥种子(100-150颗种子)或2mg含有PAT的纯合T₅植物加入(spike into)大约10,000颗野生型(敏感型)种子。每托盘植物在以下处理时间接受两次280gai/ha草铵膦的施用时机：7DAP和11DAP。处理用DeVilbiss喷头如前文所述施用。播种来自每种的另外2mg T1代拟南芥种子并且不进行喷雾以作为比较计数。在17DAP鉴定出植物是抗性的或敏感性的。处理和未处理之间的计数在表11中表现相似。这些结果说明DSM-2(v2)能够有效地用作种群的另一种选择性标记。

表11.播种种子的质量和在280g ai/ha草铵膦处理之后存活的植物数的计数

6.7-分子分析：

6.7.1-从组织收获的DNA的分离和定量为Xμl

将新鲜组织置于试管中并且在4℃冷冻干燥2天。组织完全干燥之后，将钨珠(Heavy Shot)置于试管中，并且使用Kelco珠研磨器(bead mill)对样品进行1分钟的干磨。然后是标准DNeasy DNA分离流程(Qiagen，DNeasy69109)。然后将提取的DNA的等分试样用Pico Green(Molecular ProbesP7589)染色并且在荧光计(Wavelength 485/530-BioTek)上读数，使用已知的标准品来获得以ng/μl为单位的浓度。

6.7.2-侵入测定分析Xμl(Invader assay analysis Xμl)

将DNA样品稀释到0.7ng/μl，然后通过在热循环仪中以95℃温育10分钟来变性。然后按照Third Wave Technologies发布的96孔模式流程制备侵入测定反应混合物。将7.5μl制备的反应混合物分装入96孔平板的每个孔中，然后加入7.5μl对照和0.7ng/μl经稀释变性的未知样品的等分试样。每个孔用15μl矿物油(Sigma)覆盖。然后将平板在63℃温育1小时并且在荧光仪(Biotek)上读数。用靶探针(FAM染料波长560/620)相对于背景的％信号除以相对于背景的内部对照探针(RED染料波长485/530)的％信号进行的计算将算出比值。然后使用所述比值决定事件的接合性(event′s zygosity)。

6.8-遗传率

将多种T₁事件自花授粉产生T₂种子。通过向100个随机的T₂同胞种(sibling)施用草铵膦(200g ai/ha)对这些种子进行子代测试。将每个单独的T₂植物移植到3英寸见方的盆中，然后进行喷雾施用(以187L/ha的施用率，用轨道喷雾器)。63％的T₁家族(T₂植物)分离成孟德尔遗传对显性遗传的单一基因座所预期的3抗性：1敏感性模型，如通过X方分析所测定的(P＞0.05)。

对接合性的侵入是对来自每个作为单一基因座分离的品系的16株随机选择的植物进行的。从纯合侵入测定的T₂个体收集种子(T₃种子)。对来自4个纯合侵入测定的T₂家族中的各25个T₃同胞种如前文所述进行子代测试。全部被预测为纯合的(非分离型种群)T₂家族均为非分离型。这些数据证明DSM-2(v2)稳定整合并以孟德尔方式遗传了至少三代。

实施例7.使用HERBIACE对玉米的晶须介导转化

7.1-克隆DSM-2(v2)

将DSM-2(v2)基因从DASPICO45载体作为Bbs1/Sac1片段切下。将其定向连接至以类似方法切割的pDAB3812载体中，所述载体含有ZmUbi1单子叶植物启动子。使用T4DNA连接酶将所述两个片段连接起来，并且转化至DH5α细胞中。使用Qiagen’s QIASpin小量制备试剂盒对所得菌落进行小量制备，并且消化菌落以检查方向。将最终的构建体命名为pDAB3250，其含有ZmUbi1/DSM-2(v2)/ZmPer5。如上构建了含有PAT基因的相同的对照载体。将此构建体命名为pDAB3251。

7.2-愈伤组织/悬浮液起始。

为了获得未成熟的胚用于愈伤组织培养起始，进行在温室培养的Hi-II亲本A和B(Armstrong等1991)之间的F₁杂交。当胚大小为1.0-1.2mm时(大约在授粉后9-10天)，收获穗(ear)并且通过用Liqui-

皂擦洗、浸入70％乙醇2-3分钟、再浸入20％商用漂白剂(0.1％次氯酸钠)30分钟来进行表面灭菌。

在无菌蒸馏水中清洗穗，并且将未成熟的合子胚无菌地切下并且在15Ag10培养基(N6培养基(Chu等，1975)，1.0mg/L 2，4-D，20g/L蔗糖，100mg/L酪蛋白水解物(酶促消化)，25mM L-脯氨酸，10mg/L AgNO₃，2.5g/LGelrite，pH 5.8)上培养2-3周，其中盾片(scutellum)朝着培养基之外的方向(facing away from the medium)。将显示正确形态的组织(Welter等，1995)以两周的间隔选择性地转移至新鲜的15Ag10培养基上，持续约6周，然后以两周的间隔转移至4培养基(N6培养基，1.0mg/L 2，4-D，20g/L蔗糖，100mg/L酪蛋白水解物(酶促消化)，6mM L-脯氨酸，2.5g/L Gelrite，pH 5.8)，持续大约2个月。

为了起始胚发生悬浮培养，将源自单一胚的大约3ml收集细胞体积(PCV)的愈伤组织加入大约30ml H9CP+液体培养基(MS基础盐混合物(Murashige and Skoog，1962)，修改的MS维生素，含1/10(10-fold less)的烟酸和5倍的盐酸硫胺素，2.0mg/L 2，4-D，2.0mg/Lα-萘乙酸(NAA)，30g/L蔗糖，200mg/L酪蛋白水解物(酸消化)，100mg/L肌醇，6mM L-脯氨酸，5％v/v椰子汁(coconut water)(传代培养之前即刻添加)，pH 6.0)。将悬浮培养在温控振荡装置中以125rpm于28℃在黑暗条件下保持在125mlErlenmeyer烧瓶中。细胞系通常在起始后2-3个约开始建立。在建立过程中，通过每3.5天使用宽孔移液管将3ml PCV的细胞和7ml经调节的培养基加入20ml新鲜的H9CP+液体培养基对悬浮液进行传代培养。一旦组织开始成倍生长，按比例增加悬浮液并且保持在500ml烧瓶中，其中将12ml PCV的细胞和28ml经调节的培养基转移至80ml H9CP+培养基中。一旦悬浮液完全建立，将它们冷藏保存备用。

7.3-悬浮液的冷藏保存和融化

传代培养2天之后，将4ml PCV的悬浮细胞和4ml经调节的培养基加入8ml冷冻保护剂(溶于不含椰子汁的H9CP+培养基，1M甘油，1M DMSO，2M蔗糖，过滤除菌)，并且使其在125ml烧瓶中于4℃以125rpm振荡1小时。1小时之后，向冷的5.0ml Corning冷冻管加入4.5ml。一旦装入，将单独的小管在速度受控的冰箱中于4℃保持15分钟，然后使其以-0.5℃/分钟的速度冷冻直至达到-40℃的最终温度。在达到最终温度之后，将小管转移至充满液氮蒸汽的Cryoplus 4贮藏单元(Forma Scientific)内搁架中的盒子里。

为了解冻，将小管从贮藏单元中移出并置于闭合的干冰容器中，然后投入保持在40-45℃的水浴直至“沸腾”消退。解冻之后，将内容物倒在有盖的100×25mm培养皿中一叠～8张无菌的70mm Whatman滤纸(No.4)上。允许几分钟使液体吸入滤纸，然后将含有细胞的顶部滤纸转移至GN6培养基(N6培养基，2.0mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖，2.5g/L Gelrite，pH5.8)上，保持1周。1周之后，仅将具有有希望的形态的组织从滤纸上移下直接移到新鲜的GN6培养基上。每7-14天对这种组织进行传代培养，直到1-3克可用于悬浮，悬浮在125mlErlenmeyer烧瓶中大约30mL H9CP+培养基中起始。每3.5天将3ml PCV传代培养至新鲜的H9CP+培养基中直到获得总共12mlPCV，进行传代培养的点如前文所述。

