CN101586109B - 通过功能基因相对表达量鉴别棉花纤维品质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了1项通过功能基因相对表达量鉴别棉花纤维品质的方法，该方法基于功能基因GhCAD6与棉花纤维次生壁发育同步、并且与棉花纤维品质间负相关的理论基础，在开花后15天采集待检测育种材料发育中的纤维样品，通过RT-PCR相对定量法检测该基因在棉花纤维发育时期的相对表达量来鉴别棉花发育中的纤维品质，相对表达量低的即为优良品质的材料。为育种家在品种选育中提供了一种分子选择的可靠依据，可使育种家在棉花纤维发育时期在田间做农艺形状选择的同时，能综合品质因子进行育种材料的选择，也可结合最终品质分析的结果做出决选，提高了选择的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一项功能基因的应用方法，具体为一项通过功能基因相对表达量鉴别棉花纤维品质的方法，属棉花分子育种中分子辅助选择领域。
背景技术
新中国成立以来，我国棉花的产量和品质都得到了大幅度的提高，但品质还不尽人意，难以满足国内外市场和纺织工业的多种需求。90年代中期以后，我国棉花品质改良进入瓶颈期，虽然目标仍是在保持其他品质指标的同时，重点提高纤维强度，但由于与缺乏优异种质系和亲本材料，也缺乏创新技术，所以主要品质指标改观并不明显(郭香墨等，1999)。新疆作为我国最大的优质棉生产基地，也存在同样的问题。品质问题制约了新疆棉区作为优质棉基地的发展，由于新疆是我国主要的棉花出口基地，因此也影响我国棉花在国际上的竞争能力。随着国家高技术研究发展计划以及国家转基因研究与产业化开发项目资助棉纤维发育的基因克隆与转基因技术的研究，国内研究者已构建了棉花纤维生长发育的特异表达基因文库并开展了棉纤维细胞伸长的研究，发掘了大量的与棉花纤维发育相关的功能基因。但目前还少有棉花纤维生长发育的功能基因相对表达量和品质的关系研究的报道，更没有将棉花纤维功能基因的表达量应用于发育中棉纤维品质鉴定的实例。
在常规育种中，育种材料或单株品质的选择主要是根据收获成熟纤维的品质检测结果，这种选择往往滞后于田间农艺性状的选择，也没有从品质形成的分子机理去选择。在育种实践中，育种家期望在田间做农艺形状选择的同时，能综合品质因子的选择。肉桂醇脱氢酶(CAD)是苯丙烷代谢途径上一个重要的基因家族，在形成细胞壁交联结构、细胞壁的延伸停止、次生壁发育起始及次生壁的发育中起重要的作用。GhCAD6基因是我们从发 育的棉纤维中克隆的一个该家族基因中重要的功能基因。在几年的研究中，我们发现在众多的基因中只有该基因的表达量与棉花纤维的次生壁发育同步，并且表达量升高的早，棉花纤维的长度短，强力低。反之，表达量升高的晚，棉花纤维的长度长，强力高。这在理论上也符合细胞壁的发育理论。因此，我们利用QuantumRNATM 18S内标相对定量法来研究该基因的相对表达量，因为该方法用普通的PCR仪就可以实现，并经Northern杂交证实定量结果的正确性(Fan et al.2006)，并将GhCADG基因的相对表达量应用于棉花育种中陆地棉高代材料或单株材料的品质选择中。
发明内容
本发明的目的是利用相对表达量与棉花纤维的次生壁发育同步、并且与棉花纤维品质密切相关的功能基因GhCAD6，并通过QuantumRNATM 18S内标相对定量法用该基因在棉花纤维发育时期的相对表达量来鉴别陆地棉纤维品质的一种分子辅助育种的选择方法。
实现通过相对表达量鉴别棉花纤维品质及其应用的第一个关键是与棉花纤维品质形成密切相关的功能基因。CAD(肉桂醇脱氢酶)是苯丙烷类化合物代谢途径上一个重要的基因家族，在形成细胞壁交联结构，细胞壁的延伸停止中起着重要的作用。GhCAD6基因不仅相对表达量与棉花纤维的次生壁发育同步，而且与纤维品质密切相关。
实现通过相对表达量鉴别棉花纤维品质及其应用的第二个关键是设计基因特异引物，即选择GhCAD6基因序列有别于该基因家族保守序列的特异序列区设计引物，使扩增的基因产物只来自于GhCAD6，而不是该家族基因中其他的基因。
