CN105137078A - 一种预测胰腺癌病人预后不良风险的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种预测胰腺癌患者预后不良风险的试剂盒及其应用，即通过免疫组织化学的方法测定胰腺癌患者组织标本中CXCL12及CXCR7表达的高低，以CXCL12和CXCR7作为标记物在体外评估胰腺癌预后，可以快速、安全、方便、有效地预测胰腺癌患者预后不良风险，为临床诊治提供依据。

Description

一种预测胰腺癌病人预后不良风险的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种通过测定胰腺癌组织标本趋化因子CXCL12及趋化因子受体CXCR7表达强弱，预测胰腺癌病人预后不良风险的试剂盒及其应用。
背景技术
胰腺癌是一种严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤，其临床表现隐匿、病情进展迅速、预后极差。85％的患者就诊时已属晚期，仅20％左右的患者可行手术治疗，总体5年生存率小于5％，因此国际上将其称为“二十一世纪医学的顽固堡垒”。近年来，胰腺癌发病率在世界范围内逐年攀升。在西方国家，胰腺癌已经成为十种最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤死亡原因的第四位。美国在过去10年中胰腺癌的发病率升高了三倍；我国胰腺癌发病亦呈迅猛增长之势。在北京、生海、天津等大城市，其发病率在20年间增长了约4倍，发病率和死亡率上升了50％左右。
外科手术是治疗胰腺癌的最直接方式，也是提高胰腺癌患者远期生存率的最有效手段。在我国多数患者到医院就诊时已处于胰腺癌晚期，手术切除率一般在10％左右。根治性外科手术治疗是胰腺癌治疗的首选的治疗方式，包括标准根治术以及扩大根治术。两种术式均立足于传统的胰十二指肠切除的基础之上，即肿瘤完全切除，胰头切除，肝门以下胆管切除，十二指肠切除，部分空肠切除，部分胃切除。扩大根治术与标准根治术的主要差异在于淋巴结的清扫，即扩大根治术除外常规的淋巴结清扫外，在进行淋巴结清扫时，采取经后腹膜途径扩大进行广泛区域的淋巴结清扫。虽然根治性手术可以极大的改善患者的远期生存率，然而由于胰腺癌的早期诊断难，患者在就诊时往往已经失去了根治性手术的机会，因而在大多数临床病例中，姑息性手术也成为重要的手术方式。姑息性手术主要目的为解除黄疸以及胃肠道梗阻。姑息性手术虽然对于延长生存时间没有太大意义，但是可以确实的减轻患者的肿瘤负担，解除疼痛，从而可以提高患者的生存质量。
与单纯手术相比，术后辅助化疗具有明确的疗效，可以防止或延缓肿瘤复发，提高术后长期生存率，因此，积极推荐术后实施辅助化疗。胰腺癌具有对化疗药物的多药耐药性，但化疗仍是最常用的方法，若不进行化疗，其中位生存时间仅约3～4个月。全身化疗目前国际及国内均已将吉西他滨作为胰腺癌化疗的一线用药，虽然其疗效仅在20％左右，但目前仍无可以超越吉西他滨的药物。此外，胰腺癌的术后综合治疗还包括术后放疗、分子靶向治疗、免疫治疗等等。
尽管关于胰腺癌治疗的研究正如火如荼地进行，但很少有研究着眼于胰腺癌患者预后的评估，亦没有有效的方法及产品评估胰腺癌患者预后。
发明内容
本实验室通过前期研究发现胰腺癌组织中CXCL12和CXCR7共同高表达是影响患者预后的独立危险因素。为了评估胰腺癌患者的预后，基于以上原理，本发明提供了一种预测胰腺癌患者预后不良风险的试剂盒及CXCL12和CXCR7作为标记物在体外评估胰腺癌预后中的应用，即通过免疫组织化学的方法测定胰腺癌患者组织标本中CXCL12及CXCR7表达的高低，可以快速、安全、方便、有效地预测胰腺癌患者预后不良风险，为临床诊治提供依据。
为实现以上发明目的，本发明采取以下技术方案：
一种预测胰腺癌患者预后不良风险的试剂盒，包括：用于特异性检测胰腺癌组织中趋化因子CXCL12及趋化因子受体CXCR7的表达的试剂。