在转化之前大约24小时，将12ml PCV之前冷冻保藏的胚发生玉米悬浮细胞加上28ml经调节的培养基在500ml Erlenmeyer烧瓶中80ml GN6液体培养基(不含Gelrite的GN6培养基)中传代培养，并且置于28℃、125rpm的摇床上。使用相同的细胞系将此重复2次，由此将总共36ml PCV分配在3个烧瓶中。在24小时之后，去除GN6液体培养基，并且用每瓶72mlGN6S/M渗透培养基(N6培养基，2.0mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖，45.5g/L山梨糖醇，45.5g/L甘露醇，100mg/L肌醇，pH 6.0)代替以使细胞的质壁分离(plasmolyze)。将烧瓶置于黑暗中的摇床上30-35分钟，并且在这段时间期间通过向～405mg预先高压灭菌的碳化硅晶须(Advanced Composite Materials，Inc.)添加适当体积的GN6S/M液体培养基来制备50mg/ml碳化硅晶须的悬浮液。

在GN6S/M中的温育之后，将每个烧瓶的内容物汇集在250ml离心瓶中。一旦全部细胞沉降在底部，将几乎～14ml的GN6S/M液排出，并且收集在无菌的1-L烧瓶中备用。将预湿的晶须悬浮液以最高速涡旋振荡60秒，再将8.1ml加入瓶中，向所述瓶中加入170μg DNA作为最后一步。将瓶子立即置于改良的Red Devil 5400商用涂料混合器中并且搅拌10秒。搅拌之后，将细胞、培养基、晶须和DNA的混合物与125ml新鲜GN6液体培养基一起加入1-L烧瓶的内容物以减少渗压剂(osmoticant)。使细胞在摇床上恢复2小时，然后在Whatman#4滤纸(5.5cm)上进行过滤，使用与房屋真空管道(house vacuum line)连接的玻璃细胞收集装置。

在用真空抽吸的同时将大约6mL分散的悬浮液用移液管吸至滤纸的表面上。将滤纸置于60×20mm GN6培养基的平板上。将平板在暗盒中于28℃培养1周。

1周之后，将20张滤纸转移至60×20mm平板中的GN6(1Herbiace)，将20张滤纸转移至60×20mm平板中的GN6(2Herbiace)，并且将20张滤纸转移至60×20mm平板中的GN6(4Herbiace)培养基(N6培养基，2.0mg/L2，4-D，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，1、2或4mg/L双丙氨酰膦(来自Herbiace)和，2.5g/L Gelrite，pH 5.8)。将平板置于盒中并且再培养额外的一周。

额外的一周之后，再次将全部滤纸转移至相同浓度的GN6+Herbiace培养基(1H、2H和/或4H)。将平板置于盒中并且再培养额外的一周。

转化之后三周，通过将平板上1/2的细胞刮下放入含有1、2或4mg/L来自Herbiace的双丙氨酰膦的3.0mL融化的GN6琼脂糖培养基(N6培养基，2.0mg/L 2，4-D，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，7g/L Sea Plaque琼脂糖，pH 5.8，在121℃高压灭菌仅10分钟)，将组织包埋。将组织打碎(break up)并且将3mL琼脂糖和组织根据细胞最初在其上进行培养的浓度均匀地倒在100×15mm的GN6平板(1H、2H或4H)表面上。用每个平板上的另外1/2的细胞重复此过程。一旦包埋，将平板单独地用

或Parafilm

密封，然后在暗盒中于28℃培养约4周。

7.4-用于植物再生的方案。

推定得到转化的分离株通常最先在转化之后5-8周可见。将任何潜在的分离株从包埋平板中移出，并且转移至60×20mm平板中相同浓度的新鲜选择培养基。如果在大约2周之后，明显有持续不变的生长，那么认为该事件为抗性的。然后将抗性事件的亚组进行分子分析。

通过将愈伤组织转移至基于细胞分裂素的诱导培养基28(1H)来起始再生，所述培养基含有(MS盐和维生素，30.0g/L蔗糖，5mg/L BAP，0.25mg/L2，4-D，1mg/L双丙氨酰膦，2.5g/L Gelrite；pH 5.7)。使细胞在低光照(13μEm^-2s^-1)条件下生长一周，然后在高光照(40μEm^-2s^-1)条件下再生长一周，之后转移至再生培养基36(1H)，其与28(1H)相同，除了它缺乏植物生长调节剂。将小(3-5cm)植株移出并且置于含有非选择性SHGA培养基(SchenkandHildebrandt basal salts and vitamins(基础盐和维生素)，1972；1g/L肌醇，10g/L蔗糖，2.0g/L Gelrite，pH 5.8)的150×25-mm培养管中。一旦小植株发育了足够的根和茎系统，将它们移植到温室的土壤中。

7.5-分子分析：玉米材料和方法

7.5.1-从组织收获的DNA的分离和定量。

将新鲜组织置于试管中并且在4℃冷冻干燥2天。组织完全干燥之后，将钨珠(Valenite)置于试管中，并且使用Kelco珠研磨器(bead mill)对样品进行1分钟的干磨。然后是标准DNeasy DNA分离流程(Qiagen，DNeasy 69109)。然后将提取的DNA的等分试样用Pico Green(Molecular Probes P7589)染色并且在荧光计(BioTek)上读数，使用已知的标准品来获得以ng/μl为单位的浓度。

7.5.2-PAT侵入测定分析。

将DNA样品稀释到20ng/μl，然后通过在热循环仪中以95℃温育10分钟来变性。然后使用提供的寡聚混合物和MgCl₂(Third Wave Technologies)来制备信号探针混合物。将7.5μl的等分试样置于侵入测定平板的每个空中，接着是对照、标准品和20ng/μl稀释的未知样品的7.5μl等分试样。每个孔用15μl矿物油(Sigma)覆盖。然后将平板在63℃温育1小时并且在荧光仪(Biotek)上读数。用靶探针相对于背景的％信号除以相对于背景的内部对照探针的％信号进行的计算将算出比值。开发并使用Southern印迹分析验证的已知拷贝标准品的比值被用来鉴定未知事件的估计拷贝。

7.5.3-对PAT的聚合酶链式反应

将总共100ng的总DNA用作模板。将20mM的每种引物与Takara ExTaq PCR聚合酶试剂盒(Mirus TAKRR001A)一起使用。用于PAT PTU的引物是(正向MAS123-GAACAGTTAGACATGGTCTAAAGG)(SEQ ID NO：5)和(反向Per5-4-GCTGCAACACTGATAAATGCCAACTGG)(SEQ ID NO：6)。将PCR反应在9700 Geneamp热循环仪(Applied Biosystems)中进行，通过使样品经历94℃3分钟，和35个循环的94℃30秒、62℃30秒和72℃3分15秒，接着是72℃10分钟。用于编码区PCR PAT的引物是(正向-ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC)(SEQ ID NO：7)和(反向-CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA)(SEQ IDNO：8)。将PCR反应在9700 Geneamp热循环仪(Applied Biosystems)中进行，通过使样品经历94℃3分钟，和35个循环的94℃30秒、65℃30秒和72℃1分45秒，接着是72℃10分钟。用于DSM-2的编码区PCR的引物是(正向-ATGCCTGGAACTGCTGAGGTC)(SEQ ID NO：9)和(反向-TGAGCGATGCCAGCATAAGCT)(SEQ ID NO：10)。将PCR反应在9700 Geneamp热循环仪(AppliedBiosystems)中进行，通过使样品经历94℃3分钟，和35个循环的94℃30秒、65℃30秒和72℃45秒，接着是72℃10分钟。通过用EtBr染色的1％琼脂糖凝胶上的电泳来分析PCR产物。

