CN101597602B - 灭活内源性过氧化物酶的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了免疫组化中一种灭活内源性过氧化物酶的方法。本发明所公开的免疫组化中一种灭活内源性过氧化物酶的方法，是用微波处理组织切片，灭活内源性过氧化物酶；2.45GHz、功率为650～800w，所述处理的时间为10～15分钟。通过对各种组织的实验证明，本发明的灭活内源性过氧化物酶的方法，既可以灭活内源性过氧化物酶，又可以起到抗原修复的作用，而且操作简单、省时省力。因此，在免疫组化中应用本发明的灭活内源性过氧化物酶的方法，可以将抗原修复和内源性过氧化物酶的封闭合并为一步，进而省略了用稀释的过氧化氢封闭液来灭活内源性过氧化物酶的步骤，使得免疫组化的操作步骤更为精简，影响因素进一步减少。
Description
技术领域
本发明涉及一种灭活内源性过氧化物酶的方法及其应用。
背景技术
免疫组化技术目前已经在临床和科研中得到较为广泛的应用，能够为组织中蛋白的定位及相关功能研究提供较为重要的信息。影响染色效果的因素较多，包括内源性过氧化物酶的处理、微波抗原修复过程、抗体、组织固定液、抗原的所在部位以及DAB显色时间等。内源性过氧化物酶能否被成功封闭是目前认为影响免疫组化染色效果的关键步骤之一，因为如果不能完全封闭组织中的内源性过氧化物酶活性，将会造成免疫组化的假阳性染色，极大的干扰结果的判断。在免疫组化操作过程中使用稀释的过氧化氢封闭液进行内源性过氧化物酶的封闭已经成为免疫组化不可缺少的步骤之一，沿用已有多年。
除了内源性过氧化物酶的封闭外，抗原修复是影响结果的另一个较为关键的步骤。热修复是目前在免疫组化操作过程中使用最为广泛的修复方法，包括微波高温热修复、高压锅热修复和水浴热修复等。Shi et al在1991年改进了微波高温介导的抗原热修复的方法，到目前为止微波高温热修复是最为推荐的修复方法。修复液的pH值、浓度和离子组成等，均会对免疫组化的染色效果产生影响，选择合适的抗原修复液对于成功的进行抗原修复非常重要。有研究表明金属离子对于抗原修复不仅是是非必需的，而且其毒性作用可能会对最终的染色效果产生影响。尽管目前枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)使用最为广泛，但有研究比较了多种抗原修复液的修复效果，其中包括枸橼酸盐缓冲液、枸橼酸缓冲液(柠檬酸缓冲液)、EDTA、PBS和双蒸水等，表明从枸橼酸/柠檬酸缓冲液(pH 6.0)获得的染色效果最为理想。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种免疫组化中的灭活内源性过氧化物酶的方法。
本发明所提供的免疫组化中的灭活内源性过氧化物酶的方法，是用微波处理组织切片，灭活内源性过氧化物酶；所述微波的频率为2.45GHz、功率为650～800w，所述处理的时间为10～15分钟。
本发明的另一个目的是提供一种免疫组化中的灭活内源性过氧化物酶及抗原修复的方法。
本发明所提供的免疫组化中的灭活内源性过氧化物酶及抗原修复的方法，是将组织切片置于装有抗原修复液的容器1中，再将所述容器1置于装有水的容器2中，然后进行如下微波处理：所述微波的频率为2.45GHz、功率为650～800w，所述处理的时间为10～15分钟。
上述微波的功率具体可为720w；上述处理的时间具体可为15分钟。
其中，所述抗原修复液为0.01M、pH为6.0的柠檬酸缓冲液。
上述方法在免疫组化中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种免疫组化方法。
本发明所提供的一种免疫组化方法，包括用上述方法进行抗原修复和灭活内源性过氧化物酶的步骤。