实现通过相对表达量鉴别棉花纤维品质及其应用的第三个关键是选择棉纤维发育合适的时机采样来鉴别其表达量。经过对大量的棉花种质资源 及棉花高代品系在开花后5，10，15，20，25天该基因表达量的鉴定后发现，在开花后5天，10天时，GhCAD6在发育中的棉纤维的表达量在任意品种中相对均较低，此时期正值棉花纤维迅速伸长期。在开花后20天，25天时，GhCAD6在发育中的棉纤维的表达量在任意品种中相对均较高，此时期正值棉花纤维次生壁发育时期。只有在开花后15天，GhCAD6在发育中的棉纤维的表达量因棉花纤维品质表现出差异(图1)，即在开花店15天优质品质的材料GhCAD6相对表达量较低。因此，开花后15天该基因的相对表达量用来定为鉴别棉花纤维品质的时期。
实现通过相对表达量鉴别棉花纤维品质及其应用的第四个关键是GhCAD6表达量与发育中棉纤维品质有显著的负相关关系。研究发现该基因表达量升高的越早，即在15天时GhCAD6在发育中的棉纤维中表达越高，棉纤维细胞壁上的交联结构形成越早，纤维细胞停止伸长就早，棉花纤维的长度短，强力低，纤维粗，反之亦然。这为我们在育种材料的选择上奠定了基础。也为育种家在品种选育中提供了一种分子选择的可靠依据。理论上也符合细胞壁的发育理论。
棉花育种材料GhCAD6基因的相对表达量可以利用QuantumRNATM 18S内标相对定量法来检测，条件许可也可以用实时荧光定量RT-PCR法或Northern杂交的方法。如果条件不许可，只要选择好内标基因，做好RNA模板浓度均一化和循环数实验，也可采用常规半定量RT-PCR法。
用GhCAD6基因在棉花纤维发育时期的相对表达量来鉴别陆地棉纤维品质。首先，用这种方法对10个陆地棉育种材料GhCAD6在15DPA的相对表达量的检测发现在优劣品质之间的材料表现出显著的差异，与品质检测的结果相吻合。同时又用实时定量RT-PCR进行了验证，获得相似的结果。同时对12个品种(系)进行连续两年(2007年，2008年)的分析，证明了其相对稳定性。之后，又对10个未知品质的陆地棉育种高代材料GhCAD6相 对表达量进行检测，并用2个已知的材料做标样，进一步验证了该方法的重现性、稳定性和正确性。用这种方法在棉花纤维发育时期来鉴别陆地棉纤维品质，可以配合育种家田间高代材料和单株与农艺性状的选择。也可结合最终品质分析的结果做出决选，若选择GhCAD6在开花后15天相对表达量很低的材料，同时又选择品质分析优良的材料，证明该材料不但有分子生物学意义上伸长的潜力，且实际品质优良，提高了选择的准确性。若该材料在年际间表现一致，证明该材料的优良品质特性是可以稳定遗传的。这对于育种材料的品质性状选择有重要的意义，也是当前棉花育种实践中所迫切需要的。
具体实施方式
1.仪器与试剂
Bio-Rad梯度PCR仪(美国)，Eppendorf生物分光光度计(德国)，HERAEUS微型冷冻离心机(德国)，Bio-Rad凝胶成像仪(美国)，Bio-Rad电泳仪(美国)，水平电泳槽(北京六一厂)，Eppendorf移液器一套，超低温冰柜(SANYO MD192)。
RNA提取试剂(RNA提取缓冲液，蛋白酶K，1.6M KCl，2M、4M LiCl，10mM Tris-Cl(pH7.5)，2M KAc(pH5.5)，70％、无水乙醇，液氮)；RT-PCR试剂(ImProm-IITM 5×反应缓冲液，随机引物，2.5mM dNTP，RNAsin，逆转录酶M-MLV RT，超纯水)；PCR试剂(10×Taq PCR缓冲液，2.5mM dNTP，Taq酶，超纯水)；QuantumRNATM 18S试剂盒(Ambion)。
基因的特异引物由华大基因公司(北京)合成。
2.棉花纤维样品的采集
当要检测的棉花育种高代材料或单株接近盛花期时，在开花当天用红色毛线系于花柄处，于开花后15天采集毛线标记的棉铃，用镊子迅速剥取棉瓣并包于预先准备好的锡箔纸中，投入液氮，在-80℃冰箱中贮存，每样采集两个棉铃。
3.棉花纤维RNA的提取
在提取RNA之前，在液氮中仔细将棉纤维与棉籽分离，并挑出棉籽。棉花纤维RNA的提取采用热硼酸法(Shi et al.2006)，提取的总RNA用核酸蛋白快速检测仪测定总RNA产物量及纯度，在A260/A280＞1.8、A260/A230＞2.0时方可使用。稀释每个样品浓度至0.25μg/μL，并各取0.5μL的RNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳验证RNA浓度调整的准确性。
4.RNA反转录合成cDNA
