CN101580868A - 测定对溶解细胞的抗生素具有抗性的细菌存在的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于靶细菌对溶解细胞的抗生素的抗性来测定是否存在所述靶细菌的方法。将所述的抗生素用于溶解样品中非靶细菌的细胞,因此在采用已知的方法进行检测前,有利于靶细菌的分离。
Description
本申请是分案申请,其原申请的国际申请号为PCT/GB02/03990,中国国家申请号为02818402.5,申请日为2002年9月2日,发明名称为“测定对溶解细胞的抗生素具有抗性的细菌存在的方法”。
技术领域
本发明涉及测定样品中是否存在一种或一种以上的靶细菌的方法,其中所述的靶细菌对一种或一种以上的溶解细胞的抗生素具有抗性。本发明具体但非限制性地涉及测定在临床样品中是否存在一种或一种以上耐甲氧苯青霉素的细菌的方法。
背景技术
对常用抗生素具有抗性的细菌的出现是一个越来越普遍的问题,这个问题与对感染患者的治疗密切相关。事实上,这些所谓的超级病菌例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)几乎对最有效的抗生素都产生了抗性。在医院环境中,这个问题变得更加严重,因为免疫系统弱的患者在医院内感染对抗生素具有抗性的细菌时,可引发严重的并发症,甚至死亡。因此,在这种环境中需要使感染的危险性降至最低。使这种危险性降至最低的方法之一在于早期测定此类细菌的存在,以对个体和环境进行仔细监测,并且如果必要,进行早期治疗。
然而,目前测定对抗生素具有抗性的细菌存在的方法耗时过多,此类方法需要首先培养纯态的细菌,然后将该细菌与一系列抗生素接触,以检查其生长是否受到抑制。整个过程可能需要至少2天,因而导致在对患者采取最佳治疗方案前的经常性的临界延误。当然,这种延误不仅仅对患者的健康不利,而且会使其在医院环境中逗留更长的时间。
因此,需要一种快速测定存在于患者体内或环境中的、对某种抗生素具有抗性的细菌的方法。
申请人同时待审的专利申请WO 99/37799提供了一种快速测定已知存在于培养物中的特定细菌是否对特定抗生素敏感或具有抗性的方法。然而,该方法的局限性在于其优选需要细菌以纯培养物或纯分离菌形式存在。然而,所述方法可适用于测定混合培养物中的特定细菌对抗生素的抗性或敏感性。在所述情况下,所述方法通常取决于在用特定抗生素处理前或专门针对该特定细菌的其他作用之前的初步分离步骤。
作为选择,如果抗生素的作用方式是已知的,所述方法可以揭示已知存在于混合培养物中的特定细菌对抗生素的抗性或敏感性。该方法具体采用以下方法,即,从混合培养物获得四等分培养物,并在下列情况下分别培养这四等分培养物:i)无抗生素、ii)具有抗生素、iii)存在特异性针对细菌的噬菌体和iv)存在所述抗生素和噬菌体的混合物,然后比较分析这四等分培养物的细胞内腺苷酸激酶的含量,从而揭示已知存在于混合培养物中的特定细菌对抗生素的抗性或敏感性。例如,当与仅用噬菌体培养的样品相比,用抗生素和噬菌体培养的样品中的细胞内腺苷酸激酶减少时,基于这种情况可以推断该细菌对溶解细胞的抗生素敏感。
尽管可假设WO 99/37799中公开的方法可简明地显示混合培养物中存在对特定抗生素具有抗性的细菌,但在实践中尤其是当抗性细菌的浓度低时,还是不能明确并且可靠地获得这种结果。
甚至,即使能达到上述目的,显而易见这种测定细菌存在的方法仍需要进行许多重复步骤,包括培养、处理和分析来自混合培养物的不同的至少四份等分样品。这样的重复步骤是笨拙的而且增加了出错的可能性。另外,由于用噬菌体处理混合培养物的等分样品时需要时间来确保细菌已证实处于其对数生长期,因此所述方法还存在着固有延迟。
因此,始终需要简单而快速地测定样品中是否存在耐抗生素的细菌的方法。具体地,始终需要简单而快速地测定临床样品中是否存在耐抗生素的细菌的方法。