通过对各种组织的实验证明，本发明的灭活内源性过氧化物酶的方法，既可以灭活内源性过氧化物酶，又可以起到抗原修复的作用，而且操作简单、省时省力。因此，在免疫组化中应用本发明的灭活内源性过氧化物酶的方法，可以将抗原修复和内源性过氧化物酶的封闭合并为一步，进而省略了用稀释的过氧化氢封闭液来灭活内源性过氧化物酶的步骤，使得免疫组化的操作步骤更为精简，影响因素进一步减少。
附图说明
图1为人体胃黏膜标本未经过氧化氢封闭液处理，阳性染色显示的为内源性过氧化物酶的表达(×100)
图2为人体胃黏膜标本的苏木素-伊红染色结果：与图1为同一连切标本(×200)
图3为人体胃黏膜标本未经过氧化氢封闭液处理，阳性染色显示的为内源性过氧化物酶的表达(×200)
图4为人体胃黏膜标本只经过微波高温热修复，未经过氧化氢封闭液处理，并未见内源性过氧化物酶的阳性表达(×200))
图5为同时经过微波高温热修复和过氧化氢封闭液的处理(一)：抗原修复前用3％的过氧化氢封闭液处理
图6为人体胃黏膜标本同时经过微波高温热修复和过氧化氢封闭液的处理(二)：抗原修复前用0.3％的过氧化氢封闭液处理，未见内源性过氧化物酶的阳性表达(×200)
图7为人体胃黏膜标本同时经过微波高温热修复和过氧化氢封闭液的处理(三)：抗原修复后用3％的过氧化氢封闭液处理，未见内源性过氧化物酶的阳性表达(×200)
图8为人体胃黏膜标本同时经过微波高温热修复和过氧化氢封闭液的处理(四)：抗原修复后用0.3％的过氧化氢封闭液处理，未见内源性过氧化物酶的阳性表达(×200)
图9为内源性过氧化物酶在人体胃黏膜标本红细胞中的分布(×400)
图10为红细胞中的内源性过氧化物酶只经过微波高温热修复处理，未经过氧化氢封闭液处理，内源性过氧化物酶被灭活(×400)
图11为人体结肠黏膜组织只经过微波高温热修复处理，未经过氧化氢封闭液处理，未见内源性过氧化物酶阳性染色(×400)
图12为人体小肠黏膜组织只经过微波高温热修复处理，未经过氧化氢封闭液处理，未见内源性过氧化物酶阳性染色(×200)
图13为内源性过氧化物酶在小鼠肝脏中的正常分布(×400)
图14为微波高温热修复对小鼠肝脏中内源性过氧化物酶的灭活作用(×400)
图15为内源性过氧化物酶在小鼠脾脏中的正常分布(×400)
图16为微波高温热处理对小鼠脾脏中内源性过氧化物酶的灭活作用(×400)
图17为胃癌组织的苏木素-伊红染色结果(与下图18为同一组织连切标本)(×400)
图18为使用省略过氧化氢封闭处理后的程序进行免疫组化操作的结果(一)：Bax抗原在胃癌组织中的阳性表达(×400)
图19为胃癌组织的苏木素-伊红染色结果(与下图20为同一组织连切标本)(×200)
图20为使用省略过氧化氢封闭处理后的程序进行免疫组化操作的结果(二)：Bax抗原在胃癌组织中的阳性表达(×400)
图21为使用省略过氧化氢封闭处理后的程序进行免疫组化操作的结果(三)：Bcl-2抗原在人结肠组织中的阳性表达(×400)
图22为使用省略过氧化氢封闭处理后的程序进行免疫组化操作的结果(四)：Bax抗原在人小肠组织中的阳性表达(×400)
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、通过微波加热封闭内源性过氧化物酶
一、本实施例中所使用的各实验方法：
本实施例中所使用的各实验方法如表1所示。
表1、不同的内源性过氧化物酶封闭程序
| 方法编号 | 方法步骤 |
| M1 | 脱蜡再水化→DAB显色→封片、显微镜观察 |
| M2 | 脱蜡再水化→微波高温热处理→DAB显色→封片、显微镜观察 |
| M3 | 脱蜡再水化→3％H2O2→微波高温热处理→DAB显色→封片、显微镜观察 |
| M4 | 脱蜡再水化→0.3％H2O2→微波高温热处理→DAB显色→封片、显微镜观察 |
| M5 | 脱蜡再水化→微波高温热处理→3％H2O2→DAB显色→封片、显微镜观察 |
| M6 | 脱蜡再水化→微波高温热处理→0.3％H2O2→DAB显色→封片、显微镜观察 |
表中各实验的具体方法如下：