RNA反转录体系为20μL，1μg RNA与1μg随机引物在72℃、5min变性后，立即置于冰上，加入4μL ImProm-IITM 5×反应缓冲液，2.4μLMgCl2(25mmol/L)，2μL dNTP(2.5mmol/L)，0.4μL RNasin，1μL逆转录酶，加ddH20至20μL。混合液在25℃复性5min，42℃、60min延伸后，70℃加热15min使反转录酶失活。反转录产物-20℃保存备用。
5.最佳循环数的确定
确定PCR最佳循环数的目的是为了排除量化分析体系中不敏感的分析区间。因此，在确定最佳循环数之前，需要在所有分析的样品中确定目的基因相对表达量最高的样品，确保所有样品在同一PCR循环数下能鉴别出差异，PCR循环数的实验可以提高该方法的灵敏度。因此，本实验的PCR最佳循环数是用相对表达量最高的样品来确定的。在做了所有样品的RNA浓度均一化之后，再做同一条件的普通PCR，琼脂糖电泳检测，可比较选择相对表达量最高样品。循环数选择22到34，做7个PCR反应混合液，分装到各个反应管中。反应体系20μL：14μL ddH2O，2μL 10×Reaction Buffer(MgCl2 15mol/L)，1.6μL dNTP(2.5mmol/L)，0.4μL Taq酶，上下游引物(20μmol/L)各0.5μL，cDNA模板1μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸10min。最初在PCR仪中放入一管反应液，每隔2个循环放入一管PCR反应液，形成系列循环数的PCR产物，图2所示是利用被选样品15DPA的cDNA进行的PCR循环数实验，像素密度值分析结果显示在PCR循环数为30 时，曲线出现拐点，证明只要在循环数30以内，表达量最高样品的PCR产物在此电泳体系中不会出现饱和，而表达量较低的样品也可在电泳图像中体现。因此最佳的PCR循环数为30。
6.内标引物与竞争剂最佳比率确定
在定量实验中控制内标与目的基因扩增水平具有可比性很重要。根据QuantumRNATM 18S试剂盒说明书，实验设计18S引物与竞争剂的3个比率：1∶9，2∶8，3∶7。在分装的反应混合液中加入预先混合好的不同比率的引物，所得PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳检测(图3)。结果表明，在内标引物与竞争剂比率为3∶7时，内标18S rRNA与目的基因GhCAD6条带的亮度相近，作为本实验中最佳比率的选择。
7.QuantumRNATM 18S内标相对定量法检测GhCAD6基因的表达量
在15μL反应体系中，0.75μL反转录产物，1.5μL 10×ReactionBuffer(MgCl2 15mol/L)，1.2μL dNTP(2.5mmol/L)，0.2μL Taq酶，上下游引物(20μmol/L)各0.3μL，1.2μL内标引物与竞争抑制剂混合液(3∶7)，加ddH2O至15μL。PCR扩增条件同上，30个循环(最佳循环数)。
实例1.陆地棉育种材料GhCAD6表达量及与实时定量法验证
1RNA的提取和浓度均一化
2007年在田间随机选择5个优良品质和5个差品质的棉花育种材料，用上述方法在开花后15天采样，提取10个材料的总RNA，通过电泳和Eppendorf生物分光光度计检测RNA的完整性和纯度，将样品的RNA浓度调整到0.25μg/μl。图4为10个陆地棉高代材料的RNA琼脂糖凝胶电泳图。可以看见非常清晰的28S和18S两条带，说明RNA提取完好，未被降解，无DNA污染。
2GhCAD6基因特异区的引物序列：
GhCAD6-F：5’ACCCCTCTTCAGTTTGTTACCCC 3’
GhCAD6-R：5’GCTTCCAGCAACATCCACGAC 3’
预期扩增片段大小为225bp。
3PCR循环数、内标引物与竞争剂比率
根据上述实验，GhCAD6基因的PCR循环数为30。内标引物与竞争剂比率比率为3∶7。
4GhCAD6表达量及其品质
利用QuantumRNATM 18S内标相对定量法检测GhCAD6基因在这10个材料中的表达量(图5)，结果表明凡表达量低的材料均为优质材料，表达量高的材料均为品质较差的(表1)。
表1.棉花纤维品质检测结果(10个材料)
| 代号 | 品种(系) | 长度(mm) | 强力(CN/tex) | 马克隆值 |