发明内容
因此,本发明提供了测定耐抗生素的细菌是否存在于样品中尤其是临床样品中的方法,该临床样品是通过例如擦拭感染患者来采集的,该方法简单、快速并且包括的必需步骤最少。
本发明起源于如下认识:各种细菌通常对溶解细胞的抗生素敏感,因此,首先可有利地丢弃混合培养物中敏感细菌的细胞内物质。
因此,本发明提供了测定样品中是否存在对溶解细胞的抗生素具有抗性的靶细胞的方法,该方法包括以下依次进行的步骤:
i)在含有溶解细胞的抗生素的培养基中培养样品,
ii)在含有捕获剂的固体载体上捕获未溶解的靶细菌细胞,
iii)使未溶解的靶细菌细胞与能引起其细胞溶解的试剂接触,
iv)测定是否存在来自所述溶解的靶细菌细胞的细胞内物质。
在本发明的一个实施方案中,本方法还包括在步骤iii)之前,进行洗涤步骤和/或过滤步骤,以除去从对溶解细胞的抗生素敏感的细胞获得的细胞内物质。
应理解本申请全文中的短语“溶解细胞的抗生素”描述的是一种在细菌复制过程中破坏细菌的细胞壁合成的试剂。因此,任何β-内酰胺抗生素都适用于实施本发明的方法。在本发明的一个优选实施方案中,所述的溶解细胞的抗生素为青霉素,例如氨苄青霉素或甲氧苯青霉素。
在本发明的一个实施方案中,所述的捕获剂可以仅对特定种类的菌种具有特异性。在另一实施方案中,所述的捕获剂可以对特定株的细菌具有特异性。在一个优选实施方案中,所述的捕获剂是可与金黄色葡萄球菌结合的纤维蛋白原。作为选择,所述的捕获剂为金黄色葡萄球菌的特异性抗体。
当然,应意识到本发明的方法可包括一个或一个以上额外的中间步骤以能测定一种以上靶细胞的存在。典型地,这些步骤可包括在含有一种或一种以上捕获剂的固体载体上捕获未溶解的靶细菌细胞。
有利的是,实施本发明的培养基包括液体培养基。在该实施方案中,所述的固体载体可包括包被有合适的抗体或其他捕获剂的磁珠。作为选择,所述固体载体可包括至少部分地包被有合适的抗体或其他捕获剂的刮铲、桨状物或过滤器。
在本发明的另一实施方案中,所述能够引起细胞溶解的试剂具有对靶细菌的选择性。优选所述的试剂具有对金黄色葡萄球菌的选择性。更优选所述能够引起细胞溶解的试剂为溶葡萄球菌素。
在本发明的另一实施方案中,所述能够引起细胞溶解的试剂为具有对靶细菌的选择性的噬菌体或获自所述噬菌体的溶胞素。在又一实施方案中,所述能够引起细胞溶解的试剂为大肠杆菌素。
当然,也应意识到本发明的方法还可包括许多测定是否存在其他靶细菌的类似步骤。
测定来自溶解的靶细菌细胞的细胞内物质的方法可包括本领域已知的任何合适的分析方法。优选地,所述分析方法包括生物发光分析。更优选所述的生物发光分析是基于腺苷酸激酶(AK)的分析,即,如申请人同时待审的专利申请WO 94/17202和WO 96/02665中所述。然而,所述分析可选择性地包括基于细胞内的酶标记(例如磷酸酶或过氧化物酶)的比色测定分析或荧光测定分析。
另一方面,本发明提供了一种用于实施本发明方法的检测箱。优选所述检测箱为一次性检测箱。所述的检测箱可包含合适的组分,以进行选定的分析。所述的检测箱优选包含合适的培养基,该培养基含有选定的溶解细胞的抗生素。所述的检测箱更优选包含:含有对靶细菌具有特异性的捕获剂的固体载体、洗涤溶液和能引起靶细菌细胞溶解的试剂。
在本发明的一个实施方案中,所述的检测箱包含含有甲氧苯青霉素的液体培养基。所述含有甲氧苯青霉素的液体培养基优选以冷冻干燥形式提供。
有利的是,所述的检测箱可以采用多井式容器的形式提供,例如申请人同时待审的专利申请GB 0110476.9中所述。
本发明的方法的一个优点是提供了一种快速(约3个小时)测定是否存在对溶解细胞的抗生素具有抗性的细菌的方法,该方法包括对细胞内物质的简单分析。另外,本方法不需要进行多次重复的比较分析,进一步的优点是可采用明确、独立的定性分析方式而不是比较或定量分析方式来解读结果。
将参考非限定性的实施方案和下列附图描述本发明。
附图说明