进一步地，用于特异性检测胰腺癌组织中趋化因子CXCL12的试剂包括抗CXCL12的抗体，用于特异性检测胰腺癌组织中趋化因子受体CXCR7的表达的试剂包括抗CXCR7的抗体。
进一步地，所述试剂盒还包括：携带有可检测信号分子的检测抗体。
优选地，携带有可检测信号分子的检测抗体包括生物素化二抗和链亲和素标记的HRP。
进一步地，所述试剂盒还包括：显色液、H2O2、二甲苯、乙醇、TBS、抗原修复液、封闭液和中性树脂。
优选地，所述显色液包括DAB和苏木精，所述抗原修复液为柠檬酸缓冲液，所述封闭液为与抗CXCL12的抗体和抗CXCR7的抗体同种属来源的血清，亦可以为小牛血清、BSA、羊血清等。
本发明还提供了趋化因子CXCL12和趋化因子受体CXCR7作为标记物在制备预测胰腺癌患者预后不良风险的试剂盒中的应用。
以及趋化因子CXCL12和趋化因子受体CXCR7作为标记物在体外评估胰腺癌患者预后中的应用。
进一步地，当胰腺癌患者组织标本中趋化因子CXCL12及趋化因子受体CXCR7共同高表达时，表示预后不良发生风险高；当胰腺癌患者组织标本中趋化因子CXCL12或趋化因子受体CXCR7低表达时，表示预后不良发生风险低。
进一步地，通过以下方法判定胰腺癌患者组织标本中趋化因子CXCL12及趋化因子受体CXCR7的表达情况：显微镜下观察染色的胰腺癌组织切片，阳性结果成棕黄色颗粒样染色，随机选择5个高倍视野计数阳性细胞个数。阳性细胞数比例0％，1-30％，31-60％及大于60％分别判定为0、1、2、3分。每张切片阳性细胞的着色强度按无着色、淡黄色、棕黄色及棕褐色分别判读为0、1、2、3分。将两项积分的乘积结果作为最后综合评分标准，最后综合评分的范围为0-9分，其中0-3分判定为低表达，4-9分判定为高表达。
有益效果：
本发明的试剂盒通过免疫组织化学方法检测胰腺癌组织中CXCR7及CXCL12表达的高低，预测胰腺癌患者预后不良风险。本检测方法快速、安全、方便、灵敏，易于推广，可以为胰腺癌的临床诊治提供依据。
附图说明
图1是CXCL12和CXCR7在癌组织及癌旁组织中表达情况；
图2是CXCL12和CXCR7表达情况的Cox生存分析。
具体实施方式
实施例1：利用本发明的试剂盒对胰腺癌组织(标本来源于161例胰腺癌患者手术切除的癌组织，其中男性患者104人，女性患者57人，年龄跨度为34-85岁，中位年龄59岁)表达的趋化因子CXCL12及趋化因子受体CXCR7进行检测
本实施例中的胰腺癌预后试剂盒，由以下组分构成：
(1)试剂A：封闭液，为10％山羊血清；
(2)试剂B：已稀释的即用型抗CXCL12一抗；
(3)试剂C：已稀释的即用型抗CXCR7一抗；
(4)试剂D：抗山羊生物素化二抗；
(5)试剂E：链亲和素标记的HRP；
(6)试剂F：20倍浓缩DAB底物溶液；
(7)试剂G：20倍浓缩DAB底物缓冲溶液；
(8)试剂H：20倍浓缩DAB显色溶液。
其中试剂B、C原装进口分装即用型抗体，稀释倍数为1：500；试剂D原装进口分装即用型抗体，稀释倍数为1：400试剂A、D、E、F、G、H为原装进口分装。
(其中试剂B为SDF-1(C-19):sc-6193,SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC.
试剂C为CXCR-7(I-13):sc-107515，SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC.
试剂D为donkeyanti-goatIgG-B:sc-2042，SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC.
试剂E为Horseradishperoxidase(HRP),RZ1.0：sc-280786，SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC.