| 1 | 高品 | 31.47 | 23.5 | 3.96 |
| 2 | H5 | 31.86 | 23.4 | 3.28 |
| 3 | 70827 | 31.86 | 23.4 | 4.58 |
| 4 | 70831 | 32.33 | 25.6 | 4.61 |
| 5 | 70833 | 32.02 | 25.4 | 3.47 |
| 6 | 新陆早6 | 26.81 | 19.5 | 4.25 |
| 7 | 谢1 | 26.95 | 20.9 | 4.90 |
| 8 | C2 | 28.64 | 20.6 | 4.38 |
| 9 | C5 | 28.16 | 20.9 | 4.01 |
| 10 | 70807 | 26.98 | 20.6 | 4.81 |
5.用实时荧光定量RT-PCR法的验证
为了验证这种鉴定方法的正确性，用实时荧光定量RT-PCR法对相同的样品进行测定。
首先，分别用内标基因ubiquitin和目标基因GhCAD6构建重组质粒T -ubiquitin和T-GhCAD6，并用7个系列稀释后的质粒作为模板进行real-time RT-PCR反应，得到各自的循环阈值(Ct)。7个标准品的Ct值与起始模板浓度的对数值之间存在线性关系，通过Roche Light Cycler实时定量PCR仪所附带的软件获得标准曲线。获得的标准方程分别是，T-ubiquitin为：y＝-3.522x+19.20，Ct值从8.163到28.78个循环；GhCAD6mRNA为：y＝-3.833x+19.79，Ct值从7.703到30.94个循环。其对应的标准曲线见图6和图7。上述标准曲线的相关系数均(r2)为1，故所作的标准曲线拟合效果很好。
实验结果进一步验证了GhCAD6在15DPA时的相对表达量在优劣品质棉纤维材料之间有明显差异，即劣质品质棉纤维的表达量明显高于优质品质棉纤维的表达量(图7)。与利用QuantumRNATM 18S内标相对定量法检测GhCAD6基因的相对表达量获得相似的结果。证实了该方法本身和结果的正确性及可重现性。
实例2.陆地棉高代材料GhCAD6年际间表达量
在育种高代材料中选取12个材料连续两年种植，分别在2007年和2008年开花后15天采样，提取总RNA，利用QuantumRNATM 18S内标相对定量法检测这两年中GhCAD6基因在这12个材料的相对表达量(图8)，前6个材料(1-6号)代表优良品质材料，其长度大于30mm，强力大于24CN/tex，后6个材料(7-12号)代表品质较差的材料，其长度小于29mm，强力小于21CN/tex。从图中可已看出前6个材料GhCAD6的PCR扩增产物带相对较暗，与18S内标带相比比率较低，表明相对表达量较低；后6个材料GhCAD6的PCR扩增产物带相对较亮，与18S内标带相比比率较高，表明相对表达量较高。结果表明这12个高代材料在两年间结果存在相对一致性。
实例3.陆地棉育种高代材料GhCAD6相对表达量及其品质
在育种的高代材料中随机选择10个样品，开花后15天采样，提取总 RNA，利用QuantumRNATM 18S内标相对定量法检测这10个材料的相对表达量(图10)，并用前期检测表达量低品质好(70831)和表达量低品质差(谢1)作对照。在成熟期采棉株中部的棉纤维送交农业部农产品质检中心(乌鲁木齐)用Uster HVI纤维检测系统检测，检测结果(表2)显示前期检测表达量低的材料(1号)和表达量高的材料(2号)在此次检测中表现稳定；6号和9号材料表达量最低，同时也是综合品质最优的材料；5号、7号和8号材料表达量次低，其综合品质也不如表达量最低的材料。进一步验证了该方法的稳定性和正确性。
表2.棉花纤维品质检测结果(12个材料)
| 代号 | 品系号 | 长度(mm) | 强力(CN/tex) | 马值 |
| 1 | 70831 | 32.33 | 25.6 | 4.61 |
| 2 | 谢1 | 26.95 | 20.9 | 4.90 |
| 3 | 80499 | 30.54 | 20.5 | 4.61 |
| 4 | 80500 | 30.05 | 22.2 | 4.75 |
| 5 | 80539 | 30.28 | 25.8 | 4.32 |
| 6 | 80542 | 31.78 | 26.7 | 4.25 |