(1)脱蜡再水化的实验步骤为：二甲苯I 20min→二甲苯II 20min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 10min→95％乙醇10min→90％乙醇10min→80％乙醇10min→蒸馏水；用PBS冲洗2次，每次5min。
(2)本发明改进的微波高温热处理的实验步骤为：
I.将组织切片置于切片架上，然后放入一装有0.01M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)的塑料盒中，盖上盖子，但不要太紧以保证气体能够相互流动；
II.将塑料盒放入一稍大的微波加热盒中，内装有适量的自来水，盖上一相对较松的盖子，防止水分过度蒸发导致干片；
III.微波功率为2.45GHz，调至650～800w(中、高火)，连续加热10～15min，中途可稍停察看液体量，必要时可稍添加缓冲液，但也需适当延长加热时间；
IV.从微波中移出所有加热器皿，打开微波盒的盖子，其余保持原状，自然冷却至室温，所需时间约45-60min；
V.取出切片，PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。
本发明根据传统方法在微波修复步骤稍加修改，避免反复添加修复液带来不良效果，又能保持恒定的抗原修复条件。
(3)传统的微波高温热修复的实验步骤为：将组织切片放入装有修复液的容器中直接微波辐射加热，时间没有固定，有10～15分钟，有5分钟×2次，并且较多的选择使用解冻档，明显的缩短抗原修复时间。但是，带来的问题是：时间太短无法达到较好的抗原修复效果；时间若超过5～7分钟，液体挥发较快，反复添加修复液将无法保持抗原修复所需的温度。
(4)过氧化氢封闭的实验步骤为：将切片置于0.3％或3％的过氧化氢封闭液中，室温避光孵育15min；PBS冲洗：5min×3次。
(5)DAB显色的实验步骤为：将切片置于DAB显色液中，室温孵育10～15min；自来水终止反应，并充分冲洗。
(6)组织标本的石蜡切片制备方法如下：
I.固定：将所取新鲜组织用4％多聚甲醛液固定6～8小时，固定液的量应超过所固定组织重量的6～10倍。
II.脱水：使用阶段乙醇脱水，顺序依次为80％乙醇1h→90％乙醇1h→95％乙醇I 1h→95％乙醇II 1h→无水乙醇I 1h→无水乙醇II 1h。
III.透明：二甲苯I 30min→二甲苯II 1h。
IV.浸蜡及包埋：石蜡I 2h→石蜡II 2h→包埋。
V.载玻片的预处理1(经多聚赖氨酸处理)：泡酸过夜后，用流水充分冲洗，蒸馏水浸洗，无水乙醇浸泡过夜，取出擦净；多聚赖氨酸按1∶10比例(体积比)用双蒸水稀释，混匀后直接涂抹于酸预处理过的载玻片上，5min后置于37℃烤箱中过夜烤干，装盒储存备用。
载玻片的预处理2(未经多聚赖氨酸处理)：泡酸过夜后，用流水充分冲洗，蒸馏水浸洗，无水乙醇浸泡过夜，取出擦净；置于37℃烤箱中过夜烤干，装盒储存备用。此玻片用于H-E染色。
VI.每份组织均制成厚度4μm的切片。所有切片均需经37℃烤箱烤片过夜，装盒后4℃储存备用。
下述各实施例中，将由步骤V中预处理1所述方法得到的切片称作“经多聚赖氨酸处理的切片”(作为实验组，即用于免疫组化染色)，将由步骤V中预处理2所述方法得到的切片称作“未经多聚赖氨酸处理的切片”(作为对照组，用于苏木素-伊红染色，辅助检测内源性过氧化物酶在组织中的分布和辅助判断细胞性质)。
(7)苏木素-伊红(H-E)染色步骤：二甲苯I 9min→二甲苯II 9min→无水乙醇I 5min→无水乙醇II 5min→95％乙醇5min→90％乙醇5min→80％乙醇5min→蒸馏水冲洗→苏木素染液5～7min→流水短暂冲洗(自来水)→分色液1min→反蓝液1min→蒸馏水冲洗→伊红染液2min→自来水冲洗→80％乙醇2min→→90％乙醇2min→95％乙醇2min→无水乙醇I 2min→无水乙醇II 2min二甲苯I 2min→二甲苯II 2min→中性树胶封片。