7.5.4-Southern印迹分析。

用获得自Qiagen DNeasy试剂盒的总DNA进行了Southern印迹分析。对总共5μg的总基因组DNA用NcoI和SwaI进行过夜消化以获得整合数据。将用限制酶SspI进行的5μg消化用于获得PTU数据。在分析了SspI消化数据之后，使用限制酶MfeI来消化全部剩余的样品，因为MfeI在酶中似乎是更好的选择。在过夜消化之后，将～100ng的等分试样在1％凝胶上运行以确保完全消化。在这种确认之后，将样品在大的0.85％琼脂糖凝胶上以40伏过夜运行。然后将所述凝胶在0.2M NaOH、0.6M NaCl中变性30分钟。然后将凝胶在pH 7.5的0.5MTris HCl、1.5M NaCl中中和30分钟。然后设置一个含有20x SSC的凝胶装置以获得凝胶向尼龙膜(Millipore INYC00010)的过夜重力转移。在过夜转移之后，再藉由交联仪(Stratagene UV交联仪1800)在120,000微焦耳对所述膜施以UV光。然后将膜在0.1％SDS、0.1SSC中洗涤45分钟。45分钟洗涤之后，将膜在80℃烘烤3小时，再于杂交之前贮藏在4℃。使用质粒DNA使用编码区PCR制备杂交模板片段。将产物在1％琼脂糖凝胶上运行，再切下，然后使用Qiagen(28706)凝胶提取方法进行凝胶提取。然后将膜在60℃在Perfect Hyb缓冲液(Sigma H7033)中进行预杂交步骤1小时。使用Prime it RmT dCTP-标记反应(Stratagene 300392)来开发基于p32的探针(Perkin Elmer)。使用Probe Quant.G50柱(Amersham27-5335-01)提纯所述探针。使用每毫升杂交缓冲液两百万计数CPM来过夜杂交Southern印迹。过夜杂交之后，再将印迹在0.1％SDS、0.1 SSC中在65℃洗涤两次各20分钟。然后将印迹过夜曝光于胶片，在-80℃温育。

7.6-结果

用前文描述的2种构建体(PAT和DSM-2)各自进行了三个晶须介导的玉米转化。从这些全部实验，回收了230个分离株。在含有1和2mg/L双丙氨酰膦(来自Herbiace)的培养基上，PAT和DSM-2之间的事件回收率非常相似，然后，在含有4mg/L双丙氨酰膦的培养基上，PAT的事件回收率高于DSM-2。

表.实施例7.6-1

藉由Southern印迹分析对用1或2Herbiace选择的48个DSM-2事件进行拷贝数分析和完整植物转化单元(PTU)的存在性(分析)。全部48个事件含有至少一个拷贝的DSM-2基因。将得自较低拷贝事件(3个或更少)的结果的亚组示于下文。

表.实施例7.6-2

分别藉由侵入测定法和PCR对用1、2或4Herbiace选择的48个PAT事件进行拷贝数评估和完整植物转化单元(PTU)的存在性(分析)。全部48个事件含有至少一个拷贝的PAT基因。将得自较低拷贝事件(3个或更少)的结果的亚组示于下文。

表.实施例7.6-3

植物ID	拷贝#	PTUPCR
			1942[1]-001	1	+
1942[1]-007	3	+
			1942[2]-017	2	+
1942[3]-018	1	+
			1942[3]-021	1	+
1942[3]-022	1	+
			1942[3]-024	3	+

从前文列出的15个含DSM-2的事件各自再生了大约6-10株T₀植物，并且从7个含PAT的事件再生了大约7-8株植物，用于评估对Liberty的耐受。

用Western印迹实验分析了来自31个不同事件的愈伤组织样品以及未经转化的愈伤组织(阴性对照)。除了阴性对照之外的所有样品都具有一条相对于标记的相对分子量为20kDa的条带。这与预测的19.7kDa的蛋白质大小相符。此外，该条带还与标准品具有相同的大小，所述标准品即纯化自大肠杆菌的纯化的DSM-2蛋白。使用凝胶上0.7μg/mL的标准品并且为其给出5(+++++)的假定得分，对来自不同事件的条带进行了相对评级，并且在下表中列出。

表.实施例7.6-4

编号	事件#	总克数	Western检测
				1	1941[1]-018	0.090	++
2	1941[1]-019	0.070	++++
				3	1941[1]-020	0.080	++
4	1941[1]-021	0.060	++
				5	1941[1]-022	0.070	++++
6	1941[1]-023	0.050	+
				7	1941[1]-024	0.080	++
8	1941[1]-025	0.050	++
				9	1941[1]-026	0.070	+
10	1941[1]-027	0.060	++
				11	1941[2]-028	0.080	++++
12	1941[2]-029	0.090	+++
				13	1941[2]-030	0.110	++
14	1941[2]-031	0.140	+++
				15	1941[2]-032	0.130	+++
16	1941[2]-033	0.120	+++
				17	1941[2]-034	0.070	+++
18	1941[2]-035	0.140	+
				19	1941[4]-036	0.160	+
20	1941[4]-037	0.140	++
				21	1941[4]-038	0.140	+/-
22	1941[4]-039	0.130	+
				23	1941[4]-040	0.100	+/-
24	1941[4]-041	0.130	++
				25	1941[4]-042	0.090	+/-
26	1941[4]-043	0.110	+
				27	1941[5]-044	0.090	+++
28	1941[5]-045	0.090	++
				29	1941[5]-046	0.100	+++
30	1941[5]-047	0.090	+++
				31	1941[5]-048	0.110	+

7.6.1-T₀玉米中的叶涂敷直接比较

用向下流的草铵膦除草剂(a rundown of glufosinate herbicide)涂敷T₀DSM-2(v2)植物。测试了来自15个T₀事件中每一个的同胞种，并且每株单独植物的4片叶在大约V8阶段接受了向下流的草铵膦。将流下处理(rundowntreatment)随机化成各种比率，使得在单独叶片上的处理位置产生变化。对于玉米，0.25％v/v草铵膦是分辨敏感植物和具有有意义的抗性水平的植物的最低有效剂量。还施用了升高的比率以测定抗性的相对水平(0.5％、1.0％和2.0％v/v)。使用棉花棒(cotton tipped applicator)将草铵膦处理施用到大约直径2.5cm的处理区中。

表11比较了DSM-2(v2)和对照基因对于为玉米T₀转化体赋予草铵膦抗性的响应。响应按照％可见损伤2WAT来表现。将数据表示为展现非常小的损伤或无损伤的个体(＜20％)、展现中度损伤的个体(20-40％)或展现重度损伤的个体(＞40％)的柱状图。由于每个T₀是独立的转化事件，可以预见在给定的比率内单独的T₀响应的显著变化。显示了每个处理的算数平均值和标准差。未转化的野生型玉米充当草铵膦敏感型对照。DSM-2(v2)基因为单独的T₀玉米植物赋予了除草剂抗性。在给定的处理中，植物响应的水平差异很大，并且可能归因于每株植物代表独立的转化事件这个事实。值得注意的是，在高达2％v/v的草铵膦，DSM-2(v2)整体表现得优于用PAT转化的植物。按照比率的整体种群损伤均值示于表11，仅为说明用DSM-2(v2)转化的植物与野生型或用PAT转化的对照之间的显著差异。

