CN101597633B - 一种新的细胞悬浮培养生产重组人促红细胞生成素的方法 - Google Patents

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本发明涉及重组人促红细胞生成素生产过程中的细胞培养，尤其是驯化重组人促红细胞生成素生产细胞株适应无血清培养，使用一次性袋式激流反应器对细胞进行大规模悬浮培养，提高细胞生长密度，从而高效生产重组人促红细胞生成素。本方法可提高批生产量，缩短生产周期，减少成本，降低污染。

Description

一种新的细胞悬浮培养生产重组人促红细胞生成素的方法
所属技术领域
本发明涉及重组人促红细胞生成素生产过程中的细胞培养方法，尤其是驯化生产细胞株适应无血清培养，用一次性袋式激流反应器对细胞进行悬浮培养，提高细胞生长密度，缩短生产周期，降低生产成本，减少污染，从而高效生产重组人促红细胞生成素。
背景技术
红细胞生成素是一种糖蛋白激素，分子量约34kD。血浆中存在的促红细胞生成素由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖基成分主要是唾液酸。根据碳水化合物含量不同，天然存在的促红细胞生成素分为两种类型，α型含34％的碳水化合物，β型含26％的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类促红细胞生成素基因位于7号染色体长22区，1985年其cDNA被成功克隆。红细胞生成素主要由肾小管内皮细胞合成，也可由肝细胞和巨噬细胞产生。促红细胞生成素是一种强效的造血生成因子，在0.05～1U/ml时即呈剂量依赖效应。促红细胞生成素活性单一，只作用于骨髓巨核前体细胞，可刺激红祖细胞及早幼红细胞形成成熟的红细胞集落；对红细胞造血过程的调节需其他细胞因子(如IL-3、GM-CSF和IL-1等)的协同作用才能完成。促红细胞生成素的产生受机体内血容量和氧分压的调节，在失血或低氧的刺激下，促红细胞生成素水平迅速上升。在某些肿瘤患者，可也现促红细胞生成素异常增高；骨髓造血反应不良的贫血患者，其促红细胞生成素也升高。重组人促红细胞生成素是通过基因工程克隆人的重组人促红细胞生成素基因，由CHO细胞发酵表达的有生物学活性的蛋白，其具有与人体内源性促红细胞生成素相似的生物学功能。
目前，在培养基应用方面，重组人促红细胞生成素生产细胞株主要在含有8～10％牛血清的培养基中进行扩增培养，细胞扩增到一定量后换为无血清培养基进行培养。其中，血清有很多不足的地方，比如：
1.血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给纯化工作带来许多困难。
2.血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期只有一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使生产的标准化和连续性受到限制。
3.动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。
4.取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致生产失败或生产结果不可靠性。
5.大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养的生产成本的主要部分之一。
无血清培养基质量相对更加稳定，可提高细胞培养和实验结果的重复性。避免了血清源性污染。可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化，目前市面上有很多无血清培养基可供选择。
当细胞在有血清培养基中贴壁生长时细胞必须贴附在基质的表面上才能生长，一但细胞长成单层，因为细胞间的接触抑制，细胞不再增殖。这样细胞贴壁生长时的细胞密度取决于贴附基质表面积的大小，每平方厘米表面积可以容纳1～5×105个细胞，因此，在方瓶和转瓶培养中，细胞密度一般只能在1～5×106细胞/毫升之间。在采用了微载体或片状载体的生物反应器中，细胞密度可达1～2×107细胞/毫升。
然而，在无血清培养基中，细胞经驯化可以进行悬浮培养，细胞密度主要取决于培养基的营养程度，因此，理论上讲，只要有足够的营养，细胞密度可以无限大。目前，对于不同的无血清培养基，细胞密度可以达到0.5～1×108细胞/毫升之间。
目前，重组人促红细胞生成素生产主要使用的是NBS生物反应器(或转瓶)，在罐体中加入微载体进行贴壁灌流培养，培养周期在2个月左右，重组人促红细胞生成素表达量为10mg/L，这种培养方式由于罐体体积小，微载体量有限，细胞密度较低，重组人促红细胞生成素表达量低，培养周期较长，生产成本高。
发明内容
本发明中所述的一次性袋式激流反应器是指哈尔滨安普科技发展有限公司申请的专利《一种细胞悬浮培养罐》(申请号：200710130135.X)所述相关产品。
本发明的目的是提供一种细胞密度高，容易放大，生产周期短，表达量高的重组人促红细胞生成素生产方法。本发明通过驯化重组人重组人促红细胞生成素表达细胞株，使之能在无血清培养基中悬浮生长，从而改变了细胞培养的方式，达到高密度培养细胞，大规模生产重组人促红细胞生成素。
本发明提供了细胞悬浮培养生产重组人促红细胞生成素的方法，该方法包括如下步骤：
a)重组人促红细胞生成素表达细胞株在较小的摇瓶中无血清培养；
b)当细胞生长到一定密度时，接种到较大的摇瓶或激流反应器的袋子中无血清培养；
c)使细胞增殖，表达；