图1概略地显示了本发明方法的必要步骤;
图2以图表形式着重显示了阴性试验和阳性试验的差异;
图3以图表形式显示了用50μg/ml氨苄青霉素或4μg/ml甲氧苯青霉素培养三个半小时后,检测耐甲氧苯青霉素的和对甲氧苯青霉素敏感的金黄色葡萄球菌菌株的结果;和
图4为本发明的检测箱的剖视图。
具体实施方式
现在请参考图1,例如用拭子从患者处采集样品,该样品包含一种细菌混合物,其中含有普遍耐甲氧苯青霉素的细菌11和普遍对甲氧苯青霉素敏感的细菌12。在约1ml体积含有约4μg抗生素的液体培养基中于37℃培养所述样品。
耐甲氧苯青霉素的细菌11存活并可繁殖。但是对甲氧苯青霉素敏感的细菌12在初始生长期后产生了弱化的细胞壁13并且溶解,向液体培养基释放出其细胞内物质14。
因此,在2至4小时后,所述的液体培养基中含有由未溶解的耐甲氧苯青霉素的细菌和溶解的对甲氧苯青霉素敏感的细菌组成的混合物。
然后,通过向液体培养基中加入包被有纤维蛋白原的顺磁珠15,测定特定细菌如金黄色葡萄球菌是否存在。所述的纤维蛋白原是金黄色葡萄球菌的特异性结合剂。在2至10分钟后利用磁性从培养基中取出珠子并在分析步骤前进行洗涤。
然后利用能溶解细胞的去污剂在单独的容器中处理磁珠15和所附着的靶细菌11。利用荧光素-荧光酶生物发光方法,分析由此获得的细胞内物质中的腺苷酸激酶。信号16显示了耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌的存在。为了确定起见,可将信号16与合适的空白信号比较,以排除由腺苷酸激酶的背景浓度引起的异常。
显而易见,只有始终不受甲氧苯青霉素影响并固定在磁珠上的细胞才能表现出作为对腺苷酸激酶分析的响应的明显信号。
当然,通过替换或增加步骤也可检测是否存在其他种类的耐甲氧苯青霉素的靶细菌,所述替换或增加的步骤包括加入包含其它包被层的珠子或加入在其包被层中包含一种或一种以上的捕获剂的珠子。
替换地或额外地,在最终的细胞溶解步骤中,将特定的多种细菌作为目标,可在所述方法中引入特异性。例如,可使用对金黄色葡萄球菌特异的噬菌体或去污剂组合物。
图2显示了获得的生物发光检测结果,以用于测定一系列临床样品中是否存在金黄色葡萄球菌。如图所示,可轻易将阳性检测结果(样品编号M421000M和M421148L)与阴性检测结果(样品编号M421117S和M421131P)区分开。
图3显示了在氨苄青霉素和甲氧苯青霉素存在下,培养金黄色葡萄球菌的不同株系而获得的生物发光检测结果。在每种情况中,本方法将存在的耐抗生素的株系与对抗生素敏感的株系区分开。
请参考图4,本发明的方法中使用的检测箱包括注塑的固体聚丙烯外壳(整体定为17),该固体聚丙烯外壳内包含许多小室,即18、19、20、21和22,这些小室可用作各种合适的工具和试剂的贮存室和/或反应室(参见如下描述)。
小室18贮存含有溶解细胞的抗生素的液体培养基22,其适用于培养获自感染的患者的拭子样品。小室18具有实心小棍23,该实心小棍23带有用于获得所述样品的拭子24。小棍23带有与其垂直的横向部分25,该部分可用作小棍18的把柄,小棍23还方便地带有盖子26,该盖子用以封闭小室18中含有溶解细胞的抗生素的液体培养基22。
相邻的小室19和20分别贮存含有磁珠的悬液27的水溶液和磷酸盐缓冲盐水即洗涤溶液28。合适的磁珠为获自Dynal公司的商标名为DynabeadsTM的磁珠。正如前所述,这些磁珠上包被有能捕获靶细菌的试剂。
小室21用作该检测箱的反应室,其中具有适合进行基于腺苷酸激酶的生物发光分析的缓冲水溶液29。在缓冲水溶液29的上部,该小室还具有用箔密封的小囊30和31,其中分别含有基于荧光素/荧光酶的生物发光试剂和含有去污剂或能溶解靶细菌细胞的试剂的二磷酸腺苷水溶液。在所述用箔密封的小囊之间的空间32具有镁源,例如乙酸镁,所述镁源用作生物发光分析的促进剂。