7.6.2-T₂玉米中高草铵膦耐受的确认

将来自T₁DSM-2(v2)x 5XH751杂交的种子种植在含有Metro Mix培养基的4英寸盆中，并且在2叶阶段在设定为187L/ha的轨道喷雾器中以560g ai/ha草铵膦喷雾以去除无效株(nulls)。在7DAT时，将无效株去除并且在轨道喷雾器中如上所述按以下比率对抗性植物进行喷雾：0、560、1120、2240和4480g ai/ha草铵膦。在3和14DAT时对植物进行评级，并且与5XH751x Hi II对照植物比较。下面的表实施例7.6.2-1显示存在个别DSM-2(v2)植物，其被提供高达2240g ai/ha草铵膦而损伤低于20％。DSM-2(v2)还提供了与PAT转化的对照类似的对4480g ai/ha草铵膦的耐受。

表.实施例7.6.2-1.T₂玉米对出土后(14DAT)施用的一系列草铵膦比率的响应

7.6.3-玉米中DSM-2(v2)遗传率

将来自T₁ DSM-2(v2)x 5XH751杂交的种子种植在含有Metro Mix培养基的3英寸盆中，并且在2叶阶段在设定为187L/ha的轨道喷雾器中以0、280、560、1120、2240和4480gai/ha草铵膦喷雾。在3和14DAT时对植物进行评级，并且与5XH751 x HiII对照植物比较。用0-100％的可见损伤如前进行植物的评级。为了决定每个种群的分离(segregation)，选择了1120g ai/ha及更高的比率。对抗性和敏感性植物进行计数，并且测定了全部T₁家族作为单一基因座、显性孟德尔性状(1R:1S)分离，如通过X方分析所测定的。将存活的植物自交以产生T₂代。当与商用杂交种(hybrid)互交时，DSM-2(v2)在多个物种中可以作为强力的草铵膦抗性基因遗传。

还对五个DSM-2(v2)T₂家族进行了子代测试。将种子如上所述种植在3英尺盆中。在3叶阶段，如前文所述将全部植物在轨道喷雾器中用560g ai/ha草铵膦喷雾。7DAT之后，对抗性和敏感性植物进行计数。所测试五个品系中的四个作为单一基因座、显性孟德尔性状(3R:1S)分离，如通过X方分析所测定的。

7.6.4-叠加DSM-2(v2)以增加除草剂谱

进行了T1植物与BE1146RR的杂交。可以将DSM-2(v2)-转化的植物方便地培育成其它含有额外的感兴趣的性状的玉米品系。将一种含有草甘膦耐受性状CP4的近交系(BE1146RR)与含有DSM-2(v2)的T₁植物杂交。可以通过以等于或超过通常为致死性除草剂比率的比率依次施用草铵膦和草甘膦或施用用罐混合的草铵膦和草甘膦(例如可以用280、560、1120g ae/ha，或更多的，两种除草剂来对植物进行喷雾)，来测试后续世代的植物两种除草剂耐受性状的效力。这将鉴定在组合施用或相继施用中使用两种除草剂用于除草剂抗性管控的能力。

实施例8.藉由抗体从转化的植物检测蛋白质

8.1-多克隆抗体制备

将5毫克纯化的DSM-2(参见前节)递送至Invitrogen Custom AntibodyServices(South San Francisco，CA)用于兔多克隆抗体制备。兔在12周期间接受了4次注射，每次注射包含悬浮在1mL不完全弗氏佐剂中的0.5mg所述纯化蛋白。在直接ELISA和Western印迹实验二者中测试了血清以确认特异性和亲和力。

8.2-从愈伤组织提取DSM-2

将使用单孔打孔器得到的4片玉米(Hi-II)叶盘(leaf discs)放入微量离心管中，所述管中含有2颗不锈钢珠(4.5mm；Daisy Co.，目录号145462-000)和500μL植物提取缓冲液(PBS，含0.1％Triton X-100和5μL/mL蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Cat#P9599))。将离心管固定在Geno/Grinder(Model2000-115，Certiprep，Metuchen，NJ)中并且用1x的500rpm设定振荡6分钟。将离心管在5000xg离心10分钟并且在Western印迹实验中测定了含有可溶性蛋白的上清液以检测DSM-2的存在。

8.3-Western印迹分析

向叶提取物掺入不同浓度的纯化DSM-2，并且与Laemmli样品缓冲液一起在95℃温育10分钟，然后在8-16％Tris-甘氨酸预制凝胶中进行电泳分离。其后将蛋白质使用标准方案电转移至硝酸纤维素膜上。在PBS中4％的脱脂奶中封闭之后，用抗DSM-2抗血清继之以山羊抗兔/HRP缀合物来检测DSM-2蛋白。将检出的蛋白质通过化学发光底物ECL Western分析试剂(Amersham Cat.#RPN 21058)来显影。

8.4-结果

使用在大肠杆菌细胞中表达并且从大肠杆菌细胞中纯化的蛋白质生成了DSM-2的多克隆抗体。在4次注射之后，抗血清具有比直接ELISA中观察到的更高的抗DSM-2抗体效价。在100,000倍稀释后，所述血清仍提供了背景之上六倍的信号。

在(对野生型玉米(Hi-II)叶基(leaf matrix)中DSM-2的)Western印迹分析中，所述血清能够检测到大约22kDa的主条带，其与基于DSM-2(v2)基因的预测分子量相当。当向提取物以最低测试浓度5ng/mL掺入时，仍能检测到同一条带。在高DSM-2浓度还观察到了次要条带，认为这些条带是靶蛋白的聚合体，因为在较低浓度没有观察到。观察到了分子量与预测分子量相当的单一主条带。(在此凝胶上运行的泳道是分子量标记、和含有浓度分别为0.005、0.05、0.5和5μg/mL的DSM-2蛋白的叶提取物。)此外，多克隆抗体不与任何玉米叶蛋白交叉反应，因为几乎观察不到背景信号。

使用Western印迹分析测定了自转化的烟草愈伤组织表达的DSM-2。在不同的事件中观察到了与标准(大约22kDa)具有相当的大小的检出条带，说明DSM-2在转基因烟草组织中得到了表达。

实施例9.烟草(细胞培养物)转化

在转化之前4天，通过向NT-1B培养基加入2ml的NT-1培养物或1ml压紧的细胞，将每7天传代培养一次的1周龄NT-1烟草悬浮液传代培养至新鲜培养基。将传代培养的悬浮液保持在黑暗中25+1℃下125rpm的摇床上。

表.实施例9-1

NT-1培养基配方

试剂 每升

MS盐(10X)	100ml
		MES	0.5g
盐酸硫胺素(1mg/ml)	1ml
		肌醇	100mg
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	137.4mg
		2，4-D(10mg/ml)	222μl
蔗糖	30g
		pH为5.7±0.03

使用含有感兴趣的二元载体的根癌农杆菌[菌株LBA4404]的50％甘油储液，通过向含有50-100mg/L壮观霉素的30ml YEP液(10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/L NaCl、0-10g/L蔗糖)中加入20、100或500μl来起始液态过夜培养。将所述细菌培养物在150-250rpm的温育摇床中在28℃黑暗条件下温育指导OD₆₀₀为1.5±0.2。这大约需要18-20小时。

对于测试的每种载体，将20-70mL 4天时间的悬浮细胞转移至无菌容器(vessel)中，向其中添加500-1750μl的适当OD的农杆菌悬浮液。为了确保获得均匀的混合物，将细胞用10ml宽孔移液管上下吹吸5次。然后将均匀的悬浮液吸入重复移液器的25ml桶中，并且将250μl所述悬浮液分配至24孔平板的每个孔中，持续分配直到悬浮液耗尽。将多孔平板用Parafilm包裹，并且在黑暗中于25±1℃不摇动地共培养3天。