| 7 | 80545 | 31.73 | 24.3 | 3.77 |
| 8 | 80547 | 29.25 | 24.5 | 4.49 |
| 9 | 80541 | 32.23 | 24.6 | 4.57 |
| 10 | 80501 | 29.71 | 25.0 | 4.60 |
| 11 | 80574 | 26.50 | 19.5 | 4.83 |
| 12 | 80502 | 28.37 | 21.8 | 4.82 |
附图说明
图1.GhCAD6基因在不同品质棉纤维不同发育时期中的表达水平。A代表差品质材料，B代表优质品质材料，18S代表内标基因，CAD6代表GhCAD6基因。
图2.系列循环数PCR扩增产物像素灰度值分析
图3.GhCAD6因的内标比率实验，18S引物与竞争剂的比率分别为1∶9，2∶8，3∶7，18S代表内标基因，CAD6代表GhCAD6因。
图4.陆地棉育种材料RNA浓度均一化
图5.陆地棉育种材料GhCAD6基因在15DPA时的相对表达量。M代表DNA标记，数字代表材料号，18S代表内标基因，CAD6代表GhCAD6基因。
图6.实时荧光定量RT-PCR内标基因ubiquitin标准曲线
图7.实时荧光定量RT-PCR GhCAD6基因标准曲线
图8.15DPA时用实时荧光定量RT-PCR法测得GhCAD6基因在陆地棉育种材料棉纤维中的相对表达量，数字代表材料号。
图9.陆地棉育种材料GhCAD6基因年际间在15DPA时的相对表达量。M代表DNA标记，数字代表材料号，18S代表内标基因，CAD6代表GhCAD6基因。
图10.陆地棉育种高代材料GhCAD6相对表达量15DPA时的相对表达量。M代表DNA标记，数字代表材料号，18S代表内标基因，CAD6代表GhCAD6基因。
参考文献
郭香墨，刘正德，罗云佳 (1999) 我国面向 21 世纪棉花纤维品质改良对策。棉花学报 11 ： 321-325
Fan L ， Linker R ， Gepstein S ， Tanimoto E ， Yamamoto R ， Neumann PM(2006)Progressive Inhibition by Water Deficit of Cell Wall Extensibilityand Growth Along the Elongation Zone of Maize Roots Is Related toIncreased Lignin Metabolism and Progressive Stelar Accumulation ofWall Phenolics.Plant Physiol 140(2) ： 603-612
Shi YH ， Zhu SW ， Mao XZ ， Feng JX ， Qin YM ， Zhang L et al.(2006). Transcriptome profiling ， molecular biological ， and physiologicalstudies reveal a major role for ethylene in cotton fiber cellelongation.Plant Cell 18 ， 651-664.
Claims (1)
1.通过功能基因相对表达量鉴别棉花纤维品质的方法，其特征在于：所述的功能基因是表达量与棉花纤维次生壁发育同步、纤维品质密切相关的功能基因棉花肉桂醇脱氢酶GhCAD6，该功能基因的相对表达量与棉花纤维品质存在负相关关系；在开花后15天采集纤维样品、采用热硼酸法提取棉花纤维RNA、RNA反转录合成cDNA、采用QuantumRNATM 18S内标相对定量法检测GhCAD6基因的表达量，内标引物与竞争剂的比率为3∶7，相对表达量低的为优质材料；在上述过程中，选择GhCAD6基因序列有别于该基因家族保守序列的特异序列区设计引物，使扩增的基因产物只来自于GhCAD6，该引物序列为
GhCAD6-F：5’ACCCCTCTTCAGTTTGTTACCCC 3’
GhCAD6-R：5’GCTTCCAGCAACATCCACGAC 3’。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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