d)纯化收获重组人促红细胞生成素。
本生产方法没有使用血清，培养基质量稳定，能够提高产品产量。由于用一次性袋式激流反应器悬浮培养，细胞生长不受贴附表面积的限制，细胞密度远远高于贴壁生长(5～10倍)，重组人促红细胞生成素表达量高，容易放大，降低了生产成本，避免了血清的污染。
具体实施方式：
在很多情况下，细胞是在有血清中保存的，需要对细胞进行驯化，使其适应在无血清中悬浮生长，驯化是本领域很常规的技术，具体步骤如下：先用含有血清(胎牛血清)的培养基(DMEM培养基)传代细胞几次，然后取处于对数生长期的细胞制成悬液，接到无菌摇瓶中，适宜的接种密度为1～5×105细胞/毫升，摇床的速度为100-400rmp，适宜的速度为200-300rmp，当细胞密度达到1～5×106细胞/毫升时，进行细胞传代。最佳传代密度为2～3×106，按1∶3传代，当细胞在无血清中生长速度，与含有血清中生长速度接近时，就实现了细胞的驯化。本发明对设备，试剂没有特殊要求。
下面通过实施例进一步说明本发明，对本发明不够成限制。
实施例1
从细胞库中复苏一支重组人促红细胞生成素细胞株，用DMEM培养基加10％胎牛血清传代两次，当细胞处在对数生长期时，用胰蛋白酶消化，加血清终止消化，1000rmp，5分钟，离心，去上清，加入无血清培养基(哈尔滨安普科技发展有限公司提供)，把细胞制成悬液，接种到无菌摇瓶中，每瓶培养基体积为50毫升，接种细胞密度为3×105细胞/毫升，摇床速度为200rmp，当细胞密度达到2～3×106细胞/毫升，按1∶3传代，传代5～6次时，当细胞在无血清中生长速度，与含有血清中生长速度接近，冻存细胞。建立种子细胞库。
实施例2
从细胞库中复苏一支重组人促红细胞生成素细胞株，用DMEM培养基加10％胎牛血清传代两次，当细胞处在对数生长期时，用胰蛋白酶消化，加血清终止消化，1000rmp，5分钟，离心，去上清，加入无血清培养基(GIBCO公司CHO无血清悬浮培养基)，把细胞制成悬液，接种到无菌摇瓶中，每瓶培养基体积为50毫升，接种细胞密度为3×105细胞/毫升，摇床速度为200rmp，当细胞密度达到2～3×106细胞/毫升，按1∶3传代，传代5～6次时，当细胞在无血清中生长速度，与含有血清中生长速度接近，冻存细胞。建立种子细胞库。
实施例3
从细胞库中复苏一支重组人促红细胞生成素细胞株，用DMEM培养基加10％胎牛血清传代两次，当细胞处在对数生长期时，用胰蛋白酶消化，加血清终止消化，1000rmp，5分钟，离心，去上清，加入无血清培养基(SAFC Bioscience公司的无血清悬浮培养基)，把细胞制成悬液，接种到无菌摇瓶中，每瓶培养基体积为50毫升，接种细胞密度为3×105细胞/毫升，摇床速度为200rmp，当细胞密度达到2～3×106细胞/毫升，按1∶3传代，传代5～6次时，当细胞在无血清中生长速度，与含有血清中生长速度接近，冻存细胞。建立种子细胞库。
实施例4
本实施例中所用培养基为哈尔滨安普科技发展有限公司提供，对袋子(20L)进行咖吗射线消毒，加入培养基为哈尔滨安普科技发展有限公司提供无血清培养基10L，并接种实施例1中所得的种子细胞，接种密度为4×105细胞/毫升，在37度，转速为200rmp下进行培养，流加浓缩培养基(哈尔滨安普科技发展有限公司提供无血清培养基)，每天测糖，保证糖含量在0.5～1g/L，以保细胞营养充足。
培养5～8天后，细胞密度可以达到3～8×107细胞/毫升，继续培养2～3天收获上清，进行纯化，重组人促红细胞生成素表达量达到25000IU/ml，而贴壁培养为5000～10000IU/ml，其他指标都有提高。
实施例5
本实施例中所用培养基为哈尔滨安普科技发展有限公司提供，对袋子(40L)进行咖吗射线消毒，加入培养基为哈尔滨安普科技发展有限公司提供无血清培养基20L，并接种实施例1中所得的种子细胞，接种密度为4×105细胞/毫升，在37度，转速为200rmp下进行培养，流加浓缩培养基(哈尔滨安普科技发展有限公司提供无血清培养基)，每天测糖，保证糖含量在0.5～1g/L，以保细胞营养充足。培养5～8天后，细胞密度可以达到3～8×107细胞/毫升，继续培养2～3天收获上清，进行纯化，重组人促红细胞生成素表达量达到25000IU/ml，而贴壁培养为5000～10000IU/ml，其他指标都有提高。

Claims (1)

1.一种细胞悬浮培养重组人促红细胞生成素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)从细胞库中复苏一支重组人促红细胞生成素细胞株，用DMEM培养基加10％胎牛血清传代两次，当细胞处在对数生长期时，用胰蛋白酶消化，加血清终止消化，1000rpm，离心5分钟，去上清，加入无血清培养基，把细胞制成悬液，接种到无菌摇瓶中，每瓶培养基体积为50毫升，接种细胞密度为3×105个细胞/毫升，摇床速度为200rmp，当细胞密度达到2～3×106细胞/毫升，按1∶3传代，传代5～6次时，当细胞在无血清培养基中生长的速度，与在含有血清培养基中生长的速度接近时，冻存细胞，作为种子细胞，
(2)对激流式生物反应器的袋子进行咖吗射线消毒，加入无血清培养基10L，并接种种子细胞，接种密度为4×105个细胞/毫升，在37度，转速为200rmp下进行培养，流加浓缩的无血清培养基，每天测糖，保证糖含量在0.5-1g/L，培养5-8天后，细胞密度可以达到3-8×107细胞/毫升，继续培养2-3天收获上清，纯化收获重组人促红细胞生成素。
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