共培养之后，用1mL移液管头将全部多余的液体从每个孔中移出，并且将剩余的细胞重悬在1ml NTC液(NT-1B培养基，含500mg/L羧苄青霉素，在高压灭菌之后添加)中。将单独的孔中的内容物使用一次性移液器分散到100×25mm选择平板的整个表面上。选择培养基由用8g/l TC琼脂固化的NTC培养基组成，补充有在高压灭菌后添加的7.5-15mg/L双丙氨酰膦或工业级草铵膦(glufosinate ammonium)。将全部选择平板(不包裹)保持在28℃黑暗中。

推定的转化体作为小簇愈伤组织出现在死亡的、未转化细胞的背景上。在转化之后大约2-6周将愈伤组织分离。将每个愈伤组织分离体转移至它自己的60×20mm平板，所述平板含有相同的选择培养基，并且允许其在进行分析之前生长大约2周。

9.1-结果

完成了将DSM-2(v2)与PAT进行比较的并排实验(side-by-sideexperiment)。在该研究中，100％的PAT选择平板在10mg/L双丙氨酰膦培养基上产生了至少一个PCR阳性分离体，而79％的DSM-2(v2)选择平板产生了至少一个PCR阳性分离体。藉由编码区PCR测定了全部事件中DSM-2(v2)或PAT基因的存在，并且发现均为阳性。

表.实施例9-2

构建体	感兴趣的基因	PCR确认之后的在10mg/L双丙氨酰膦上的转化率
			pDAB3778	DSM-2	79％
pDAB3779	PAT	100％

对DSM-2(v2)选择的事件的小亚组进行了Western印迹，并且如以下数据中所示鉴定了三个阳性事件。在第二个实验中，在7.5、10、12.5或15mg/L双丙氨酰膦或工业级草铵膦之上对用DSM-2(v2)处理的烟草进行了选择。下表中列出了通过编码区PCR确认之后的转化频率(产生至少一个愈伤组织的选择平板的％)。

表.实施例9-3

以mg/L为单位的浓度	草铵膦	双丙氨酰膦
			7.5	55.6％	38.9％
10	50.0％	44.4％
			12.5	44.4％	38.9％
15	38.9％	22.2％

实施例10.其它作物的农杆菌转化

受到主题内容的启发，可以按照主题的发明使用本领域已知的技术转化其它作物。对于农杆菌介导的黑麦转化，参见，例如，Popelka and Altpeter(2003)。对于农杆菌介导的大豆转化，参见，例如，Hinchee等，1988。对于农杆菌介导的高粱转化，参见，例如，Zhao等，2000。对于农杆菌介导的大麦转化，参见，例如，Tingay等，1997。对于农杆菌介导的小麦转化，参见，例如，Cheng等，1997。对于农杆菌介导的稻转化，参见，例如，Hiei等，1997。

这些植物和其它植物的拉丁名在下文给出。应该清楚这些及其它(非农杆菌)转化技术可以用于将DSM-2(v1)，例如，转化至这些植物和其它植物中，所述植物包括但不限于玉米(禾本科(Gramineae)玉米(Zea mays))、小麦(早熟禾亚科(Pooideae)小麦属物种(Triticum spp.))、稻(禾本科稻属物种(Oryzaspp.)和菰属物种(Zizania spp.))、大麦(早熟禾亚科大麦属物种(Hordeumspp.))、棉花(昂天莲属双子叶植物纲昂天莲(AbromaDicotyledoneae Abromaaugusta)和锦葵科(Malvaceae)棉属物种(Gossypium spp.))、大豆(大豆(Soya)豆科(Leguminosae)大豆(Glycine max))、糖甜菜(sugar beet)(藜科(Chenopodiaceae)甜菜(Beta vulgaris altissima))、甘蔗(桄榔(Arenga pinnata))、番茄(茄科(Solanaceae)番茄(Lycopersicon esculentum)和番茄属其它物种、Physalisixocarpa、黄水茄(Solanum incanum)和茄属其它物种、和树番茄(Cyphomandrabetacea))、马铃薯、甘薯、黑麦(早熟禾亚科黑麦属物种(Secalespp.))、胡椒(pepper)(茄科辣椒(Capsicum annuum)、Capsicum sinense和Capsicum frutescens)、莴苣(菊科(Compositae)莴苣(Lactuca sativa)、Lactucaperennis和Lactuca pulchella)、甘蓝、芹菜(伞形科(Umbelliferae)旱芹(Apiumgraveolens))、茄(茄科茄(Solanum melongena))、高粱(全部高粱属物种(Sorghumspecies))、苜蓿(豆科紫苜蓿(Medicago sativum))、胡萝卜(伞形科胡萝卜(Daucus carota sativa))、菜豆(beans)(豆科菜豆属物种(Phaseolusspp.)和其它的属)、燕麦(燕麦(Avena Sativa)和Avena Strigosa)、豌豆(豆科豌豆属(Pisum)、豇豆属(Vigna)和Tetragonolobus spp.)、向日葵(菊科向日葵(Helianthusannuus))、西葫芦(双子叶植物纲南瓜属物种(Cucurbita spp.))、黄瓜(双子叶植物纲属)、烟草(茄科烟草属物种(Nicotiana spp.))、拟南芥(十字花科(Cruciferae)拟南芥(Arabidopsis thaliana))、草皮草(黑麦草属(Lolium)、剪股颖属(Agrostis)和其它科)和三叶草(豆科)。这样的植物，含DSM-2(v2)基因，例如，包括在主题的发明中。可以通过选择性地施用草铵膦来改进对于因使用DSM-2(v2)转化而导致被赋予草铵膦或双丙氨酰膦抗性的植物的植被控制。

DSM-2(v2)具有增加能够用DSM-2灭活的除草剂(例如草铵膦、双丙氨酰膦和/或膦丝菌素)用于在多种落叶和常绿木材种植系统中季节性使用(in-season use)的可应用性的潜力。草铵膦或双丙氨酰膦抗性木材物种将增加过度使用这些除草剂的灵活性而没有造成损伤的顾虑。这些物种将包括，但不限于：桤木(alder)、梣树(ash)、杨树(aspen)、山毛榉(beech)、桦木(birch)、樱桃树(cherry)、桉树(eucalyptys)、山核桃(hickory)、槭树(maple)、橡树(oak)、松树(pine)和杨树(poplar)。在观赏性物种中使用草铵膦或双丙氨酰膦抗性用于选择控制也在本发明的范围之内。实例可以包括，但不限于，蔷薇(roses)、卫矛(Euonymus)、矮牵牛(petunia)、秋海棠(begonia)和万寿菊(marigolds)。

实施例11.在任意作物中与草甘膦耐受性状叠加的DSM-2(V2)

在北美种植的棉花、油菜和大豆田中的大多数含有草甘膦耐受(GT)性状，且GT玉米的采用也在增加。其它GT作物(例如，小麦、稻、糖甜菜和草皮草)已经在开发中，但是迄今尚未投入商用。许多其它草甘膦抗性物种处在实验到开发阶段(例如，苜蓿、甘蔗、向日葵、甜菜(beet)、豌豆、胡萝卜、黄瓜、莴苣、洋葱、草莓、番茄和烟草；林业物种如杨树和枫香树(sweetgum)；和园艺物种如万寿菊、矮牵牛和秋海棠；isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005，在万维网上)。GTC’s是关于由这种系统提供的受控杂草的绝对广度和便利性和成本效率的一种有价值的手段。然而，草甘膦的利用作为现行标准基础处理是对草甘膦抗性杂草的选择。另外，草甘膦对其先天效率较低的杂草迁移(shift)为实施仅含草甘膦的化学工程的田地中的优势种类。通过将DSM-2(v2)与GT性状通过常规育种或通过结合为新转化事件来叠加，可以改进杂草控制效率、灵活性和管控杂草迁移(shift)和除草剂抗性的发展。在任何单子叶作物或双子叶作用物种中，可以预见关于改进的杂草控制选择的多种模式，其中将DSM-2(v2)和GT性状叠加：

a)可以按标准出土后施用率(420-2160g ae/ha，优选560-840g ae/ha)施用草甘膦，用于大多数草和阔叶杂草物种的控制。对于草甘膦抗性阔叶杂草如小白酒草(Conyzacanadensis)或先天难以用草甘膦控制的杂草(例如，鸭跖草属物种(Commelina spp)、番薯属物种(Ipomoea spp)等)的控制，可以相继地、用罐混合地或作为与草甘膦的预混合物施用280-2240g ae/ha(优选350-1700g ae/ha)草铵膦以提供有效控制。

b)目前，GTC’s中的草甘膦施用率通常在每次施用时560-2240g ae/ha的范围。草甘膦对草类物种比对阔叶杂草物种远为有效。DSM-2(v2)+GT的叠加性状将允许草有效性草甘膦比率(105-840g ae/ha，更优选210-420gae/ha)。然后可以相继地、用罐混合地或作为与草有效比率的草甘膦的预混合物施用草铵膦(按照280-2240g ae/ha，更优选地350-1700g ae/ha)以提供必要的阔叶杂草控制。