(8)结果判定方法：
记分方法均参照Rahman等的标准并作适当修改，具体判定方法如下：
染色强度记分：无色0分；淡黄色1分；黄色2分；棕褐色3分。
阳性细胞数记分：＜25％，1分；26％～50％，2分；51％～75％，3分；＞75％，4分。
根据染色强度和阳性细胞数计分之和进行判断：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～5分为阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。
所有结果均经三位发明人在专业病理医师帮助下分别阅片，若有疑义共同商议后确定。
统计学处理采用SPSS 13.0软件，阳性率之间的比较采用×检验，P＜0.05即认为存在统计学差异。
二、内源性过氧化物酶的封闭效果与过氧化氢封闭液的浓度和新旧无关
目前，多数推荐使用稀释的3％过氧化氢液作为内源性过氧化物酶的封闭液，但也有推荐0.3％的过氧化氢液，认为都可以达到理想的封闭效果，并且绝大多数都建议过氧化氢封闭液应该现配现用。
本实验所用的0.3％过氧化氢封闭液是由美国Neomarkers公司试剂盒提供，是稀释好的即用型的过氧化氢封闭液(即不是现配现用的)；3％浓度的过氧化氢封闭液则是由100％的过氧化氢液经蒸馏水稀释而来，现用现配，即为新的过氧化氢封闭液。浓度有高(3％)有低(0.3％)。
材料来源及切片的制备：以8份人胃黏膜组织为实验原料。材料来源：8份人胃黏膜活检标本均来自北京大学第三医院消化科内镜中心。8份人胃黏膜标本石蜡切片的制备方法同步骤一中(6)所述一致。
下述试验中，第3至第6种方法中各实验步骤与步骤一中(1)、(3)、(4)、(5)、(6)和(7)中所述相同。
取上述8份人胃黏膜组织标本各1张，分别用表1中第3种方法进行实验。实验设3次重复，结果表明8份人体胃黏膜标本中均未见内源性过氧化物酶的阳性染色(×200)(图5)。
取上述8份人胃黏膜组织标本各1张，分别用表1中第4种方法进行实验。实验设3次重复，结果表明8份人体胃黏膜标本中均未见内源性过氧化物酶的阳性染色(×200)(图6)。
取上述8份人胃黏膜组织标本各1张，分别用表1中第5种方法进行实验。实验设3次重复，结果表明8份人体胃黏膜标本中均未见内源性过氧化物酶的阳性染色(×200)(图7)。
取上述8份人胃黏膜组织标本各1张，分别用表1中第6种方法进行实验。实验设3次重复，结果表明8份人体胃黏膜标本中均未见内源性过氧化物酶的阳性染色(×200)(图8)。
综上结果表明，尽管过氧化氢封闭液有新有旧(实验方法3和5中所用3％过氧化氢封闭液，为现用现配的所谓新的过氧化氢封闭液，实验方法4和6中所用0.3％过氧化氢封闭液，为公司提供的所谓旧的过氧化氢封闭液)，浓度有高有低，并且封闭有在抗原修复前也有在抗原修复后，但是对最终的结果并没有产生影响，所有组织中的内源性过氧化物酶均被完全封闭，各种方法之间并没有差异。因此，可以得出结论：组织中内源性过氧化物酶的封闭效果与过氧化氢封闭液的浓度及新旧无关。
三、微波加热封闭内源性过氧化物酶活性
(一)以人胃黏膜组织为实验原料验证微波加热能封闭其中内源性过氧化物酶活性(本实验中各实验步骤与步骤一中(1)、(2)、(5)、(6)和(7)中所述相同，其中微波处理方法为本发明的改进的微波方法，其具体条件为：微波功率为2.45GHz，调至720w(中、高火)，连续加热15min。
1、材料及切片的制备：
材料来源及切片的制备与步骤二中所述一致。
2、内源性过氧化物酶在人胃黏膜组织中的分布：
取8份人胃黏膜组织的经多聚赖氨酸预处理的石蜡切片各1张，用表1中所示的第1种方法进行实验，经脱蜡再水化后直接滴加DAB工作液显色，DAB特异性的显色过氧化物酶，而此操作并未使用外源性的过氧化物酶，如辣根过氧化物酶等，因此结果显示的即为内源性的过氧化物酶在组织中的分布情况；同时，取8份人胃黏膜组织的未经多聚赖氨酸预处理的石蜡切片各1张，按照一中(7)所述方法进行苏木素-伊红染色，辅助判断细胞性质(图2)。