试剂F、G、H购置于福州迈新生物技术开发有限公司，产品编号:DAB-0031/1031)除外试剂盒中包含的以上试剂，用户可自行而配制或购买以下试剂：
(1)蒸馏水或去离子水；
(2)3％H2O2；
(3)二甲苯；
(4)75％、85％、95％酒精及无水乙醇；
(5)10mMTBS溶液(pH7.2～7.4)：三羟基氨基甲烷1.21g，氯化钠7.6g，加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH值至7.2～7.4，最后定容至1000mL；
(6)10mMpH6.0柠檬酸缓冲液：柠檬酸0.38g，柠檬酸三钠2.45g，加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH值至6.0，最后定容至1000mL；
(7)苏木精溶液；
(8)中性树脂。
利用上述试剂盒检测胰腺癌组织中趋化因子CXCL12及趋化因子受体CXCR7的表达：
(1)组织包埋：10％的中性福尔马林固定胰腺癌组织标本2h，用流水反复冲洗以去除固定液，将标本放置入75％酒精过夜，然后采用酒精梯度脱水，75％酒精1h，85％酒精1h，95％酒精1h，无水乙醇2次，每次1.5h，然后置于二甲苯中浸泡1.5h，60℃烘箱中浸蜡1h包埋，冷却后4℃保存备用；
(2)石蜡切片：修整蜡块，调整切片机(SLEE石蜡切片机CUT5062)将切片厚度设为3～4μm，连续切片，置于60℃温水漂浮展平，平铺于涂有阳离子树脂的载玻片上；
(3)烤片：将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1h；
(4)脱蜡：切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，每次10min；
(5)水化：切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95％乙醇2次(每次2min)，85％乙醇2min；75％乙醇2min，蒸馏水冲洗1分钟；
(6)抗原修复：高压锅中加入柠檬酸缓冲液1000ml，将装有切片的切片架浸入缓冲液中，高温高压修复2分45秒，用TBS洗涤3次，每次2min；
(7)3％H2O2滴加在切片上，室温静置15min，TBS洗涤3次，每次2min；
(8)封闭：滴加试剂A于切片上，需完全覆盖组织切片，室温孵育10min后吸干液体，无需冲洗；
(9)加一抗：不同的切片分别滴加试剂B(抗CXCL12一抗)及试剂C(抗CXCR7一抗)，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒孵育2hr或4℃过夜；
(10)洗涤：TBS-T洗涤(3×5min)；
(11)加二抗：试剂D(滴加生物素化二抗)，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒中孵育30min；
(12)洗涤：TBS洗涤3次，每次5min；
(13)加HRP-SA：滴加试剂E(链亲和素标记的HRP)，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒中孵育30min；
(14)洗涤：TBS洗涤3次，每次5min；
(15)制备DAB显色液：需现用现配，以染一张切片为例，取2.5ul试剂F加入到50ul蒸馏水中并混匀，再分别向上述液体中加入2.5ul试剂G及2.5ul试剂H，混匀。
(16)显色：滴加上述DAB显色液于切片上，需完全覆盖组织切片，显微镜下观察显色，蒸馏水冲洗终止显色；
(17)复染：苏木精复染3min，盐酸酒精分化；
(18)封片：75％酒精浸泡2min，85％酒精浸泡2min，95％酒精浸泡2min，无水乙醇浸泡2min，然后置于二甲苯中浸泡15min，更换二甲苯后再浸泡15min，中性树脂封片；
(19)结果判读：显微镜下观察染色的胰腺癌组织切片，阳性结果成棕黄色颗粒样染色，随机选择5个高倍视野(10*40)计数阳性细胞个数。阳性细胞数比例0％，1-30％，31-60％及大于60％分别判定为0、1、2、3分。每张切片阳性细胞的着色强度按无着色、淡黄色、棕黄色及棕褐色分别判读为0、1、2、3分。将两项积分的乘积结果作为最后综合评分标准，最后综合评分的范围为0-9分，其中0-3分判定为低表达，4-9分判定为高表达。