小室22具有中空棒33,其带有适用于刺穿箔封闭的小囊30和31的尖锐的锥尖34。棒33具有与其垂直的横向部分35,该部分35带有接合装置(例如狭槽-未显示),该接合装置用于接合适于沿垂直或水平方向移动棒33的机械装置,所述移动是在控制硬件或软件(未显示)的控制下进行的。与棒33垂直的横向部分35还具有孔(未显示),以便使棒33能容纳可缩进的圆柱状磁铁(未显示)。
小室19、20、21和22具有金属箔形式的层压密封装置。与小室18具有的密封装置不同,在所述的层压密封装置破裂后,便不打算再使用。
使用时,通过把柄25将具有拭子24的实心小棍23从小室18中手动取出,并将其用于从感染的患者处获得样品。立即将小棍23放回该室中,以便将拭子24浸没于液体培养基22中,并再次形成盖子26与小室18间的密封状态。
将检测箱保持在合适的条件下约3小时,以培养患者的样品。在该培养阶段结束时,从小室18中取出小棍23,并将密封小室19、20、21和22的金属箔除去。
将中空棒33(包含可缩进的磁铁)与移动机械装置接合。在硬件或软件的控制下,使棒33移动至小室19;在小室19中,用棒33从悬液27中收集磁珠,再从那里转移至小室18;在小室18中通过例如蜗杆传动装置缩回磁铁,从而使珠子沉在培养基中。
在一段合适的时间后,并且如果进行适当的搅拌,使磁铁重新回到棒33中以便用其收集所述珠子。然后将棒33转移至小室20;在小室20中,使所述的珠子沉在洗涤溶液28中,并再过一段合适的时间后,按照前面描述的方法取回珠子。
接着,将携带着洗过的珠子的棒33转移至反应室21中,从而用尖锐的锥尖34使由箔密封的小囊30和31中的内含物释放到缓冲溶液29中。然后,通过从棒33中收回磁铁而将珠子释放到溶液29中并将该棒返回小室22。
用放置在聚丙烯外壳17的小室21下面的光电倍增管(未显示)检测随后由生物发光反应发出的光。(反应的详述见申请人同时待审的专利申请WO 94/17202和WO 96/02665)。
Claims (7)
1、对样品中的对溶解细胞的抗生素具有抗性的靶细菌的存在进行快速测定以及将所述靶细菌与对溶解细胞的抗生素敏感的细菌相区分的方法,该方法包括以下依次进行的步骤:
i)在含有溶解细胞的抗生素的液体培养基中培养样品,从而使得对溶解细胞的抗生素敏感的细菌的细胞溶解,
ii)在固体载体上捕获未溶解的靶细菌细胞,
iii)进行洗涤和/或过滤以除去从对溶解细胞的抗生素敏感的细胞获得的细胞内物质,
iv)将未溶解的靶细菌细胞利用能引起所述细胞溶解的试剂进行溶解,
v)测定来自所述溶解的靶细菌细胞的细胞内物质的存在;
其中,所述固体载体包括对靶细菌具有特异性的捕获剂,并且/或者所述能引起细胞溶解的试剂对所述靶细菌具有选择性。
2、如权利要求1所述的方法,其中,在大约3个小时的期间内确定对溶解细胞的抗生素具有抗性的靶细菌的存在。
3、如权利要求1或2所述的方法,其中所述能引起细胞溶解的试剂为噬菌体。
4、如权利要求1~3任意一项所述的方法,其中所述靶细菌为金黄色葡萄球菌。
5、如权利要求1~4任意一项所述的方法,其中所述固体载体包含磁珠。
6、如权利要求1~5任意一项所述的方法,其中所述溶解细胞的抗生素为β-内酰胺抗生素。
7、一种对样品中的对溶解细胞的抗生素具有抗性的靶细菌的存在进行快速测定以及将所述靶细菌与对溶解细胞的抗生素敏感的细菌相区分的检测箱,其为用于实施权利要求1~6任一项所述的方法的检测箱,该检测箱内包括:包含许多小室的外壳、含有溶解细胞的抗生素的培养基、含有捕获剂的固体载体、能引起细胞溶解的试剂、用于测定来自溶解的靶细菌细胞的细胞内物质的存在的试剂,
其中,所述固体载体包括对靶细菌具有特异性的捕获剂,并且/或者所述能引起细胞溶解的试剂对所述靶细菌具有选择性。
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