结果如图1、3和9所示，有大量免疫组化染色阳性的细胞，其中，棕褐色颗粒即为内源性过氧化物酶的表达。图1和图3中，绝大多数细胞经普通病理学方法(苏木素-伊红染色)被确定为嗜酸性粒细胞；图9中，几乎所有的阳性细胞都为红细胞。因此，嗜酸性粒细胞和红细胞可以被认为是人体胃组织中内源性过氧化物酶的主要来源。该结论将会在人体其它组织和小鼠部分组织中进一步被论证。
3、微波加热能封闭人胃黏膜组织中内源性过氧化物酶活性：
取与步骤2中相同来源的8份人胃黏膜组织的经多聚赖氨酸预处理的石蜡切片各1张，用表1中所示的第二种方法进行实验，不加过氧化氢封闭液进行内源性过氧化物酶的封闭，切片经过微波热处理后直接滴加DAB显色。
实验均设3次重复。结果表明：在所有的8份人胃黏膜组织切片中，均未见内源性过氧化物酶的阳性染色(图4)；作为内源性过氧化物酶另一主要来源的红细胞也能被成功封闭(图10)。因此，微波热修复起着抗原修复和灭活内源性过氧化物酶的双重作用，嗜酸性粒细胞和红细胞中的内源性过氧化物酶活性均可以微波灭活。
(二)以人小肠和人结肠组织为实验原料验证微波加热能封闭其中内源性过氧化物酶活性(本实验中各实验步骤与步骤一中(1)、(2)、(5)、(6)和(7)中所述相同，其中微波处理方法为本发明的改进的微波方法，其具体条件为：微波功率为2.45GHz，调至650w，连续加热10min。
1、材料及切片的制备：
以人小肠组织和人结肠组织为实验原料。选择人的胃肠道组织是因为胃肠道已经被公认为是内源性过氧化物酶丰富的组织。
材料来源：本研究包括小肠和结肠组织91例，其中正常小肠组织40例，小肠腺癌组织7例、正常结肠组织30例和结肠腺癌组织14例。新鲜组织均来自北京大学第三医院消化科造影室和消化内镜中心，活检前均已征得患者或家属同意并签署知情同意书。活检标本取出后直接置于4％多聚甲醛液中固定，固定液的量应超过所固定组织重量的6～10倍，做好标记及记录(包括姓名、性别、年龄、病历号、肠镜或造影号、临床诊断、部位、来源及数目)后带回实验室进行后续处理。
44份人结肠组织和47份人小肠组织的石蜡切片的制备方法同上述(6)中所述一致。
2、内源性过氧化物酶在人结肠组织和人小肠组织中的分布：肠道组织是经前人实验证实的内源性过氧化物酶较为丰富的组织。操作步骤同(一)中2所述，结果表明嗜酸性粒细胞和红细胞是组织中内源性过氧化物酶的主要来源。
3、微波加热能封闭人结肠组织和人小肠组织中内源性过氧化物酶活性：
取与步骤2中相同来源的人结肠组织和人小肠组织石蜡切片，分别用表1中所示的第二种方法进行实验，不加过氧化氢封闭液进行内源性过氧化物酶的封闭，切片经过微波热处理后直接滴加DAB显色。共处理了44份结肠组织和47份小肠组织。
结果表明，在44份人结肠组织切片(图11)和47份人小肠组织切片(图12)中，均未见内源性过氧化物酶的阳性染色，证明微波加热可以灭活人结肠组织和小肠组织中的内源性过氧化物酶活性。
(三)以小鼠的肝脏和脾脏组织为实验原料验证微波加热能封闭内源性过氧化物酶活性(本实验中各实验步骤与步骤一中(1)、(2)、(5)、(6)和(7)中所述相同，其中微波处理方法为本发明的改进的微波方法，其具体条件为：微波功率为2.45GHz，调至800w，连续加热15min。
1、材料及切片的制备：
以小鼠的肝脏和脾脏组织为实验原料，因为红细胞是内源性过氧化物酶的另一主要来源，考虑到肝脏和脾脏是血供极为丰富的组织，因此选择小鼠的肝脏和脾脏组织标本作为实验原料。材料来源：来自小鼠，共3只；小鼠由北京大学医学部动物实验中心提供。3只小鼠的肝脏和脾脏组织石蜡切片的制备方法同上述(6)中所述一致。
2、内源性过氧化物酶在小鼠的肝脏和脾脏组织中的分布：