本领域技术人员将认识到，可以通过用DSM-2(v2)转化植物而使其它除草剂(例如双丙氨酰膦)能够作用。具体的比率可以通过CPR(Crop ProtectionReference)书或相似编著中汇编的除草剂标签、线上(例如，cdms.net/manuf/manuf.asp)汇编的标签或任何商用的或学术的作物保护指南例如Crop Protection Guide from Agriliance(2003)来确定。每种通过DSM-2(v2)而能够在HTC中使用的除草剂，无论是单独使用、用罐混合使用、或相继使用，均认为在本发明的范围之内。

实施例12.在任意作物中与AHAS性状叠加的DSM-2(v2)

咪唑啉酮除草剂耐受(AHAS，等)目前存在于多种在北美终止的作物中，包括但不限于，玉米、稻和小麦。其它咪唑啉酮耐受作物(例如，棉花和糖甜菜)已经处于开发中，但是至今尚未投入商用。许多咪唑啉酮除草剂(例如，咪草啶酸、咪草烟、灭草喹和甲咪唑烟酸)目前选择性地用于多种常规作物。通过咪唑啉酮耐受性状如AHAS等已经使得咪草烟、咪草啶酸和非选择性灭草烟的使用成为可能。目前的商用咪唑啉酮耐受HTC具有非转基因的优势。这种化学种类还具有显著的土壤参与活性，因此能够提供延长到施用时间之外的杂草控制，不像基于草甘膦或草铵膦的系统。然而，受咪唑啉酮除草剂控制的杂草谱不像草甘膦那么宽(Agriliance，2003)。另外，许多杂草已经发展出对咪唑啉酮除草剂所具有的作用模式(抑制乙酰乳酸合酶，ALS)的抗性(Heap，2004)。通过将DSM-2(v2)与咪唑啉酮耐受性状通过常规育种或通过结合为新转化事件来叠加，可以改进杂草控制效率、灵活性和管控杂草迁移和除草剂抗性的发展。在任何单子叶作物或双子叶作用物种中，可以预见关于改进的杂草控制选择的多种模式，其中将DSM-2(v2)和咪唑啉酮耐受性状叠加：

a)可以按标准出土后施用率(35-280g ae/ha，优选70-140g ae/ha)施用咪草烟，用于多种草和阔叶杂草物种的控制。

i)ALS-抑制剂抗性阔叶杂草如野苋(Amaranthus rudis)、三裂叶豚草(Amaranthus rudis)、藜(Chenopodium album)(等等，Heap，2004)可以通过用罐混合280-2240g ae/ha，更优选350-1700g ae/ha草铵膦来控制。

ii)对咪唑啉酮除草剂先天更耐受的阔叶物种如番薯属物种也可以通过用罐混合280-2240g ae/ha，更优选350-1700g ae/ha草铵膦来控制。

杂草控制领域的技术人员将认识到，通过DSM-2(v2)转化并且通过常规育种或遗传工程与任何咪唑啉酮耐受性状叠加，使单独或多重组合的多种商用咪唑啉酮除草剂和基于草铵膦的除草剂中的任一种的使用成为可能。代表这些化学物质的其它除草剂的具体比率可以通过CPR(Crop ProtectionReference)书或相似编著中汇编的除草剂标签、线上(例如，cdms.net/manuf/manuf.asp)汇编的标签或任何商用的或学术的作物保护指南例如Crop Protection Guide from Agriliance(2003)来确定。每种通过DSM-2(v2)而能够在HTC中使用的可选除草剂，无论是单独使用、用罐混合使用、或相继使用，均认为在本发明的范围之内。

实施例13.稻中的DSM-2(v2)

13.1-培养基描述

将采用的培养基用1M KOH调节至pH 5.8并且用2.5g/l Phytagel(Sigma)固化。将胚发生愈伤组织培养在含有40ml半固体培养基的100×20mm培养皿中。将细胞悬浮液保持在含有35ml液体培养基的125-ml锥形瓶中，并且以125rpm旋转。胚发生培养物的诱导和保持在黑暗中以25-26℃进行(Zhang等1996)。

胚发生愈伤组织的诱导和保持在NB基础培养基上如先前所述(Li等1993)进行，但是改为含有500mg/l谷氨酰胺。悬浮培养在SZ液体培养基(Zhang等1998)中起始并保持，所述培养基包含30g/l蔗糖代替麦芽糖。渗透培养基(NBO)由甘露醇和山梨糖醇各添加了0.256M的NB培养基组成。在补充有8mg/l双丙氨酰膦的NB培养基上选择除草剂抗性愈伤组织，进行9周，每3周传代培养一次。

13.2-组织培养发育

将水稻(Oryza sativa L.japonica)Taipei 309栽培种的成熟干燥种子如Zhang等1996中所述进行了灭菌。通过在NB培养基上于黑暗中培养无菌的成熟稻种子诱导了胚发生组织。将直径大约1mm的原始愈伤组织(primarycallus)从盾片移下并用于起始SZ液体培养基中的细胞悬浮液培养(cellsuspension)。然后将悬浮液如Zhang 1995中所述保持。在前一次传代培养之后3-5天，将悬浮液衍生的胚发生组织从液体培养物中移出并且置于NBO渗透培养基上以在培养皿中形成宽约2.5cm的圆，并且在轰击之前培养4小时。轰击之后16-20小时，将组织从NBO培养基转移至NBH8 herbiace选择培养基上，确保受轰击的表面朝上，并且在黑暗中温育3周。将新形成的愈伤组织于新鲜NBH8培养基每3周传代培养两次。

13.3-微粒轰击

全部轰击用Biolistic PDS-1000/He^TM系统(Bio-Rad，Laboratories，Inc.)进行。将3毫克1.0微米直径的金粒用100％乙醇洗涤一次，用无菌蒸馏水洗涤2此，并且重悬在硅化的Eppendorf管中的50μl水中。向金悬浮液加入5微克质粒DNA、20μl亚精胺(0.1M)和50μl氯化钙(2.5M)。将混合物在室温温育10分钟，以10000rpm进行10s使沉淀形成，在60μl冷100％乙醇中重悬，并且将8-9μl分配至每个大载体(macrocarrier)上。如Zhang等(1996)所述在1100psi和27in的Hg真空(at 1100psi and 27in of Hg vacuum)对组织样品进行了轰击。

实施例14.在任意作物中与AAD-1(V3)叠加的DSM-2(V2)

草铵膦像草甘膦一样是相对无选择性、广谱的草类和阔叶类除草剂。草铵膦的作用模式与草甘膦不同。其作用更快，导致受处理的叶在除草剂施用24-48小时之后干燥且“灼伤”。这对于快速杂草控制的表象是有利的。然而，这也限制了草铵膦向目标植物分生组织区的易位，导致杂草控制较差，如通过在多种物种中对两种化合物的相对杂草控制性能评级所证明的(Agriliance，2003)。