如图1所示，A为胰腺癌组织CXCL12蛋白表达情况；B为胰腺癌癌旁正常胰腺组织CXCL12蛋白表达情况；C为胰腺癌组织CXCR7蛋白表达情况；D为胰腺癌癌旁正常胰腺组织CXCR7蛋白表达情况。
实施例2本发明的试剂盒在预测胰腺癌病人预后中的应用
采用病例对照的研究方法并应用小试生产的试剂盒，对161例接受根治性手术治疗的胰腺癌患者的组织标本中趋化因子CXCL12及趋化因子受体CXCR7的表达进行检测，并对胰腺癌患者进行长期随访(每月进行电话随访，随访87个月，期间病人发生死亡则不再进行随访)，采用统计学的方法研究胰腺癌组织表本中趋化因子CXCL12及趋化因子受体CXCR7表达的强弱与患者预后的关系。如图2所示，CXCL12和CXCR7共同高表达组的中位生存期明显短于CXCL12和CXCR7共同低表达组及CXCL12或CXCR7高表达组；相比CXCL12和CXCR7共同低表达组及CXCL12或CXCR7高表达组，CXCL12和CXCR7共同高表达组的预后更差(P＝0.002)。
经统计分析得出以下结论：
表1.影响胰腺癌总生存期的多因素分析
如表1所示，将CXCL12和CXCR7共同高表达、性别、年龄、N分期、分化程度纳入Cox回归模型进行多因素分析，统计结果表明CXCL12和CXCR7共同高表达是影响患者预后的独立危险因素，其P＝0.034。
表2.CXCL12和CXCR7高表达情况对胰腺癌患者预后的影响
如表2所示，进一步将CXCL12和CXCR7的表达情况进行不同组合后分组，经过Cox生存分析发现CXCL12和CXCR7共同高表达的危险度为二者均低表达的1.867倍，P＝0.001。以上结果表明癌组织中CXCL12和CXCR7共同高表达的胰腺癌患者预后不良的风险更高，预后更差。

Claims (10)

1.一种预测胰腺癌患者预后不良风险的试剂盒，包括：用于特异性检测胰腺癌组织中趋化因子CXCL12及趋化因子受体CXCR7的表达的试剂。
2.如权利要求1所述的预测胰腺癌患者预后不良风险的试剂盒，其特征在于，用于特异性检测胰腺癌组织中趋化因子CXCL12的试剂包括抗CXCL12的抗体，用于特异性检测胰腺癌组织中趋化因子受体CXCR7的表达的试剂包括抗CXCR7的抗体。
3.如权利要求1所述的预测胰腺癌患者预后不良风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：携带有可检测信号分子的检测抗体。
4.如权利要求3所述的预测胰腺癌患者预后不良风险的试剂盒，其特征在于，携带有可检测信号分子的检测抗体包括生物素化二抗和链亲和素标记的HRP。
5.如权利要求1所述的预测胰腺癌患者预后不良风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：显色液、H2O2、二甲苯、乙醇、TBS、抗原修复液、封闭液和中性树脂。
6.如权利要求5所述的预测胰腺癌患者预后不良风险的试剂盒，其特征在于，所述显色液包括DAB和苏木精，所述抗原修复液为柠檬酸缓冲液，所述封闭液为与抗CXCL12的抗体和抗CXCR7的抗体同种属来源的血清。
7.趋化因子CXCL12和趋化因子受体CXCR7作为标记物在制备预测胰腺癌患者预后不良风险的试剂盒中的应用。
8.趋化因子CXCL12和趋化因子受体CXCR7作为标记物在体外评估胰腺癌患者预后中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，当胰腺癌患者组织标本中趋化因子CXCL12及趋化因子受体CXCR7共同高表达时，表示预后不良发生风险高；当胰腺癌患者组织标本中趋化因子CXCL12或趋化因子受体CXCR7低表达时，表示预后不良发生风险低。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，通过以下方法判定胰腺癌患者组织标本中趋化因子CXCL12及趋化因子受体CXCR7的表达情况：显微镜下观察染色的胰腺癌组织切片，阳性结果成棕黄色颗粒样染色，随机选择5个高倍视野计数阳性细胞个数，阳性细胞数比例0％，1-30％，31-60％及大于60％分别判定为0、1、2、3分，每张切片阳性细胞的着色强度按无着色、淡黄色、棕黄色及棕褐色分别判读为0、1、2、3分，将两项积分的乘积结果作为最后综合评分标准，最后综合评分的范围为0-9分，其中0-3分判定为低表达，4-9分判定为高表达。
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