取小鼠的肝脏和脾脏组织的经多聚赖氨酸预处理的石蜡切片，分别用表1中所示的第1种方法进行实验，经脱蜡再水化后直接滴加DAB工作液显色，DAB特异性的显色过氧化物酶，而此操作并未使用外源性的过氧化物酶，如辣根过氧化物酶等，因此结果显示的即为内源性的过氧化物酶在组织中的分布情况。同时，取小鼠的肝脏和脾脏组织的未经多聚赖氨酸预处理的石蜡切片各1张，按照一中(7)相同步骤进行苏木素-伊红染色，辅助判断细胞性质。
实验设3次重复。结果，如图13所示，表明了内源性过氧化物酶在小鼠肝脏中的正常分布情况；如图15所示，表明内源性过氧化物酶在小鼠脾脏中的正常分布情况。
3、微波加热能封闭小鼠的肝脏和脾脏组织中内源性过氧化物酶活性：
取与步骤2中相同来源的小鼠的肝脏和脾脏组织的经多聚赖氨酸预处理的石蜡切片，分别用表1中所示的第2种方法进行实验，不加过氧化氢封闭液进行内源性过氧化物酶的封闭，切片经过微波热处理后直接滴加DAB显色。
实验设3次重复。在小鼠肝脏组织切片中未见内源性过氧化物酶的阳性染色(图14)，在小鼠脾脏组织切片中未见内源性过氧化物酶的阳性染色(图16)；证明微波加热可以灭活小鼠的肝脏和脾脏组织中内源性过氧化物酶的活性。
实施例2、微波加热封闭内源性过氧化物酶活性在免疫组化中的应用
本实施例通过两种方法观察Bax抗原和Bcl-2抗原在组织中的表达情况，第一种方法是传统的免疫组化方法，第二种方法是利用微波加热封闭内源性过氧化物酶的免疫组化方法，通过抗原检测效果和免疫组化染色效果的比较，看本发明的利用微波加热封闭内源性过氧化物酶的免疫组化方法是否有效。
一、实验中用到的材料和试剂
材料及来源：本实施例以人的胃癌组织及上述结肠和小肠组织为实验材料。材料来源：结肠和小肠组织标本来源同上，胃癌组织标本均来自北京大学第三医院消化科内镜中心。人胃癌组织石蜡切片的制备方法同实施例1中(6)中所述一致。
抗体：一抗为Anti-Bax Ab-1鼠抗人单克隆抗体，购自Neomarkers公司(LabVision，UK)，为即用型抗体；Bcl-2为鼠抗人单抗，购自美国Sigma公司(SaintLouis)，稀释浓度为1∶600；二抗包括在SP检测试剂盒中。
SP检测系统(Neomarkets公司(Lab Vision，Fremont，USA))。DAB等常规试剂购自北京中杉公司。
二、检测内源性过氧化物酶在上述组织中的分布情况
本实验是为了证明下面的免疫组化方法没有假阳性的存在。
取未经多聚赖氨酸预处理的人胃癌组织石蜡切片，经过苏木素-伊红染色，确定内源性过氧化物酶在其中的分布情况及辅助判断细胞性质。
结果如图17和19所示，表明了人胃癌组织中内源性过氧化物酶的正常分布情况。
三、免疫组化方法检测Bax抗原和Bcl-2抗原在上述各组织中的表达情况：
方法一：利用传统方法进行免疫组化操作(使用过氧化氢封闭液进行常规封闭)
对Bax抗原在人胃癌组织和人小肠组织中表达情况检测及Bcl-2抗原在人结肠组织中表达情况检测的的实验步骤均如下：
I.脱蜡再水化：二甲苯I 20min→二甲苯II 20min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 10min→95％乙醇10min→90％乙醇10min→80％乙醇10min→蒸馏水；用PBS冲洗2次，每次5min。
II.抗原修复(AR)：同实施例1一中(3)所述。
III.内源性过氧化物酶的封闭：使用现用现配3％的过氧化氢封闭液，室温避光孵育10min；用PBS冲洗3次，每次5min。
IV.滴加稀释好的一抗，湿盒中37℃孵育60min；用PBS冲洗3次，每次5min。阳性对照为Bax抗原阳性表达的淋巴瘤标本(美国Neomarkers公司提供，货号为MS-711-PCS)或Bcl-2阳性表达的组织(福州迈兴公司)，阴性对照采用PBS缓冲液取代一抗的替代对照。
V.滴加二抗，室温孵育20min；用PBS冲洗3次，每次5min。
VI.滴加辣根过氧化物酶标记的SP液，室温孵育10min；用PBS冲洗3次，每次5min。