通过将AAD-1(v3)(参见USSN 11/587,893；WO 2005/107437)与草铵膦耐受性状通过常规育种或通过结合为新转化事件来叠加，可以改进杂草控制效率、灵活性和管控杂草迁移(shift)和除草剂抗性的发展。如在前文实施例中提到的，通过用AAD-1(v3)转化作物，能够在单子叶作物中选择性地施用AOPP除草剂，单子叶作物将具有更高的苯氧基生长素安全性限度，而苯氧基生长素能够选择性地在双子叶作物中施用。在任何单子叶作物或双子叶作用物种中，可以预见关于改进的杂草控制选择的多种模式，其中将AAD-1(v3)和草铵膦耐受性状叠加：

a)可以按标准出土后施用率(200-1700g ae/ha，优选350-500g ae/ha)施用草铵膦，用于多种草和阔叶杂草物种的控制。至今，尚未确认草铵膦抗性杂草；然而，草铵膦比草甘膦具有更多先天对其更耐受的杂草。

i)先天耐受的草类杂草物种(例如稗属物种(Echinochloa spp)或高粱属物种)可以通过用罐混合10-200g ae/ha(优选20-100g ae/ha)喹禾灵来控制。

ii)先天耐受的阔叶杂草物种(例如，丝路蓟(Cirsium arvensis)和Apocynumcannabinum)可通过用罐混合280-2240g ae/ha，更优选560-2240g ae/ha，2，4-D来控制，用于有效控制这些难以控制的多年生物种并改进对一年生阔叶杂草物种的控制力度(robustness)。

b)例如，草铵膦(200-500g ae/ha)+2，4-D(280-1120g ae/ha)+喹禾灵(10-100gae/ha)的三重组合能够提供更强的、重叠的杂草控制谱。此外，重叠的谱提供用于管控或延迟(delay)除草剂抗性杂草的其它机制。

实施例15.在任意作物中与AAD-12(V2)叠加的DSM-2(V2)

草铵膦，像草甘膦一样，是相对无选择性的、广谱的草类和阔叶类除草剂。草铵膦的作用模式与草甘膦不同。其作用更快，导致受处理的叶在除草剂施用24-48小时之后干燥且“灼伤”。这对于快速杂草控制的表象是有利的。然而，这也限制了草铵膦向目标植物分生组织区的易位，导致杂草控制较差，如通过在多种物种中对两种化合物的相对杂草控制性能评级所证明的(Agriliance，2003)。

通过将AAD-12(v1)与草铵膦耐受性状通过常规育种或通过结合为新转化事件来叠加，可以改进杂草控制效率、灵活性和管控杂草迁移(shift)和除草剂抗性的发展。在任何单子叶作物或双子叶作用物种中，可以预见关于改进的杂草控制选择的多种模式，其中将AAD-12(v1)和草铵膦耐受性状叠加：

a)可以按标准出土后施用率(200-1700g ae/ha，优选350-500g ae/ha)施用草铵膦，用于多种草和阔叶杂草物种的控制。至今，尚未确认草铵膦抗性杂草；然而，草铵膦比草甘膦具有更多先天对其更耐受的杂草。

i)先天耐受的阔叶杂草物种(例如，丝路蓟、Apocynum cannabinum和小白酒草)可通过用罐混合280-2240g ae/ha，更优选560-2240g ae/ha，2，4-D来控制，用于有效控制这些难以控制的多年生物种并改进对一年生阔叶杂草物种的控制力度。定草酯(triclopyr)和氟草烟在杂草控制方案中将是值得考虑的可取成分。对于定草酯，使用率将通常在70-1120g ae/ha的范围，更通常为140-420g ae/ha。对于氟草烟，使用率将通常在35-560g ae/ha的范围，更通常为70-280ae/ha。

b)例如，草铵膦(200-500g ae/ha)+/-2，4-D(280-1120g ae/ha)+/-定草酯或氟草烟(按照上文列出的比率)将提供更强力的、重叠的杂草控制谱。此外，重叠的谱提供用于管控或延迟除草剂抗性杂草的其它机制。

实施例16.在任意作物中与昆虫抗性(IR)或其它输入性状叠加的DSM-2(V2)

由转基因性状提供的作物中的昆虫抗性流行于北美和全球的玉米和棉花生产中。组合了IR和HT性状的商业产品已经由多家种子公司开发。这些包括Bt IR性状(例如在lifesci.sussex.ac.uk，2006网站上列出的Bt毒素)和任何或所有上文所述的HTC性状。因此，这种贡献(offering)带来的价值包括通过遗传手段在一种贡献中控制多种害虫问题的能力。如果杂草控制和昆虫控制独立于彼此完成，这种贡献的便利将受到限制。单独的DSM-2(v2)或与一种或多种另外的HTC性状叠加的DSM-2(v2)可以通过常规育种或结合作为一个新的转化事件来与一种或多种另外的输入性状(例如，昆虫抗性、真菌抗性或应激耐受，等)(isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005)叠加。益处包括上文实施例11-15中所述的便利性和灵活性，以及在由DSM-2(v2)和相关的除草剂耐受性提供的改进的杂草控制之外，管控虫害和/或其它农艺应激的能力。因此，主题的发明可以用于提供改进作物质量的完整农艺套装(agronomic package)，其具有灵活并有费用效益地控制多种农艺问题的能力。

组合的IR和HT性状在大多数农艺和园艺/观赏作物和林木中具有应用。DSM-2(v2)及其相配的除草剂耐受性与由多种Bt或非Bt IR基因中的任一提供的昆虫抗性的组合能够应用于(但不限于)实施例10中所列的作物物种。杂草控制领域的技术人员将认识到将DSM-2与相应的HT性状或IR性状叠加能够通过例如常规育种或遗传工程来完成。

实施例17.其它基因组合

本发明还包括产生与一种或多种其它除草剂抗性基因“叠加”在一起的一种或多种本发明的酶的植物，所述其它除草剂抗性基因包括但不限于，草甘膦-、ALS-(咪唑啉酮、氯磺隆(chlorsulfuron))、芳氧基链烷酸酯/盐-、HPPD-，PPO-和草铵膦-抗性基因，从而提供与更宽且更强力的杂草控制相符的除草剂耐受植物和除草剂抗性管控选择。本发明进一步包括利用本文示例的基因和蛋白质的同源物的方法和组合物。

在一些实施方案中，本发明提供对双丙氨酰膦、膦丝菌素或草铵膦及一种或多种商业上可以获得的除草剂(例如，草甘膦、草铵膦、百草枯(paraquat)、ALS-抑制剂(例如，氯磺隆、咪唑啉酮、三唑并嘧啶磺苯胺(triazolopyrimidinesulfonanilides)等)、HPPD抑制剂(例如，甲基磺草酮(mesotrione)、异噁氟草酮(isoxaflutole)等)、2，4-D、氟草烟(fluroxypyr)、绿草定(tricoplyr)、麦草畏(dicamba)、溴苯腈(bromoxynil)、芳氧苯氧丙酸酯(aryloxyphenoxypropionates)等等)耐受的单子叶植物和双子叶植物。也公开了包含负责这种除草剂耐受性的核苷酸序列的载体，还包含使用这样的耐受植物和除草剂的组合用于杂草控制和防止杂草种群迁移的方法。本发明使按照新方式使用新的除草剂组合成为可能。另外，本发明提供防止杂草菌株的发展并且对该杂草菌株进行控制的新方法，所述杂草菌株对一种或多种除草剂例如草甘膦是抗性的。本发明使得除草剂和作物的新组合的新用途称为可能，包括在种植植物种子之前即刻对将要进行种植的区域进行种植前施用，所述植物在其它情况下对除草剂(例如草铵膦)将是敏感的。

为了本领域公知的有关草铵膦耐受的额外机制，所述DSM-2基因可以与一种或多种pat/bar基因叠加。

对于编码HPPD(羟基-苯基丙酮酸双加氧酶)的基因在植物中的使用，参见美国专利第6,268,549和7,297,541号。这种“叠加的”植物可以与草铵膦抗性的其它基因组合，且这种叠加的植物(和多种其它植物和本发明的叠加的植物)可以用于防止草甘膦抗性的发展。

编码具有草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)活性的基因也可以与本发明的DSM-2基因一起使用(叠加)。参见，例如Castle等(2004)，“Discovery ofDirected Evolution of aGlyphosate Tolerance Gene，”Science Vol.34，pp.1151-1154；和WO 2002/36782。

主题的DSM-2基因也可以与分别在WO 2005/107437、WO 2007/053482和USSN 60/928,303中的AAD-1和AAD-12和AAD-13基因叠加，并且如其中所述，在一些优选的实施方案中，可以用于与草甘膦抗性竞争。

Claims (33)

1.一种选择膦丝菌素抗性转基因植物细胞的方法，所述方法包括：

用低拷贝数载体转化多个植物细胞，所述低拷贝数载体包含与在所述植物细胞中有功能的启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2的膦丝菌素乙酰转移酶蛋白；

将所述的多个植物细胞培养在允许表达所述膦丝菌素乙酰转移酶蛋白的植物细胞生长、同时杀死或抑制不包含与所述启动子可操作连接的所述多核苷酸的植物细胞的生长的膦丝菌素除草剂浓度中，并且

选择包含单个拷贝的整合到该植物细胞的基因组中的与所述启动子可操作连接的所述多核苷酸的转基因植物细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述膦丝菌素除草剂是草铵膦。

3.权利要求1或2的方法，其中所述转基因植物细胞进一步包含昆虫抗性基因，该基因源自选自下组的生物：苏云金芽孢杆菌、光杆状菌属、致病杆菌属。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述转基因植物细胞进一步包含选自下组的农艺性状的基因：真菌抗性、应激耐受、增加的产率、改进的油分布谱、改进的纤维质量、病毒抗性、延迟的成熟、冷耐受、盐耐受。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述多核苷酸具有用于增加在该转基因植物细胞中的表达的密码子应用选择。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述膦丝菌素抗性转基因植物细胞是转基因单子叶植物细胞。

7.权利要求6的方法，其中所述单子叶植物细胞选自下组：玉米细胞、稻细胞、小麦细胞、大麦细胞、黑麦细胞、甘蔗细胞、温季和凉季草皮草细胞、燕麦细胞、高粱细胞、牧草细胞。

8.权利要求6的方法，其中所述转基因单子叶植物细胞是玉米植物细胞。

9.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。

10.权利要求9的方法，其中所述转基因双子叶植物细胞是大豆植物细胞。

11.一种产生转基因植物的方法，所述方法包括：

从通过权利要求1-10中任一项的方法选择的膦丝菌素抗性转基因植物细胞再生转基因植物。

12.一种用于产生膦丝菌素抗性植物的方法，所述方法包括：

将单拷贝的与在植物细胞中有功能的启动子可操作连接的多核苷酸并入植物的基因组，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2的膦丝菌素乙酰转移酶蛋白，并

通过将植物曝露于允许表达所述膦丝菌素乙酰转移酶蛋白的植物生长、同时杀死或抑制不包含与所述启动子可操作连接的所述多核苷酸的植物的生长的量的膦丝菌素来选择膦丝菌素抗性。

13.一种通过消灭杂草来保护田地中成组的栽培植物的方法，其中所述栽培植物在它们的细胞的基因组中并入了与在所述植物中有功能的启动子可操作连接的单拷贝的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2的膦丝菌素乙酰转移酶蛋白，其中所述杂草是通过施用包含谷氨酰胺合成酶抑制剂作为活性成分的除草剂来消灭的，该方法包括将所述除草剂施用于所述田地。

14.权利要求13的方法，其中所述栽培植物进一步包含草甘膦抗性基因，并且其中所述方法进一步包括对所述田地施用草甘膦。

15.权利要求13或权利要求14的方法，其中所述栽培植物进一步包含咪唑啉酮抗性基因，并且其中所述方法进一步包括对所述田地施用咪唑啉酮除草剂。

16.权利要求13-15中任一项的方法，其中所述栽培植物进一步包含选自由aad-1和aad-12组成的组的除草剂抗性基因，并且其中所述方法进一步包括对所述田地施用2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。

17.一种将含有单拷贝的编码SEQ ID NO:2的基因的单独植物或成组作物类植物从不含所述基因的相同物种的植物的群体选出的方法，该方法包括对所述植物的群体施用允许包含所述基因的植物生长、同时杀死或抑制不包含所述基因的植物的生长的量的膦丝菌素除草剂。

18.权利要求17的方法，其中所述方法田地中实施。

19.权利要求17的方法，其中所述方法在温室或培养箱中实施。

20.一种控制田地中的杂草的方法，所述方法包括

在所述田地中种植至少一种转基因植物的种子，所述转基因植物包含单拷贝的异源多核苷酸，其编码SEQ ID NO:2的膦丝菌素乙酰转移酶蛋白；以及

向所述田地的至少一部分施用允许所述转基因植物生长、同时杀死或抑制杂草生长的量的膦丝菌素除草剂。

21.一种控制田地中的杂草的方法，所述方法包括

在所述田地中种植至少一种转基因植物，所述转基因植物包含单拷贝的多核苷酸，其编码SEQ ID NO:2的膦丝菌素乙酰转移酶蛋白；以及

向所述田地的至少一部分施用允许所述转基因植物生长、同时杀死或抑制杂草生长的量的膦丝菌素除草剂。

22.权利要求20或21的方法，其中所述转基因植物进一步包含选自下组的第二异源除草剂抗性基因：草甘膦抗性基因、咪唑啉酮抗性基因、aad-1、aad-12，该方法进一步包括：

向所述田地的至少一部分施用允许包含所述第二异源除草剂抗性基因的转基因植物生长、同时杀死或抑制杂草生长的量的第二除草剂。

23.权利要求22的方法，其中所述膦丝菌素除草剂和第二除草剂是相继施用的。

24.权利要求22的方法，其中所述膦丝菌素除草剂和第二除草剂是同时施用的。

25.权利要求17-24中任一项的方法，其中所述膦丝菌素除草剂是草铵膦。

26.权利要求17-24中任一项的方法，其中所述膦丝菌素除草剂是双丙氨酰膦。

27.权利要求17-26中任一项的方法，其中所述转基因植物是转基因大豆植物。

28.权利要求17-26中任一项的方法，其中所述转基因植物是转基因玉米植物。

29.一种检测植物是否包含单拷贝的编码SEQ ID NO:2的膦丝菌素乙酰转移酶蛋白的多核苷酸的方法，其中所述方法包括：

从所述植物收集样品，和

测定所述样品中所述多核苷酸的存在以及拷贝数。

30.权利要求29的方法，所述方法还包括：测定所述样品中SEQ ID NO:2的膦丝菌素乙酰转移酶蛋白质的存在。

31.权利要求30的方法，其中所述方法包括使用抗体来检测样品中SEQ ID NO:2的膦丝菌素乙酰转移酶蛋白质的存在。

32.权利要求29-31中任一项的方法，其中所述方法包括使用寡核苷酸探针来检测通过聚合酶链式反应自所述多核苷酸扩增的核苷酸序列的存在。

33.一种使用多核苷酸产生包含单拷贝的编码SEQ ID NO:2的膦丝菌素乙酰转移酶蛋白的多核苷酸的转基因植物细胞的方法，其中所述多核苷酸具有用于增加在植物中的表达的密码子应用选择。

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