VII.DAB显色：将切片置于DAB显色液中，室温孵育10～15min；自来水终止反应，并充分冲洗。
VIII.苏木素复染：苏木素复染液：苏木素1克，碘酸钠0.2克，钾矾50克，水1000ml。向切片中滴加1-2滴苏木素复染液，染15sec；自来水冲洗，洗去苏木素。。
IX.分色反蓝：向切片滴加分色液(75％酒精配制1％稀盐酸液或0.02M柠檬酸液)，分色1min；向切片滴加反蓝液(0.1％氨水溶液)，反蓝1min。
X.脱水透明：80％乙醇2min→→90％乙醇2min→95％乙醇2min→无水乙醇I2min→无水乙醇II 2min二甲苯I 2min→二甲苯II 2min。
XI.封片：中性树胶封片，显微镜观察。
结果判定方法如实施例1中(8)所述一致。
方法二：结合本发明进行免疫组化操作方法
本方法省略了过氧化氢稀释液封闭内源性过氧化物酶的步骤，通过微波处理同时实现了内源性过氧化物酶的封闭和抗原修复。
具体方法如下：
I.脱蜡再水化：与上述方法一中所述一致。
II.微波处理：使用0.01M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)，具体步骤如实施例1中(2)所示，其具体条件为：微波功率为2.45GHz，调至720w(中、高火)，连续加热15min，空气中自然冷却至室温。
III.其余的滴加一抗和二抗、辣根过氧化物酶标记的SP液、DAB显色、苏木素复染、分色反蓝、脱水透明、封片及结果判定方法均与上述方法一中所述一致。
图18和图20是通过本发明方法进行的免疫组化检测结果，表明Bax抗原在人胃癌组织中表达情况；
图21是通过本发明方法进行的免疫组化检测结果，表明Bcl-2抗原在人结肠组织中的阳性表达结果；
图22是通过本发明方法进行的免疫组化检测结果，表明Bax抗原在人小肠组织中的阳性表达。
结果表明：①与内源性过氧化物酶在人胃癌组织中、人小肠组织和人结肠组织中正常分布情况相比，本发明的省略过氧化氢稀释液封闭液处理的免疫组化染色方法未见内源性过氧化物酶的假阳性染色，照片清晰，未见非特异性背景染色，特异性及敏感性较高；②与方法一中用传统方法免疫组化检测结果相比，结果未见差异。③以上结果证明本发明方法有效，微波高温热处理可以起到抗原修复和内源性过氧化物酶封闭的双重功效，在免疫组化操作中，如果采用微波高温热处理作为抗原修复方法，并且采用0.01M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)作为抗原修复液，可以省略稀释过氧化氢封闭液的处理过程。
本发明方法在理论上也是可以解释的，微波加热不但能起到抗原修复的作用，而且还能同时灭活内源性过氧化物酶活性，原因应该在于高温直接导致了内源性过氧化物酶的变性。因为高温能导致几乎所有的蛋白质发生变性，因此有理由认为高温同样在一定程度上可以使内源性过氧化物酶发生变性。当然变性过程会受到石蜡引起的蛋白间交联的影响，但是打断蛋白之间形成的交联本身就是抗原修复所需达到的目标，因此微波高温最终导致内源性过氧化物酶变性并且消除由此带来的背景染色也就不足为怪了。
Claims (4)
1.免疫组化中的灭活内源性过氧化物酶及抗原修复的方法，是将组织切片置于装有抗原修复液的容器1中，再将所述容器1置于装有水的容器2中，然后进行如下微波处理：所述微波的频率为2.45GHz、功率为650～800w，所述处理的时间为10～15分钟；
所述抗原修复液为0.01M、pH为0.6的柠檬酸缓冲液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微波的功率为720w；所述处理的时间为15分钟。
3.权利要求1或2所述方法在免疫组化中的应用。
4.一种免疫组化方法，包括用权利要求1或2所述方法进行抗原修复和灭活内源性过氧化物酶的步骤。
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